CARACTERIZAÇÃO DE HEMAGLUTININAS DO EXTRATO DA
BIOMASSA DE Chlorella vulgaris
V. L. R. CAVALCANTI1, D. A. VIANA-MARQUES 2, P. N. HERCULANO1, R. P. BEZERRA1, R. M. P. B. COSTA1, C. O. NASCIMENTO3, A. L. F. PORTO1
1
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Área de Bioquímica, Rua Manuel de Medeiros, s/n - Dois Irmãos, Recife – PE – Brasil
2
Universidade de Pernambuco, Campus Serra Talhada, Serra Talhada – PE – Brasil.
3
Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico Vitória – CAV, Rua do Alto do Reservatório, S/N – Bela Vista, Vitória de Santo Antão, – PE – Brasil
E-mail para contato: viviannecavalcanti@outlook.com
RESUMO – Ricas fontes de compostos bioativos, as microalgas estão sendo bastante utilizadas nos mais variados setores da biotecnologia, a exemplo do setor farmacêutico. Estudos têm demonstrado que as algas podem ser fontes de hemaglutininas. No entanto, existem poucos estudos sobre a caracterização destas moléculas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as hemaglutininas extraídas de Chlorella vulgaris. Os extratos foram submetidos a diferentes temperaturas, pHs, inibição por glicoproteínas e carboidratos. Os ensaios mostraram que as hemaglutininas de C. vulgaris são estáveis até 60ºC, inibidas pelas glicoproteínas, mantém sua atividade em todos os pHs testados e não possuem afinidade com ramnose e a rafinose. Isto comprova que as hemaglutininas do extrato de C. vulgaris possuem boa estabilidade química, o que contribui para a qualidade de sua aplicação na indústria farmacêutica, nas áreas de pesquisa em bioquímica e imunologia, bem como na saúde pública.
1. INTRODUÇÃO
Micro-organismos fotossintetizantes são organismos fotoautotróficos unicelulares que convertem facilmente energia luminosa em energia química. Eles apresentam inúmeras vantagens tais com capacidade de utilizar tanto carbono inorgânico quanto orgânico, podem ser produzidos de forma contínua, ocupam pequenas áreas de cultivo, podem ser passíveis de manipulação genética e não estão sujeitos às variações climáticas. Os cultivos são facilmente controlados, não afetam drasticamente o meio ambiente, pois não precisam de aplicação de pesticidas e apresentam tempo de geração curto quando comparados às células vegetais (LOURENÇO, 2006).
Como resultado da sobrevivência em variados habitats, as microalgas têm a capacidade de sintetizar inúmeros complexos metabólitos tais como: peptídeos, lipopeptídeos, ácidos graxos, carboidratos entre outros, fascinando pesquisadores a descobrirem novas moléculas para o emprego
em indústrias farmacêuticas e biotecnológicas (SHING et al., 2005). Neste contexto, esses micro-organismos têm sido reconhecidos como uma fonte potencial de novos compostos bioativos de interesse biotecnológico (SPOLAORE et al., 2006).
Recentemente, as microalgas se tornaram uma fonte atrativa de inovadores compostos naturais com aplicações em diversos setores industriais. Esses compostos estão atingindo alvos em biotecnologia e outras diversas áreas, uma vez que são utilizados como suplementos alimentares; na agricultura por seu potencial de combate à pragas sem causar grandes danos ambientais; e, especialmente no setor de investigação biomédica e farmacêutico, provendo novos compostos de origem mais econômicas com eficácia semelhante ou superior aos fármacos já existentes no mercado, uma vez que as hemaglutininas possuem atividades que podem vir a sanar necessidades na saúde pública, como fármacos antivirais, antimicrobianos e antineoplásicos (RAJA et al., 2008).
Entre os diversos tipos de proteínas encontram-se as hemaglutininas, que geralmente são proteínas ou glicoproteínas de origem não imune, com pelo menos um domínio não catalítico, aglutinantes de células e glicoconjugados, com capacidade de ligar-se reversivelmente a mono/oligossacarídeos específicos através de ligações de hidrogênio e interações de Van der Waals sem alterar a estrutura covalente destes. Sua presença tem sido observada em quase todos os organismos vivos, principalmente em plantas superiores. A maior parte dos estudos visando a atividade hemaglutinante é correlacionada com a produção de lectinas (VAN DAMME, 2010; LIS; SHARON, 1998). Estudos têm demonstrado que as algas podem ser boas fontes de lectinas (CHU et al, 2004; SATO et al, 2000). Apesar do considerável progresso no estudo da distribuição e do caráter bioquímico das hemaglutininas de macroalgas marinhas, poucos estudos têm relatado a sua presença em micro-organismos fotossintetizantes; como exemplo, a microalga Chlorella pyrenoidosa apresentou considerável atividade hemaglutinante, com uma titulação máxima de 4096 hemaglutininas por poço. Apesar de existirem relatos acerca da atividade hemaglutinante e da purificação de lectinas extraídas de plantas, ainda existem poucos estudos sobre o isolamento, a caracterização e, mais importante, as propriedades biológicas destas proteínas em algas, tornando-se um campo aberto para novas pesquisas.
Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar as hemaglutininas de Chlorela vulgaris, quanto a diferentes temperaturas, pHs, inibição por glicoproteínas e carboidratos.
2. METODOLOGIA
Obtenção da biomassa:
Foi realizado o cultivo de um pré-inóculo para que houvesse células jovens e aptas a multiplicar-se devidamente durante o cultivo, realizado em meio BBM, pH 6,8, sob iluminação constante a 72 uMol. A concentração celular foi determinada por turbidimetria, a 685nm (CHEN et
al., 2011). O pH foi medido em potenciômetro através da imersão do eletrodo nas culturas. Ao final dos quinze dias de cultivo, as células foram centrifugadas e submetidas à liofilização por 24 horas (PELIZER et al., 1999). Posteriormente foram armazenadas em freezer a -18 ºC para a realização das análises descritas a seguir.
Preparo dos extratos de Chlorela vulgaris:
Os extratos foram preparados com base nas metodologias de Chu et al (2006), Dinh et al (2009) e Bermejo Roman et al (2001). O primeiro consiste na suspensão das células em 200 mL de tampão TBS (salina-Tris-HCl) pH 7,5 submetida à agitação magnética por 9 horas, em banho de gelo constante. Após esse tempo, as amostras foram centrifugadas a 7.000 rpm por 8 min. Os sobrenadantes foram utilizados nos testes de hemaglutinação e na caracterização parcial.
Atividade Hemaglutinante (AH):
Em uma placa de microtitulação de fundo cônico, foram adicionados 50 uL de solução salina 0,15 M em todos os poços. Em seguida, foram adicionados 50 uL de sangue glutarizado no poço A1, sendo este o branco. No poço A2, foram adicionados 50 uL do extrato de C. vulgaris e então foi feita a diluição seriada, que consiste em retirar 50 uL dessa mistura de solução salina e extrato, transferindo-a para o poço seguinte, e assim sucessivamente, até o poço 12, descartando os 50 uL restantes. Então, 50 uL de sangue foram adicionados, sendo este processo repetido em todas as linhas. Terminada esta etapa, a placa passou 45 minutos reservada em temperatura ambiente para observação dos resultados. Se houver formação de malha de hemaglutinação, o resultado é positivo. Porém, se houver um ponto distinto no fundo do poço, o resultado é negativo para hemaglutinação. A AH foi definida como o inverso do título correspondente a maior diluição em que se observou aglutinação (diferente do controle, primeiro poço) (KILPATRICK &YEOMAN, 1978).
Caracterização Parcial:
Estabilidade à temperatura e ao pH:
Os extratos selecionados foram submetidos a diferentes temperaturas (20 a 80ºC) e soluções tampão a 10 mM (citrato fosfato, pH 3,5 a 6,5; fosfato de sódio, pH 7,0; Tris-HCl, pH 7,5 a 9,5) por 40 minutos (SHIOMI et al., 1979). Após esse tempo, a AH foi realizada para detecção de aglutinação em cada extrato.
Determinação da inibição por açucares da AH:
A metodologia foi realizada de acordo com Correia e Coelho (1995). Soluções de lactose, maltose, rafinose, xilose, frutose, arabinose, galactose, glicose, N-Acetil-D-Glicosamina, albumina de soro bovino e azocaseína foram preparadas em NaCl 0,15 M para soluções finais de 0,3 e 0,6 M, por diluições sucessivas. Volumes iguais (50 mL) do extrato da biomassa da microalga e 50 mL soluções de açúcares foram previamente incubados por 30 min em temperatura ambiente antes da adição da suspensão de eritrócitos (50 mL). A atividade foi determinada como descrita no ensaio de
hemaglutinação previamente descrito e expressa como a mais baixa concentração do composto na qual não foi observada hemaglutinação.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os testes de hemaglutinação com o tampão Tris-HCl-NaCl obtiveram resultados positivos de até 4096 U/mg hemaglutininas. Com relação à estabilidade aos diferentes pHs, as hemaglutininas do extrato de C. vulgaris mostraram-se estáveis em todos os testes realizados, como demonstrado na a tabela 1. Desta forma pode-se constatar que as hemaglutininas do extrato de C. vulgaris são estáveis desde pHs ácidos até os básicos, o que facilita suas possíveis aplicações na indústria farmacêutica. Estes dados corroboram com outros encontrados por Chu et al (2006), que observaram o mesmo padrão de estabilidade para os extratos de C. pyrenoidosa.
Tabela 1 – Estabilidade das hemaglutininas presente nos extratos de C. vulgaris em diferentes pHs.
Tampões pHs testados Hemaglutininas
(U/mg)
Citrato fosfato 3,5; 4,5; 5,5; 6,5 4096
Tris-HCl 7,5; 8,5; 9,5 4096
Fosfato de sódio 7,0 4096
Com relação aos testes de inibição, a AH dos extratos de C. vulgaris foram inibidos pela maioria dos carboidratos testados (Tabela 2). Os únicos carboidratos que não inibiram a AH foram a Ramnose e a Rafinose, o que indica que os mesmos não possuem afinidade com as hemaglutininas, que puderam formar a malha de hemaglutinação com os eritrócitos de coelho. Esses resultados corroboram com o estudo de Chu et al (2006), que verificaram a não influência dos mesmos carboidratos testados nesta pesquisa nos extratos de C. pyrenoidosa, assim como também a inibição da AH pela albumina e azocaseína.
carboidratos e glicoproteínas.
Carboidratos / Glicoproteínas Hemaglutininas (U/mg) Galactose - Arabinose - N-acetil-D-glicosamina Ramnose Rafinose Glicose Lactose Frutose Xilose Maltose Albumina Azocaseína - 4096 4096 - - - - - - - (-): ausência de atividade hemaglutinante
Por fim, com relação às temperaturas testadas, a AH do extrato da biomassa de C. vulgaris foi estável até 60 °C; em temperaturas mais altas, o extrato perdeu AH, com pontos distintos no fundo dos poços das placas de microtitulação. Estes resultados estão de acordo com o encontrado por Correia e Coelho (1994), que observaram esta mesma perda de AH. Este comportamento pode ser elucidado pela investigação para descobrir a que classe de macromoléculas pertencem as hemaglutininas presentes nos extratos de C. vulgaris. Mais testes estão em andamento neste sentido.
4. CONCLUSÃO
Diante dos resultados, podemos concluir que os extratos de C. vulgaris apresentam alta atividade hemaglutinante. As hemaglutininas presentes nos extratos são estáveis em diferentes pHs, a
temperaturas de até 60ºC, são inibidas por Rafinose, Ramnose, Albumina e Azocaseína. Mais ensaios de purificação e caracterização se fazem necessários, pois, as macromoléculas provenientes de microalgas aumentam o valor agregado destes organismos vivos, bem como representam uma nova fonte para futuras aplicações na pesquisa em bioquímica, biologia celular e saúde tanto humana quanto animal.
5. REFERÊNCIAS
BERMEJO ROMAN R, TALAVERA EM, ALVAREZ-PEZ JM. Chromatographic purification and characterization of b-phycoerythrin from Porphyridium cruentum. Semipreparative HPLC separation and characterization of its subunits. Journal of Chromatography A, v. 917, p.135– 45, 2001.
CHU, C.Y.; LAIO, W.R.; HUANG, R.; LIN, L.P. Hemagglutinating and antibiotic activities of freshwater microalgae. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 20, p. 817–825, 2004. CHU, C.Y.; HUANG, R.; LIN, L.P. Purification and characterization of a novel haemagglutinin from Chlorella pyrenoidosa. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 33, p. 967–973, 2006.
DINH, H. L.; HORI, K.; QUANG, N. H. Screening and preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese marine algae. Journal Applied of Phycology, v. 21, p. 89–97, 2009. KILPATRICK D. C.; YEOMAN M. M. Purification of the Lectin from Datura stramonium. Biochem. J. 175, 1151-1153, 1978.
LOURENÇO, S.O. Cultivo de microalgas marinhas: princípios e aplicações. São Carlos: RiMa, 2006. 606 p.
RAJA R, HEMAISWARYA S, ASHOK KN, SRIDHAR S, RENGASAMY R. A perspective on the biotechnological potential of microalgae. Critical Review of Microbiology, v. 34, p. 77–88, 2008. SHARON N., LIS H. Lectins as cell recognition molecules. Science. 1998; 246:227–234.
SHING, S.; KATE, B. N.; BANERJEE, UC. Bioactive compounds from cyanobacteria and microalgae: An overview. Critical Review of Biotechnology, v. 25, p. 73-95, 2005.
SPOLAORE, P.; JOANNIS-CASSAN, C.; DURAN, E.; ISAMBERT, A. Commercial Applications of Microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 101, v. 87-96, 2006.
VAN DAMME, E.J.M.; LANNOO, N.; PEUMANS, W.J. Plant lectins. Adv Bot. Res. 48: 107–209, 2010.
