SINAGRA, 2004; POOLE-WILSON, 2004; POOLE-WILSON et al., 2003).

1 INTRODUÇÂO

A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de mau prognóstico que tem como características anormalidades da função ventricular esquerda acompanhada de ativação do sistema neuro-humoral, aumento da retenção de fluido, e a intolerância aos esforços, além de diminuir a longevidade (PACKER, 1997). Essa síndrome exige gastos em torno de 2% da renda de grandes centros (POOLE- WILSON, SWEDBERG, CLELAND, DI LENARDA, HANRATH, KOMAJDA, LUBSEN, LUTIGER, METRA, REMME, TORP-PEDERSEN, SCHERHAG & SKENE, 2003) e pode acometer em torno de 5% da população (SCHOCKEN, ARRIETA, LEAVERTON & ROSS, 1992). No Brasil, somente no ano de 2002, foram gastos aproximadamente 200 milhões de reais no tratamento da insuficiência cardíaca (ALBANESI, 2005).

O desenvolvimento da insuficiência cardíaca está associado à hiperatividade do sistema nervoso simpático que, apesar de benéfica em situações agudas (pois, exerce efeito inotrópico positivo, o que aumenta o débito cardíaco), é deletéria quando crônica, por levar a diminuição na contratilidade cardíaca, arritmias, remodelamento cardíaco associado à degradação de miócitos, dessensibilização dos receptores pós-sinápticos β

-adrenérgicos e a ativação de outros sistemas neuro- humorais, tais como o sistema renina-angiotensina-aldosterona (HARRINGTON, LUTREL & ROCKMAN, 2003). Dessa forma, visando minimizar os já citados efeitos deletérios da hiperatividade simpática, os antagonistas β-adrenérgicos passaram a ser um dos principais agentes utilizados na terapia da insuficiência cardíaca e atualmente são foco de inúmeros estudos que têm como objetivo analisar os efeitos dessa droga em portadores de insuficiência cardíaca (DI LENARDA, SABBADINI &

SINAGRA, 2004; POOLE-WILSON, 2004; POOLE-WILSON et al., 2003).

Por muito tempo, o tratamento da insuficiência cardíaca com base no

bloqueio do sistema nervoso simpático, pelo uso de antagonistas β-adrenérgicos, foi

contra-indicado por acreditar-se que a redução da freqüência cardíaca e da

até o inicio da década de 90, a insuficiência cardíaca era conceituada e tratada como um distúrbio hemodinâmico e as principais formas de tratamento incluíam de diuréticos, vasodilatadores e agentes inotrópicos positivos. Tais medicamentos tinham como principal objetivo atenuar os sintomas da síndrome reduzindo a resistência periférica e aumentando a força de contração cardíaca (KATZ, 2003).

Entretanto, com avanço de recursos tecnológicos que proporcionaram o maior entendimento dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da síndrome, a insuficiência cardíaca passou a ser entendida como uma síndrome de natureza neuro-humoral e, conseqüentemente, houve uma mudança de paradigma que levou a uma mudança no tratamento farmacológico da síndrome. Atualmente, é consenso tanto na literatura, (ARONOW, 1997; GOTTLIEB & MCCARTER, 2001; PACKER, COATS, FOWLER, KATUS, KRUM, MOHACSI, ROULEAU, TENDERA, CASTAIGNE, ROECKER, SCHULTZ & DEMETS, 2001) quanto na prática clínica, o poder benéfico da terapia à base do uso de antagonistas β-adrenérgicos, pela redução na freqüência cardíaca, na atividade nervosa simpática, e por melhorar a função cardíaca e diminuir a mortalidade. Inúmeros ensaios clínicos foram conduzidos a fim de entender a ação dos principais β-bloqueadores (EFFECT..., 1999; POOLE-WILSON et al., 2003). Entretanto, apesar de amplamente estudados na literatura e utilizados na prática clínica, as diferenças farmacodinâmicas e farmacocinéticas entre antagonistas β-adrenérgicos de diferentes gerações, assim como, os mecanismos envolvidos na melhora da função cardíaca, ainda não estão totalmente esclarecidos. Três diferentes gerações de antagonistas β-adrenérgicos foram desenvolvidas e utilizadas no tratamento da insuficiência cardíaca (1ª geração – não seletivo para os receptores β-adrenérgicos, 2ª geração – seletivo para o subtipo β

–adrenérgico e 3ª geração – não seletivo para os receptores β- adrenérgicos e com ação vasodilatadora).

Com o desenvolvimento de diferentes gerações de antagonistas β-

adrenérgicos a importância de se estudar os efeitos de tais medicamentos no

tratamento da insuficiência cardíaca se faz necessária. Dessa forma, os modelos

experimentais passaram a ter importância para o esclarecimento dos efeitos de

diferentes gerações de antagonistas β-adrenérgicos no tratamento da insuficiência

cardíaca. Atualmente, estudamos em nosso laboratório um modelo genético de cardiomiopatia induzida por hiperatividade simpática, o que possibilita seu uso para a avaliação do tratamento farmacológico dessa cardiomiopatia. Previamente foi demonstrado (BRUM, KOSEK, PATTERSON, BERNSTEIN & KOBILKA, 2002) que a deleção dos genes dos receptores α

e α

adrenérgicos proporciona o desenvolvimento da cardiomiopatia por hiperatividade simpática. O desenvolvimento da doença ocorre em função dos receptores α

e α

adrenérgicos inibirem a liberação de catecolaminas nos terminais nervosos simpáticos. Portanto, a deleção destes receptores leva a um aumento da concentração de catecolaminas circulantes.

Tais animais com deleção para os receptores α

e α

adrenérgicos (KO) apresentam 50% de mortalidade aos sete meses de idade e esse alto índice de mortalidade deve-se ao fato de a hiperatividade simpática exercer efeitos deletérios cardíacos, estando entre eles a diminuição significativa na capacidade máxima de realização do exercício físico, a perda de cardiomiócitos e disfunção sistólica associada à diminuição na contratilidade cardíaca.

Portanto, no presente projeto de pesquisa temos como objetivo avaliar o possível efeito terapêutico de antagonistas β-adrenérgicos de três diferentes gerações sobre a tolerância ao esforço, função e ultraestrutura cardíacas e sobrevida em camundongos KO que desenvolvem cardiomiopatia induzida pela hiperatividade simpática.

2 REVISÂO DE LITERATURA 2.1 Insuficiência cardíaca

A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de mau prognóstico que

envolve disfunção miocárdica associada à intolerância ao exercício físico, alterações

funcionais e estruturais cardíacas, incidência de arritmias ventriculares, além da

diminuição da expectativa de vida. Segundo dados epidemiológicos, a insuficiência

cardíaca acomete em torno de 1 a 2% da população geral (SCHOCKEN et al.,1992),

podendo esses valores chegar a 5% em grandes centros (SUTTON, 1990). Dados

recentes (GREENBERG, 2004) confirmam que, somente nos Estados Unidos, existem, atualmente, mais de 5 milhões de portadores de insuficiência cardíaca. No Brasil, as doenças do aparelho circulatório são a maior causa de mortalidade e, segundo o DATASUS do Ministério da Saúde

, somente em 2002 ocorreram 982.807 óbitos, sendo 267.496 devido a doenças do aparelho circulatório, o que representou aproximadamente 27% dos óbitos ocorridos naquele ano.

A insuficiência cardíaca é a via final da maioria das doenças do aparelho circulatório. Com o agravamento da síndrome, observa-se diminuição do débito cardíaco, como conseqüência da perda de eficiência do coração em suprir as demandas do organismo.

Concomitantemente à diminuição do débito cardíaco, observa-se um aumento reflexo na atividade nervosa simpática visando restabelecer o aporte sanguíneo para os tecidos. A ativação reflexa do sistema nervoso simpático é inicialmete benéfica na medida em que o aumento do tônus simpático leva a um aumento na freqüência cardíaca e na força de contração do miocárdio. Entretanto, cronicamente a hiperatividade do sistema nervoso simpático está associada a efeitos deletérios ao tecido cardíaco em virtude da sua alta toxicidade (MOLAVI & MEHTA, 2004), leva a disfunção contrátil (DHALLA, AFZAL, BEAMISH, NAIMARK, TAKEDA &

NAGANO, 1993) e desencadeia arritmias (NERHEIM, BIRGER-BOTKIN, PIRACHA &

OLSHANSKY, 2004). A hiperatividade simpática acarreta em mudanças estruturais importantes no tecido cardíaco, como o aumento na fração de colágeno cardíaco (KATZ, 2002) e a perda de cardiomiócitos. Logo, na tentativa de compensar essa perda de células viáveis, observa-se hipertrofia dos cardiomiócitos remanescentes, que visam manter a função contrátil.

1

Fonte: MS/Funasa/Cenepi-Sistema de Informações sobre Mortalidade (SIM). Dados

disponíveis no site do DATA-SUS: http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/sim/obtmap.htm

Portanto, atualmente é consenso tanto na literatura quanto na prática clinica, a importância da investigação do tratamento da insuficiência cardíaca, uma vez que sua prevalência na sociedade é alta e, segundo previsões, a tendência é de que em dez anos o número de pacientes portadores dessa síndrome seja de aproximadamente 10 milhões (GREENBERG, 2004).

2.2 O tratamento da insuficiência cardíaca: Breve histórico

Entre as décadas de 40 e 80 a insuficiência cardíaca era conceituada principalmente como uma síndrome de natureza hemodinâmica cujos principais sintomas observados eram retenção de fluidos, a alta pressão venosa e o baixo debito cardíaco (KATZ, 2003). A visão de distúrbio hemodinâmico como sendo o principal fator desencadeante da síndrome foi favorecida em virtude de recursos técnicos e tecnológicos existentes na época. Dessa forma, os diuréticos, vasodilatadores e agentes inotrópicos positivos eram as principais terapias da insuficiência cardíaca.

Em relação ao uso de diuréticos no tratamento da síndrome, os mesmos visavam prevenir a congestão observada nos pacientes, pois os diuréticos diminuem a retenção hídrica e, conseqüentemente, diminuem a pressão venosa central.

Entretanto, em longo prazo, observava-se falência renal e hepática associada a uma diminuição de débito cardíaco (KATZ, 2003). Isso provavelmente ocorria em função das altas doses de diuréticos utilizadas, quando essa droga era a base do tratamento dos pacientes.

Os vasodilatadores foram também alvo no tratamento da síndrome na

década de 70 (ROSS, 1976) visando redução da pós-carga aumentada nos

pacientes acometidos. Entretanto, em ensaios clínicos realizados com os principais

vasodilatadores da época, não foi possível observar melhora no prognóstico dos

pacientes tratados com vasodilatadores, tais como hidralazina e flosequinan (COHN,

1993; COHN, ARCHIBALD, ZIESCHE, FRANCIOSA, HARSTON, TRISTANI,

DUNKMAN, JACOBS, FRANCIS, FLOHR, et al., 1986) provavelmente por uma

ativação reflexa dos sistemas nervoso simpático e o sistema renina-angiotensina-

aldosterona, associada à queda da pressão arterial com o uso de vasodilatadores.

Porém, dentre as várias drogas com ação vasodilatadora, vale a pena ressaltar que quando os inibidores da ECA eram usados com o objetivo de diminuir a resistência vascular periférica dos pacientes, observava-se melhora na sobrevida dos mesmos, diferentemente do observado em pacientes tratados com as outras classes de vasodilatadores. Embora os resultados tenham chamado a atenção dos pesquisadores, as razões pelas quais o uso de inibidores do sistema renina- angiotensina-aldosterona melhoravam o prognóstico de portadores de insuficiência cardíaca não foram estudadas a fundo na época (EFECTS…1987; PFEFFER, BRAUNWALD, MOYE, BASTA, BROWN JUNIOR, CUDDY, DAVIS, GELTMAN, GOLDMAN, FLAKER, et al., 1992). No entanto, essa dicotomia na ação dos vasodilatadores no tratamento da insuficiência cardíaca foi o primeiro desafio à visão da insuficiência cardíaca exclusivamente como um distúrbio de natureza hemodinâmica. Mesmo assim, a visão hemodinâmica da síndrome ainda prevaleceu até o início da década de 90.

Por fim, ainda tentando reverter um possível distúrbio hemodinâmico, os agentes inotrópicos positivos foram utilizados tentando compensar o baixo poder inotrópico de um coração insuficiente e com conseqüente baixo debito cardíaco.

Entretanto, tal medicação, além de não promover melhora no prognóstico dos pacientes assim medicados, provocava sensível diminuição na expectativa de vida desses pacientes (XAMOTEROL…, 1990). Essa resposta era observada, porque as doses de agonista β-adrenérgicos utilizadas eram muito elevadas.

Os consecutivos insucessos no tratamento da insuficiência cardíaca com os diuréticos, vasodilatadores e agentes inotrópicos positivos, somados aos avanços tecnológicos que permitiram o desenvolvimento de novos equipamentos, tiveram grande importância e contribuíram para que no início da década de 90 houvesse uma mudança de paradigma ao se conceituar a insuficiência cardíaca. Em paralelo, evidências acumuladas ao longo dos anos mostravam que o distúrbio hemodinâmico na síndrome era acompanhado por hiperativação de sistemas neuro-humorais.

Embora já se soubesse que havia hiperatividade dos nervos simpáticos na

insuficiência cardíaca, somente na década de 80 (COHN, LEVINE, OLIVARI,

GARBERG, LURA, FRANCIS, SIMON & RECTOR, 1984) demonstrou-se que essa hiperatividade simpática estava associada a um mau prognóstico em portadores de insuficiência cardíaca. Com isso, os pesquisadores passaram a atribuir maior participação dos sistemas neuro-humorais no desenvolvimento da síndrome. Dessa maneira, a insuficiência cardíaca passou a ser conceituada de forma mais ampla como um distúrbio neuro-humoral o que acarretou mudanças importantes na abordagem terapêutica da síndrome.

Sendo assim medicamentos que atuassem diretamente na modulação dos sistemas renina-angiotensina-aldosterona e nervoso simpático passaram a ser protagonistas no tratamento da insuficiência cardíaca. Dentre os bloqueadores do sistema renina-angiotensina-aldosterona duas classes importantes do medicamento passaram a ser utilizadas. A primeira delas constituiu-se nos inibidores da enzima conversora da angiotensina (ex. enalapril e captopril). Posteriormente, na década de 90, os bloqueadores dos receptores AT

da angiotensina II (ex. losartan) também ganharam importância no tratamento da insuficiência cardíaca. Tanto os inibidores da enzima conversora da angiotensina como os antagonistas dos receptores AT

da angiotensina II promovem remodelamento reverso cardíaco com redução de colágeno. A modulação do sistema renina-angiotensina-aldosterona também tem importância grande na medida em que sua ativação ou bloqueio tem participação direta na regulação da ação do sistema nervoso simpático (HARRINGTON, LUTREL

& ROCKMAN, 2003).

Os antagonistas β-adrenérgicos proscritos para o tratamento da insuficiência cardíaca até o inicio da década de 90, por se acreditar que os efeitos inotrópicos e cronotrópicos negativos gerados por esse tipo de droga seriam maléficos para o tratamento da doença, passaram a ser, juntamente com os inibidores da enzima conversora da angiotensina e antagonistas dos receptores AT

da angiotensina II, uma das principais formas de tratamento da insuficiência cardíaca.

Já na década de 90 começaram a surgir as primeiras evidências de que a

terapia com o uso de antagonistas β-adrenérgicos seria benéfica ao paciente com

estudos nessa área, pôde-se observar que, na insuficiência cardíaca, o coração era constantemente exposto a hiperatividade do sistema nervoso simpático. Esta exarcebação simpática provocava taquicardia, aumento do consumo de oxigênio do miocárdio e do potencial de arritmias ventriculares, além de contribuir para a ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona, provocando morte dos cardiomiócitos e, conseqüentemente, agravando o quadro da insuficiência cardíaca. Por essa razão, o tratamento da doença com o uso de antagonistas β-adrenérgicos passou a ser prescrito, e ensaios clínicos começaram a ser conduzidos com o objetivo de avaliar o efeito do uso de antagonistas β-adrenérgicos no tratamento da insuficiência cardíaca (EFECTS...., 1999; POOLE-WILSON et al., 2003). Estes estudos mostraram que o tratamento da insuficiência cardíaca com o uso de antagonistas β-adrenérgicos era altamente recomendado pois, preveniam o coração da ação deletéria associada ao excesso de catecolaminas.

Vários estudos têm mostrado os benefícios do uso de antagonistas β-

adrenérgicos após um período que varia em média de quatro a oito semanas para

portadores de insuficiência cardíaca (ARONOW, 1997; GOTTLIEB & MCCARTER,

2001; PACKER et al., 2001). Esses benefícios podem ser explicados por uma série

de mecanismos que atuam a partir do bloqueio dos receptores β-adrenérgicos

cardíacos: 1- Redução dos níveis de noradrenalina plasmática e tecidual em

conseqüência da diminuição da atividade do sistema nervoso simpático e bloqueio

dos efeitos tóxicos das catecolaminas sobre os cardiomiócitos com redução de

apoptose e necrose celular. 2- Restabelecimento da densidade dos receptores β

-

adrenérgicos, outrora alterada em decorrência da doença. 3- Aumento dos níveis de

proteína Gαs, com maior atividade da adenilciclase, maior produção de energia e

maior eficácia das unidades contráteis. 4- Redução dos níveis de secreção de renina

pelo bloqueio simpático, mimetizando a ação dos inibidores da enzima de conversão

da angiotensina e prevenindo o escape da supressão de angiotensina II pelos

inibidores da enzima de conversão da angiotensina. 5- Melhora da função

barorreflexa, redução da pós-carga e melhora da eficiência circulatória. 6- Redução

da falência cardíaca, com menor consumo de oxigênio pelo miocárdio, melhora da

função diastólica, aumento de fluxo coronariano, e redução de isquemia, arritmias

ventriculares e morte súbita (ALMEIDA, DINIZ, VIEGAS, SILVA & CARVALHO, 2000).

Portanto, o estudo do efeito do uso de diferentes tipos de antagonistas β- adrenérgicos na terapêutica da insuficiência cardíaca é importante, para que as ações específicas de cada antagonista β-adrenérgico sejam melhor entendidas.

2.3 Receptores β-adrenérgicos e suas funções na insuficiência cardíaca Os receptores β-adrenérgicos pertencem a uma família de receptores caracterizados por possuírem sete domínios transmembrânicos acoplados a proteína G. Quando o primeiro mensageiro (noradrenalina) se liga aos receptores β

- adrenérgicos cardíacos, ocorre uma mudança conformacional do receptor que se acopla à proteína estimulatória G

que tem três subunidades, α, β e γ . Em seguida, a subunidade α se desacopla das demais subunidades e estimula a enzima adenil ciclase. Com isso, há aumento das concentrações de AMP-cíclico intracelular (segundo mensageiro). O aumento das concentrações de AMP-cíclico faz com que os mesmos ativem a proteína quinase-A (PKA). As subunidades catalíticas da PKA fosforilam inúmeras proteínas intracelulares, principalmente as proteínas que regulam as concentrações de cálcio no citosol, regulando assim, todo o processo de contração e relaxamento miocárdico.

No coração, a via β-adrenérgica exerce papel fundamental, tendo em vista que os receptores α-adrenérgicos estão em menor quantidade no miocárdio. Em relação aos subtipos de receptores β-adrenérgicos cardíacos, os receptores β

- adrenérgicos estão expressos em maior quantidade quando comparados aos receptores β

-adrenérgicos (80: 20 %, respectivamente) prevalecendo, dessa forma, a ação dos receptores β

-adrenérgicos. Na insuficiência cardíaca a relação β

: β

modifica-se, pois ocorre “downregulation” dos receptores β

-adrenérgicos na

membrana, fazendo com que a razão β

: β

chegue a valores de aproximadamente

60: 40% (BRISTOW, 1993). O processo de “downregulation” consiste na

Como os receptores β

-adrenérgicos têm menor ação inotrópica positiva, pois se acoplam tanto a proteína Gs como a proteína Gi (BRISTOW, GINSBURG, UMANS, FOWLER, MINOBE, RASMUSSEN, ZERA, MENLOVE, SHAH & JAMIESON, 1986), há uma diminuição da função contrátil cardíaca. Portanto, a diminuição na densidade de receptores β

-adrenérgicos de membrana associa-se a reduções da resposta inotrópica e cronotrópica ao exercício físico e a uma conseqüente diminuição de tolerância à realização de esforço físico.

2.4 β-bloqueadores de diferentes gerações

Atualmente, na prática clínica, o uso de antagonistas β-adrenérgicos constitui-se em um dos principais tratamentos da síndrome da insuficiência cardíaca.

Entretanto, o mercado tem oferecido uma variedade de antagonistas β-adrenérgicos com diferentes propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas, classificados em três diferentes gerações (TABELA 1). Dentre os antagonistas β-adrenérgicos de primeira geração, o propranolol foi o mais utilizado para o tratamento pós-infarto e o tratamento da insuficiência cardíaca (ARONOW, 1997; GOTTLIEB & MCCARTER, 2001). Os antagonistas β -adrenérgicos de primeira geração apresentam a característica de serem antagonistas não-seletivos para receptores β-adrenérgicos, ou seja, exercendo sua ação sobre os subtipos β

e β

-adrenérgicos. Os antagonistas β-adrenérgicos de segunda geração são seletivos para receptores β

-adrenérgicos, usados primariamente no tratamento da hipertensão arterial (ALMEIDA et al, 2000).

Como exemplos dessa classe de antagonistas β-adrenérgicos, podemos citar o

bisoprolol e metoprolol. Não são raros na literatura estudos utilizando essas drogas,

porém são mais freqüentes estudos utilizando o metoprolol (CLEMENTS & MILLER,

2001; PACKER et al., 2001; RAJPUT, GNANASEKERAM, SATWANI, DAVENPORT,

GRACELY, GOPALAN & NARULA, 2003). A terceira geração de antagonistas β-

adrenérgicos tem a característica de não serem seletivos exercendo sua ação sobre

ambos os subtipos de receptores β

e β

-adrenérgicos. Além dessa característica

semelhante aos antagonistas β-adrenérgicos de primeira geração, essa família de

antagonistas β-adrenérgicos apresenta outras ações auxiliares, tais como, vasodilatadora e antioxidante. Como exemplo de antagonistas β-adrenérgicos de terceira geração, podemos citar o carvedilol e bucindolol (bucindolol parece não ser tão eficaz quanto o carvedilol, pois parece ser um agonista parcial, o que na clínica é chamado como atividade simpatomimética intrínseca). Estudos com o carvedilol são encontrados com freqüência na literatura recente (AL-NASSER, YOUSUFUDDIN, AL-NOZHA, ANKER, COATS, PIEPOLI & PONIKOWSKI, 2003; DE MATOS, GARDENGHI, RONDON, SOUFEN, TIRONE, BARRETTO, BRUM, MIDDLEKAUFF

& NEGRÃO, 2004; PACKER et al., 2001; RAJPUT et al., 2003), demonstrando a importância que tal medicação tem tido no tratamento da insuficiência cardíaca.

TABELA 1 - Geração e ação dos diferentes tipos de antagonistas β-adrenérgicos

Apesar de os estudos com diferentes gerações de antagonistas β- adrenérgicos existirem em grande número, parece não haver um consenso sobre qual seria a melhor geração de antagonista β-adrenérgico a ser utilizada na clínica da insuficiência cardíaca. Além disso, há carência de estudos mais aprofundados sobre

Geração antagonistas β-adrenérgicos Ação

1

geração Propanolol antagonistas β-adrenérgicos

não-seletivos

2

geração Bisoprolol

Metoprolol

antagonistas β-adrenérgicos seletivos para receptores adrenérgicos do subtipo β

3

geração Carvedilol

Bucindolol

antagonistas β -adrenérgicos

não seletivos e com ação

vasodilatadora e antioxidante

o efeito de tal tratamento na função cardíaca, no remodelamento cardíaco e nos mecanismos envolvidos nessa melhora.

A literatura e a prática clínica, de maneira geral, demonstram particular interesse em entender os efeitos do metoprolol e carvedilol no tratamento da insuficiência cardíaca.

O fato de o metoprolol ser um antagonista β-adrenérgico específico para receptores β

-adrenérgicos (TABELA 1) parece ser um ponto positivo, na medida em que, atualmente, vem se entendendo melhor o papel das vias intracelulares β- adrenérgicas. Vários estudos (CHESLEY, LUNDBERG, ASAI, XIAO, OHTANI, LAKATTA & CROW, 2000; COMMUNAL, SINGH, SAWYER & COLUCCI, 1999; ZHU, ZHU, LU, WANG, WANG & YAO, 2003) demonstraram os diferentes papéis das vias β

e β

-adrenérgicas na regulação da apoptose celular do tecido cardíaco. Sabe-se que a ativação da via β

-adrenérgica na insuficiência cardíaca tem um efeito anti- apoptótico importante modulado pela ligação da proteína G

à fosfadilinositol 3- quinase (PI-3K). Na insuficiência cardíaca o processo de morte celular programada é um dos principais fatores de remodelamento cardíaco e perda de função cardíaca, portanto, não se sabe ao certo até que ponto bloquear os receptores β

-adrenérgicos é desejável.

Os antagonistas β-adrenérgicos de 1ª e 3ª gerações são conhecidos

(TABELA 1) por serem inespecíficos, ou seja, exercem sua ação antagonista tanto

para receptores β

-adrenérgicos quanto receptores β

-adrenérgicos. Tanto na prática

clínica quanto na literatura, o carvedilol vem sendo o antagonista β-adrenérgicos

mais utilizado. Esta preferência deve-se principalmente à sua ação vasodilatadora

(bloqueio dos receptores α

- adrenérgicos). Entretanto, parece que o efeito

vasodilatador do carvedilol é perdido com o passar do tempo (KUBO, AZEVEDO,

NEWTON, PACKER & FLORAS, 2001). Outra importante propriedade do carvedilol é

a sua ação antioxidante. Demonstrou-se que em ratos enfartados, que o tratamento

de dois meses com carvedilol foi suficiente para gerar efeitos antioxidante no tecido

cardíaco. Nesse mesmo estudo, demonstrou-se que o metoprolol também tem um

efeito antioxidante associado, porém de menor magnitude (KAWAI, QUIN, SHITE, MAO, FUKUOKA & LIANG, 2004)

Os estudos sobre o tratamento da insuficiência cardíaca com os antagonistas β-adrenérgicos ainda necessitam de maiores esclarecimentos quanto às implicações que as diferentes propriedades dessas drogas podem proporcionar.

Dessa maneira, o presente projeto, valendo-se de um modelo experimental com animais geneticamente modificados que desenvolvem cardiomiopatia por hiperatividade simpática, aborda questões a respeito da ação dos antagonistas β- adrenérgicos sobre a resposta da freqüência cardíaca, pressão arterial, remodelamento cardíaco e função ventricular. Espera-se com isso ampliar os conhecimentos a respeito dos mecanismos celulares envolvidos na melhora da função cardíaca em portadores de insuficiência cardíaca sob o uso de antagonistas β-adrenérgicos.

2.5 Modelo genético de cardiomiopatia por hiperatividade simpática Os receptores α

e α

adrenérgicos são responsáveis pela regulação da ação do sistema nervoso simpático no coração. Centralmente, no bulbo rosto ventro lateral, os receptores α

-adrenérgicos são pós-sinápticos e modulam negativamente o tônus simpático (ALTMAN, TRENDELENBURG, MACMILLAN, BERNSTEIN, LIMBIRD, STARKE, KOBILKA & HEIN, 1999) Nos terminais nervosos, os receptores α

e α

adrenérgicos são pré-sinápticos e regulam negativamente a liberação de noradrenalina para o coração. Portanto a ausência de receptores α

e α

adrenérgicos leva a um aumento crônico da atividade nervosa simpática em

camundongos (HEIN, ALTMAN & KOBILKA, 1999). Com estes conhecimentos

prévios, e estudando camundongos KO, foi demonstrado que aos quatro meses de

idade esses animais apresentavam comprometimento da função cardíaca, com

evidências de lesões dos cardiomiócitos, intolerância ao esforço e redução do

consumo pico de oxigênio (BRUM et al., 2002). Esses resultados sugeriram,

portanto, que o aumento crônico da atividade nervosa simpática estava associado à

progressão da cardiomiopatia em camundongos. De fato, aos sete meses de idade, os camundongos KO apresentam insuficiência cardíaca com aumento do teor de água nos pulmões.

Dessa forma, esses animais geneticamente modificados se constituem em um interessante modelo experimental para estudar o tratamento farmacológico da insuficiência cardíaca por hiperatividade simpática.

Considerando-se que os camundongos KO apresentam hiperatividade simpática e mortalidade de aproximadamente 50% aos sete meses de idade (BRUM, et al., 2002) nos propusemos, no presente estudo, a investigar o efeito da terapia com antagonistas β -adrenérgicos de diferentes gerações sobre a função e ultraestrutura cardíacas em camundongos KO na faixa etária de cinco a sete meses, quando a cardiomiopatia é grave e associada a insuficiência cardíaca.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Estudar o efeito das três diferentes gerações de antagonistas β- adrenérgicos (propranolol, metoprolol e carvedilol) no tratamento da cardiomiopatia induzida por hiperatividade simpática, em camundongos KO na faixa etária de cinco a sete meses.

3.2 Objetivos específicos

Estudar em camundongos KO o efeito do tratamento com propranolol, metoprolol e carvedilol na:

• Tolerância ao exercício físico;

• Pressão arterial e freqüência cardíaca no repouso;

• Função ventricular;

• Peso da gordura corporal (retroperitonial e epididimal);

• Morfometria cardíaca, analisando-se, o diâmetro de miócitos e a fração de colágeno;

• Mortalidade ao longo do estudo.

Temos como hipótese que o uso de antagonistas β-adrenérgicos de segunda e terceira geração serão mais eficazes no tratamento da insuficiência cardíaca em função de suas propriedades auxiliares e de sua melhor tolerabilidade.

4 MATERIAL E METÓDOS

4.1 Amostra

Para a realização do presente projeto foi utilizado camundongos machos controle e KO, da cepa C57/BL6, com 20 semanas de vida, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina da USP.

Os camundongos utilizados neste estudo foram mantidos em biotério, com temperatura controlada entre 22 e 25° C e ciclo claro-escuro (12 horas) invertido.

Todos os procedimentos cirúrgicos e protocolos foram realizados de acordo com os Princípios Éticos de Experimentação animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA, www.cobea.org.br). O presente projeto de pesquisa integra o projeto de jovem pesquisador intitulado “Efeito do treinamento físico na cardiomiopatia induzida por hiperatividade simpática”, aprovado pelo Comitê de Ética da EEFE-USP (parecer CEP n

004)

4.2 Identificação dos animais e genotipagem 4.2.1 Identificação dos animais

Os animais foram identificados com um dispositivo introduzido

subcutâneamente no dorso, após anestesia com éter. Cada dispositivo continha um

código com letras e números, o qual foi identificado por aparelho eletrônico capaz ler

o dispositivo utilizado.

4.2.2 Genotipagem

Para a genotipagem dos camundongos KO foi extraído DNA genômico por biopsia realizada na orelha esquerda dos animais. A genotipagem foi realizada por reação de polimerização em cadeia (PCR -polymerase chain reaction) em termociclador utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores (primers) para a detecção dos genes intactos e com ruptura dos genes dos receptores α

e α

adrenérgicos.

Oligonucleotídeos para genotipagem dos receptores α

-adrenérgicos:

WTA sense: 5’ CTG CTC ATG CTG TTC ACA GTC ATT TG3’

WTA antisense: 5’ CCA CAC GGT GAC AAT GAT GGC CTT3’

Neo/sense: 5’ CGA GAT CCA CTA GTT CTA GCC TCG3’

Oligonucleotídeos para genotipagem dos receptores α

-adrenérgicos:

WTC sense: 5’ CAT CTT GTC CTC CTG CAT AGG CTC3’

WTC antisense: 5’ TCT CAT CCG GCT CCA CTT CAG TG3’

Neo/sense: 5’ GGG AGG ACA ATA GCA GGC ATG CTG3’

4.3 Pesagem corporal

A evolução do peso corporal de todos os animais foi acompanhada semanalmente, antes e durante o período de treinamento físico até o sacrifício, por balança semi-analítica (Gehaka, modelo AG 200).

4.4 Administração dos antagonistas β-adrenérgicos

A administração dos antagonistas β-adrenérgicos foi feita via gavagem em

dose estabelecida no estudo-piloto. O tratamento com todos os antagonistas β-

adrenérgicos teve duração de oito semanas, com início na 20ª semana de vida

desses animais. Os animais receberam o medicamento durante o período de

tratamento sempre no período da manhã. Foram utilizados os seguintes antagonistas β-adrenérgicos:

Propranolol (Sigma, EUA) 1

geração, antagonistas β-adrenérgicos não- seletivo, ou seja, que exerce sua ação sobre os receptores β

quanto β

-adrenérgicos (20 mg/kg).

Metoprolol (Sigma, EUA) 2

geração, antagonistas β-adrenérgicos seletivo para receptores do subtipo β

-adrenérgico (165 mg/kg).

Carvedilol (Baldacci, Br)

3

geração, antagonista β-adrenérgico não- seletivo e vasodilatador (antagonista receptores α

-adrenérgicos) e com ação anti- oxidante (38 mg/kg).

.

4.5 Avaliação da capacidade funcional

A tolerância ao exercício físico foi estimada através de um teste progressivo até a exaustão, em esteira rolante, em camundongos com cinco e sete meses de idade.

O teste progressivo até a exaustão consistiu em um protocolo de exercício físico escalonado, em que a velocidade inicial era de 6m/min com incrementos de 3m/min a cada três minutos até a exaustão do animal (FERREIRA, ROLIN, GRANÁ, BARTHOLOMEU & BRUM, 2004). A exaustão foi identificada no momento em que o animal não conseguia mais manter o padrão de corrida. As variáveis analisadas foram o tempo e a distância percorrida durante o teste máximo.

2 O Carvedilol foi gentilmente cedido pela Companhia farmacêutica Baldacci que apóia esse estudo.

4.6 Avaliação cardiovascular 4.6.1 Avaliação ecocardiográfica

As medidas ecocardiográficas seguiram as recomendações do Comitê de Padronização do modo M da Sociedade Americana de Ecocardiografia (SAHN, DEMARIA, KISSLO & WEYMAN, 1978).

O exame ecocardiográfico transtorácico foi realizado antes e após o

período de tratamento farmacológico, quando os animais estivessem com cinco e

sete meses de idade, respectivamente. Os exames foram realizados por um único

observador que estava cego tanto para o genótipo quanto para o tipo de tratamento

realizado. Em cada exame foi coletado um total de cinco medidas para cada variável,

sendo calculados posteriormente, a média, o desvio padrão da média e o erro padrão

da média dessas medidas. O exame ecocardiográfico foi realizado com os animais

anestesiados pelo anestésico volátil halotano, sendo mantido um fluxo constante de

O

misturado ao anestésico. Este animal anestesiado foi colocado em decúbito dorsal

em uma mesa cirúrgica apropriada para o posicionamento do transdutor no

hemitórax esquerdo do animal. Foi utilizado o equipamento SEQUOIA 512 (ACUSON

Corporation, Mountain View, CA), com transdutor de 14 MHz. As imagens foram

feitas com uma freqüência de 14 MHz, para a otimização da resolução e a

penetração do animal. Para registro das imagens foi utilizado gel de transmissão

para ultrassom de viscosidade média/alta (General Imaging Gel, ATL. Reedsville,

USA). As imagens foram armazenadas em fitas de videocassete (Sony SVO-9500

MD), em discos ópticos (Sony 128Mb) e em papel fotográfico (Sony, Color Video

Printer Mavigraph UP-5600 MDU). A partir da visualização do ventrículo esquerdo

(corte transversal) ao nível dos músculos papilares foi realizado o modo M e obtidas

as medidas das seguintes variáveis: diâmetro diastólico (DDFVE) e sistólico (DSFVE)

do ventrículo esquerdo e a espessura do septo interventricular e da parede posterior

do ventrículo esquerdo em sístole e diástole. Após a realização das medidas foi

calculada a massa do ventrículo esquerdo, segundo orientação da Sociedade

Americana de Ecocardiografia, que estima a massa do ventrículo esquerdo pela da

utilização da seguinte fórmula matemática: LVM = [(DDFVE+SIV+PP)

– (DDFVE)3] x

1,047, onde 1,047 (mg/mm

). Além da massa do ventrículo esquerdo, foi calculada a fração de encurtamento do ventrículo esquerdo (Fen% = [DDFVE – DSFVE)/DDFVE]

x (100).

FIGURA 1- Análise ecocardiográfica em modo monodimensional realizada em camundongos. Onde: 1; espessura do septo interventricular na diástole;

2; diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; 3; espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole; 4; espessura do septo interventricular na sístole; 5; diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo;

6; espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na sístole.

4.6.2 Medida da pressão arterial e freqüência cardíaca

A medida indireta da pressão arterial caudal foi realizada pelo método de pletismografia de cauda. O camundongo foi colocado numa caixa restritora com a superfície aquecida o suficiente para vasodilatar a artéria caudal. Em seguida, um esfigmomanômetro (adaptado para camundongos) foi colocado na cauda do animal e insuflado até a obstrução total do fluxo sanguíneo para a artéria caudal. Em seguida,

1 2 5

4

3 6

a pressão do aparelho foi diminuída lentamente até a captação dos primeiros picos de pressão arterial sistólica. A pressão arterial foi captada por um transdutor eletromagnético (Kent Scientific) localizado na cauda do animal e conectado a um amplificador (General Purpose Amplifier-Stemtech, Inc.). O sinal era repassado para um conversor de sinal analógico da pressão arterial para digital (Stemtech, Inc) e registrado em tempo real no microcomputador (Gateway 2000, 4DX2, 66V), sendo analisado pelo programa AT/CODAS com uma freqüência de amostragem de 1000Hz por canal.

Esse método visava avaliar a freqüência cardíaca e da pressão arterial caudal ao longo do período de tratamento.

4.7 Sacrifício e coleta de tecidos

Vinte e quatro horas após a realização do teste de capacidade funcional, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical.

Após o sacrifício dos camundongos, foi realizada excisão do coração para ulterior pesagem. Além disso, as gorduras retroperitoneal e epididimal (que auxiliaram na estimação da gordura corporal) foram pesadas e comparadas entre os grupos.

O sangue será centrifugado para separação do plasma e guardados em freezer -80° C.

Os corações foram submetidos à separação das câmaras em átrios,

ventrículo direito e ventrículo esquerdo, sendo que o septo ventricular em sua

totalidade fez parte do ventrículo esquerdo. Em seguida, as câmaras foram pesadas

separadamente. Apenas os átrios foram pesados conjuntamente. Os ventrículos

esquerdos foram rapidamente imersos em formalina tamponada 4% por 48 horas,

para ulterior processamento histológico.

4.8 Análise morfométrica cardíaca

Após 48 horas de fixação, o ventrículo esquerdo foi submetido ao processamento histológico habitual, com cortes de quatro micra e coloração por hematoxilina-eosina ou picrossírius. A análise morfométrica cardíaca foi realizada pela medida do diâmetro transverso dos cardiomiócitos e da avaliação do grau de fibrose do miocárdio. Estes experimentos foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. José Eduardo Krieger (InCor-FMUSP).

A medida do diâmetro transverso dos cardiomiócitos foi realizada em sistema computadorizado (LEICA QUANTIMET 500), com aumento de 400x. Os cardiomiócitos utilizados para medida estavam localizados na parede livre do ventrículo esquerdo e orientados em corte longitudinal. O critério de escolha foi a integridade do cardiomiócito e a localização central do núcleo. O diâmetro dos cardiomiócitos foi considerado a partir de uma média de 10 valores medidos para cada animal.

Uma outra parte dos ventrículos esquerdos foram armazenados em formalina 4% foram destinados à análise quantitativa de colágeno. Os ventrículos esquerdos foram cortados em quatro níveis equidistantes em anéis de 5 µm ao longo de seu maior eixo. Os anéis foram embebidos em parafina e corados com Picrossírius. A seguir, o grau de fibrose do miocárdio foi avaliado pelo método de volumetria de pontos através de microscópio óptico. O volume relativo ocupado por tecido conjuntivo nos ventrículos foi medido aleatoriamente com uma ocular especial contendo um retículo de integração de 25 pontos (cinco linhas paralelas com cinco pontos cada). Foi avaliado o número de vezes em que os pontos caem sobre tecido conjuntivo em 25 campos microscópicos. A fração de volume ocupada por tecido conjuntivo (Ppi) foi calculada através da fórmula:

Ppi = p/P

Onde, p é a soma do número de pontos que caem sobre áreas

preenchidas com tecido conjuntivo, P é o número total de pontos que caem no

campo total da lâmina. Esta análise teve como objetivo identificar possíveis alterações histopatológicas decorrentes da miocardiopatia tóxica desenvolvida pelos camundongos KO e o possível remodelamento cardíaco após o período de tratamento farmacológico.

4.9 Análise estatística

Os dados obtidos neste estudo estão apresentados na forma de média ± erro padrão da média. A porcentagem de sobrevida foi analisada pelo teste Mantel- Haenszel logrank e modelo de regressão de Cox.

As variáveis peso corporal, pressão arterial caudal, freqüência cardíaca, tolerância ao esforço e ecocardiograma, foram comparados entre os grupos pela análise de variância de um caminho (ANOVA) para medidas repetidas. O peso das gorduras, diâmetro de miócitos e fração de colágeno pela analise de variância de um caminho.

Em caso de significância foi utilizado post-hoc de Tukey. Para todas as análises, foram adotados como nível de significância valores com p ≤0,05.

5 RESULTADOS

Apresentaremos na presente seção os resultados do estudo realizado com

camundongos controle e camundongos KO, subdivididos de acordo com a TABELA

2.

TABELA 2- Amostra utilizada e distribuição entre os grupos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO)

Grupo controle Grupo KO

Salina 22

Salina 22

Propranolol 22

Metoprolol 30

Carvedilol 20

5.1 Teste de tolerância ao esforço

Antes e após o período de tratamento dos animais foram realizados testes de exercício progressivo escalonado até a exaustão, em esteira rolante, com o intuito de verificar a tolerância ao esforço nos camundongos controle e com cardiomiopatia.

Observamos que os animais KO apresentaram intolerância ao esforço aos cinco meses de idade quando comparados aos camundongos controle de mesma faixa etária (FIGURA 2). Essa resposta se manteve aos sete meses de idade.

Interessante nos camundongos KO, o tratamento com antagonistas β-adrenérgicos

não modificou a tolerância ao esforço.

100 150 200 250 300 350 400 450

CO KOS KOP KOM KOC

Distânciapercorrida(m)

pré-tratamento pós-tratamento

* *

FIGURA 2- Distância percorrida no teste de esforço antes e após período de experimento em camundongos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C)

* Diferença significativa vs KO

Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de variância de um caminho (ANOVA) para medidas repetidas com post-hoc de Tukey. (p ≤ 0.05)

5.2 Medidas cardiovasculares

5.2.1 Evolução da pressão arterial caudal e freqüência cardíaca

Na FIGURA 3 observamos que o comportamento da pressão arterial caudal medida nos grupos estudados ao longo de oito semanas de experimento.

Conforme observado, não encontramos alteração da PA caudal em nenhum dos

grupos estudados. A não modificação da pressão arterial nesse modelo genético de

cardiomiopatia por hiperatividade simpática já era esperada e foi demonstrada anteriormente em nosso laboratório.

40 60 80 100 120 140 160 180 200

1 2 3 4 5 6 7 8

P .A (m m H g) ^CO

KOS KOP KOM KOC

FIGURA 3- Resposta da pressão arterial ao longo do período de experimento em camundongos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C)

Na FIGURA 4 observamos que a freqüência cardíaca durante o período

de tratamento. Nos camundongos KO tratados com salina observamos taquicardia

basal típica desse modelo de cardiomiopatia. Esses resultados de freqüência

cardíaca demonstram que as doses dos antagonistas β -adrenérgicos utilizados no

projeto de pesquisa são de fato equipotentes em reduzir a freqüência cardíaca, o que

facilitou a comparação intergrupos. Além disso, a redução da freqüência cardíaca

parece estar associada à melhora na função sistólica, representada pela fração de

encurtamento como pode ser observado na FIGURA 5.

450 500 550 600 650 700 750 800 850

1 2 3 4 5 6 7 8

semanas

FC (b pm ) CO

KOS KOP KOM KOC

# #

FIGURA 4- Resposta da freqüência cardíaca durante o período de experimento em camundongos controle (CO) com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M) e carvedilol (C)

# Diferença significativa vs CO,KOP, KOM e KOC

Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas com post-hoc de Tukey. (p ≤ 0.05)

5.3 Avaliação da função ventricular

Observamos na FIGURA 5 a realização do exame ecocardiográfico em

camundongos. Portanto, a seguir, apresentaremos os dados de fração de

encurtamento (índice de função sistólica) obtidos antes e após o período de dois

meses de tratamento com antagonistas β-adrenérgicos, com o intuito de verificar o

efeito respectivo dos antagonistas β -adrenérgicos de diferentes gerações sobre a

função sistólica. Os camundongos KO tratados com salina apresentaram redução de

fração de encurtamento quando comparados aos camundongos controle de mesma

faixa etária, (15% vs 21% respectivamente p ≤ 0,05). Interessante, o tratamento com

antagonistas β-adrenérgicos, independente da geração utilizada, restaurou a fração de encurtamento nos camundongos KO.

0 5 10 15 20 25

CO KOS KOP KOM KOC

FS (% )

pré-tratamento pós-tratam ento

#

#

#

# #

* * *

FIGURA 5- Fração de encurtamento (FS) antes e após período de experimento em camundongos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C)

* Diferença significativa para pré-tratamento (p ≤ 0.05)

# Diferença significativa para CO e pós-tratamento (p ≤ 0.05)

Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de variância de um caminho (ANOVA) para medidas repetidas com post-hoc de Tukey.

Na TABELA 3 observamos os dados de diâmetro do ventrículo

esquerdo durante a sístole e durante a diástole obtidos no exame

ecocardiográfico. Além disso, podemos observar a freqüência cardíaca durante o

exame.

Embora não tenhamos observado diferença significante no diâmetro

diastólico final do ventrículo esquerdo dos camundongos KO quando comparados

aos camundongos do grupo controle, o diâmetro sistólico final estava

significantemente aumentado nos camundongos KO tratados com salina em

relação aos demais grupos estudados. Esses dados sugerem que o tratamento

com antagonistas β-adrenérgicos reverte a dilatação do ventrículo esquerdo em

sístole nos camundongos com cardiomiopatia. Interessante, durante o exame a

freqüência cardíaca entre os grupos estudados foi mantida semelhante para que

evitássemos sua influencia sobre a contratilidade, já que o aumento da

freqüência cardíaca aumenta a contratilidade cardíaca.

TABELA 3- Diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo (DSFVE) diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (DDFVE) e freqüência cardíaca (FC) durante exame ecocardiográfico em camundongos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C).

*Diferença significativa para CO pré CO pós, KOP pós, KOM pós e KOC pós (p ≤ 0.05). Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de variância de um caminho (ANOVA) para medidas repetidas com post-hoc de Tukey.

5.4 Avaliação da massa corporal ao longo do período de tratamento

A evolução do peso corporal dos animais utilizados no experimento foi acompanhada durante as oito semanas de tratamento, e, como se observa na FIGURA 7, não houve diferença significativa no peso dos camundongos durante tal período.

DSFVE pré (mm)

DSFVE pós (mm)

DDFVE pré (mm)

DDFVE pós (mm)

FC pré (bpm)

FC pós (bpm) CO

3,01 ± 0,08 2,99 ± 0,08 3,86 ± 0,09 3,85 ± 0,09 433 ± 31 448 ± 38

KOS

3,35 ± 0,02 3,36 ± 0,07* 3,96 ± 0,02 3,97 ± 0,09 451 ± 42 437 ± 45

KOP

3,38 ± 0,07 3,16 ± 0,05 4,04 ± 0,07 4,01 ± 0,05 435 ± 31 440 ± 35

KOM

3,40 ± 0,05 3,10 ± 0,03 4,05 ± 0,06 4,02 ± 0,09 455 ± 37 464 ± 44

KOC

3,25 ± 0,04 3,03 ± 0,06 3,94 ± 0,06 3,96 ± 0,08 461 ± 44 457 ± 35

10 15 20 25 30 35 40

1 2 3 4 5 6 7 8

semanas

P es o (g ) ^CO _KOS

KOP KOM KOC

FIGURA 6- Evolução do peso corporal (PC) ao longo do período de experimento nos grupos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C

Observamos na FIGURA 7 o peso das gorduras retroperitoneal (A) e epididimal (B) corrigido pelo comprimento da tíbia após o período experimental nos grupos estudados. Apesar de uma haver tendência de queda nos camundongos KO tratados com salina (p = 0,095), não observamos diferença significativa do peso da gordura retroperitonial entre os grupos estudados.

Entretanto, quando analisamos o peso da gordura epididimal observamos que os

camundongos KO tratados com salina apresentaram valores significativamente

menores quando comparado com os demais grupos estudados.

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

CO K O S K O P K O M K O C

g/ cm

A

*

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08

CO K O S K O P K O M K O C

g/ cm

B

FIGURA 7- Peso das gorduras retroperitoneal (A) e epididimal (B) após período de experimento em camundongos controle (CO) com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C)

* Diferença significativa para CO, KOP, KOM, KOC (p ≤ 0.05)

Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de

variância de um caminho (ANOVA) para medidas repetidas com

post-hoc de Tukey

5.5 Análises morfológicas e morfométricas cardíacas

5.5.1 Peso das câmaras cardíacas, diâmetro dos cardiomiócitos cardíacos e fração de colágeno cardíaco

Na FIGURA 8 observamos que o peso do ventrículo esquerdo corrigido

pelo comprimento da tíbia dos animais KO apresentaram um aumento significante

quando comparados aos animais controle e KO tratados com antagonistas β-

adrenérgicos.

FIGURA 8- Peso das câmaras cardíacas corrigido pelo comprimento da tíbia ao término do período de experimento em camundongos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C)

* diferença significativa vs KOP, KOM e KOC

Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de variância de dois caminhos (ANOVA) com post-hoc de Tukey. (p ≤ 0.05)

O diâmetro dos cardiomiócitos de camundongos controle e KO está apresentado na FIGURA 9. Os camundongos KO tratados com salina apresentaram aumento significante do diâmetro dos cardiomiócitos quando comparados com os camundongos controle e KO tratados com antagonistas β- adrenérgicos. No entanto, vale a pena ressaltar que enquanto o tratamento dos camundongos KO com propranolol e carvedilol reduziram parcialmente o diâmetro dos cardiomiócitos, o tratamento desses animais com metoprolol restabeleceu as dimensões dos cardiomiócitos que passaram a ser semelhantes as dos camundongos controle.

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08

Átrio VD VE P.Total

Pe so (g /c m ) CO

KOS KOP KOM KOC

*

Na FIGURA 10 observamos a fração de colágeno em camundongos

controle e camundongos KO. Os camundongos KO tratados com salina

apresentaram a fração de colágeno significantemente aumentada (3x) em relação

aos camundongos controle. Interessante notar que somente os camundongos KO

tratados com metoprolol apresentaram uma redução parcial e significativa da fração

de colágeno cardíaco, o mesmo não acontecendo com os camundongos KO tratados

com propranolol e carvedilol.

FIGURA 9- Diâmetro dos cardiomiócitos após o período de experimento nos grupos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C)

* diferença significante vs Grupo CO salina (p< 0,05).

# diferença significante vs KOS e KOC (p< 0,05).

Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de variância de dois caminho (ANOVA) com post-hoc de Tukey.

0 5 10 15 20 25

CO KOS KOP KOM KOC

m ic rô m et ro s

*

* *

# #

#

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

CO KOS KOP KOM KOC

Fr aç ão de co lá ge no (% )

*

*

*

# *

FIGURA 10- Fração de colágeno após o período de experimento nos grupos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C)

* diferença significante vs CO salina (p< 0,05).

# diferença significante vs KOS e KOC (p< 0,05).

Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de variância de dois caminho (ANOVA) com post-hoc de Tukey.

5.6 Mortalidade ao longo do estudo

Ao longo do protocolo experimental, obtivemos uma alta taxa de mortalidade dos camundongos KO em função do agravamento da cardiomiopatia.

Os camundongos KO tratados com salina apresentaram uma mortalidade de 50% ao longo dos 2 meses de estudo. Os camundongos KO tratados com

propranolol apresentaram uma redução da taxa de mortalidade (24%) que foi inferior

à redução observada pelo tratamento com metoprolol e carvedilol (31%).

0 10 20 30 40 50 60 20

40 60 80 100

Tempo (Dias)

Ta xa de m or ta lid ad e (% ) CO

KOM KOC KOP KOS*

FIGURA 11- Curva de mortalidade durante o período de experimento nos grupos controle (CO) e com deleção dos receptores α

/ α

adrenérgicos (KO) tratados com salina (S), propranolol (P), metoprolol (M), e carvedilol (C).

* Diferença significativa vs CO e KOP, KOM e KOC

Os dados foram comparados entre os grupos pela análise de Haenszel logrank e modelo de regressão de Cox (p 0.05)

6 DISCUSSÂO

Em sumário, o tratamento com antagonistas dos receptores β-adrenérgicos em camundongos KO:

1- Não modificou a tolerância ao esforço, ou seja, os camundongos KO

permaneceram intolerantes ao esforço quando comparados aos camundongos

controle.

2- Reduziu a freqüência cardíaca de repouso em níveis semelhantes aos dos camundongos controle, de maneira equipotente entre as gerações utilizadas no estudo.

3- Não modificou a pressão arterial

4- Restaurou a função sistólica estimada a partir da fração de encurtamento e restabeleceu a dimensão do ventrículo esquerdo em sístole.

5- Reduziu o peso do ventrículo esquerdo que tornou-se então semelhante ao do grupo controle.

6- Teve efeito diferenciado sobre o diâmetro dos cardiomiócitos. Enquanto propranolol e carvedilol reduziram parcialmente o diâmetro dos cardiomiócitos, o metoprolol restabeleceu as dimensões dos cardiomiócitos dos camundongos KO que passaram a ser semelhantes aos dos camundongos controle.

7- Teve efeito diferenciado sobre a fração de colágeno. Somente o metoprolol foi capaz de reduzir, mesmo que parcialmente, a fração de colágeno cardíaco nos camundongos KO.

8- Teve efeito diferenciado sobre a mortalidade. Enquanto que o metoprolol e carvedilol reduziram a alta taxa de mortalidade dos camundongos KO (50%) em 31

%, o propranolol reduziu-a em apenas 24 %.

6.1 Tolerância ao esforço

Uma das principais características dos pacientes portadores de insuficiência cardíaca é a reduzida capacidade de realização de esforço físico (RUBIM, NETO, ROMEO & MONTERA, 2006). Por essa razão, a capacidade de realização de esforço vem sendo utilizada como um índice importante para diagnosticar a gravidade da doença e referir o paciente para cirurgia de transplante cardíaco (GRIGIONE, RUSSO, POTENA, IELASI, FABBRI, BACHI-REGGIANI, CARIGI, MASURACA, BIGLIARDDI, COCCOLO, MAGNARI, SPECCHIA, MAGELLI

& BRANZI, 2006). Em adição, o teste de tolerância ao esforço é também utilizado

para testar a eficácia do medicamento utilizado no tratamento de portadores de

insuficiência cardíaca (RUBIM et al., 2006).

A intolerância ao esforço físico está associada a um consumo de oxigênio reduzido. Segundo a Lei de Fick

, o consumo de oxigênio é influenciado tanto pelo débito cardíaco quanto pela diferença arterio-venosa de oxigênio. Dessa maneira o consumo de oxigênio representa a capacidade do coração em ofertar oxigênio para os tecidos, além da capacidade de determinado tecido (músculo esquelético em caso de exercício) em utilizar o oxigênio que está sendo ofertado. Com isso, podemos dizer de maneira simplificada, que o consumo de oxigênio está relacionado a fatores centrais (coração) e fatores periféricos (músculo esquelético).

Nós observamos que nenhum dos antagonistas β-adrenérgicos melhorou a tolerância ao esforço após dois meses de tratamento. A limitação na tolerância ao esforço apresentada em pacientes com insuficiência cardíaca, mesmo após a terapia com antagonistas β-adrenérgicos, está associada a uma limitada capacidade de aumento do consumo máximo de oxigênio (DE MATOS et al., 2004; FOLEY, BRUBAKER, MATRAZZO, BERRY, PRIBANICH & MILLER, 1997; WHITTE, THACKRAY, NIKITIN, CLELAND & CLARK, 2005). De fato, como esse tipo de medicamento restringe a resposta da freqüência cardíaca ao exercício, acabará reduzindo o débito cardíaco e por fim o consumo de oxigênio nos portadores de insuficiência cardíaca em exercícios de intensidades mais altas. Além disso, os antagonistas β-adrenérgicos têm muito pouco efeito sobre a musculatura esquelética, outro fator que poderia afetar a resposta do consumo de oxigênio ao exercício físico.

Em trabalho prévio de nosso grupo observamos que o tratamento de portadores de insuficiência cardíaca com carvedilol por seis meses não alterou a resposta do fluxo sanguíneo e resistência vascular periférica tanto em repouso quanto durante a execução de exercício de preensão de mãos (DE MATOS et al., 2004). Esses dados corroboram os achados de HRYNIEWICZ, ANDRONE, HUDAIHED e KATZ (2003) que também não observaram alterações nas respostas de resistência vascular periférica e fluxo sanguíneo em portadores de insuficiência cardíaca. Apesar da conhecida propriedade vasodilatadora do carvedilol (antagonismo de receptores α

- adrenérgicos), tal propriedade parece exercer pouco efeito sobre o aporte sanguíneo ofertado para o músculo em exercício.

3-Adolph Fick, médico alemão que viveu entre os anos de 1829 e 1901 e propôs a Lei de Fick que

Essa resposta muito provavelmente se deve a desensibilização desses receptores a ação dos antagonistas α

-adrenérgicos em longo prazo. Outra possível limitação da terapia com antagonistas β-adrenérgicos sobre a oferta de oxigênio para o músculo esquelético diz respeito a sua ação sobre os receptores β

-adrenérgicos no músculo liso, que têm a função de relaxar o músculo liso e consequentemente promover vasodilatação. Com isso a ação de antagonistas β-adrenérgicos não seletivos pode promover queda do aporte sanguíneo para a musculatura esquelética limitando assim a capacidade de realizar esforço físico.

Vale a pena ressaltar que os estudos vêm demonstrando que o tratamento com antagonistas β-adrenérgicos não proporciona aumento na capacidade máxima de realização de esforço físico tiveram a duração de no máximo seis meses (GULLESTAD, DOLVA, SOYLAND & KJEKSHUS, 1988; KONHO, YOSHIKAWA, YOSHIZAWA, NAKAMURA, ANZAI, SATOH & OGAWA, 2005; WHITTE, et al., 2005). Entretanto, em recente estudo que avaliou a tolerância ao esforço ao longo de 12 meses (PATRIANAKOS, PARTHENAKIS, MAVRAKIS, DIAKAKIS, CHLOUVERAKIS & VARDAS, 2005), os autores observaram que após esse período de tratamento com carvedilol e nevibolol havia um aumento na tolerância ao esforço.

Interessante citar que no mesmo estudo não observava-se aumento na tolerância ao esforço em avaliação feita no terceiro mês de tratamento. Portanto, esses dados sugerem que o tratamento com antagonistas β-adrenérgicos pode causar algum tipo de adaptação que repercuta em aumento na tolerância ao esforço em tratamentos com maior duração.

Uma das limitações de nosso estudo foi não avaliar a capacidade de realização de esforço em intensidades submáximas, pois parece ser consenso que em intensidades submáximas de esforço físico o tratamento com antagonistas β- adrenérgicos é efetivo (DEMERS, Mc KELVIE, NEGASSA & YUSUF, 2001;

GULLESTAD, et al., 1988; POELZL, FRICK, LACKNER, HUEGEL, ALBER, MAIR, HEROLD, SCHWARZACHER, PACHINGER, & WEIDINGER, 2006). Testes de esforço submáximos vêm sendo utilizados com freqüência no diagnóstico da insuficiência cardíaca, pois não exigem um grande aumento da freqüência cardíaca.

Essa característica é importante na medida em que o bloqueio dos receptores

adrenérgicos não interfere no resultado e consequentemente na interpretação dos resultados obtidos durante o teste. Por essa razão um dos testes diagnósticos usados no diagnóstico da insuficiência cardíaca é o teste de seis minutos (DEMERS et al., 2001) aonde o paciente tem que executar uma caminhada durante seis minutos. Futuramente pretendemos avaliar o consumo de oxigênio em teste de esforço submáximo nesses animais KO para verificar se o tratamento com antagonistas β-adrenérgicos pode ter alguma repercussão na realização de esforço numa condição de menor solicitação de aumento do débito cardíaco.

6.2 Medidas cardiovasculares

Não observamos alteração na pressão arterial dos camundongos KO.

Poderia-se especular sobre o aumento da pressão arterial em função desses animais apresentarem hiperatividade simpática. No entanto, como esses animais apresentam uma redução importante da fração de encurtamento (FIGURA 5) e provavelmente do débito cardíaco, isso poderia se contrapor ao aumento da resistência vascular periférica e consequentemente a pressão arterial não se alteraria. Ainda quanto à resposta da pressão arterial ao tratamento, esperávamos que a propriedade vasodilatadora do carvedilol pudesse repercutir em queda da pressão arterial, porém tal resposta não foi observada. No entanto, o uso crônico de carvedilol leva a dessensibilização de receptores α

-adrenérgicos (KUBO et al., 2001) o que minimizaria a ação vasodilatadora desse antagonista β-adrenérgico.

Quanto à resposta da freqüência cardíaca ao longo do estudo, observamos que os animais KO tratados com salina apresentaram taquicardia característica do modelo. O tratamento com propranolol, metoprolol e carvedilol proporcionou uma queda na freqüência cardíaca de igual magnitude (FIGURA 4) e a freqüência cardíaca passou a ser semelhante a dos camundongos controle. Esse resultado nos deu segurança para realizar comparações entre as respostas ao uso desses medicamentos, uma vez que tem sido preconizado que somente doses equipotentes de antagonistas β-adrenérgicos podem ter seus efeitos comparados (TALBERT, 2004). Alternativa que poderíamos ter adotado para equiparar as doses dos

β-adrenérgicos

equimolares de propranolol, metoprolol e carvedilol. No entanto, preferimos utilizar a freqüência cardíaca como indicador do efeito do bloqueio β-adrenérgico, por ter mais proximidade ao que é realizado em estudos clínicos.

O uso de antagonistas β-adrenérgicos leva a uma queda importante no trabalho cardíaco. O trabalho cardíaco além de ser influenciado pela freqüência cardíaca, está relacionado com a força de contração do miocárdio. A diminuição do trabalho cardíaco leva a uma menor demanda energética e menor produção de metabólitos provenientes da contração cardíaca. A diminuição da força de contração do músculo cardíaco tem importante repercussão no aumento do aporte sangüíneo do miocárdio, na medida em que diminui da pressão intra-ventricular ao longo do ciclo cardíaco (FOX & MATHEWS, 1983). Essa menor pressão dentro das cavidades cardíacas facilita a circulação de sangue nas artérias coronárias aumentando a oferta de oxigênio e remoção de metabólitos. A oferta de oxigênio para o miocárdio melhora em função da redução do trabalho cardíaco e contribui para a manutenção dos estoques de ATP e pH intracelular. De fato, recentemente foi demonstrado que o aumento das concentrações de adenosina em função da hidrólise do ATP está relacionado com a gravidade da insuficiência cardíaca (CHIDA, OTANI, KOHZUKI, KAGAYA, TAKAI, TAKAHASHI, YAMADA & ZUGUCHI, 2006). O aumento da demanda energética em função do aumento do trabalho cardíaco, além de gerar aumento nas concentrações de adenosina também gera aumento de metabólitos que alteram o pH intracelular e aumenta a produção fosfato inorgânico (P

) que tem ação direta sobre a força de contração reduzindo-a. O aumento na concentração de P

intracelular interfere na função de inúmeras enzimas envolvidas na produção de energia, assim como na sensibilidade dos miofilamentos ao cálcio (LIOU & CHANG, 2004).

6.3 Avaliação da função sistólica

Os parâmetros de função sistólica como a fração de ejeção e a fração de encurtamento são normalmente utilizados para fins de prognóstico e como indicadores da progressão da insuficiência cardíaca (FRIGERIO & ROUBINA, 2005).

Atualmente é consenso na literatura que o tratamento da insuficiência cardíaca com