DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
Discussão dos Resultados
A verificação dos perfis de citocinas e quimiocinas produzidas por células do sistema imune, induzidas por um determinado estímulo, auxilia a compreensão dos mecanismos envolvidos neste processo de resposta, e possibilita avaliar a capacidade do estímulo estudado em modular processos inflamatórios. Diversos estudos têm sido realizados no intuito de se compreender as respostas de células do sistema imune, através da avaliação das citocinas e quimiocinas produzidas, às bactérias probióticas, e mais particularmente aos Lactobacillus sp. Neste trabalho, a observação dos resultados nos permitiu caracterizar, de forma mais detalhada, a resposta imunológica de esplenócitos murinos frente ao Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20.
Os dados anteriormente obtidos em nosso laboratório por Castro (2005) e Castanheira e colaboradores (2007), e que justificaram a elaboração deste estudo, já demonstravam a produção de citocinas pró-inflamatórias IL-12, TNF-α e IFN-γ por esplenócitos murinos e células mononucleares do sangue periférico humano, induzida por
L. delbureckii UFV H2b20 morto pelo calor. Diversos outros estudos, utilizando bactérias probióticas, também documentaram a indução da produção destas citocinas pró- inflamatórias por diferentes tipos celulares (Mohamadzadeh e cols., 2005; Haller e cols., 2000; Hessle e cols., 2000; Miettinen e cols., 1996). Recentemente, Sashihara e cols.(2006) verificaram que algumas cepas de lactobacilos apresentam a capacidade de induzir, in vitro, a produção de IL-12 por espenócitos murinos e que estas mesmas conferiram redução nos níveis de IgE induzidos por ovoalbumina em camundongos BALB/c. Outro estudo, realizado por Ishida-Fujii e colaboradores (2007), observou que macrófagos de camundongos tratados com Lactobacillus casei mostraram maior ativação de NF-κB e produção de TNF-α e IL-12 após indução por LPS.
Os experimentos iniciais, utilizando camundongos BALB/c, C57BL/6 e C3H/HeN, corroboram os dados acima descritos quando avaliamos a produção das citocinas TNF-α e IFN-γ induzidas pela estirpe bacteriana estudada (Fig. 1 e 2). Além desta observação, pudemos perceber que a dose de Ldmc utilizada mostrou-se importante para a produção
significativa destas citocinas, assim como fora detectado pelos trabalhos citados anteriormente. Pudemos, deste modo, verificar que, para todas as linhagens citadas, o aumento da dose de Ldmc determinou a diminuição dos índices de IFN-γ e ΤNF-α, com aumento da transcrição de IL-10 (Fig.3).
A presença de RNAm para IL-10, detectada nas linhagens BALB/c, C57BL/6 e C3H/HeN, altera, por sua vez, a percepção da resposta imunológica anteriormente constatada, já que esta citocina pode determinar a modulação do processo inflamatório (de Waal e cols., 1991). Embora não tenha sido avaliada no trabalho desenvolvido por Castro (2005), a produção de IL-10 induzida por lactobacilos e outras bactérias probióticas foi verificada por diversos outros autores (Chatelain e cols., 1992; Di e cols., 2005; Helwig e cols., 2006; Miettinen e cols., 1996; Niers e cols., 2005).
O aumento da transcrição gênica desta citocina, de forma dose dependente, poderia explicar a diminuição da expressão de TNF-α e IFN-γ (Oswald e cols., 1992). Por outro lado, a necessidade do aumento da dose de Ldmc para transcrição de IL-10 sugere que a molécula indutora desta citocina encontra-se em baixas concentrações no estímulo. Neste contexto, Christensen e colaboradores (2002) mostraram que baixas doses de Lacobacillus
casei induziram altos níveis de IL-6, IL-12 e TNF-α e não foram capazes de induzir IL-10. Entretanto, em altas concentrações, a produção de IL-10 aumentou expressivamente. Alternativamente, pode-se supor que o excesso de citocinas inflamatórias, induzidas pelo aumento da concentração do estímulo, pode determinar o aumento de IL-10 na tentativa de modulação da resposta.
Particularmente, os resultados apresentados em nosso trabalho são contrários aos descritos por Castanheira e colaboradores (2007), onde não foi verificada a produção desta citocina reguladora por células mononucleares do sangue periférico (CMSP) humano. Esta diferença de indução pode ser decorrente da baixa dose de estímulo utilizada, 50:1, em relação a dose 150:1 de Ldmc que apresentou maior indução desta citocina, ou pela diferença entre os tipos celulares e condições experimentais envolvidos nos estudos. Por outro lado, Foligne e colaboradores (2007) observaram que algumas cepas de lactobacilos foram capazes de induzir in vitro a produção de IL-10 em CMSPs humano. Este estudo mostrou ainda que as bactérias que determinaram maiores concentrações de IL-10 em relação à produção de IL-12 atenuaram de forma mais significativa os sintomas de colite
em camundongos BALB/c e C57BL/6. Estes dados também diferem dos encontrados por Castanheira e cols. (2007), onde não se verificou a presença de IL-10 induzida por L.
delbrueckii. Neste caso esta divergência pode ser devido ao uso de cepas distintas de lactobacilos.
Drakes e colaboradores (2004) demonstraram que DC derivadas de monócitos murinos podem apresentar marcadores de maturação em sua superfície e, ainda produzir citocinas como IL-10, após a indução por probióticos contendo Lactobacillus sp. Outro trabalho utilizando este mesmo tipo celular revelou uma indução de resposta tipo TH2 após tratamento com L. reuteri (Christensen e cols., 2002). Por outro lado, Mohamadzadeh e colaboradores (2005), mostrou que DCs mielóides humanas tratadas com este mesmo lactobacilo levou à ativação de células TH1. Considerando estes estudos, podemos perceber que diferentes tipos celulares podem reagir de forma distinta a um mesmo estímulo, o que também poderia explicar a discrepância entre os resultados obtidos por Castanheira e colaboradores (2007) e os aqui apresentados. Este fato pode ser determinado pela diferença na expressão de receptores entre os tipos celulares, como observado por Kadowaki e cols. (2001) em estudo utilizando subtipos precursores de células dendríticas.
Ainda dentro deste contexto, é interessante observarmos a diferença dos resultados obtidos para a dosagem de RNAm de IL-10 para as linhagens BALB/c, quando comparadas aos animais C57BL/6 e C3H/HeN. Para esses animais, o aumento da dose de Ldmc não interferiu na produção de RNAm desta citocina reguladora, que se manteve elevada tanto para 1:1 quanto para 150:1 (Fig.3). Os altos índices de RNAm IL-10 para os camundongos BALB/c ajudam a entender os dados obtidos por Castro (2005) que mostraram a ineficiência do lactobacilo em proteger esta linhagem contra a infecção por Leishmania
braziliensis.
Todas estas variações de perfis podem ser melhor compreendidas se considerarmos as diferenças na expressão de TLRs entre diferentes linhagens de camundongos. Segundo Liu e colaboradores (2002), por exemplo, células dendríticas de camundongos BALB/ c apresentam mais receptores TLR-2, -4, -5 e -6 em relação a animais C57BL/6, que por sua vez expressam mais TLR-9. Além disto, foi verificada neste estudo uma maior expressão de STAT4 para esta última linhagem, o que poderia explicar a tendência desta linhagem em
produzir maiores níveis de IFN-γ, já que este fator de transcrição contribui para a produção desta citocina mesmo na ausência de IL-12 (Pasare & Medzhitov, 2004).
A indução da produção de citocinas pró e anti-inflamatórias, por L. delbrueckii, pode indicar o envolvimento de diferentes moléculas estimuladoras, bem como a participação de receptores celulares distintos que, ao reconhecerem seus ligantes, podem determinar respostas finais sinérgicas ou antagônicas. Desta forma, a citocina IFN-γ pode estar regulada, tanto em sua produção quanto em sua ação, pela citocina reguladora IL-10 (Silva e cols., 1992). Este fato poderia explicar a ausência de reação inflamatória, in vivo, dos camundongos BALB/c tratados com Ldmc e desafiados com Leishmania braziliensis, durante os experimentos realizados por Castro (2005). Heinzel e colaboradores (1991) verificaram que células T CD4+ de camundongos BALB/c infectados com Leishmania major, apresentavam altos índices de RNAm para IL-10 e, ao mesmo tempo, suscetibilidade à infecção. O uso de anticorpos anti-CD4, porém, determinou uma diminuição dos índices desta citocina e aumento de RNAm de citocinas inflamatórias como IFN-γ. Este trabalho fortalece a hipótese apresentada e, assim como diversos outros, demonstra a participação fundamental da citocina IL-10 para a modulação do sistema imune.
Sabe-se, atualmente, que receptores TLR-2 estão envolvidos no reconhecimento de bactérias gram-positivas, e por conseqüência auxiliam na determinação da resposta celular para estes agentes (Vinderola e cols., 2005; Yoshimura e cols., 1999).
A realização dos experimentos comparativos entre camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- nos permitiu observar a importância deste receptor para os eventos imunológicos decorridos da indução por Ldmc. Os dados obtidos nos revelam que a ausência do receptor, aparentemente, levou a uma demora na produção de IFN-γ, uma vez que, após 48 horas de indução, a produção desta citocina mostrou-se superior para C57BL6 (figura 4), enquanto os animais TLR-2 -/- apresentaram maiores índices de RNAm da mesma (figura 6).
Trabalhos recentes têm demonstrado a participação de TLR-2 na modulação de células T reguladoras, importantes para o controle da resposta inflamatória. Sutmuller e colaboradores (2006) observaram que a ativação de TLR-2 diretamente em células T reguladoras, por ligante específico, induz a proliferação das mesmas, in vitro e in vivo, e ainda promove uma perda temporária de sua capacidade supressora. Da mesma forma, Liu
e colaboradores (2006) verificaram que a interação entre este receptor e seu agente agonista levou à proliferação de células T efetoras e reguladoras e, ao mesmo tempo, à inibição transiente da atividade supressiva destas últimas, permitindo a produção de IFN-γ por células T efetoras. Além de regular de forma direta a função da célula T reguladora, foi observado que a ativação de TLR-2, em células T efetoras, promove a produção de citocina IL-2, que, por sua vez, é capaz de conferir, a estas mesmas células, efeitos refratários à ação das células T reguladoras.
Em conjunto, estes trabalhos nos dão subsídios para a formulação de uma hipótese para explicar as discrepâncias encontradas nos perfis de IFN-γ, citocina e RNAm, entre os animais selvagens e deficientes para TLR-2. Em um primeiro momento, células T reguladoras presentes entre os esplenócitos poderiam ser inibidas de exercer sua atividade supressora, através da ativação dos receptores TLR-2 por Ldmc. Esta ativação poderia ocorrer diretamente nas células T reguladoras, inibindo sua atividade, ou em células T efetoras tornando-as menos susceptíveis à ação supressora das células T reguladoras pela indução de IL-2. Esta modulação permitiria inicialmente uma produção significativa de IFN-γ por linfócitos T auxiliares e, conseqüentemente, a eliminação do estímulo Ldmc por macrófagos ativados por esta citocina. A redução dos níveis do agonista de TLR-2, a partir da eliminação do lactobacilo, possibilitaria o restabelecimento da atividade supressora das células T reguladoras e, conseqüentemente, o controle da resposta inflamatória. Por outro lado, esta inibição da atividade supressora das células T reguladoras não ocorre na cultura de esplenócitos de camundongos deficientes para TLR-2, podendo haver uma modulação da resposta inflamatória inicial. Desta forma, podemos observar que, para este caso, após 48 horas, os níveis da citocina IFN-γ se encontram inferiores aos da linhagem C57BL/6. Já a presença de RNAm é significativamente superior, demonstrando o retardo na resposta.
As dosagens de TNF-α nos experimentos comparativos não demonstraram a influência de TLR-2 em sua indução. Este resultado difere dos encontrados em outros trabalhos, em que se observou que a ausência deste receptor determinou a diminuição da produção desta citocina por esplenócitos e macrófagos murinos (Matsuguchi e cols., 2003; Murciano e cols., 2007) e por células mononucleares de sangue periférico humano (Lien e cols., 1999). A expressão desta citocina, entretanto, pode estar vinculada também ao estímulo de outros receptores que poderiam ser ativados por Ldmc, como TLR-4 (Zughaier
e cols., 2005). A avaliação da produção de TNF-α por camundongos C3H/HeJ mostram que ausência de TLR-4 funcional determinou a diminuição dos níveis desta citocina, porém não de forma estatisticamente significativa (Fig.8).
Outro fato interessante foi observado através da análise da citocina IL-10. Quando avaliamos sua transcrição gênica em camundongos deficientes para receptores TLR-2 e comparamos com as linhagens selvagens, pudemos perceber sua relação no controle da resposta imune por esplenócitos murinos frente ao estímulo Ldmc. A ausência do receptor TLR-2 nestas células aparentemente levou a um aumento da indução de IL-10, o que pode indicar sua participação no balanço da resposta imune, provavelmente através da indução vias de sinalização que direcionam a produção de citocinas características de um perfil TH1. Esta observação corrobora outros estudos que revelam a importância de TLR-2 para a maturação de células dendríticas humanas, indução da síntese de IFN-γ, IL-12 e outras citocinas pró-inflamatórias (Hertz e cols., 2001; Liew e cols., 2005; Sobek e cols., 2004). Este dado, no entanto, difere de alguns trabalhos que demonstram a participação deste receptor na modulação do sistema imune através da indução de IL-10. Neste sentido, utilizando Mycobacterium tuberculosis, Jang e colaboradores (2004) observaram que a ausência de TLR-2 em células dendríticas murinas impediu a síntese das citocinas IL-6 e IL-10. Re e Strominger (2004), por outro lado, observaram que a produção de IL-10, induzida por TLR-2, bloqueou a produção de citocinas TH1 induzidas por TLR-4 e TLR-3 em células dendríticas humanas.
Além da participação das citocinas no processo inflamatório, o recrutamento seletivo de monócitos, neutrófilos e demais células do sistema de defesa para os sítios de inflamação é considerado outro ponto crítico para o estabelecimento de uma resposta imune eficaz do hospedeiro aos agentes infecciosos. Alguns estudos têm sido realizados a fim de se compreender a possível relação entre o reconhecimento de moléculas associadas a patógenos por TLR e a expressão de quimiocinas e seus respectivos receptores.
No intuito de se avaliar a participação específica de TLR-2 e -4 na expressão de receptores CCR1 e CCR2, importantes receptores de quimiocinas, Parker e colaboradores (2004) realizaram experimentos in vitro que demonstraram uma regulação negativa destes, após o tratamento de monócitos humanos com ligantes de TLRs. Durante este estudo, os autores observaram que a ativação de TLR-2 e -4 levaram à produção de CCL5 e CXCL8, e
não induziram CCL2 e CXCL10. Estes resultados divergem dos encontrados em nossos experimentos, onde se pôde constatar que camundongos deficientes em TLR-2 apresentaram quantidade relativa de RNAm para as quimiocinas CCL2 e CXCL10 inferiores aos camundongos C57BL/6 (Fig.6). Por outro lado, estudo realizado por Lan e cols. (2005), assim como nosso trabalho, demonstrou a importância do estímulo de TLR-2 para a indução destas mesmas quimiocinas. Neste mesmo estudo verificou-se, por meio de ligantes específicos e bactérias íntegras, como Escherichia coli, que a ligação a TLR-4 também induzia estas quimiocinas. A comparação dos dados citados permite observar que condições diferenciadas, como células e ligantes, podem determinar resultados distintos para o estímulo de quimiocinas.
A relação entre as quimiocinas CCL2, CCL5 e CXCL10, objetos deste trabalho, e diferentes perfis de resposta imune, TH1 e TH2, estão diretamente vinculados aos tipos celulares que estas moléculas recrutam. CCL2 e CXCL10, por exemplo, são responsáveis pelo deslocamento de monócitos e células NK, enquanto CCL5 destaca-se pelo recrutamento misto de leucócitos, incluindo células T (Haringman e cols., 2004; Rollins, 1997; Rottman, 1999). A importância deste tipo celular para o estabelecimento de uma resposta TH1 sugere a participação de CCL5 neste perfil resposta.
Nossos resultados demonstraram a importância da ativação de TLR-2 por L.
delbrueckii para a indução de CCL2 e CXCL10. Sua ausência, no entanto, não alterou a indução de CCL5. Neste caso, mesmo a estimulação de células dos camundongos C57BL/6 não levaram à produção desta citocina. Este fato auxilia a compreensão dos resultados encontrados por Castro (2005) que mostram a incapacidade de Ldmc em funcionar como um adjuvante in vivo em camundongos imunizados contra L. braziliensis.
Receptores TLR-4 estão intimamente relacionados ao reconhecimento de bactérias gram-negativas, por um importante componente da parede celular, o LPS. Sua ativação pelo agente ligante, segundo alguns trabalhos, podem direcionar a resposta imunológica através da indução de diversas citocinas (Campos e cols., 2004; Hoshino e cols., 1999). Apesar de sua participação no reconhecimento de LPS, sua importância na participação da resposta imune frente a bactérias gram-positivas, como L. delbrueckii, não pode ser descartada.
O estudo da síntese de IFN-γ e TNF-α em camundongos C3H/HeJ (Fig.7 e 8), nos mostrou uma tendência de menor produção das mesmas pelos esplenócitos, o que sugere a participação do receptor TLR-4 no reconhecimento de moléculas do estímulo Ldmc e, conseqüentemente na intensidade da resposta, apesar de se tratar de uma bactéria gram positiva. Em acordo com esta observação, Kawahara e Otani (2006) observaram uma diminuição da produção de IFN-γ por esplenócitos murinos induzidos por diferentes cepas de lactobacilos, após o uso de anticorpos anti-TLR-4. Esta complexa relação entre ligante e receptor, relacionada ao reconhecimento de moléculas associadas a bactérias gram positivas e negativas, foi evidenciada por Hirshfeld e colaboradores (2001), através da observação de que LPS derivado de Porphyromonas gingivalis é reconhecido por TLR-2, enquanto LPS de bactérias como Escherichia coli são reconhecidos por TLR-4. Outro dado relevante nesse aspecto, foi a observação de que moléculas semelhantes de ácido lipoteicóico de diferentes espécies bacterianas induziram de forma distinta a produção de TNF-α, via TLR- 2 (Han e cols., 2003). Em conjunto, estes trabalhos sugerem que o reconhecimento do agente ligante, por um determinado receptor, depende, basicamente, de suas características moleculares.
Já a participação de TLR-4 para a indução da citocina reguladora IL-10 não ficou bem estabelecida, visto que, apesar de observarmos a diminuição de sua produção em camundongos mutantes, os dados não são estatisticamente significativos. Esta participação foi evidenciada em um trabalho recente, realizado por Higgins (2003), onde se mostrou a indução de IL-10 via TLR-4, por células dendríticas murinas, estimuladas in vitro com
Bordetella pertussis.
Ao avaliarmos as quimiocinas CCL2, CCL5 e CXCL10, percebemos que a deficiência neste receptor não determinou diferenças na transcrição gênica para estas moléculas. Esta observação foi também evidenciada por Antoniazi (2004) utilizando-se infecção por Leishmania major em camundongos TLR-4 deficientes. De forma interessante, tanto para C3H/HeJ, quanto para C3H/HeN, não foram observadas mensagens significativas para estas moléculas, indicando que para estas duas linhagens o estímulo
Ldmc aparentemente não leva à sinalização para o recrutamento de leucócitos. Entretanto, é necessário salientar que a quantificação do RNAm foi avaliada após um tempo fixo determinado. Assim, a transcrição gênica para estas moléculas poderia se fazer em
momentos diferentes, anterior ou posterior ao verificado. A variação da transcrição de quimiocinas em relação ao tempo foi observada no estudo realizado por Parker e colaboradores (2004). Neste, foi observado que o estímulo de TLR-4 por LPS não induziu a produção de CCL2 e CXCL10, assim como verificado em nossos experimentos. Entretanto, pôde-se observar a indução transitória de CCL5, com pico no tempo de 4 horas e posterior decaimento. Este dado sugere que a não detecção de CCL5 em nossos experimentos pode ter ocorrido devido ao tempo utilizado para avaliação da indução desta citocina.
Coletivamente, nossos dados nos revelam que TLR-2 se apresenta mais importante para uma resposta imune à estirpe bacteriana L. delbrueckii UFV H2b20. A ativação deste receptor contribuiu para o balanço dos eventos imunológicos favorecendo a indução TH1 e diminuindo a modulação da resposta.
Uma vez observado a participação de TLR-2 no reconhecimento de L. delbrueckii íntegro, optou-se por verificar sua influência para a resposta induzida pela fração extrato de parede da bactéria.
A realização de experimentos utilizando extrato de parede de L. delbrueckii UFV H2b20 foi proposta inicialmente por Castro (2005), na tentativa de se obter, de forma isolada, a molécula da bactéria responsável pela indução in vitro das citocinas IFN-γ, IL-12 e TNF-α em esplenócitos de BALB/c.
A ativação de receptores TLR-2 por moléculas provenientes de bactérias gram positivas, como ácido lipoteicóico e peptideoglicano, tem sido documentada e relacionada com a indução da produção de variadas citocinas (Liu e cols., 2002; Yoshimura e cols., 1999; Sun e cols., 2005) .
Os dados obtidos em nosso trabalho nos mostraram que este receptor foi essencial para a indução de IFN-γ, mas não de TNF-α, frente ao estímulo extrato de parede. Entretanto, através da avaliação do perfil de resposta, tanto em camundongos C57BL/6 quanto em TLR-2 -/-, pudemos verificar a necessidade de maiores doses deste estímulo para a produção de IFN-γ, o que indica a presença de menor concentração da molécula imunomoduladora no extrato, e que esta é responsável pela indução desta citocina. Por outro lado, a produção de IFN-γ mostrou-se superior em relação ao Ldmc, anteriormente utilizado. Este fato indica que provavelmente outras moléculas presentes na bactéria são responsáveis pelo controle da produção da resposta TH1 induzida pela molécula retirada
pelo processo de extração. Este procedimento, no entanto, não alterou o perfil de resposta apresentado pela bactéria, como verificado através dos experimentos utilizando a fração (-) extrato, o que pode indicar a pouca eficiência do processo para obtenção da fração extrato de parede.
Os resultados apresentados corroboram os de Castro (2005) que evidenciaram a produção da citocina pró-inflamatória IFN-γ, de forma dose dependente, a partir da ativação deste receptor pela fração extrato e (-) extrato de parede. Nossos dados, além disto, complementam esta verificação, indicando a que TLR-2 é o principal responsável pelo reconhecimento da molécula imunomoduladora presente no extrato de parede.