Caracterização das correntes de potássio de células embrionárias de rim humano (HEK293)

CA

DE C

Mestra

2009

ARACT

CÉLULA

ado em Bio

DEPAR

ERIZAÇ

AS EMB

ologia Mo

UNIVERS

FACULD

RTAMENTO

ÇÃO DA

BRIONÁ

olecular Hu

SIDADE DE

ADE DE C

O DE BIO

AS COR

ÁRIAS D

umana

E LISBOA

CIÊNCIAS

LOGIA VE

RRENTE

DE RIM H

A

EGETAL

ES DE P

HUMAN

OTÁSS

NO (HEK

SIO

K293)

CA

DE C

Mestra

2009

ARACT

CÉLULA

ado em Bio

DEPAR

ERIZAÇ

AS EMB

ologia Mo

UNIVERS

FACULD

RTAMENTO

ÇÃO DA

BRIONÁ

olecular Hu

SIDADE DE

ADE DE C

O DE BIO

AS COR

ÁRIAS D

umana

E LISBOA

CIÊNCIAS

LOGIA VE

RRENTE

DE RIM H

A

EGETAL

ES DE P

HUMAN

OTÁSS

NO (HEK

1

SIO

K293)

2

I. Resumo/Abstract 4

II. Introdução 6

III. Objectivos 8

IV. Materiais e Métodos

1. Culturas de células HEK293 9

2. Medição das correntes na configuração de whole cell (célula inteira) 9 3. Soluções para a medição de correntes de potássio 11

4. Tratamento dos resultados 12

V. Resultados e Discussão 14

1. Correntes de potássio das células HEK293 14

2. Efeito do sódio nas correntes de potássio 18

3. Efeito do cloreto nas correntes de potássio 19 4. Dependência da voltagem da activação da corrente 21

5. Possíveis implicações fisiológicas 26

VI. Conclusões e Perspectivas Futuras 27

VII. Bibliografia 29

Anexo I. Glossário i

3

várias configurações possíveis das preparações e para os detalhes técnicos dos potenciais aplicados. Manteve-se também a mesma nomenclatura relativamente à classificação dos canais. No glossário (Anexo I) encontra-se a tradução de todas estas expressões utilizadas neste texto.

4

Resumo

A linha celular derivada de rim humano embrionário (HEK293) é frequentemente utilizada em investigação electrofisiológica e bioquímica, servindo também de modelo celular para estudos de função renal. Estudos de patch clamp efectuados por outros autores mostraram a presença de canais regulados por voltagem de K+_{, Ca}2+ _{e Na}+ _{nestas células, assim como}

canais passivos de Cl-_{. Não há consenso em qual dos iões é o maior contribuidor para a}

corrente celular e a manutenção do potencial de membrana. Neste estudo caracterizaram-se as correntes de potássio nestas células na configuração de whole cell da técnica de patch

clamp. Verificou-se a existência de dois tipos de correntes de potássio com rectificação

positiva, de tipo inactivante e de tipo persistente. Observou-se ainda que a densidade das correntes é afectada pela presença intracelular de sódio e cloreto. As alterações observadas dos parâmetros das funções de Boltzmann assentes às curvas de activação das correntes inactivantes mostram haver alterações da sensibilidade dos canais à voltagem e do potencial a que metade dos canais está activa. Os resultados sugerem mecanismos de regulação diferentes por parte do sódio e do cloreto, e entre concentrações diferentes de cloreto. A corrente persistente mostra também sensibilidade aos outros iões. É possível que a saída de potássio através de canais em situações in vivo possa ser regulada de forma semelhante pelo sódio e pelo potássio.

Palavras Chave: Células HEK293, Patch Clamp, Canais de Potássio Dependentes de

Potencial, Regulação por Aniões, Regulação por Catiões.

Abstract

Human Embryonic Kidney cells (HEK293) are widely used for electrophysiological and biochemical investigation and as cellular model for kidney function studies. Previous patch-clamp studies by other groups have demonstrated the expression of endogenous voltage-gated K+_{, Ca}2+ _{and Na}+ _{channels and passive Cl}- _{channels in this cell line. Nevertheless,}

there is no agreement on which ion is the major contributor to the cell current and to the maintenance of the resting potential. In this study, the whole cell configuration of the patch clamp technique was used to characterize the potassium currents from these cells under different intra and extracellular ionic conditions showed the existence of two types of positively rectifying potassium currents (inactivating and persistent). It was also observed a negative regulation of the cellular density of these currents by intracellular sodium and chloride. The observed changes of the parameters of a Boltzmann function fitted to the activation curves for the inactivating currents shows deviations of the potential at which half

5

of the channels are activated and/or the sensitivity to the voltage. The results suggest the existence of different mechanisms for the regulation by the different ions, and in particular for different concentrations of chloride. The persistent currents also show sensitivity to the intracellular presence of sodium and chloride. In vivo, the effects observed here may play a role in the regulation of exit of potassium through channels in situations in which the intracellular concentration of sodium and/or chloride changes during transepithelial salt transport.

Key Words: HEK293 cells, Patch Clamp, Voltage-Dependent Potassium Channels, Anionic

6

II. Introdução

O rim é um órgão excretor cuja principal função é a osmoregulação do organismo. Este processo consiste na manutenção do balanço hídrico e da concentração de sais e outros compostos no corpo entre os compartimentos intra e extracelulares e também entre organismo e o meio externo[1]_.

O desempenho renal é possível devido à existência de sistemas de transporte especializados distribuídos de forma desigual pelas diferentes porções do túbulo renal. São exemplos disso o cotransportador de Na+_/Cl- _{do túbulo distal, o cotransportador de}

Na+_/K+_/2Cl- _{do segmento ascendente da ansa de Henle e os canais epiteliais de sódio ENaC}

do túbulo colector[1].

Do ponto de vista clínico, é muito importante reconhecer quais os transportadores membranares que podem estar envolvidas em situações de doença. Um exemplo disso é a utilização de diuréticos para o controlo de situações de pressão arterial elevada. Diuréticos como o amiloride e a furosemida, que actuam nos canais de sódio ENaC do túbulo colector e no cotransportador Na+_/K+_/2Cl- _{da ansa de Henle respectivamente, inibem a reabsorção de}

sódio (e de sal em geral) nesses segmentos[2]_.

Grande parte do que se conhece do transporte iónico efectuado pelo rim provém de estudos que utilizaram animais ou a perfusão de túbulos inteiros. Os sais de sódio constituem a maior parte dos solutos que são filtrados pelo rim em quase todos os segmentos do nefrónio, e os mecanismos de transporte envolvidos e sua regulação hormonal são bem conhecidos. O mesmo não se pode dizer dos mecanismos celulares envolvidos no transporte de potássio, principalmente os canais iónicos envolvidos no transporte passivo

deste ião. Alguns estudos recentes mostram que o aumento da ingestão deste ião se

relaciona de forma inversa com o aumento de pressão arterial[2] .

Foram já identificados diversos canais de potássio renais, em rato e ratinho. São exemplos os canais de potássio com rectificação negativa, Kir4.1 e Kir5.1 da membrana basolateral das células principais do túbulo colector[3]_{; o canal ROMK (Kir1.1) do túbulo colector cortical}

(responsável pela manutenção do potencial de repouso)[4]_{; os canais TASK-2 e BK (canais}

de elevada condutância regulados por cálcio) do túbulo proximal[5, 6]_{. De um modo geral}

atribui-se aos canais Kir a manutenção do potencial de repouso nos diferentes segmentos renais. Os canais TASK-2, sendo sensíveis ao pH, estão envolvidos na homeostase ácido-base, e os BK participam na regulação do volume celular.

7

Em alternativa à utilização de porções isoladas de rim e células isoladas, é possível dispor de linhas celulares imortalizadas que podem servir de base para o estudo de transportadores renais. Um exemplo de sucesso, é a caracterização do transporte de sódio através do canal ENaC expresso endogenamente pelas células A6 derivadas de rim de anfíbio[7,8]_.

No presente estudo, usou-se a linha celular de rim embrionário humano (HEK293) como modelo celular para o estudo das correntes passivas de potássio, reconhecidas nestas células. Apesar de se desconhecer qual o destino topológico destas células no túbulo renal[9]_{, é razoável assumir que os seus sistemas de transporte iónico também estejam}

presentes no órgão desenvolvido e que possam exercer um papel na fisiologia renal.

Canais de potássio das células renais HEK293

Diversos estudos de electrofisiologia, pela técnica de patch-clamp, permitiram identificar funcionalmente a presença de canais de potássio dependentes da voltagem (Kv) nas células HEK293:

- Correntes com rectificação positiva e inactivação rápida, identificadas por alguns grupos como de tipo A[10,11,15]_,

- Correntes com rectificação positiva e activação e inactivação lentas, identificadas por alguns grupos como do tipo delayed rectifier[9, 10, 12, 13, 14,15]_.

Os estudos em situação de voltagem controlada em células HEK293 mostram que a densidade de corrente devida à passagem de iões potássio é superior à devida a correntes de cloreto[9,10,14]. Outro estudo mostra o contrário, baseado na alteração do potencial de inversão das curvas de corrente-voltagem em experiências de substituição iónica[12]_{. No}

entanto, um estudo efectuado em situação de corrente controlada, em que se seguiu a evolução do valor de potencial de membrana em resposta à substituição do cloreto ou do potássio na solução que banha as células por outros iões não permeáveis, mostra ser o potássio o ião que mais contribui para o potencial de repouso da célula, visto se observar um desvio no potencial de repouso das células em resposta a alterações do gradiente químico deste ião[9]_.

No grupo de Transporte Biológico da F.C.T. - U.N.L. verificou-se que as correntes de potássio medidas na presença de cloreto apresentavam características diferentes das correntes medidas na ausência do anião. É possível que as diferenças observadas entre os resultados dos diferentes grupos sejam devidas a não haver uma uniformização da

8

composição iónica das soluções intra e extracelulares utilizadas, nem dos protocolos de potencial (Tabela 1).

Tabela 1. Composição iónica das soluções utilizadas para estudar as correntes de potássio das células HEK293 e respectivos protocolos de potencial.

Ao nível do rim são conhecidos exemplos de fenómenos que envolvem a alteração dos fluxos de potássio com modificações da concentração de cloreto. Sabe-se que, quando o cloreto do lúmen do túbulo renal é substituído por outros aniões não permeáveis, se observa uma maior perda de potássio para a urina. É também conhecido que o diurético tiazida pode inibir a secreção de potássio em situações de uma baixa concentração de cloreto no lúmen tubular. Pensa-se que estes efeitos da concentração de cloreto no transporte de potássio estão relacionados com a alteração do funcionamento do cotransportador de K+_/Cl- _da

membrana apical de alguns tipos de células renais[2]_.

Neste trabalho, coloca-se a hipótese de a concentração de cloreto poder influenciar directamente as correntes de potássio através de canais das células HEK293. Adicionalmente, testou-se a possível regulação destas correntes por iões sódio.

III. Objectivos

Com este projecto pretende-se proceder à caracterização electrofisiológica dos fluxos de potássio através de canais iónicos nativos das células HEK293 pela técnica de patch-clamp. Em particular, pretende-se investigar os mecanismos pelos quais os iões cloreto e sódio regulam as correntes de potássio.

Os resultados serão discutidos face ao que é conhecido ao nível da regulação de canais de potássio por outros iões. Discutem-se possíveis implicações fisiológicas ao nível do rim.

Autor/Ano S. Pipeta (mM) S. Banho (mM) Protocolos de Potencial

K+ Na+ Cl- K+ Na+ Cl- V espera (mV) Duração dos Pulsos (ms)

Zhu et al. 1998 [12] 150 - 152 3 140 147 -60 140 Yu e Kerchner 1998 [9] 120 2 125 2.5 110 114.5 -70 250 Gamper et al ., 2002 [11] 136 - 139 5 140 152 -70 200 Jiang et al ., 2002 [10] 140 2 142.2 5.4 138 147.6 -40/-80/-110 300/600 Avila et al. , 2004 [14] 138 - 8.4 3 140 153 -80 200 Varghese et al. , 2006 [13] 130 10 141 30 110 143.6 -40/-80 200 Kurejová et al ., 2007 [15] 130 5 140 5 120 149 -60 500

9

IV. Materiais e Métodos

1. Culturas de células HEK293

Para a realização dos ensaios experimentais foi necessário manter culturas celulares durante toda a duração do trabalho prático. As células HEK293 foram obtidas do banco americano de células “American Type Culture Collection” (ATCC No. CRL 1573), e a cultura é mantida numa incubadora com temperatura controlada a 37ºC e numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar. As células crescem em meio de cultura

DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Gibco) com 4500 mg/L glucose, +GlutaMAXTM _I, sem piruvato, enriquecido com 10% de soro bovino fetal e suplementado com 50 I.U/ml de penicilina e 50 U.G/ml de estreptomicina para prevenir infecções bacterianas.

O manuseamento das culturas celulares foi efectuado em condições de esterilidade dentro de uma câmara de fluxo laminar. A passagem da cultura de células foi efectuada por tripsinização, sempre que a cultura celular atingiu uma confluência de aproximadamente 70%. Para as experiências de electrofiologia, as células cresceram em caixas de cultura redondas (35 mm ∅) adequadas ao suporte do microscópio acoplado ao equipamento de electrofisiologia.

2. Medição das correntes na configuração de whole cell

O trabalho prático consistiu na medição de correntes de potássio através de canais de membrana das células HEK293 pela técnica de patch clamp na situação de célula inteira[16]_.

Formação do Giga-selo

Uma caixa com células banhadas por solução salina é colocada na platina de um microscópio invertido assente sobre uma mesa anti-vibratória (para evitar as vibrações mecânicas) e protegido por uma gaiola de Faraday (para isolar da radiação electromagnética de fontes exteriores). Um selo de elevada resistência entre a membrana celular e a pipeta é um pré-requisito para a obtenção de registos com baixo ruído. Enche-se uma micropipeta de vidro com uma solução salina intracelular (Tabela 2) e insere-se no suporte para a pipeta do pré-amplificador. O contacto eléctrico é efectuado através de um eléctrodo de Ag/AgCl que fica emerso na solução. Quando a ponta da pipeta é imersa no banho, gera-se um potencial de junção líquido-líquido. A sua magnitude depende das concentrações e mobilidades dos iões que constituem tanto a solução de banho como a solução de pipeta. O potencial de junção é anulado enquanto a pipeta é imersa no banho, alterando manualmente o potencial no interior da pipeta através do controlo Vnull (junction

null) do amplificador. Este procedimento também anula o potencial na junção líquido-metal

10

referência contacta com a solução de banho através de uma ponte salina (0.5M KCl em agar 3%), para reduzir o valor do potencial de junção.

Procede-se à aproximação da pipeta à superfície de uma célula com a ajuda de um micromanipulador hidráulico. Quando a pipeta toca na célula o processo de formação do selo é monitorizado no osciloscópio pela observação das correntes da pipeta enquanto se

aplicam pequenos pulsos de voltagem. A resistência da pipeta é monitorizada pela

observação do tamanho do pulso de corrente produzido pelos pulsos de voltagem. Quando este contacto é estabelecido, o tamanho do pulso de corrente diminui. Após formação do Giga-selo cancelam-se as correntes capacitivas transientes produzidas pelo carregar e descarregar da capacitância da pipeta em resposta a cada pulso de voltagem usando os comandos de cancelamento da capacitância rápida do amplificador de patch clamp. Chama-se a esta configuração cell-attached.

Estabelecimento da configuração de whole cell

Esta configuração é obtida a partir da configuração de cell-attached aplicando uma pressão negativa na pipeta (sucção). Quando se rompe a membrana celular na abertura da pipeta, o interior desta fica em continuidade eléctrica com o interior da célula. A ruptura da membrana é assinalada pela observação de transitórios capacitivos típicos do carregar e descarregar da capacitância da membrana celular aquando da aplicação de pulsos de potencial. Estes transitórios são cancelados com o circuito de compensação de capacitância do amplificador. Após entrada em whole cell a célula era levantada com ajuda do micro-manipulador e levada até à proximidade do tubo de perfusão.

Medição de correntes e protocolos de potencial

As correntes iónicas foram medidas em modo de voltagem controlada, em que é possível fixar o valor do potencial de membrana e medir os fluxos iónicos através dos canais da membrana celular sob a forma de corrente eléctrica[17]_{. O potencial é fixo através de um}

amplificador de feedback como está esquematizado na Figura 1. Na técnica de patch clamp a injecção de potencial e medição de corrente é efectuada por apenas um eléctrodo que está em continuidade eléctrica com o interior da célula. Vc representa o potencial de comando do amplificador que é aplicado à membrana da célula através da pipeta. A corrente iónica gerada vai dissipar uma porção do potencial aplicado. O amplificador compara os valores de potencial de membrana e de comando e corrige a diferença aplicando uma corrente equivalente, If através da resistência de feedback, Rf. Através deste mecanismo de realimentação de potencial é possível manter o potencial de membrana fixo a um valor determinado pelo operador. A ligação do amplificador ao eléctrodo de referência que se encontra no banho (e ligado à terra) fecha o circuito. Iout representa na figura a corrente medida.

11

Figura 1. Circuito eléctrico para controlo da voltagem na configuração de whole cell. Rf- resistência

de feedback; If- corrente de feedback; Vc- potencial de comando; Rs-resistência em série; Iout

-corrente medida. Adaptado de [17].

Neste testudo utilizou-se o amplificador Axopatch 1-D (Axon Instruments) ligado a um conversor analógico para digital e digital para analógico que lhe permite transformar os sinais analógicos que recebe do amplificador e envia-los para o computador e aplicar sinais de comando de voltagem do computador e envia-los para o amplificador. Para desenhar e aplicar os protocolos de voltagem usou-se o programa Clampex 8.0 (Axon Instruments). O mesmo programa foi utilizado para a recolha dos resultados de correntes. Os protocolos utilizados estão descritos em pormenor na secção dos resultados (“Correntes de potássio das células HEK293”) e estão representados como um diagrama nas Figs. 2A e B. O sinal eléctrico foi adquirido a uma frequência de 20 kHz, sendo filtrado a 2 kHz.

3. Soluções para a medição de correntes de potássio

As correntes iónicas foram medidas usando-se uma solução de pipeta (intracelular) baseada em sais de potássio e uma solução de banho (extracelular) baseada em sais de sódio (Soluções Padrão). Em semelhança à situação in vivo, o pH extracelular é de 7.4 e o intracelular de 7.2. Usou-se o programa Webmaxclite v1.15 (http://www.stanford.edu/

~cpatton/webmaxc/webmaxclite115.htm) para estimar uma concentração livre de Ca2+

intracelular (≤ nM). A osmolaridade das soluções foi ajustada com sacarose para aproximadamente 300 mOsm. A composição das soluções intra e extracelulares estão representadas nas Tabelas 2 e 3. Para o estudo de regulação das correntes de potássio pelo ião cloreto ou sódio, estes iões foram incluídos em diferentes concentrações na composição das soluções intra- e extracelular. Para estudar o possível efeito regulatório das correntes de potássio por ATP ou cálcio intracelulares alterou-se a sua concentração na

12

solução de pipeta Padrão. Adicionalmente testaram-se os inibidores de correntes de potássio 4-aminopiridina (4-AP) e tetra-etil-amónio (TEA).

Tabela 2. Soluções Intracelulares (Pipeta) em mM.

Tabela 3. Soluções Extracelulares (Banho) em mM.

As experiências foram efectuadas sob perfusão rápida com as células colocadas à distância de ~200 μm de um tubo com um diâmetro interno de 350 μm por onde as soluções de banho saiam com uma taxa de fluxo linear de 10cm/s.

4. Tratamento dos resultados

Usou-se o programa Clampfit 8.0 (Axon Instruments) na medição e cálculo de parâmetros das correntes registadas e para o ajuste de funções de regressão linear e de Boltzmann. Na análise e construção de figuras e gráficos usaram-se os programas Microsoft Excel e o Origin 6.1 (OriginLab Corporation).

Soluções de Pipeta

Substituição iónica Efeito dos iões Cl- e Na+

PADRÃO A B C D E F G H I J Kgluc 150 - - - - 100 150 100 50 -Nagluc 50 MgPO4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Cagluc 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 sacarose 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Na2-ATP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 EGTA 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 NaCl KCl 150 50 100 150 MgCl2 1 1 CaCl2 0.1 1 NMG-gluc 150 150 -NMG-Cl 150 Csgluc 150 Soluções de Banho

Efeito dos iões Cl- e Na+

PADRÃO A B C K I M N O P Q R Kgluc 5 - - - 5 5 - - 5 5 5 5 Nagluc 140 - - 140 120 140 - - - 70 70 -MgPO4 1 - 1 1 1 1 - - 1 1 1 1 Cagluc 1 - 1 1 1 1 - - 1 1 1 1 sacarose 10 10 10 10 - 5 10 5 10 10 10 10 HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Na2-ATP EGTA NaCl 140 120 140 70 140 KCl 5 5 5 MgCl2 1 1 1 CaCl2 1 1 1 NMG-gluc 5 140 70 NMG-Cl 145 Csgluc TEA-Cl 20 TEA-gluc 20 4-AP 5 5

13

Os valores de corrente registados foram corrigidos para a corrente de fuga. A corrente de fuga foi estimada para os valores de corrente registados nos potenciais mais negativos (para os quais os canais iónicos se encontram fechados) por extrapolação de uma regressão linear (I=mV+b) ajustada aos valores de corrente experimentais. Este procedimento permite isolar os valores de corrente que directamente caracterizam o comportamento do canal. Os valores corrigidos foram normalizados em relação à capacitância respectiva de cada célula, e usados na construção de curvas de densidade média de corrente em função do potencial aplicado (curvas do tipo I/V). A partir dos valores corrigidos calcularam-se as condutâncias forward (G) pela aplicação de uma regressão linear aos pontos da curva mais despolarizantes. Os valores médios de condutância foram normalizados para o pulso mais despolarizante (+90 mV) através da relação G=I/(Vm-EK+), em que Vm é o potencial de

membrana aplicado, I a corrente medida e EK+ o potencial de equilíbrio estimado para o

potássio através da equação de Nersnt (~-87mV). Construíram-se gráficos dos valores médios de condutância normalizados em função do potencial de membrana aplicado (G/Gmax

vs. Vm), e assentou-se-lhes uma função de Boltzmann do tipo: I(Vm)=G1-G2 / (1+e (Vm-V½)/d(Vm)),

em que G1 e G2 são os limites superior e inferior da curva, V½ é o potencial de membrana para o qual metade dos canais se encontram activados e d(Vm) é o declive da porção média

da curva (determina a sensibilidade da activação do canal à voltagem). Os potenciais de junção liquido-liquido, foram calculados com o programa Clampex 8.0 e os valores obtidos foram subtraídos ao eixo das ordenadas de todos os gráficos.

Para comparar as diferentes situações experimentais e sempre que a dimensão da amostra foi suficiente, utilizou-se o teste t-Student. Assumiu-se um nível de significância p<0.05 (diferença significativa). Ao longo do trabalho os valores médios são apresentados como valor médio ± erro padrão da média (EPM). O símbolo n corresponde ao número de células usadas.

14

1. Correntes de potássio das células HEK293

Os mecanismos subjacentes ao comportamento dos canais das células HEK293 perante variações do potencial de membrana podem ser explicados pelo modelo desenvolvido por Hodgkin e Huxley para correntes através de canais dependentes da voltagem em células excitáveis[18] _{(Anexo 2).}

As correntes de potássio das células HEK293 foram estudadas por diversos grupos, não havendo uma uniformização dos protocolos de potencial utilizados e um consenso na identificação das correntes de potássio (Tabela 1, Introdução). Nas figuras 2A e 2B estão representados os protocolos de potencial que foram utilizados neste estudo, e que foram desenvolvidos durante o estágio de licenciatura realizado no grupo de transporte biológico da FCT-UNL[19]_{. Aumentou-se a duração da aplicação do protocolo de pulsos de potencial}

para 3000 ms para permitir o decaimento completo das correntes inactivantes. Aumentou-se o período de pré-pulso para 15 s entre varrimentos para garantir o recrutamento máximo de canais em todas as células. Para isolar as correntes persistentes escolheu-se -20mV para valor de pre-pulso, visto que se observou que valores mais negativos já recrutavam correntes inactivantes em algumas células. Quando as células eram mantidas a -80 ou -120 mV por 15 s não se observaram diferenças significativas entre os valores maximos de corrente recrutada. Escolheu-se o valor de -80 mV para elicitar as correntes inactivantes visto os selos serem mais estáveis para este valor.

Para medir correntes de potássio, foram registadas as correntes celulares de células isoladas na configuração whole cell pela técnica de patch clamp, utilizando as soluções de banho e pipeta Padrão (Tabelas 2 e 3, Materiais e Métodos). As Figuras. 2A e 2B mostram correntes típicas de potássio iactivantes e persistentes, elicitadas a partir de potenciais de espera de -80 e -20 mV, respectivamente. As correntes inactivante e persistente mostram uma forte rectificação positiva e apresentam potenciais de abertura de -40 mV e -20 mV, respectivamente. Na Figura 2D estão representadas as curvas médias de densidade de corrente em função do potencial teste aplicado. Os valores utilizados foram o valor máximo da corrente de pico (para as correntes inactivantes) e o valor médio de corrente de 1000 ms (para as correntes persistentes). O valor calculado para a condutância positiva da corrente inactivante é de 6.15 ± 0.68 nS (n = 36). O valor da condutância positiva da corrente persistente é de 5.19 ± 0.61 nS (n = 36).

As correntes do tipo delayed rectifier que foram identificadas por vários autores (Tabela 1, Introdução) não foram observadas com as condições experimentais estabelecidas neste trabalho. É provável que esta diferença se deva maioritariamente ao facto de os outros

15

grupos terem utilizado potenciais de espera entre -80 e -40mV. Neste estudo observou-se que os potenciais de -30 e -40 mV já elicitavam em algumas células correntes inactivantes. Adicionalmente, a duração dos pulsos utilizada nos outros trabalhos é curta, entre 140-200ms, o que pode ter mascarado o processo de inactivação das correntes. Dois trabalhos de biologia molecular[10,11] _{demonstram a existência de transcritos de mRNA por RT-PCR}

para canais do tipo delayed rectifier nas células HEK293. Não se pode excluir a possibilidade de estes canais serem elicitados por potenciais de membrana intermédios. Adicionalmente, as correntes de potássio foram medidas pelos diversos grupos na presença de concentrações intracelulares diferentes de cloreto de de sódio. Este estudo mostra que os canais de potássio são sensiveis a diferentes concentrações intracelulares destes iões, o que pode também influenciar os resultados entre grupos.

Figura 2. Correntes típicas de potássio obtidas de uma célula a partir de um potencial de espera de

-80mV (A) ou de -20 mV (B) com os protocolos de potencial representados. As correntes foram medidas com as soluções Padrão. (C) Correntes medidas com soluções A. O potencial de espera é de -80 mV. (D) Curva média da densidade de corrente inactivante (Soluções Padrão ■, n = 36, Soluções A □, n= 20) e persistente (Soluções Padrão •, n = 36, Soluções A ο, n= 20) em função do potencial de membrana aplicado. (E) e (F) são correntes medidas a partir de um potencial de espera de -80mV, utilizando soluções B e C, respectivamente.

16

Tal como descrito por outros investigadores[9] _{não foram detectadas diferenças nas}

correntes ao variar a concentração intracelular de cálcio (0.1 ou 1 mM na solução Padrão, n = 36 e n = 5, respectivamente). Adicionalmente testou-se a possibilidade de estes canais serem regulados por ATP, à semelhança de outros canais renais de potássio com rectificação positiva[1,20]_{. As correntes medidas sem ATP na pipeta (n = 5) ou na presença de}

1 mM ATP (n = 36) não apresentaram variações significativas. Este resultado também exclui a possível contaminação dos resultados com correntes através de canais de potássio com rectificação negativa que são regulados por ATP intracelular e que já foram detectados nestas células[9]_{. Os valores médios de corrente média máxima e de condutância positiva}

estão representados na Tabela 4. Decidiu-se manter o cálcio e o ATP intracelulares para se efectuarem as experiências em situação próxima das encontradas na literatura.

Mediram-se as correntes de potássio na presença dos iões sódio e cloreto com as soluções A (Tabelas 2 e 3). Esta situação é mais aproximada da fisiológica, com uma concentração elevada de sódio extracelular e de potássio intracelular, e com cloreto em ambos os compartimentos. Surpreendentemente, observou-se uma redução do valor máximo da densidade das correntes inactivantes e persistentes de potássio e das respectivas condutâncias (Figuras 2C e D; Tabela 4). Adicionalmente, a corrente elicitada por um potencial de espera de -80 mV deixa de ser linear para potenciais ≥ +50 mV em 16 das 20 células analisadas, indicando que houve uma alteração da cinética do canal. Não se observou uma diferença significativa do potencial de abertura dos canais inactivantes, o que é uma indicação de que se trata dos mesmos canais. Para além de sofrerem uma diminuição de 77% do valor de condutância, as correntes persistentes apresentam um comportamento linear. O potencial a partir do qual se observa a abertura de canais também sofreu um desvio para potenciais menos positivos (de 23.3 para 6.1 mV). Nesta situação experimental a contribuição do cloreto é negligenciável visto a sua condutância nestas células (determinada com as soluções B) é aproximadamente 30 vezes inferior (Tabela 4). Apesar de as células HEK293 apresentam correntes passivas de cloreto (típicas de canais rectificadores positivos epiteliais[12]_{) também não é provável que contribuam para as}

correntes de fuga que foram corrigidas. A condutância backward das correntes de cloreto medidas neste trabalho é de 0.40 ± 0.09 nS.

17

Tabela 4. Valores médios das condutâncias forward, das densidades de corrente calculadas para cada grupo experimental, e da percentagen de inibição por 20 mM de TEA-gluc ou 5 mM 4-AP. Os valores apresentados das densidades de corrente e percentagens de inibição foram obtidos a partir dos valores da corrente máxima para o potencial de +90 mV.

** valores significativamente diferentes da situação padrão, t-student p<0.05.

Até à data, as correntes de sódio descritas para as células HEK293 foram observadas ocasionalmente e apresentam uma densidade de corrente de aproximadamente -2 pA/pF[15,22]_{. São descritas como correntes negativas que inactivam em menos de 10 ms e}

que são elicitadas a partir de um potencial de repouso de -80 mV. Como esperado, com os protocolos aqui utilizados, não foram observadas correntes de sódio nestas células que possam contribuir para as correntes de potássio deste estudo (Figura 2F, n=5).

Testou-se o efeito de inibidores conhecidos de correntes de potássio das células HEK293, a 4-aminopiridina (4-AP) (inibidor de correntes do tipo A) e o tetra-etil-amónio (TEA)[9,10,11,14]_.

Usaram-se 5mM de 4-AP e 20mM de TEA, concentrações suficientes para se obter um efeito máximo. Na tabela 4, estão indicados os valores médios da densidade de corrente (medidos para +90 mV) na presença de cada inibidor. A aplicação de cada um dos inibidores resultou numa inibição total das correntes inactivantes, permanecendo apenas as correntes persistentes. Verifica-se uma diminuição da corrente de 63.32% (n=5) e de 56.66% (n=7) com 4-AP e TEA, respectivamente. Observou-se uma redução da condutância da corrente inactivante na presença dos inibidores em relação padrão. Os valores médios das condutâncias estão apresentados na Tabela 4. Os valores são comparáveis aos descritos anteriormente por outros autores[9,10,11,14]_.

densidade de corrente

Tipo de Corrente Condição Experimental G forward (nS) ± erro (pA/pF) ± erro n % Inibição

Padrão 6.15 ± 0.68 50.06 ± 4.66 36 K, Cl e Na 3.35 ± 0.43** 29.88 ± 3.30** 20 "só Cl-_" 0.11 ± 0.04 8.19 ± 4.05 5 "só Na+_" 0.04 ± 0.02 3.98 ± 0.56 5 Inactivante ØATP 8.61 ± 1.75 58.26 ± 8.58 5 1mM Ca2+ 5.80 ± 1.39 49.42 ± 13.99 5 TEA-gluc 5.01 ± 0.78** 20.04 ± 3.18** 7 56.66 4-AP 2.51 ± 0.79** 21.30 ± 9.44** 5 63.32 Cs-gluc 5.01 ± 0.89 19.45 ± 9.09** 7 61.16 NMG-gluc - - 7 Padrão 5.19 ± 0.61 15.25 ± 1.57 36 K, Cl e Na 1.17 ± 0.19** 6.57 ± 1.08** 20 "só Cl-_" 0.112 ± 0.09 2.63 ± 1.05 5 "só Na+" 0.04 ± 0.02 2.69 ± 0.67 5 Persistente ØATP 7.32 ± 1.87 17.39 ± 3.78 5 1mM Ca2+ 4.34 ± 0.84 14.72 ± 2.97 5 TEA-gluc 4.93± 0.811 16.49 ± 3.27 7 - 4-AP 2.21 ± 0.90** 12.05 ± 4.38 5 24.19 Cs-gluc 4.37 ± 0.73 14.62 ± 5.21 7 4.12 NMG-gluc - - 7

18

Para demonstrar que as correntes são de potássio fizeram-se adicionalmente medições em que este ião foi substituido pelo ião césio na pipeta. Mais uma vez se observou o desaparecimento das correntes inactivantes, ficando ainda as correntes persistentes, indicando que se poderá tratar de um canal pouco selectivo (Figuras 3A e B, Tabela 4). Visto não se ter observado qualquer efeito dos inibidores testados nas correntes

persistentes substituiu-se o ião potássio da pipeta por NMG+ _{(N-metil-glucamina)}

observando-se uma redução quase completa das correntes (Figuras 3C e D). Conclui-se que todas as correntes observadas em situação controlo são devidas à passagem de iões potássio por diferentes tipos de canais.

Figura 3. Correntes medidas a

partir de um potencial de espera de -80mV (A e C) ou de -20mV (B e D), utilizando soluções de pipeta com Cs+ (A e B) ou NMG+ (C e D). Foi mantida a escala da figura 2 para comparação.

2. Efeito do sódio nas correntes de potássio Efeito do sódio extracelular

Aquando do início deste estudo, teve de se estabelecer quais as soluções padrão intra e extracelular a utilizar. Testou-se se a presença extracelular de sódio interfere com as correntes de potássio. Fizeram-se experiências em que uma solução de banho rica em sódio foi substituida por outra que não continha sódio na sua composição (n = 5). O inverso foi também efectuado (n = 5). Não se observaram diferenças nas correntes de potássio

19

medidas nestas condições (Figura 4A, Tabela 5). Visto ser mais fácil manter os selos, e que os estudos efectuados por outros investigadores têm sódio na composição da solução de banho (situação aproximada à fisiológica), o ião foi mantido no banho na concentração de 140 mM.

Figura 4. Correntes de potássio medidas na presença de diferentes concentrações extracelulares (A

e B) ou intraceluares de Na+ (C). Curvas médias de densidade da corrente inactivante e persistente em função do potencial de membrana aplicado. Os símbolos fechados representam a situação Padrão e os símbolos abertos representam o teste. (A) e (B) Efeito da ausência (n = 10) e da presença de 70 mM de sódio no banho (n = 5), respectivamente. A troca de solução de banho foi efectuada por perfusão. (C) Efeito de 50 mM de sódio na pipeta (n = 5). Em (A) e (B) usou-se a solução de pipeta Padrão e as soluções O e P no banho, respectivamente. Em (C) usou-se a solução de pipeta F e o banho Padrão.

Adicionalmente, testou-se a concentração intermédia de 70 mM de sódio no banho. Foi observada uma redução da densidade da corrente inactivante e da sua condutância (Figura 4B, Tabela 5, n = 5). Das três concentrações testadas de sódio extracelular (nominalmente zero, 70 e 140 mM) apenas se observou este efeito com 70mM. Não é possível determinar o mecanismo, mas não parece estar relacionado com o gradiente químico. As experiências representadas na Figura 4A e 4B foram feitas em grupos independentes de células provenientes diferentes alíquotas. No futuro, dever-se-á testar as três concentrações numa mesma célula para validar o resultado.

20

Tabela 5. Valores médios das condutâncias forward e das densidades de corrente calculados para cada grupo experimental, e percentagens de alteração de corrente causadas pela variação da concentração de sódio na solução intra ou extracelular. Os valores apresentados das densidades de corrente e percentagens de inibição foram obtidos a partir dos valores da corrente máxima para o potencial de +90 mV.

** Valores significativamente diferentes da situação padrão, t-student p<0.05. 1 e 2, referem-se aos grupos independentes de experiências em que se fez troca de solução de banho por ∅ e 70 mM de Na+_{, respectivamente.}

Efeito do sódio intracelular

Para averiguar se as correntes de potássio podem ser reguladas pela presença intracelular de sódio, para além dos 2mM presentes na solução padrão, testou-se uma concentração intracelular de 50 mM (banho Padrão e pipeta F). Os resultados obtidos a partir de dez células estão representdos na Figura 4C. Na curva de densidade de corrente em função do potencial de membrana verifica-se uma diminuição da amplitude da corrente para potencias positivos sem que se altere os potenciais de abertura dos canais, atingindo-se um valor relativamente constante de densidade de corrente de ~10 pA/pF (+15.4 ≥Vm≥ 55.4 mV). Para potenciais mais positivos, para os quais o gradiente electroquímico do potássio é cada vez maior, observa-se um aumento da corrente com o potencial aplicado, mas sempre com valores mais pequenos que a situação Padrão. São conhecidos exemplos de canais de potássio que apresentam o mesmo tipo de comportamento na presença de concentrações crescentes de sódio[23,24] _{tendo sido sugerido que o sódio poderá estar a actuar como}

bloqueador dos canais para potenciais positivos. Um mecanismo semelhante poderá estar a actuar nos canais inactivantes das células HEK293 com os iões sódio a obstruir a passagem de iões de potássio no poro do canal.

Em todos os casos experimentais representados na Figura 4, o potencial de abertura dos canais não se alterou indicando que os efeitos observados são nos canais de potássio.

densidade de corrente

Tipo de Corrente Condição Experimental G forward (nS) ± erro (pA/pF) ± erro n % de alteração de I

Padrão1 1,66 ± 0,08 37.97 ± 4,26 8 Ø Na+ 1.24 ± 0.53 37.79 ± 6.17 8 Inactivante Padrão2 4,15 ± 0.09 35,91 ± 5,20 8 70mM Na+ 2.56 ± 0.59 23.54 ± 4.02** 8 34.44 50mM Na+ in 2.87 ± 1.39** 19.19 ± 4.71** 6 61.65 Padrão1 1,48 ± 0,07 14,25 ± 2.39 8 Ø Na+ 0.67 ± 0.31 10.34± 2.71 8 Persistente Padrão2 3,46 ± 0.07 10,32 ± 1,68 8 70mM Na+ 2.69 ± 0.79 8.11 ± 1.94 8 50mM Na+ in 3.28 ± 0.73** 9.79 ± 2.22** 6 21.31

21

Efeito do cloreto extracelular

Testaram-se duas concentrações de cloreto extracelular nas correntes de potássio, por troca da solução de banho padrão (sem cloreto) para soluções de banho contendo 70 ou 140 mM de cloreto (pipeta Padrão, Banho Padrão, Q e R, respectivamente). A densidade máxima de corrente e a condutância forward não se alteraram (Tabela 6).

Tabela 6. Valores médios das condutâncias forward e das densidades de corrente calculadas para

cada grupo experimental, e percentagens de alteração de corrente causadas pela variação da concentração de cloreto na solução intra ou extracelular. Os valores apresentados das densidades de corrente e percentagens de alteração de corrente foram obtidos a partir dos valores da corrente máxima para o potencial de +90 mV.

** Valores significativamente diferentes da situação padrão, t-student p<0.05.

Efeito do cloreto intracelular

Para estudar a possível regulação das correntes de potássio por cloreto intracelular foram efectuados grupos independentes de experiências em que se se mediram as correntes com a solução de banho Padrão e se utilizaram soluções de pipeta contendo diferentes concentrações de cloreto: 0, 4, 50, 100 e 150 mM. A Figura 5 mostra as curvas médias de densidade de corrente inactivante (A) e persistente (B). Nestas condições experimentais, não se espera que o cloreto esteja a contribuir para as correntes positivas que são atribuídas ao potássio (cloreto a entrar na célula).

densidade de corrente

Tipo de Corrente Condição Experimental G forward (nS) ± erro (pA/pF) ± erro n % de alteração de I

out Padrão - Ø Cl- _{6.15 ± 0.68 50.06 ± 4.66} 36 70 mM Cl -7.22 ± 2.03 43.66 ± 9.18 4 140 mM Cl -5.23 ± 0.85** 43.69 ± 7.11 6 Inactivante in 4 mM Cl -2.17 ± 0.27** 20.27 ± 2.14** 15 59.50 (‐) 50 mM Cl -7.37 ± 2.58 56.06 ± 7.26 6 11.98 (+) 100 mM Cl -6.05 ± 0.39 42.51 ± 4.78 6 15.08 (‐) 150 mM Cl- 2.96 ± 0.54** 23.49 ± 2.99** 7 53.06 (‐) out Padrão - Ø Cl- _{5.19 ± 0.61} 15.25 ± 1.57 36 70 mM Cl- 3.78 ± 1.38 11.22 ± 3.12 4 140 mM Cl -3.53 ± 0.62** 16.19 ± 5.12 6 Persistente in 4 mM Cl -0.50 ± 0.10** 3.39 ± 0.62** 15 77.78 (‐) 50 mM Cl -6.39 ± 1.37 21.42 ± 2.66 6 40.43 (+) 100 mM Cl -4.74 ± 0.744 14.16 ± 2.27 6 7.17 (‐) 150 mM Cl- 2.02 ± 0.50** 6.26 ± 1.59** 7 58.94 (‐)

22

Figura 5. Correntes de potássio medidas na presença de diferentes concentrações intracelulares de

Cl-_{. Curvas médias de densidade da corrente inactivante (A) e persistente (B) em função do potencial}

de membrana. Soluções de pipeta Padrão, E, G, H, I e J e solução de banho Padrão.

Tanto a corrente de pico como a persistente são afectadas pela presença de cloreto intracelular. Os resultados apontam para a existência de dois mecanismos diferentes de regulação. Observam-se dois valores extremos das concentrações testadas para os quais a actividade do canal é fortemente modulada: 4 mM e ≥ 100mM. A presença de apenas 4 mM de cloreto intracelular causou uma redução acentuada da densidade de corrente. Em particular, as correntes inactivantes atingiram um valor máximo para potenciais de membrana ≥ +53.8 mV. Simultaneamente observa-se que a densidade de corrente também é fortemente diminuida na presença de 150 mM de cloreto intracelular, observando-se um efeito menor para concentrações intermédias de cloreto (50 e 100 mM). Os dois mecanismos não parecem ser independentes, pois em caso contrário, seria de esperar que a diminuição da corrente fosse superior para concentrações cada vez maiores de cloreto intracelular. Os efeitos encontrados são semelhantes para os dois tipos de correntes, podendo isto indicar que as correntes inactivantes e persistentes podem atravessar o mesmo canal.

Apesar de não haver diferença no potencial de abertura na corrente inactivante (~-25mV), observou-se uma alteração de abertura dos canais da corrente persistente Verifica-se que o potencial de abertura na presença de uma concentração de cloreto intracelular de 50mM é semelhante à situação Padrão, de cerca de ~26mV. Quando se aumentou a concentração

23

de cloreto para 100mM ou 150mM observa-se que os canais começam a abrir apenas a partir de ~44.7mV. Na presença de 4mM de cloreto os canais abrem a partir de ~14mV. Os resultados aqui apresentados não permitem identificar a natureza precisa pela qual os iões cloreto modulam as correntes de potássio. Visto que os canais de potássio não são regulados por cálcio intracelular, é pouco provável que seja este ião o intermediário dos efeitos observados aquando da substituição do gluconato da pipeta por cloreto (situação em que esperamos ter mais cálcio livre intracelular).

O quociente das correntes inactivantes e transientes dá uma indicação da contribuição relativa de cada corrente para a corrente total de potássio nas diversas situações experimentais. Os valores da tabela 7 mostram que a contribuição relativa dos dois tipos de correntes é afectada pela presença de cloreto intracelular em particular nas experiências efectuadas com 4 ou 150 mM de cloreto intracelular. Adicionalmente, os valores percentuais são diferentes para as correntes medidas para potenciais de membrana de +40 e +90mV, o indica que a contribuição relativa dos dois tipos de corrente é diferente para potenciais de membrana diferentes.

Tabela 7. Valores médios percentuais do quociente da densidade de corrente (pA/pF) do tipo

inactivante e persistente para dois potenciais de membrana aplicados, +40 e +90 mV, na ausência e presença de diferentes concentrações de cloreto na composição intracelular (solução de banho Padrão).

4. Dependência da voltagem da activação da corrente

Foi estudada a dependência da voltagem da activação da corrente para as situações experimentais em que se observou uma diferença significativa das condutâncias forward quando comparadas com a situação padrão: correntes medidas na presença de sódio e cloreto (soluções A), 50 mM de sódio intracelular e 4 ou 150 mM de cloreto intracelular. Para o efeito fizeram-se assentamentos com uma função de Boltzmann às curvas de condutância normalizada para o valor máximo (corrente inactivante) em função do potencial de

% Corrente inactivante/persistente [Cl-]in densidade de corrente (pA/pF) ± erro

+ 40 mV + 90 mV 0 22.02 ± 5.58 44.69 ± 5.55 4 10.15 ± 1.95 16.46 ± 2.53 50 10.69 ± 3.36 39.18 ± 3.64 100 5.65 ± 1.25 34.26 ± 5.67 150 9.01 ± 2.97 25.15 ± 3.62

24

membrana. Os resultados estão representados na figura 6 e os parâmetros de assentamento na Tabela 8.

Figura 6. Curvas médias da dependência da voltagem da activação obtidas através dos valores de

condutância normalizadas da corrente inactivante nas situações experimentais em que se usaram as soluções (A) , Padrão; , Banho e Pipeta A. (B) , Padrão; , Pipeta F. (C) , Padrão; , Pipeta G; 1, Pipeta J.

Tabela 8. Parâmetros das funções Boltzmann assentes às curvas de dependência da voltagem da

activação da figura 6.

Observou-se que as correntes medidas na presença dos três iões principais (Figura 6A) não sofreram alterações de V½ nem de Vs.

A presença de 50 mM de sódio intracelular fez com que se observe um desvio de ~-13 mV para o potencial de membrana a que metade dos canais está activada, em comparação com a situação padrão. Isto seria de esperar no caso de os iões sódio poderem inibir as correntes dos canais de potássio para potenciais positivos (como proposto acima). Para contrariar este efeito são necessários potenciais de membrana mais negativos. Também se detectou uma alteração da sensibilidade do canal à voltagem (Figura 6B).

As alterações aos parâmetros obtidos com 4 e 150 mM de cloreto intracelular são diferentes, em concordância com as diferenças observadas nas curvas de densidade de

V½ Vs PADRÃO -3.57 ± 1.00 15.57 ± 0.93 K+, Cl- e Na+ -3.87 ± 0.47 14.50 ± 0.43 50 mM Na+ -16.50 ± 0.72** 9.98 ± 0.65** 4mM Cl- -13.26 ± 0.93** 12.51 ± 0.85** 150 mM Cl- _{0.21 ± 1.22** 18.77 ± 1.18**}

25

corrente. A concentração mais baixa de cloreto afecta maioritariamente V½, com um desvio semelhante ao causado pela presença de sódio. A concentração mais elevada causou um ligeiro desvio em ambos os parâmetros (Figura 6C).

É possível que a regulação se faça por ligação do anião ao canal, causando uma alteração da sua conformação. São conhecidos exemplos de ligação do cloreto a canais[25]_,

transportadores secundários[26, 27] _{e bombas}[28]_{. Adicionalmente, há evidências de a}

concentração de cloreto alterar a conformação tri-dimensional de proteínas. Baseados no estudo de Collins & Washabaugh 1985[29]_{, foi proposto que a presença de cloreto afecta a}

estrutura de um canal de potássio dependente de ATP [28]_{. Bekar e colaboradores (2005)}[30]

mostraram que a concentração de cloreto altera a cinética de inactivação de dois tipos de canais de potássio regulados por voltagem (Kv1.4 e Kv4.2), sugerindo que pode estar envolvida uma alteração do campo electrico através do sensor de potencial do canal.

Verificou-se não ser adequado assentar a função de Boltzmann aos valores das condutâncias normalizadas obtidos a partir das correntes persistentes. A figura 7 mostra duas tendências da dependencia da voltagem. Verificou-se que a dependência da voltagem da activação não é afectada pela presença intracelular de 50 mM de sódio nem de 150 mM de cloreto. Os resultados não permitem identificar os mecanismos que podem estar envolvidos na alteração da sensibilidade do canal à voltagem na presença de todos os iões (Soluções A) e na presença intracelular de 4 mM de cloreto.

Figura 7. Curva média da dependência da voltagem da activação obtida através dos valores de condutância normalizadas da corrente persistente nas situações experimentais em que se usaram as soluções Padrão (), Banho e Pipeta A (), Banho Padrão e Pipeta F (), Pipeta G (), Pipeta J (1).

5. Possíveis implicações fisiológicas

O rim possui um papel central no controlo dos níveis plasmáticos de vários solutos. Durante o desempenho renal, enquanto se mantém a reabsorção iónica, os epitélios dos vários

26

segmentos têm que suportar grandes fluxos transepiteliais de cloreto e sódio e simultaneamente prevenir a ocorrência de grandes pertubações da composição iónica e volume celulares. Diversos transportadores secundários e canais (apicais e basolaterais) estão envolvidos no transporte de solutos e iões nos vários segmentos do túbulo renal e são específicos de cada segmento.

A técnica de patch clamp aliada a métodos de biologia molecular, permitiram a localização precisa de transportadores, e em particular a determinação de factores reguladores e propriedades de canais singulares nas membranas apical e basolateral de células tubulares

[20]_{. Diversos canais iónicos renais selectivos para diferentes iões foram identificados. Entre}

estes encontram-se os canais humanos de cloreto CLC-Ka e CLC-Kb [32]_{, o canal epitelial de}

sódio ENaC responsável pela reabsorção de sódio no túbulo colector cortical [2] _{e o canal de}

potássio ROMK (Kir, dependentes de ATP) responsável pela secreção de potássio em diferentes segmentos tubulares[20]_.

Estudos funcionais e moleculares mostram a presença de canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) típicos de células excitaveis, em células epiteliais. Um exemplo são os canais de potássio Shaker, que foram identificados na linha celular medular renal, GRB-PAP1, e na medula de coelho [32]_{. Adicionalmente foram identificados vários Kv na}

membrana apical do tubulo proximal pelas técnicas de patch clamp e imunocitoquímica. A classe de canais Maxi-K+ _{(regulados por cálcio) é a mais estudada, no entanto outras}

técnicas como hibridização in situ e Nothern Blot indicam a presença de mais dois tipos de canais Kv específicos de rim, KCNQ1 e KCNA10 que parecem participar na estabilização do potencial de membrana do túbulo proximal durante a absorção electrogenica de sódio. O papel fisiológico renal dos canais Kv ainda não se encontra bem determinado[33]_.

Paulais e colaboradores (2006) demonstraram pela primeira vez a presença de um canal de potássio funcional de elevada condutância activado por sódio e por cloreto (canal do tipo Slo2.2) cujas propriedades funcionais são semelhantes aos canais de KNa presentes nas

células excitáves no túbulo ascendente da porção posterior da ansa de Henle. Proposeram que o canal pode estar envolvido na comunicação entre as membranas basolateral e apical através de flutuações intracelulares das concentrações de sódio e de cloreto[34]_.

Os resultados do estudo aqui apresentado mostram que uma elevada concentração de sódio intracelular (50 mM) reduz a amplitude e altera a cinética das correntes. O estudo de Morton e colaboradores[23] _{sugere que, em epitélios como o túbulo proximal, o bloqueio do}

canal de potássio TASK-2 pelo Na+ possa influenciar a perda de potássio pelo rim, particularmente durante o transporte induzido pela presença de solutos.

27

Não é ainda conhecida a natureza molecular dos canais responsáveis pelas correntes de potássio das células HEK293 nem a sua localização no rim. É possível que os mecanismos propostos para a regulação de canais de potássio renais por sódio[23,34] _{e por cloreto}[34]

possam também regular os canais das células HEK293 num possível contexto fisiológico.

VI. Conclusões e Perspectivas Futuras

Estudaram-se as correntes de potássio através de canais dependentes da voltagem das células HEK293 na situação de whole cell pela técnica de patch clamp. Detectaram-se correntes de tipo inactivante e de tipo persistente, elicitadas por potenciais de espera de -80mV e -20 mV, respectivamente. O potencial de abertura destes canais é de –40 e –20 mV.

Observou-se que as correntes de potássio medidas na presença de sódio e cloreto (soluções A) apresentavam características diferentes, nomeadamente uma redução da amplitude (principalmente para os potenciais mais positivos testados) e uma alteração do potencial de abertura dos canais responsáveis pelas correntes persistentes. Levantou-se a hipótese de as correntes de potássio poderem ser reguladas por sódio ou cloreto e realizaram-se experiências de medições de corrente na presença destes iões. Verificou-se que:

- As correntes de sódio e de cloreto são negligenciáveis quando comparadas com as de potássio.

- A densidade das correntes de potássio e a sua cinética é alterada pela presença intracelular de sódio e de cloreto.

- 50 mM de sódio intracelular reduziram os valores da condutância e das correntes inactivante e persistente de potássio, sem causar alterações ao potencial de abertura dos canais. É sugerido um mecanismo de bloqueio do canal pelos iões sódio para potenciais mais despolarizantes.

- 4 mM e 150 mM de cloreto intracelular causaram uma redução da densidade de corrente e condutâncias das correntes inactivante e persistente de potássio. Observa-se um desvio do potencial de abertura dos canais responsáveis pelas correntes persistentes para potenciais mais positivos e que é diferente para as duas concentrações do anião.

- As curvas de dependência da voltagem da activação da corrente inactivante mostram que a presença de 50 mM de sódio intracelular altera o potencial de membrana a que metade dos canais está activada e uma alteração da sensibilidade à voltagem.

28

- 4 mM e 150 mM de cloreto intracelular causaram efeitos diferentes na cinética de activação das correntes inactivantes. A presença de 150 mM afectou principalmente a sensibilidade à voltagem, enquanto 4 mM de cloreto afectou maioritariamente o potencial de membrana a que metade dos canais está activada.

- Os resultados não permitem identificar o mecanismo pelo qual os iões cloreto

regulam as correntes de potássio, mas parecem estar envolvidos dois mecanismos diferentes.

Para elucidar os mecanismos de acção do cloreto será necessário testar mais concentrações intracelulares deste ião tanto no intervalo inferior (perto dos 4 mM) como superior (por exemplo entre 50 e 150 mM) para tentar discernir uma possível cinética conhecida de ligação do ião à proteína do canal.

Seria ainda interessante tentar identificar molecularmente os canais responsáveis pelas correntes de potássio. Uma primeira aproximação seria a utilização de anticorpos para canais conhecidos de cinética semelhante ou de canais Kv para os quais já tenha sido identificado RNA mensageiro nas células HEK293[10,11]_{. Poder-se-ia proceder á amplificação}

dos genes correspondentes aos casos reconhecidos positivamente e á sua clonagem em vectores para expressão em células animais. Posteriormente os genes poderiam ser expressos em células de outra linha celular para confirmação funcional por patch clamp. Para estabelecer se os efeitos aqui observados têm implicações fisiológicas, seria também útil conhecer a localização exacta dos canais de potássio cujas correntes foram estudadas neste trabalho.

29

1. Moffett, D., Schauff, C., & Moffett, S. (1993) Human Physiology, 2th edition, Mosby Coll. Publ., pp 554-586.

2. Okusa, M. D., & Ellison, D. H. (2000) Diuretics: Physiology and Pathophysiology In: Seldin, D. W., & Giebisch, G. (eds) The Kidney - Physiology and Pathophysiology, Volume II, 3rd _{Edition, New York: Raven Press, pp 2877-2911.}

3. Lachheb S., Cluzeaud F., Bens M. Genete M., Hibino H., Lourdel S., Kurachi Y.,

Vandewalle A., Teulon J. and Paulais, _{M. (2008) Kir4.1/Kir5.1 chennel forms the major K}+

channel in the basolateral membrane of mouse renal collecting duct principal cells. Am J

Physiol Renal Physiol 294: F1398-F1407.

4. Babilonia, E., Li, D., Wang, Z., Sun, P., Lin, D.H., Jin, Y. and Wang, W.H. (2006) Mitogen-activeted protein kinases inhibited the ROMK (Kir 1.1) – like small conductance K+

channels in the cortical collecting duct. J. Am. Soc. Nephrol.

5. Morton, M. J., Chipperfield, S., Abohamed, A., Asipu, S. & Malcolm H. (2005). Na+ -induced inward rectification in the two-pore domain K+ _{channel, TASK-2. Am. J. Physiol.} Renal Physiol. 288: F162–F169.

6. L'Hoste, S., Poet, M., Duranton, C., Belfodil, R., Barriere, H.E., Rubera, I., Tauc M, Poujeol C, Barhanin, J. and Poujeol, P. (2007) Role of TASK2 in the Control of Apoptotic Volume Decrease in Proximal Kidney Cells. The Journal of biological chemistry 282(50):36692-703.

7. Adebamiro, A., Cheng Yi, Johnson J. P., & Bridges R. J. (2005) Endogenous Protease Activation of ENaC: Effect of Serine Protease Inhibition on ENaC Single Channel Properties.

J. Gen. Physiol. 126 (4): 339-352.

8. Hill, W. G., Butterworth, M. B., Wang, H., Edinger, R. S., Lebowitz, J., Peters, K. W., Frizzell, R. A., & Johnson, J. P. (2007) The Epithelial Sodium Channel (ENaC) Traffics to Apical Membrane in Lipid Rafts in Mouse Cortical Collecting Duct Cells. The Journal of

Biological Chemistry 282 (52), pp. 37402–37411.

9. Yu, S. P., & Kerchner, G. A. (1998) Endogenous voltage-gated potassium channels in human embryonic kidney (HEK293) cells. Journal of Neuroscience Research 52, 612-617. 10. Jiang, B., Sun, X., Cao, K., & Wang, R. (2002) Endogenous Kv channels in human embryonic kidney (HEK293) cells. Molecular and Cellular Biochemistry 238, 69-79.

11. Gamper, N., Fillon, S., Cohen, P., Huber, S. M., Feng, Y., Kobayashi, T., & Lang, F. (2002) IGF-1 up-regulates K+ channels via PI3-kinase, PDK1 and SGK1. Pflugers Arch - Eur

30

12. Zhu, G., Zhang, Y., Xu, H., & Jiang, C. (1998) Identification of endogenous outward currents in the human embryonic kidney (HEK293) cell line. Journal of Neuroscience

Methods 81, 73-83.

13. Varghese, A., TenBroek, E. M., Coles Jr., J., & Sigg, D.C. (2006) Endogenous channels in HEK cells and potential roles in HCN ionic current measurements. Progress in Biophysics

and Molecular Biology 90, 26-37.

14. Avila, G., Sandoval, A., & Felix, R. (2004) Intramembrane charge movement associated with endogenous K+ _{channel activity in HEK293 cells. Cellular and Molecular Neurobiology}

24, 317-330.

15. Kurejová, M., Uhrík, B., Sulová, Z., Sedláková, B. Krizanová, O. and Lacinová, L. Changes in ultrastructure and endogenous ionic channels activity during culture of HEK293 cell line. European Journal of Pharmacology 567, 10-18.

16. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., and Sigworth, F. J. (1981) Improved patch clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 391:85-100.

17. Jackson, M. B., (1999) Neurophysiology unit 6 In: Gerfen, C. R., Holmes, A., Rogawski, M. A., Sibley, D., Skolnick, P., & Wray S. (eds) Current Protocols Neuroscience John Wiley & Sons, Inc. USA, unit 6.6.

18. Hodgkin, A. L., & Huxley, A. H. (1952) A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve, Journal of Physiology 117, 500-544. 19. Gonçalves, P. (2007) Caracterização electrofisiológica de correntes iónicas de células embrionárias de rim humano (HEK293). Tese de Licenciatura. Universidade Lusófona.

20. Giebisch, G. (1998) Renal potassium transport: mechanisms and regulation. . J. Physiol. 274 (Renal Physiol. 43): F817–F833.

21. Hélix, N., Strøbaek, D., Dahl, B. H. & Christophersen, P. (2003) Inhibition of the endogenous volume-regulated anion channel (VRAC) in HEK293 cells by acidic di-aryl-ureas. J Membr Biol. 196(2):83-94.

22. Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., & Agnew, S. (1992) µL Na+ Channels Expressed Transiently in Human Embryonic Kidney Cells: Biochemical and Biophysical Properties.

Neuron 8, 663-676.

23. Morton, M., Abohamed, A., Sivaprasadarao A. and Hunter M. (2005) pH sensing in the two-pore domain K+ _{channel, TASK2. Proc. Natl. Acad. Sci USA. Nov. 102(44): 16102–}

16106.

24. Lopatin, A. N., & Nichols, C. G. (1994) Internal Na+ and Mg2+ blockade of DKR1 (Kv2.1) potassium channels expressed in Xenopus oocytes. Inward rectification of a delayed rectifier.

31

25. Dutzler, R., Campbell E.B., Cadene, M., Chait, B.T. and MacKinnon, R. (1999) X-ray structure of a ClC chloride channel at 3.0 A reveals the molecular basis of anion selectivity.

The Biophysical Journal. Volume 76, Issue 4.

26. Bicho, A. and Grewer, C. (2006) Rapid substrate-induced charged movements of the GABA transpoter GAT1. Biophys J. Jul;89(1):211-31.

27. Loo, D. D. Eskandari, S., Boorer, K. J., Sarkar, H. K. And Wright, E. M. (2000) Role of Cl- in electrogenic Na+- coupled cotransporters GAT1 and SGLT1. J. Biol. Chem. 275:37414-37422.

28. McKillen, H. C., Davies, N.W., Stanfield, P.R. and Standen, N. B. (1994) The effect of intracellular anions on ATP-dependent potassium channels of rat skeletal muscle. Journal of

Physiology. 479.3, pp.341-351.

29. Collins, K. & Washabaugh, M. W. (1985). The Hofmeister effect and the behaviour of water interfaces. Quaterly Reviews of Biophysics 18, 323-422.

30. Bekar, L.K., Loewen, M.E., Forsythe, G.W. and Walz, W. (2005) Chloride concentarion affects Kv channel voltage-gatig kinetics: Importance of experimental anion concentrations.

Brain Res. Bull. 67(1-2):142-6.

31. Briet, M., Vargas-Poussou, R., Lourdel, S., Houillier, P., & Blanchard, A. (2006) How Bartter’s and Gitelman’s Syndromes, and Dent’s Disease Have Provided Important Insights into the Function of Three Renal Chloride Channels: ClC-Ka/b and ClC-5. Nephron

Physiology 103, pp 7–13.

32. Yao, X., Chang, A.Y., Boulpaep, E.L., Segal, A.S. and Desir, G.V. (1996) Molecular cloning of a glibenclamide-sensitive, voltage-gated potassium channel expressed in rabbit kidney. The Journal of Clinical nvestigation. 97(11): 2525-2533.

33. Desir G. V., Velázquez H. E. and Wright, F. S. (2007) in, Diseases of The Kidney & Urinary Tract. Chapter 5: Tubular Potassium Transport. Schrier, R. W. Ed. Eighth Edition, Volume 1, Lippincott Williams & Wilkins.

34. Paulais, M., Lachheb, S. and Teulon, J. (2006) A Na+- and Cl—activated K+ Channel in the Thick Ascending Limb Of Mouse Kidney. J. Gen. Physiol. 127(2): 205-215.