UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
A
VALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES DO TIPO TOLL NA INDUÇÃODE RESPOSTA IMUNE POR
Lactobacillus delbrueckii
UFV H2b20
Autor: Leonardo Santos de Freitas
Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Imunobiologia de Protozoários.
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
F866a Freitas, Leonardo Santos de.
Avaliação da participação de receptores do tipo toll na indução de resposta imune por Lactobacillus delbrueckii UFV H2b 20 [manuscrito] / Leonardo Santos de Freitas. – 2007.
91 f.: il., graf., tab.
Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Imunoparasitologia.
DEDICATÓRIA
Dedicatória
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
Agradeço de forma especial ao professor Dr. Luís Carlos Crocco Afonso, pela imensa paciência e incomparável compreensão, durante todos os momentos deste trabalho, e por ter dedicado seu esforço para a realização deste projeto. Agradeço também pelos grandes ensinamentos, apoio e amizade.
Aos professores Drs. Vanessa Carla Mosqueira, Helio Ideo Babá, Milton, Rogelio Brandão e Ieso Castro por terem aberto as portas dos seus laboratórios sempre com muita disposição.
Ao professor Roney por disponibilizar seu trabalho para a execução de testes importantes para finalização deste estudo.
Ao professor Jorge Humberto pela importante colaboração durante grande parte deste trabalho e por possibilitar a realização dos estudos de caracterização molecular. E, ainda, por compartilhar seus conhecimentos e experiência.
Às professoras Drs. Cláudia e Simone pelo apoio no momento mais difícil deste trabalho.
Aos professores do NUPEB, por terem contribuído para a concretização deste sonho, cada um de sua maneira.
Ao Leandro por se mostrar sempre disposto a ajudar e contribuir com os materiais. À Cida, por estar sempre disposta a nos ajudar.
Ao Eduardo por ter dedicado grande parte de seu tempo auxiliando na execução e padronização de diversas técnicas e, também, por compartilhar seus conhecimentos. Além disto, por ter descoberto uma importante alteração na seqüência do primer de CCL5/Rantes. A todos os colegas do LIP pela amizade e ajuda indispensáveis para a concretização deste projeto.
A todos os colegas de turma do mestrado pela convivência e apoio.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradecimentos Especiais
Agradeço a Deus por ter me guiado durante esta caminhada.
Aos meus pais, por me apoiarem sempre e por compreenderem todas as minhas dificuldades.
Aos meus irmãos Di, Carol e Juninho pelo carinho e pela força que sempre me deram.
À Thalyta, por estar ao meu lado durante toda esta etapa de minha vida. À Lúcia, Edinho, Ítalo, César e familiares, pela torcida.
Aos meus parentes e familiares, em especial à minha vó, por torcerem por mim, apesar da distância.
Aos amigos, Marcelo, Fernando, Matheus, Zé Arnaldo e Rodrigo pela amizade incondicional.
Aos amigos Thiago, Lucas, Tuir e Didi pela convivência, sempre alegre e harmoniosa.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Lista de figuras e tabelas
Tabela 1 – Quimiocinas...27
Tabela 2 – Primers de citocinas e quimiocinas...42
Figura 1 - Produção de IFN-γ por esplenócitos em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens, por camundongos de diferentes linhagens ...46
Figura 2 - Produção de TNF-α por esplenócitos em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens, por camundongos de diferentes linhagens...47
Figura 3 - Produção Relativa de RNA de IL-10...49
Figura 4 - Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens...51
Figura 5 - Produção de TNF-α por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens...51
Figura 6 - Produção Relativa de RNA de citocinas e quimiocinas de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/-...53
Figura 7 - Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens...55
Figura 8 - Produção de TNF-α por esplenócitos de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens...55
Figura 9 - Produção Relativa de RNA de citocinas e quimiocinas de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ....57
Figura 11 - Produção de TNF-α por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta aos estímulos (-) extrato e extrato de parede, em diferentes dosagens...61
Figura 12 - Detecção de carboidratos em extrato de parede de L. delbrueckii por Dot-Blot...62
Figura 13 - Cromatografia em camada delgada do extrato de parede de L.delbrueckii revelada em câmara de iodo ...63
Tabela 3 - Dosagem de Glicose e Triglicérides da fração Extrato de Parede...63
RESUMO
Resumo
O uso de bactérias probióticas como adjuvantes de vacinas tem sido considerado uma importante estratégia para o aumento de eficácia desta ferramenta de combate às mais diversas patologias.
Trabalhos recentes realizados com o candidato a adjuvante, Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20, demonstraram sua capacidade de induzir, in vitro, a produção das citocinas pró-inflamatórias IFN-γ, TNF-α e IL-12 por esplenócitos de camundongos
BALB/c e células mononucleares do sangue periférico humano. Apesar da indução destas citocinas características de uma resposta imune TH1, esta estirpe bacteriana foi incapaz de proteger camundongos BALB/c da infecção por L. braziliensis, sugerindo uma possível regulação do processo inflamatório. A partir destes dados, decidiu-se caracterizar o perfil de resposta induzido por L. delbrueckii em esplenócitos de diferentes linhagens de camundongos, no intuito de compreender os mecanismos envolvidos no controle da resposta. Neste sentido, verificamos que o estímulo L. delbrueckii morto pelo calor determinou a produção de citocinas pró e antiinflamatórias, e também das quimiocinas CCL2 e CXCL10, sugerindo que esta preparação é capaz de induzir o recrutamento de macrófagos e células NK.
Avaliou-se também a participação dos receptores do tipo Toll, mais precisamente TLR-2 e TLR-4, no reconhecimento do lactobacilo, e a importância deste processo na indução da resposta imune subseqüente. Os resultados obtidos nos experimentos com linhagens deficientes para estes receptores demonstraram a participação efetiva apenas do receptor TLR-2. Este dado foi comprovado pelos experimentos realizados com o extrato de parede do probiótico, em que a ausência do receptor levou à diminuição da indução de
IFN-γ. A caracterização molecular desta fração da bactéria, por sua vez, demonstrou que esta possui naturezas glicídicas e lipídicas.
ABSTRACT
Abstract
The use of probiotic bacteria as an adjuvant has been considered an important strategy to increase the effectiveness of vaccines against several pathogens.
Recent work with the adjuvant candidate, Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20, described its capacity to induce, in vitro, pro-inflammatory cytokines such as IFN-γ, TNF-α
and IL-12 by mouse splenocites and mononuclear peripheral human blood cells. The production of cytokines characteristic of a TH1 immune response was, however, unable to protect BALB/c mice against a Leishmania braziliensis infection, suggesting a possible regulation of the inflammatory process. Based on these observations, we decided to characterize the L. delbrueckii induced response profile, aiming to understand the mechanism involved in the response control. To this aim, we have verified the dead L. delbrueckii stimulation induced pro and anti-inflammatory cytokines production and also CCL2 and CXCL10 chemokines, suggesting that this preparation is probably able to recruit macrophages and NK cells.
Toll-like receptors, specifically TLR-2 and TLR-4, were also evaluated as participants in lactobacilli recognition and involvement in the subsequent immune response induction. The results of experiments with mouse lineages deficient for these receptors showed an effective participation of TLR-2 receptor only. These results were confirmed by experiments performed with the probiotic wall extract, which the absence of this receptor leaded to a decrease IFN-γ induction. The molecular characterization of this bacterial fraction demonstrated the presence of sugar and lipids in its composition.
ÍNDICE
Índice
DEDICATÓRIA...5
AGRADECIMENTOS...6
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS...7
LISTA DE FIGURAS E TABELAS...8
RESUMO...10
ABSTRACT...11
ÍNDICE...12
ABREVIATURAS...13
INTRODUÇÃO...15
JUSTIFICATIVA...30
OJETIVOS...33
MATERIAL E MÉTODOS...35
RESULTADOS...45
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS...67
SUMÁRIO DOS RESULTADOS...79
CONCLUSÃO...81
ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABTS Ácido 2,2`-bio-azino-3-etilbenzil-tiazol-6-sulfônico BAL Bactérias do ácido lático
CMSP Células mononuclears do sangue periférico DC Células dendríticas
DMEM Dulbecco`s modified eagle medium ELISA Enzime linked immunosorbent assay
HEPES N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-ácido-etanosulfônico IFN Interferon
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
IRF Fator regulador dos interferons
Ldmc Lactobacillus delbrueckii morto pelo calor LPS Lipopolissacarídeo
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
MTT Brometo de 3-[4.5-dimetiltiazol-2]-2.5-difeniltetrazólio NF-kB Fator nuclear kappa B
NK Célula natural killer
PAMPS Padrões moleculares associados a patógenos PBS Salina tamponada com fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase RNAm RNA mensageiro
RT-PCR Transcriptase Reversa – Reação em cadeia da polimerase SDS Duodecil sulfato de sódio
TLR Receptor do tipo Toll TNF Fator de necrose tumoral
INTRODUÇÃO
Introdução
Probióticos e modulação do sistema imune
A microbiota do trato gastrointestinal de um indivíduo é um ecossistema de alta complexidade, contendo cerca de 100 trilhões de bactérias pertencentes a mais de 400 espécies diferentes. Esses microorganismos convivem em relações simbióticas ou antagônicas, crescendo nos componentes que são ingeridos ou nas secreções do trato intestinal do hospedeiro.
Além desta microbiota, um adulto abriga, ainda, uma massa bacteriana distribuída pela pele, cavidades rino-faríngeas e trato genital. Sua composição, embora seja estável em indivíduos saudáveis, pode se alterar por diversos fatores como dietas, stress, estado imunológico, entre outras situações, ocasionando problemas gastrointestinais, resultando em doença ou até mesmo morte.
A colonização microbiana, que é constituída por diversas espécies em sua maioria anaeróbias e microaerófilas, Gram-positivas e Gram-negativas (Bocci, 1992; Conway, 1995), tem importantes efeitos benéficos para a saúde como imunoestimulação e contribuição nutricional.
Diversas são as formas pelas quais a presença destes seres pode favorecer a sobrevivência do hospedeiro. A simples colonização simbiótica do trato intestinal, por exemplo, previne o estabelecimento de patógenos exógenos por efeito conhecido como “exclusão competitiva” ou “efeito barreira”. Além disto, estas mesmas bactérias sintetizam substâncias como vitaminas e proteínas que, muitas vezes, são absorvidas e utilizadas pelo hospedeiro. Bactérias benéficas podem ainda estimular o sistema imunológico através de compostos produzidos, sejam eles excretados ou presentes em sua parede celular.
subprodutos, e carne. No entanto, alguns membros pertencem a habitats específicos como vagina, boca e intestinos de mamíferos.
O grupo lático possui a característica comum de produzir ácido lático em seu metabolismo, além de serem gram-positivos, não apresentarem catalase ou apenas uma pseudocatalase, não formarem esporos, não apresentarem motilidade e serem tolerantes ao ar (Adamberge cols., 2003).
A partir do ácido lático, essas bactérias podem produzir uma variedade de outras substâncias, incluindo bacteriocinas, peróxido de oxigênio e ácidos orgânicos, que podem causar inibição do crescimento de outros microorganismos (van de Guchtee cols., 2001).
As BAL são importantes na indústria alimentícia devido a seu papel na fermentação de alimentos, especialmente produtos lácteos. Vários estudos mostram que as BAL exibem uma variedade de efeitos fisiológicos e terapêuticos, incluindo estimulação da resposta imune e supressão do crescimento de patógenos (Fuglsang e cols., 2002; Klaenhammer, 1998; Rhee & Park, 2001). Dentre as BAL, incluem-se espécies dos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc e Pediococcus (Mombelli & Gismondo, 2000), mas apenas os dois primeiros apresentam estudos e dados consistentes.
A observação dos efeitos benéficos da colonização microbiana no organismo, através de vários estudos realizados ao longo dos anos, deu origem ao termo probiótico. Diversas definições têm sido utilizadas na tentativa de contemplar as características comuns às preparações microbianas capazes de beneficiar, de alguma forma, o corpo humano.
Segundo Schrezenmeir e colaboradores (2001), probióticos são preparações contendo determinados microorganismos viáveis e em número suficiente, que alteram a microbiota em um compartimento do hospedeiro, exercendo, para este, efeitos benéficos. A definição sugerida, entretanto, não corresponde de forma completa aos dados científicos recentes que comprovam a não necessidade da viabilidade dos microorganismos para a concretização destes efeitos (Lee e cols., 2004; Matsuguchi e cols., 2003; Miake e cols., 1985; Sun e cols., 2005). Com o objetivo de incluir e contemplar estes dados, Salminen e colaboradores (1999) definiram probióticos como “preparações ou componentes de células microbianas que possuem um efeito benéfico na saúde e bem estar do hospedeiro”.
bile e pelo suco gástrico; aderir ao epitélio intestinal; ser capaz de colonizar o trato gastrointestinal, mesmo que temporariamente; produzir substâncias antimicrobianas; influenciar atividades metabólicas humanas (metabolismo do colesterol, produção de vitamina, digestão da lactose, etc.) e modular o sistema imune (Gibson & Fuller, 2000). Além disso, uma característica fundamental é que o microorganismo não acarrete efeitos nocivos à saúde e ao bem estar do hospedeiro (Ishibashi & Yamazaki, 2001; Guarner & Schaafsma, 1998; Salminene cols., 1999).
Diversos efeitos têm sido associados aos probióticos, tais como a diminuição do colesterol sérico e da reabsorção de compostos aminados indesejáveis, o aumento da absorção de minerais como cálcio, ferro e magnésio, a liberação de enzimas que favorecem o metabolismo de algumas substâncias como a lactose, o aumento da resistência natural a doenças infecciosas do trato intestinal, a supressão do câncer e a estimulação do sistema imune (Fuller, 1989; Gonzaleze cols., 1995; Saavedra, 1995; Gibson & Roberfroid, 1995). Para isso, são propostos mecanismos de ação que incluem: atividade antimicrobiana; capacidade de resistência e colonização; efeitos antimutagênicos; influência na atividade enzimática; liberação de enzimas e modulação da resposta imune (Sanders, 2000).
A modulação da resposta imune por microorganismos probióticos, bem como os efeitos de sua utilização no desenvolvimento de diversas doenças, tem sido amplamente estudada. Diversos trabalhos têm avaliado a utilização destes microorganismos em diferentes patologias tanto em humanos quanto em modelos animais.
Estudo realizado por Miake e colaboradores (1985) demonstrou o efeito protetor do pré-tratamento com Lactobacillus casei morto pelo calor frente à infecção por
Pseudomonas aeruginosa em camundongos. O tratamento da diarréia por Cryptosporidium parvum, em pacientes imunocomprometidos, utilizando bactérias probióticas, também tem demonstrado excelentes resultados (Pickerd & Tuthill, 2004). Além destes, estudo recente demonstrou que o tratamento de pacientes com colite ulcerativa utilizando o probiótico
Escherichia coli apresenta eficácia equivalente ao tratamento convencional com antibacterianos (Kruise cols., 2004).
Outro estudo, desta vez realizado com crianças, demonstrou a eficiência da ingestão de leite contendo Lactobacillus rhamnosus na prevenção de doenças respiratórias (Hatakkae cols., 2001).
Os mecanismos que direcionam as respostas imunológicas determinadas pelo uso de probióticos também têm sido avaliados pela caracterização dos perfis de citocinas, quimiocinas e células do sistema imune que participam deste processo. Com este objetivo, Perdigon e colaboradores (2002) estudaram o efeito da interação de bactérias do ácido lático com o sistema imune do aparelho digestivo de camundongos. Foi observado, então, o aumento da produção das citocinas IFN-γ e TNF-α para todas as cepas utilizadas e, para
algumas bactérias, a produção das citocinas IL-10 e IL-4. Kawahara e Otani (2006) avaliaram a expressão de citocinas por esplenócitos de camundongos induzidos por diferentes cepas de Lactobacillus. Todas apresentaram uma indução do aumento da produção de IFN-γ e IL-12. Mohamadzadeh e colaboradores (2005) demonstraram que diferentes cepas de Lactobacillus induziram, in vitro, um aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias, além da secreção de IL-12 e IL-18 por células dendríticas mielóides de camundongos. Estudo realizado por Haller e colaboradores (2000) evidenciou a produção das citocinas IL-8, TNF-α e IL-1, e da quimiocina CCL2 por culturas de células de leucócitos do sangue periférico de humanos, co-cultivadas com células do epitélio intestinal, quando estimulados com Lactobacillus sakei e Escherichia coli. Por outro lado, neste mesmo estudo, foi verificada a produção da citocina IL-10 pelos leucócitos co-cultivados. A expressão desta citocina, após indução por probióticos, foi também demonstrada por Miettinen (1996). Neste trabalho, observou-se a indução da produção de TNF-α, IL-6 e IL-10 por células mononucleares do sangue periférico após estímulo com
diferentes cepas de bactérias do ácido lático.
Além do aumento da expressão da molécula imunoreguladora IL-10, outro efeito inibitório na indução de citocina foi verificado com o uso de microorganismo probiótico. Neste caso, Lactobacillus reuteri levou a uma diminuição dos níveis de IL-8, induzida por TNF-α, em culturas de células epiteliais intestinais (Mae cols., 2004).
O estímulo para produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IFN-γ, IL-18 e
macrófagos ou aumento da eficiência da apresentação de antígenos por células competentes. Além disto, a indução da expressão de quimiocinas também pode influenciar a resposta inflamatória. Estes fatores podem ser responsáveis pela contribuição do uso de probióticos no auxílio do controle de vários agentes patogênicos. Por outro lado, a estimulação de citocinas reguladoras como IL-10, ou mesmo citocinas de perfil TH2 como a IL-4, podem atuar de forma favorável no controle geral da resposta imune, determinando um balanço entre TH1 e TH2, diminuindo os efeitos maléficos de respostas imunes exacerbadas, ou mesmo beneficiando diretamente o hospedeiro em alguns casos específicos. A tolerância a diversas substâncias ingeridas pode, por exemplo, ser favorecida pela ação da regulação do sistema imune do aparelho digestivo. Da mesma forma, esta ação pode ser importante para o controle de processos alérgicos. Neste contexto, um estudo recente realizado por Helwig e colaboradores (2006) demonstrou a indução de citocinas pró e antiinflamatórias, como IL-10, IL-1β e TNF-α, por células mononucleares do sangue
periférico de humanos, quando induzidas por diferentes cepas de Lactobacillus e Bifidobacteria, e por Escherichia coli.
A ativação da resposta celular decorrente do estímulo por bactérias probióticas está intimamente relacionada com as moléculas presentes em suas estruturas, estando elas, principalmente, em sua parede celular. Sabe-se que, dentre as moléculas imunomoduladoras destes microorganismos estão os lipopolissacarídeos, constituintes de bactérias gram-negativas como a Escherichia coli, e os peptideoglicanos e ácido lipoteicóico, de bactérias gram-positivas como os lactobacilos e as bifidobacterias. O reconhecimento destas moléculas, por sua vez, ocorre através de receptores específicos denominados receptores do tipo toll (TLR), que reconhecem variados padrões moleculares. A ativação destes receptores, por estas moléculas, determina respostas celulares características, como a indução da expressão de citocinas, quimiocinas, outros receptores celulares e moléculas co-estimuladoras.
Estudo realizado por Vinderola e colaboradores (2005) demonstrou a participação do TLR-2 na indução de IL-6 em camundongos alimentados com Lactobacillus casei e
Lactobacillus helveticus. O tratamento intraperitonial de camundongos BALB/c com peptideoglicano, por outro lado, levou ao aumento da expressão de IL-12 e IFN-γ (Sun e
diversas cepas de lactobacilos foram capazes de induzir a expressão de TNF-α, in vitro, por
esplenócitos de camundongos BALB/c. Neste mesmo trabalho, foi verificado que ácido lipoteicóico de L. casei e, também de L. fermentum, não foi capaz de induzir a produção desta mesma citocina em camundongos deficientes em TLR-2.
A capacidade de estimular diferentes padrões de citocinas, por diferentes bactérias comensais, foi avaliada por Lan e cols. (2005). Este trabalho revelou que os ligantes de TLR-2 e TLR-4, peptideoglicano e lipopolissacarídeo respectivamente, levaram à secreção de IL-6, CCL2 e CXCL10 por células do epitélio intestinal murino. Além disso, a exposição a E. coli foi capaz de estimular a produção de CCL3, CCL4 e IFN-γ, enquanto
Lactobacillus ovatus induziu a expressão da quimiocina CCL2.
Todos os estudos mencionados comprovam a capacidade dos probióticos em estimular o sistema imunológico, ativando-o e direcionando-o. Esta propriedade tem sido considerada para o uso destes microorganismos como adjuvantes em vacinas para diversas patologias. No entanto, o amplo perfil de resposta, determinado por situações específicas, revela a importância da realização de novos trabalhos que visem a compreensão dos mecanismos característicos de cada processo.
Receptores tipo Toll e sistema imune inato
A imunidade inata é a primeira linha de defesa do sistema imunológico que permite aos organismos multicelulares uma resposta imediata contra diversos patógenos, sem exposição prévia aos mesmos.
Entre as características do sistema imune inato está a capacidade de reconhecer, pela interação com receptores celulares, estruturas presentes em vários grupos de microorganismos e distingui-los de moléculas próprias do hospedeiro, de ativar mecanismos para destruir os invasores e, ainda, de ativar e orientar uma resposta imune adaptativa que, através da expansão clonal de linfócitos, é capaz de combater especificamente microorganismos persistentes.
de antígenos, como as células dendríticas (DCs), mas também através de células ditas não profissionais, que têm o primeiro contato com os mesmos.
Embora a existência de receptores específicos para as PAMPs tivesse sido considerada por muitos anos, suas características ainda permaneciam obscuras.
Durante a elucidação do sistema imunológico de insetos, uma linhagem mutante de moscas apresentou-se susceptível à infecção por fungos. Investigações subseqüentes demonstraram que o produto gênico tratava-se de um receptor transmembrana tipo I que foi denominado toll e moléculas homólogas foram encontrados posteriormente em mamíferos, sendo então designados como receptores do tipo toll (TLR) (Vogele cols., 2003).
Entre os mamíferos são conhecidos 10 TLRs (Akira, 2003). Esta família de receptores possui uma porção extracelular rica em leucina, que é essencial para o reconhecimento molecular, e, ainda, uma porção citoplasmática altamente conservada (Baratin e cols., 2005), através da qual um grupo de proteínas, denominadas adaptadoras, os conectam às vias de sinalização intracelular (Vogele cols., 2003). Assim, a ligação de componentes dos microorganismos aos TLRs induz a ativação das proteínas adaptadoras que desencadeia à rápida ativação dos fatores de transcrição gênica, como o NF-κB e os IRFs que, uma vez ativados, translocam-se para o núcleo e induzem a expressão de vários genes envolvidos na resposta imunológica, incluindo genes que codificam citocinas, quimiocinas, moléculas de MHC e co-estimuladoras (Miettinene cols., 2000; Medzhitov, 2001). Por fim, a expressão destas moléculas direcionará a resposta inflamatória.
Vários são os ligantes para TLR. Entre as PAMPs, os lipopolissacarídeos (LPS) são grandes indutores de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF- , IL-6, e IL-12, além de substâncias inflamatórias como leucotrienos, prostanóides e óxido nítrico em monócitos. Estudos mostraram que TLR-4 associado a uma glicoproteína de superfície, CD14, e também a uma outra proteína, MD-2, é responsável pelo reconhecimento do LPS (da Silva e cols., 2001).
Um grande número de observações sugere ainda que TLR-1 e TLR-6 interagem com TLR-2, influenciando diretamente nas respostas primariamente mediadas por TLR-2. A expressão de TLR-1, por exemplo, aumenta a ativação de NF- B dependente de TLR-2 em resposta a Neisseria meningitidis (Wylliee cols., 2000). Além disto, células deficientes em TLR-6, bem como deficientes em TLR-2, são incapazes de produzir citocinas em resposta ao zimosam (Takeuchie cols., 2001).
Outros estudos utilizando DNA bacteriano com seqüências não metiladas CpG, e mais recentemente AT, revelaram o papel de TLR-9 no reconhecimento destes e indução de uma resposta protetora (Shimosato e cols., 2005). Além disto, um componente do flagelo da bactéria Listeria monocytogenes foi identificado como ligante para receptor TLR-5, induzindo ativação de células epiteliais e macrófagos murinos (Hayashie cols., 2001).
Além destes ligantes, fitas duplas de RNA e análogos sintéticos de imidazoquinolina também foram caracterizadas como importantes substâncias reconhecidas por TLR-3 e TLR-7 respectivamente (Alexopouloue cols., 2001; Hemmie cols., 2002).
A capacidade de ativar diferentes formas de resposta a partir do reconhecimento de diversas moléculas conservadas provém das variadas vias de sinalização a que está ligado cada receptor. Como forma de simplificar a visualização dos mecanismos de sinalização intracelular, estas vias podem ser dividas em dois grupos: dependentes e independentes de MyD88 (Akira & Hoshino, 2003). A interação entre os diversos receptores TLR e a molécula adaptadora MyD88 desencadeia uma série de novas interações intermoleculares no interior celular que, por fim, determina a translocação de fatores de transcrição gênica, direcionando a expressão de diversas citocinas, assim como a ativação de outras atividades celulares. Do mesmo modo, receptores TLR que não estão conectados a esta molécula desempenham suas funções utilizando, no entanto, outras moléculas adaptadoras (Vogel e cols., 2003) .
mecanismos de sinalização estarem diretamente relacionados à participação de MyD88, muitas outras proteínas conectoras contribuem para o processo até à mensagem final, tornando, assim, a resposta à ativação destes receptores extremamente complexa (Vogele cols., 2003).
Alguns trabalhos têm demonstrado a participação dos TLRs nas mais diversas patologias, caracterizando a importância da ativação dos mesmos para a indução de citocinas e quimiocinas relevantes à eliminação dos agentes patogênicos. TLR-4, por exemplo, demonstrou grande contribuição no controle da infecção por Leishmania major
em camundongos, uma vez que sua ausência determinou a diminuição na produção de óxido nítrico induzida pelo patógeno (Kropf e cols., 2004). A expressão gênica de quimicionas em camundongos deficientes em TLR-4, infectados por este mesmo protozoário, foi avaliada por Antoniazi e colaboradores (2004). Neste trabalho, não foram evidenciadas diferenças para as quimicionas CCL2, CCL5, CXCL10 e CCL3/MIP-1 , entre camundongos deficientes ou não em TLR-4. Em outro estudo, utilizando camundongos deficientes, este receptor mostrou-se importante na indução da imunidade mediada por célula e resistência à infecção por Brucella abortus. Sua participação, neste caso, foi essencial para a indução da expressão de TNF-α e IL-12 por este patógeno (Campose cols., 2004). Por outro lado, camundongos deficientes em TLR-2 demonstraram-se susceptíveis à infecção ao Staphilococcus aureus, evidenciando sua importância para o direcionamento de uma resposta imune eficaz (Takeuchie cols., 2000).
A interação entre as moléculas ligantes e os TLRs correspondentes pode, além de determinar a expressão de citocinas e quimiocinas específicas, induzir ativação, modulação e proliferação de alguns tipos celulares, contribuindo de forma significativa para a estimulação e controle do processo inflamatório.
ligantes de TLR-2, o que promove o restabelecimento das funções das células T reguladoras, anteriormente expandidas pela ativação deste receptor, promovendo um controle mais eficaz da resposta imune desencadeada pelo agente patológico.
Outro estudo recente, sobre a participação dos TLRs nos mecanismos de ativação de células T CD4, demonstrou que a geração de células T de memória não é suficientemente induzida apenas por uma resposta primária por células T. Foi verificado, então, que a ativação de vias de sinalização por TLR é essencial para o desenvolvimento de células T de memória (Pasare & Medzhitov, 2004). Além disto, foi observado que a ativação de mecanismos dependentes de TLR confere, às células dendríticas, capacidade de estimular células NK (Zanoni e cols., 2005). Estes trabalhos comprovam a participação destes receptores no controle da resposta inflamatória.
É interessante observar que os perfis de resposta, originados a partir da ativação de diferentes receptores, podem se sobrepor, desencadeando aumento ou diminuição na resposta final. Dentro deste contexto, um estudo realizado por Strominger e Re (2004) buscou avaliar a resposta imune após o estímulo concomitante de vários receptores TLR, através da dosagem de citocinas. Este estudo demonstrou, através do uso de ligantes purificados, que a indução da expressão de IL-10 por TLR-2, em células dendríticas humanas, bloqueou a expressão de citocinas de perfil TH1, especificamente induzidas por TLR -3 e -4, como IL-12 e IFN-γ. Por outro lado, a indução da citocina reguladora IL-10 não impediu o estímulo das citocinas IL-15 e IFN-β.
Considerando os diversos trabalhos já realizados para a compreensão da ação dos receptores TLR, pode-se verificar a grande importância destes dentro do sistema imunológico como um todo. Apesar disto, a imensa variedade de respostas induzidas por estes receptores torna o estudo de suas atividades extremamente necessário para a compreensão dos mecanismos específicos decorrentes de diferentes processos patológicos.
Participação das citocinas e quimiocinas na resposta imunológica
A expressão das citocinas é estritamente regulada. Em geral, não se observa uma produção constitutiva destas moléculas, sendo necessária uma ativação celular para se tenha quantidade suficiente para execução de suas atividades biológicas. Outras características desta família são extremamente importantes para o controle rigoroso da resposta imunológica. Além de expressadas de forma transitória, elas são capazes de atuar em diferentes tipos celulares, e em sinergismo ou antagonismo a outras citocinas. Mais de uma citocina pode, ainda, atuar ao mesmo tempo em uma mesma célula. A ligação específica e de alta afinidade com os receptores celulares é também outra propriedade deste complexo.
As ações das citocinas podem ser locais ou sistêmicas. Em grande parte, estas proteínas agem próximo ao seu local de excreção, tanto em células adjacentes quanto na célula de origem. Entretanto, em grandes quantidades podem atingir a circulação e atuar de forma sistêmica, o que é raramente desejável.
Ao se ligarem em seus receptores celulares, a maior parte das citocinas desencadeia alterações na expressão gênica destas células, resultando na ativação de outras funções, proliferação celular ou mesmo produção de outras citocinas. Assim, este grupo de moléculas tem importante participação na mediação e regulação das respostas imunes inatas e adaptativas e, ainda na hematopoiese.
Entre as que participam da resposta imune inata estão o TNF- , a IL-1, a IL-12, a IL-10, o IFN-γ, as quimiocinas e outras como IL-6, IL-15 e IL-18. Dentre estas, destacam-se o TNF- , o IFN-γ, a IL-10, a IL-4 e algumas quimiocinas, que serão objetos deste
estudo.
gram-negativo, e suas funções são influenciadas pelos tipos de receptores aos quais irá se ligar na célula-alvo (Yoshimurae cols., 1997).
Embora não apresentem função estimuladora celular, as quimiocinas desempenham importante função na resposta imune. Elas são responsáveis pelo recrutamento e migração dos tipos celulares envolvidos no processo inflamatório e, conseqüentemente, na eliminação do patógeno ou antígeno associado. Podem também ser produzidas constitutivamente por várias células de diversos tecidos e, assim, regulam o tráfego celular normal do sistema imune. Entretanto, em resposta a estímulos externos, os leucócitos são induzidos a produzir quimiocinas que determinarão o fluxo de células inflamatórias para os locais específicos (Lee cols., 2004).
As quimiocinas compreendem um grupo de moléculas que pode ser dividido em dois outros grupos principais: as famílias CXC e CC. Duas outras classes de quimiocinas foram também descritas: C e CX3C. Esta nomenclatura foi estabelecida com base no arranjo dos resíduos N-terminais de cisteína comuns às moléculas de quimiocinas, no intuito de facilitar a identificação das mesmas. Desta forma, a família CXC, por exemplo, possui um aminoácido entre os dois resíduos de cisteína e a família CC possui os dois resíduos adjacentes. A classe C, por sua vez, possui apenas um resíduo de cisteína, enquanto a classe CX3C possui 3 aminoácidos entre os resíduos de cisteína (Zlotnik & Yoshie, 2000).
Em uma reação inflamatória, as quimiocinas CXC atuam principalmente sobre os neutrófilos e as CC, sobre monócitos, linfócitos e eosinófilos. As quimiocinas de ambos os grupos são produzidas por leucócitos e outros tipos celulares como células endoteliais, epiteliais e fibroblastos. A expressão pode ser induzida por microorganismos e/ou mesmo por citocinas como TNF e IL-1. Algumas quimiocinas da família CC podem, ainda, ser produzidas por células T ativadas por antígenos (Onoe cols., 2003).
leucócitos (Marfaing-Kokae cols., 1995), e CXCL10, pelo deslocamento células NK para os sítios de resposta (Walde cols., 2006).
Alguns trabalhos têm evidenciado a importância das quimiocinas para o controle de algumas patologias, bem como demonstrado o aumento de suas concentrações em situações específicas. CCL2, por exemplo, encontra-se em concentrações elevadas na pancreatite. A quimiocina CCL5, por sua vez, contribui fortemente para o desenvolvimento e manutenção da asma crônica, por fungos, em camundongos, através do recrutamento seletivo de leucócitos e eosinófilos (Schuh e cols., 2002). Por outro lado, estudo realizado por Antonelli e colaboradores, em 2004, demonstrou a prevalência de altas concentrações de CXCL10 circulante em pacientes com hipotiroidismo (Antonellie cols., 2004). Vasquez e Soong (2006) verificaram que a injeção local de CXCL10 em lesões de infecção por
Leishmania amazonensis reduz significativamente o número de parasitas, mostrando o papel protetor desta quimiocina para esta doença.
Quimiocinas Nomenclatura
Atual Nomenclatura antiga
Receptor Células Recrutadas
CCL2 MCP-1 CCR2 Monócitos, células NK
CCL3 MIP-1α CCR1, CCR5 Misto de leucócitos
CCL4 MIP-1β CCR5 Células T, DCs,
Monócitos e NK
CCL5 Rantes CCR1, CCR3 ,
CCR5 e CCR9
Misto de leucócitos
CCL7 MCP-3 CCR1, CCR2, CCR3 Misto de leucócitos
CCL8 MCP-2 CCR3, CCR5 Misto de leucócitos
CCL13 MCP-4 CCR2, CCR3 Misto de leucócitos
CXCL8 IL-8 CXCR1,CXCR2 Neutrófilo
CXCL10 IP-10 CXCR3 Células NK
Tabela 1. Quimiocinas – Revisto por Haringman e cols. (2004) ; Rollins (1997); Rottman (1999).
Entre as citocinas, o IFN-γ tem papel destacado e é considerada a principal citocina
compostos. Além disso, o IFN-γ estimula a produção de diversas proteínas como moléculas
de MHC de classe 2 (Collinse cols., 1984). Esta citocina promove, ainda, a diferenciação de células T CD4+ TH0, para o subtipo TH1 e inibe, desta forma, a proliferação de células TH2 (Gajewski & Fitch, 1988). Por este motivo e por ser produzida também por células TH1, sua presença tem sido utilizada como marcador do tipo de resposta imunológica celular.
Outra citocina tem se apresentado como fundamental para o controle da resposta inflamatória: a IL-10. Esta interleucina é uma citocina reguladora, capaz de inibir a ação de macrófagos e células dendríticas ativados, regulando e controlando as reações da imunidade inata e adaptativa (Cassatellae cols., 1993). Sua função pode ocorrer através da inibição da produção de IL-12 e outras citocinas como IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α (de Waal e cols.,
1991). Sua participação no controle de diversas patologias tem sido amplamente estudada. A indução da expressão desta citocina por probióticos, por exemplo, tem se mostrado importante no controle de patologias como a colite em murinos (Die cols., 2005)
Entre as citocinas participantes de uma resposta TH2, a IL-4 é considerada como característica deste processo. Esta citocina é capaz de inibir a ativação de macrófagos mediada por IFN-γ e também promover a diferenciação de células T TH0 para o subtipo TH2. Este efeito foi verificado por Chatelain e Coffman, em 1992, em camundongos infectados por Leishmania major (Chatelain e cols., 1992). Além disto, pode estimular a troca de classe de imunoglobulinas de células B para o isotipo IgE (Lebman & Coffman, 1988).
.
JUSTIFICATIVA
Justificativa
A busca por vacinas eficazes contra as mais diversas patologias que afligem os seres humanos tem sido um dos maiores desafios para a ciência. As tentativas de desenvolvimento de formulações eficientes contribuíram para o crescimento do conhecimento sobre os probióticos, um dos mais promissores adjuvantes para vacinas profiláticas. Diversos estudos demonstram o papel destes probióticos no direcionamento de uma resposta imunológica efetiva, seja ativando o sistema fagocitário mononuclear, seja induzindo a produção de citocinas específicas.
Para se avaliar a capacidade de um probiótico em modular a resposta imune, é interessante saber previamente o tipo de resposta esperada para a indução de um perfil de resistência a um determinado patógeno.
Para o caso da leishmaniose, principal alvo de estudo de nosso laboratório, uma estratégia utilizada é a indução de uma resposta TH1 através do uso de adjuvantes nas vacinas.
Dados obtidos em nosso laboratório mostraram que o Lactobacillus delbrueckii
UFV H2b20 induziu a produção de citocinas características de uma resposta TH1 como IL-12, IFN-γ, TNF-α por células do sistema mononuclear do sangue periférico de voluntários
normais. Além disto, neste mesmo trabalho, realizado por Castanheira e colaboradores (2007), o Lactobacillus delbrueckii foi capaz de ativar macrófagos infectados com L. amazonensis e primar células T virgens, induzindo a diferenciação em linfócitos TH1 específicos.
Os estudos supracitados demonstraram a importância de se caracterizar, de forma mais aprofundada, os mecanismos envolvidos na indução diferencial da resposta imunológica pelas bactérias probióticas, incluindo o L. delbrueckii.
Uma avaliação correta de tais mecanismos deve considerar a participação dos receptores envolvidos no reconhecimento do adjuvante e suas vias de sinalização, assim como as estruturas moleculares responsáveis pela ativação destes receptores.
Entre os receptores celulares responsáveis pelo reconhecimento dos patógenos têm se destacado, em estudos recentes, os TLRs.
A estimulação destes receptores por determinadas moléculas associadas a patógenos é capaz de levar à produção específica de citocinas, que, por sua vez, determinarão o sentido da resposta e os tipos celulares envolvidos.
Alguns trabalhos têm revelado, por exemplo, a indução de IL-10, IL-6, TNF-α,
IFN-γ, CXCL10 e IL-12 por TLRs, além de demonstrar a participação destes no controle de patógenos como Leishmania sp e Brucella sp. (Antoniazi e cols., 2004; Campos e cols., 2004; Heinzele cols., 1991).
Diante do exposto, optou-se por avaliar a capacidade do Lactobacillus delbrueckii
OBJETIVOS
Objetivos
Objetivo Geral
Este trabalho tem como objetivo geral analisar a capacidade do Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 em induzir, in vitro, uma resposta TH1 efetiva em esplenócitos de camundongo, bem como avaliar a possibilidade do envolvimento de TLRs, 2 e TLR-4, nesta indução.
Objetivos Específicos
Verificar, in vitro, a indução, por Lactobacillus delbrueckii autoclavado, extrato de Parede de L.delbrueckii e fração sem parede, da produção de uma resposta TH1 por esplenócitos de camundongos BALB/c, C57BL/6, C3H/HeJ, C3H/HeN, TLR-2 -/-, através da dosagem das citocinas IFN- , TNF- e IL-4.
Verificar a transcrição de RNA mensageiros para quimiocinas e citocinas (IFN- , IL-10, CCL2, CCL5 e CXCL10), em esplenócitos dos camundongos BALB/c, C57BL/6, C3H/HeJ, C3H/HeN, TLR-2 -/- induzidos, in vitro, por Lactobacillus delbrueckii
autoclavado, em diferentes dosagens.
Avaliar o efeito da variação da dose dos estímulos utilizados na indução da produção e transcrição de RNAm de citocinas e quimiocinas por esplenócitos dos camundongos citados.
MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
Animais Experimentais
Foram utilizados camundongos fêmeas e machos, com idade média entre cinco e oito semanas, das seguintes linhagens: BALB/c, C57BL/6, C3H/HeN, C3H/HeJ, TLR-2 -/-. Os animais BALB/c e C57BL/6 eram provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto. Os demais foram adquiridos na Fundação Oswaldo Cruz (MG). Os animais eram mantidos em estante com sistema de filtração de ar, recebendo água e ração
ad libidum.
Microorganismos
Foi utilizado o microorganismo Lactobacillus delbrueckii estirpe UFV H2b20 fornecido pelo Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais. As culturas deste foram trazidas em meio Ágar + MRS (De Man, Rogosa e Sharp, Merck, São Paulo, Brasil) e repicadas duas vezes em caldo MRS (De Man, Rogosa e Sharp, Difco Becton, Dickinson and Company, USA) sendo incubadas por dezoito horas a 37 °C. Posteriormente as culturas foram congeladas em leite desnatado reconstituído (LDR) a 12% (Molico, Nestlé, São Paulo, Brasil) a uma temperatura de -70 °C.
Obtenção do Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 Íntegro
As culturas ativadas eram adicionadas em tubos estéreis de polipropileno de fundo cônico com capacidade para 15ml (Falcon-Becton Dickinson Labware and Company Franklin Lakes NJ, USA) e centrifugadas a 2740 x g por 23 minutos, a 4°C. Desprezava-se
o sobrenadante e lavava-se o sedimento por duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril. Após este procedimento os microorganismos eram ressuspendidos para o volume original de PBS (10mL). Retirava-se uma alíquota da suspensão de bactérias e a diluía-se 1:10 em PBS, para leitura em espectrofotômetro a 550nm. Utilizando-se o valor de transmitância, calculava-se a quantidade total de bactérias existentes e ajustava-se a concentração de bactérias de modo a se obter 1x1010 UFC/ml. A cultura era, então, autoclavada a 121°C, por 15 minutos. A preparação era resfriada à temperatura ambiente e
aliquotada. Em seguida, as preparações eram armazenadas a uma temperatura de -70°C, até sua utilização para realização dos experimentos.
Obtenção do Extrato de Parede do Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20
As culturas, depois de descongeladas e repicadas duas vezes em caldo MRS, eram lavadas por duas vezes em PBS estéril, como descrito acima. A seguir, ressuspendiam-se os microorganismos em 10mL de PBS e retirava-se uma alíquota da cultura, para quantificação das bactérias por leitura espectrofotométrica, conforme já descrito. Após ajuste da concentração, procedia-se autoclavação a 121°C, por 15 minutos, seguida do
resfriamento da preparação à temperatura ambiente.
O material obtido era centrifugado três vezes a 2740 x g, por 20 minutos, a 4° C, em
tampão HEPES 50mM, pH 7,0 (Sigma – Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA), contendo 20mM de CaCl2 (Reagen, RJ, BR). Após este procedimento, realizava-se novo
processo de lavagem utilizando tampão fosfato 50mM, pH 7,0 (Synth-Labsynth, SP, BR; VETEC-Vetec Química Fina Ltda, RJ, BR). A seguir, o sedimento era ressuspendido nesta mesma solução e a suspensão incubada a 30 °C por duas horas. Utilizou-se a razão de 10
centrifugada a 12.000 x g durante cinco minutos, a 4°C . O sobrenadante era rotulado como
“extrato de parede”. O sedimento, era rotulado como “Lactobacilo sem parede” e ressuspendido em PBS de modo a atingir uma concentração igual a 1x1010 UFC/mL. Ambos eram armazenados em uma temperatura igual a -70 °C, até o momento de utilização
nos experimentos (Tsakalidoue cols., 1999).
Para possibilitar as análises moleculares por espectrometria de infravermelho, amostras de Extrato de Parede foram concentradas por centrifugação a vácuo (Speed-Vac), por 4 (quatro) horas
Identificação da Molécula Imunoestimuladora Presente no Extrato de Parede do L. delbrueckii
Detecção da Presença de Carboidratos por Dot-Blot
A análise da presença de carboidratos foi realizada através da aplicação das amostras do extrato de parede do Ldmc em membrana de PVDF (Gelman Sciense) e posterior incubação em 1mM de MnCl2 em presença de 50mg/mL de ConA (concanavalina
A) (Bouviere cols., 1985).
Detecção da Presença de Carboidrato e Lipídeos por Ensaio Enzimático
Cromatografia de Camada Delgada
Para identificação das características da molécula imunoestimuladora presente no Extrato de Parede, foi realizada cromatografia em camada delgada utilizando-se placas de sílica e mistura dos eluentes etanol, acetato de etila e água em diferentes proporções. Para revelação, as placas eram incubadas em câmara de iodo por 18 horas.
Espectrometria de Infravermelho
Para identificação dos grupos moleculares presentes na molécula imunoestimuladora, o Extrato de Parede, concentrado por centrifugação a vácuo, foi analisado por espectrometria de infravermelho, após incorporação da amostra em nujol e pastilhas de KBr.
Experimentos de Imunoestimulação in vitro e Isolamento de células mononucleares
em que se verificou o aumento da produção destas citocinas após estes intervalos de incubação.
Dosagem de Citocinas
Foram dosadas as citocinas IL-4, e IFN- pelo método imunoenzimático ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), tipo captura.
Para dosagem dessas citocinas foram utilizadas placas de 96 poços (Nunclon Maxisorp-Nalge, Nunc. International), que eram sensibilizadas com o anticorpo monoclonal contra a citocina de interesse e deixadas a 5°C por dezoito horas. Logo após,
procedia-se o bloqueio das placas com PBS suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) por 30 minutos a 25°C. Decorrido esse tempo, os sobrenadantes das culturas, bem
como o padrão da citocina de interesse, eram adicionados às placas, seguindo-se incubação por duas horas, a 25°C. Após a adição do segundo anticorpo, seguia-se nova incubação por uma hora a 25°C. Na etapa seguinte, o anticorpo ligado à enzima peroxidase era adicionado, com incubação também a 25°C durante uma hora. Adicionava-se, então, o substrato para a peroxidase, juntamente com o cromóforo, para a formação de um produto colorido, facilmente detectável através da leitura da absorbância. Entre cada etapa, as placas eram submetidas à lavagem em solução salina com 0,5% de Tween 20 (Polioxietileno sorbitano monolaurato-Labsynth Ltda., Diadema-SP, Brasil).
Para dosagem de 4, foram utilizados os anticorpos monoclonais 11B11 (anti IL-4), e para captura o BVD-6 biotinilado para reação enzimática. Como conjugado foi utilizada estreptoavidina-peroxidase (Zymed Laboratories, Inc. - So. São Francisco, CA, EUA). A dosagem da citocina IFN- foi feita utilizando-se o anticorpo monoclonal de captura R46-A2, e como segundo anticorpo, IgG de coelho anti IFN- de camundongo. O conjugado utilizado foi o anti-IgG de coelho peroxidase (Zymed Laboratories, Inc. - So. São Francisco, CA, EUA). A revelação dos ensaios foi feita com o cromóforo ABTS (Sigma Chemical Co. - St. Louis, MO, EUA), tendo como substrato H2O2 30 volumes. A
EUA). O limite de detecção foi de 15,6 pg/mL para IL-4 e IFN- . Os anticorpos, R46-A2, IgG de coelho anti- IFN- , 11B11 e BVD-6 biotina são de produção própria do laboratório.
Bioensaio de TNF
Para dosagem de TNF, foi realizado o bioensaio com linhagem de células WEHI previamente descrito por Lattime e cols. (1988). As amostras e o padrão foram diluídos em meio para WEHI, contendo RPMI pH 7,2 (Sigma Chemical Co. – St. Louis, MO, USA) acrescido de 10% de SFB, 2 mM de L-glutamina, 100 µg/mL de sulfato de streptomicina,
100 unidades/mL de penicilina G e 1,0 mL de solução de aminoácidos não essenciais 100 X concentrado (890 mg/mL de alanina, 1320 mg/mL de asparagina, 1330 mg/mL de L-ácido aspártico, 1470 mg/mL de L-L-ácido glutâmico, 750 mg/mL de L-glicina, 1150 mg/mL de L-prolina e 1050 mg/mL de L-serina). O padrão utilizado foi TNF recombinante (rTNF) murino (R&D Systems Inc. – Mineapolis, MN, USA) na concentração de 9,5 ng/mL. Após as diluições descritas pela técnica, foram adicionados 1x106 células WEHI-164, tratadas com actinomicina D (Sigma Chemical Co. – St. Louis, MO, USA), à placa onde se realizava o bioensaio, seguindo-se incubação a 37°C / 5% de CO2, por 24h. Após esse
período, foi adicionado MTT (Sigma Chemical Co. – St. Louis, MO, USA) a 2,5 mg/mL como metabólito para as células WEHI para determinação indireta de TNF-α, e as placas
foram novamente incubadas, sob as mesmas condições, durante 4 h. A seguir, adicionou-se SDS 10% (VETEC, Rio de Janeiro, RJ, BR) em HCl 0,01M, e a placa foi incubada por 16h. Procedeu-se, então, à leitura no leitor de ELISA (Emax - Molecular Devices - Sunnyvale, CA, EUA), em filtro de 570 nm. A curva padrão foi submetida à regressão log-logit, e o limite de detecção foi de 0,1 pg/mL.
Coleta de células e extração de RNA de células induzidas in vitro
fundo de cada poço se soltassem da placa. Utilizando-se pipetador automático, o PBS era homogeneizado nos poços para retirada completa das células aderidas.
As amostras eram transferidas (PBS + Células) para tubos estéreis de polipropileno de fundo cônico com capacidade para 15ml (Falcon-Becton Dickinson Labware and Company Franklin Lakes NJ, USA) e uma alíquota era retirada para contagem de células. A seguir, as amostras eram novamente centrifugadas por 10 minutos, 4 °C e 210 x g. O sobrenadante era, então, descartado. Para cada 1 x 106 células, por amostra, era adicionado 120 µL de solução desnaturante. A partir disto, procedia-se a extração de RNA das amostras, utilizando o kit de extração de RNA (RNAgents® total RNA Isolation System - Promega), segundo protocolo do próprio fabricante.
Para quantificar o RNA, realizou-se uma diluição de 2 µL do mesmo em 500 µL de água DEPC. As amostras foram lidas em espectrofotômetro a 260 nm. Para avaliar a pureza das amostras em relação à concentração de proteínas, fazia-se também uma leitura em 280 nm. Uma relação de leitura 260nm /280 nm superior a 1,8 indicava um bom grau de pureza. A concentração de RNA era, então, determinada pelo cálculo [RNA] (µg/ µL) = Abs 260 nm x 40 x 250
1000
O RNA total obtido de cada amostra era armazenado em tubos apropriados a -70
°C.
Síntese de cDNA por RT-PCR
Após a quantificação, os RNAs das amostras eram, então, submetidos à transcrição reversa para obtenção do cDNA, utilizando reagentes do kit Superscript® (Invitrogen) e seguindo instruções do fabricante.
Amplificação por PCR
programas de amplificação com número de ciclos e temperatura de anelamento específicos para cada primer utilizado, como descrito na tabela abaixo.
Citocina Primers Temperatura de
Anelamento
Número de Ciclos
5’- ACCAGCTGGACAACATACTGCT-3’ IL-10
5’- CTTGTAGACACCTTGGTCTTGG -3’ 54 °C 30
5’-CCACGTCAAGGAGTATTTCTACACC-3’ Rantes/CCL5
5’ –CTGGTTTCTTGGGTTTGCTGTG’-3’ 54 °C 26
5’- GTTGGATACAGGCCAAGACTTTGTTG -3’ HPRT
5’- GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC -3’ 58 °C 30 5’- GGATTCACAGAGAGGGAAAAATGG -3’
MCP-1/CCL2
5’- CACTCACCTGCTGCTACTCATTCA -3’ 62 °C 30
5’- ACACTGCATCTTGGCTTTGC -3’ IFN-γ
5’- CTTGCTGTTGCTGAAGAAGG -3’ 47 °C 30
5’- TGAGCAGAGATGTCTGAATC -3’ IP-10/CXCL10
5’- TCGCACCTCCACATAGCTTACAG -3’ 62 °C 32
Tabela 2. Primers de citocinas e quimiocinas
Visualização dos Produtos da PCR e Quantificação Relativa do RNA
Análise Estatística
Para avaliar a diferença estatística entre as variáveis, utilizaram-se os testes t de Student
RESULTADOS
Resultados
A capacidade de induzir a produção, in vitro, de citocinas características de uma resposta imune do tipo 1, em camundongos BALB/c, foi verificada em nosso laboratório por Castro (2005) . Com o intuito de verificar se espécies distintas de camundongos apresentariam variação nos perfis de respostas imunológicas induzidas por Lactobacillus delbrueckii UFV H2B20, optou-se por estudar a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias pelas espécies BALB/c, C57BL/6 e C3H/HeN.
Esplenócitos murinos destas linhagens foram, então, estimulados com L. delbrueckii
morto pelo calor (Ldmc), para posterior dosagem das citocinas IFN-γ, IL-4, TNF-α e IL-10.
A avaliação da produção destas, utilizando as metodologias de ELISA, Bioensaio e RT-PCR, procurou demonstrar, também, a influência do uso de doses crescentes do estímulo.
Inicialmente, pôde-se constatar que o estímulo Ldmc foi capaz de induzir a produção de IFN-γ e TNF-α tanto em camundongos BALB/c, como verificado
anteriormente por Castro (2005) quanto nas linhagens C57BL/6 e C3H/HeN (Fig. 1 e Fig. 2).
Os resultados encontrados permitiram observar que para todas as linhagens, a produção de IFN-γ (Fig.1) foi mais elevada nas doses de 0,1, 0,5, 1, 5 e 10
microorganismos por esplenócito, com picos na dose 0,1 e 1, havendo um decaimento significativo com o aumento das doses. Por outro lado, para TNF-α, embora o padrão de
resposta tenha seguido a mesma tendência que IFN-γ, é possível verificarmos que ocorre
uma maior variabilidade em sua produção (Fig.2).
Fig. 1 - Produção de IFN-γγγγ por esplenócitos em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes
dosagens, por camundongos de diferentes linhagens
Fig. 2 - Produção de TNF-α α α α por esplenócitos em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens, por camundongos de diferentes linhagens
Para avaliar a importância da dose na indução da resposta imune frente ao lactobacilo, decidiu-se por selecionar duas doses que pudessem demonstrar o efeito dose dependente para a indução das citocinas e, assim, dar continuidade ao estudo. Para tanto, foram escolhidas as doses 1:1 e 150:1, visto as diferenças observadas nas figuras 1 e 2. Uma comparação estatística entre estas doses mostrou uma diminuição significativa da produção de IFN-γ após o aumento de 1:1 para 150:1. Este fato comprovou o decaimento
da indução desta citocina de forma dose dependente, mostrando a importância desta relação para o estímulo por L. delbrueckii (Fig.1). Para a citocina TNF-α, as diferenças entre as
concentrações obtidas para estas doses demonstraram que, nas linhagens BALB/c e C3H/HeN, a produção é maior na dose 1:1. Por outro lado, em camundongos C57BL/6 não foi possível esta observação, embora o perfil de resposta tenha se mantido (Fig.2).
Fig. 3 - Produção Relativa de RNAm de IL-10
Esplenócitos de camundongos BALB/c, C57BL/6, C3H/HeN foram estimulados com Ldmc nas doses indicadas. Após 48 horas, as células foram coletadas das placas e o RNA total das células foi extraído para posterior transcrição reversa e amplificação do cDNA por PCR. As amostras obtidas foram separadas em gel de poliacrilamida e as bandas foram analisadas, depois de fotografadas, por meio de software específico. Os valores das bandas foram corrigidos através da divisão pela banda correspondente de HPRT (RNA de proteína constitutiva). Posteriormente, os valores obtidos para as amostras estimuladas foram divididos pelos valores dos respectivos controles de cada linhagem. Os dados correspondem às médias e aos desvios padrão de 3 experimentos.
Os resultados obtidos para as linhagens BALB/c, C57BL/6 e C3H/HeN, mostraram que a estimulação por L. delbrueckii induziu de forma distinta a transcrição de IL-10. Esta diferença pode ser determinada ou influenciada pela prevalência de receptores celulares responsáveis pelo reconhecimento de moléculas presentes em patógenos, entre os quais se destacam os receptores tipo Toll.
Para avaliar a importância dos receptores TLR-2 na indução da resposta imune pelo estímulo estudado, foram realizados experimentos com camundongos deficientes para estes receptores, TLR-2 -/-, e seus respectivos controles, C57BL/6. Foram, assim, dosadas as citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-4 de sobrenadante de cultura de esplenócitos induzidos por
Ldmc nas doses 1:1 e 150:1. Com o objetivo de caracterizar esta participação de forma mais completa, foi avaliada, também, a transcrição gênica de algumas citocinas e quimiocinas por RT-PCR. Para isto, foram selecionadas as citocinas IFN-γ e IL-10, e as quimiocinas
CCL5, CCL2 e CXCL10. Ao selecionar estas quimiocinas tentou-se, mais uma vez, minimizar os custos e, ao mesmo tempo, verificar a importância do receptor para o recrutamento seletivo de leucócitos induzidos por Ldmc.
Entre estas duas linhagens pôde-se verificar diferença significativa na produção da citocina IFN-γ, particularmente para a dose 1:1, onde se observou maior produção entre os camundongos C57BL/6. Por outro lado, foram verificadas diferenças estatísticas entre as doses 1:1 e 150:1 para as duas linhagens, assim como entre a menor dose, 1:1, e o controle (Fig.4).
Para TNF-α, por sua vez, não foi verificado diferença significativa entre as doses,
Fig. 4 - Produção de IFN-γγγγ por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens.
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos C57BL/6 e TLR-2-/- foram estimulados, com Ldmc, nas doses indicadas. Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de IFN-γ por ELISA de captura. Os dados representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença estatística (p<0,05) em relação ao controle. (**) e (+) indicam diferenças estatísticas entre as doses. (^) indica a diferença estatística entre as linhagens.
Fig. 5 - Produção de TNF-αααα por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta ao estímulo L.
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos C57BL/6 e TLR-2-/- foram estimulados, com Ldmc, nas doses indicadas. Após 24 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de TNF-α por Bioensaio. Os dados representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença estatística (p<0,05) em relação ao controle.
Já a análise da indução de mensagem para IFN-γ (Fig.6) demonstrou resultados
diferentes dos encontrados para a expressão da proteína (Fig.4). Neste caso, pôde-se perceber que a ausência do receptor TLR-2 levou a um aumento na transcrição de RNAm para IFN-γ, para ambas as doses consideradas. Por outro lado, os dados obtidos para as
duas linhagens não permitiram verificar diferença entre as doses, apesar de mostrarem o mesmo perfil de decaimento observado na figura 4.
Para a citocina IL-10, foi verificado que os camundongos TLR-2 -/- apresentaram RNAm em níveis superiores ao controle na dose 1:1, diferentemente dos camundongos C57BL6. O aumento da dose de Ldmc, por outro lado, desencadeou o aumento da mensagem para esta citocina em ambas as linhagens. É interessante ressaltar que, embora não tenha sido encontrada diferença estatística entre os dados, a ausência deste receptor levou, aparentemente, ao aumento da citocina IL-10 (Fig.6).
Considerando-se a quimiocina CCL2, pôde-se constatar que apenas em camundongos C57BL/6 ocorreu uma produção significativa de RNAm. Esta alta produção só foi observada na dose 1:1, havendo grande decréscimo na dose 150:1 (Fig.6). Entretanto, não se observou diferença significativa entre as doses, possivelmente devido ao número de experimentos realizados terem sido relativamente pequeno. Assim, estes dados indicam que a ausência de TLR-2 pode levar à diminuição na transcrição de RNAm para CCL2, uma vez que camundongos C57BL/6 apresentam produção significativamente maior que a linhagem TLR-2 -/-.
A produção relativa de RNAm para a quimiocina CCL5, também foi averiguada. Para esta quimiocina não se observou diferença entre as doses 1:1 e 150:1, assim como não foi verificada diferença significativa entre as linhagens (Fig.6).
A avaliação da mensagem para a quimiocina CXCL-10 mostrou maior transcrição gênica em camundongos C57BL/6, não havendo diferença para as doses 1:1 e 150:1 de
Fig. 6 - Produção Relativa de RNA de citocinas e quimiocinas de camundongos C57BL/6 e TLR-2
transcrição reversa e amplificação do cDNA por PCR. As amostras obtidas foram separadas em gel de poliacrilamida e as bandas foram analisadas, depois de fotografadas, por meio de software específico. Os valores das bandas foram corrigidos através da divisão pela banda correspondente de HPRT (RNA de proteína constitutiva). Posteriormente, os valores obtidos para as amostras estimuladas foram divididos pelos valores dos respectivos controles de cada linhagem. Os dados correspondem às médias e aos desvios padrão de 3 experimentos. Os dados correspondem às médias e desvio padrão de 3 experimentos. (*) e (**) indicam diferença estatística (p<0,05) entre os dados representados pelas colunas.
A participação do receptor TLR-4 também foi avaliada utilizando-se os mesmos parâmetros considerados para TLR-2. No entanto, para este caso foram utilizados, nos experimentos, animais C3H/HeJ como camundongos mutantes para o receptor, e camundongos C3H/HeN como controle desta linhagem.
A produção da citocina pró-inflamatória IFN-γ foi observada nas duas linhagens consideradas, assim como nas demais linhagens já analisadas. Neste caso, apesar de ter sido observada diferença entre as doses 1:1 e 150:1, dentro de cada linhagem, não ficou evidenciada, de forma estatisticamente significativa, a importância do receptor TLR-4 nesta indução (Fig.7).
A presença de Ldmc também induziu a produção de TNF-α nas duas linhagens. O
