AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES
Clayton Queiroz Alves
1Hugo Neves Brandão
2Jorge Maurício David
3Juceni Pereira David
4Luciano da S. Lima
5RESUMO: Este trabalho descreve a avaliação da atividade antioxidante de alguns flavonóides isolados de plantas da região do semi-árido. Os flavonóides selecionados foram submetidos aos testes de inibição da oxidação do β-caroteno promovido pelo ácido oleanólico e o de seqüestro do radical DPPH. Esses testes foram acompanhados por espectrofotometria, utilizando-se como controle positivo o pirogalol, ácido gálico e quercetina. Pelos resultados observados, pode-se constatar que a atividade antioxidante dos flavonóides é dependente da presença de grupos hidroxílicos como substituintes e de sua coplanaridade.
Palavras-chave: Atividade antioxidante; Flavonóides; Seqüestro de radicais.
ABSTRACT: This work describes the antioxidant evaluation of flavonoids isolated from plants of Brazilian semi-arid region. The compounds were submitted to autooxidation of β-carotene in the system containing linollenic acid and the also the DPPH assays. These experiments were monitored by spectrophotometry employing as positive control pirogalol, gallic acid and quercetin. The results show that the antioxidant activities of the flavonoids is dependent of the presence of hydroxyl groups and the coplanarity of the structure.
Key-words: Antioxidant activity; Flavonoids; Radicalar quenching
1 Introdução
Flavonóides são substâncias pertencentes a uma classe de produtos naturais que atualmente podem ser consideradas micronutrientes. Estão presentes na dieta humana rica em vegetais e frutas,
1 Mestre em Química – UFBA e doutorando do Programa de Pós-Graduação em Química do Instituto de Química UFBA. E-mail: cleiroz@yahoo.com.br
2 Mestre em Química – UFBA. Professor. Auxiliar do Departamento de Farmácia da UEFS, doutorando do Programa de Pós-Graduação em Química do Instituto de Química UFBA.. E-mail: hugo@ufba.br
3 Doutor em Química – USP. Professor do Instituto de Química da UFBA. E-mail: jmdavid@ufba.br
4 Doutora em Química – USP. Professor do Instituto de Química da UFBA. E-mail: juceni@ufba.br
5 Mestre em Química – UFBA e doutorando do Programa de Pós-Graduação em Química do Instituto de Química
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que são as principais fontes dessas substâncias. De modo geral, os polifenóis e em particular os flavonóides possuem estrutura ideal para o seqüestro de radicais, sendo antioxidantes mais efetivos que as vitaminas C e E. A atividade antioxidante dos flavonóides depende da sua estrutura e pode ser determinada por cinco fatores: reatividade como agente doador de H e elétrons, estabilidade do radical flavanoil formado; reatividade em frente a outros antioxidantes, capacidade de quelar metais de transição e solubilidade e interação com as membranas (BARREIROS et al, 2000). De modo geral, quanto maior o número de hidroxilas, maior a atividade como agente doador de H e de elétrons. Flavonóides monoidroxilados apresentam atividade muito baixa, por exemplo, a 5-hidroxi- flavona tem atividade não-detectável (CAO et al, 1997). Entre os flavonóides diidroxilados, destacam-se aqueles que possuem o sistema catecol (3’,4’-diidroxi) no anel B. Os flavonóides com múltiplas hidroxilas como a quercetina (1), miricetina (2), luteolina (3), fustina (4), eriodictiol (5) e taxifolina (6) possuem forte atividade antioxidante (Figura 1) quando comparados ao
α
-tocoferol, ácido ascórbico,β
-caroteno (Yang et al, 2001).Este trabalho descreve a avaliação da atividade antioxidante de flavonóides isolados de plantas do semi-árido nordestino quanto ao poder de seqüestro do radical DPPH e da inibição da oxidação do β-caroteno no sistema β-caroteno/ácido linoléico.
Figura 1: Flavonóides com atividade antioxidante
O
O
OH OH
OH OH
O H
1
O
O
OH OH
OH OH
O
H OH
2
O
O
OH OH
OH O H
3
O
O
OH OH O
H
OH
4
O
O
OH OH O
H
OH 5
O
O
OH OH O
H
OH
OH
6
HO O
OH OH
OH O
O OH HO
O OH HO
2 Parte Experimental
Os flavonóides testados (Figura 2) foram isolados das folhas de Cenostigma gardenerianum (Ref.
Clayton), Cratylia mollis (Ref. Luciano) e Moldenhawera nutans (VALE et al, 2005) a partir de seus extratos metanólicos através de métodos cromatográficos usuais e foram caracterizados por métodos espectrométricos (IV, UV, EM e RMN). DPPH, β-caroteno, ácido linolênico foram obtidos da Aldrich; o pirogalol da Merck e o ácido gálico isolado de fontes naturais (VALE et al., 2005). As reações foram monitoradas em espectrofotômetro Cary I da Varian.
Figura 2: Flavonóides testados
HO O
OHOH O
OH OH OH O
O
O OH HO
O OH OH
O
O OH HO
OH
OH HO
OH O O
7 8 9
HO O
OHOH O
O
OH O
O OH HO
O OH OH
O
O OH HO
OH
O
O OR2 HO
MeO OH OH
OR1
10 11 12 R1=R2=H
13 R1=Glu, R2=H 14 R1=Gal, R2=H 15 R1=Xil, R2=galoil
Teste da Inibição da co-oxidação do β-caroteno: A atividade antioxidante in vitro das substâncias
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provocada pela adição de ácido linoléico. Este método foi desenvolvido por Marco (1968) e modificado por Miller (1971). Resumidamente, a mistura de 1,0mL de solução de β-caroteno (0,2mg/mL em CHCl3); 20mg ácido linoléico e 200mg de Tween 60 foi submetida à completa evaporação do clorofórmio. Em seguida, então adicionados 90mL de água destilada, agitando-se vigorosamente para promover a aeração. Substâncias puras (50, 100 e 200 µg) foram adicionadas às cubetas contendo 2,5mL da emulsão do sistema β-caroteno/ácido linoléico, sendo a reação acompanhada no espectrofotômetro em λ = 470nm, com leitura imediata e em intervalos de 15min, durante 1h, incubando as cubetas a 50ºC. As análises foram realizadas em triplicatas, empregando-se quercetina (1) como padrão positivo, acompanhadas por controle sem adição de substância-teste. A capacidade antioxidante foi expressa em percentual de inibição da oxidação através do decaimento da absorbância, medido em relação ao controle (quercetina ou ácido gálico).
Fórmula para cálculo de Atividade Antioxidante:
AA= 100 [1- (A0 – At) / (A00 – At0)]
Onde:
A0= Absorbância inicial da amostra At= Absorbância final da amostra A00= Absorbância inicial do branco At0= Absorbância final do branco
Seqüestro do radical livre DPPH: Esse teste avalia a habilidade que uma substância tem de seqüestrar o radical livre estável DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e está baseado no descoramento de uma solução composta pelo radical estável, de cor violeta, quando da adição de substâncias que podem ceder um átomo de hidrogênio (BRAND-WILLIAMS et al., 1995). Para esse procedimento, foi preparada solução etanólica de DPPH (45µg/mL) e soluções com as substâncias-testes e padrão em três concentrações diferentes (100, 50 e 25 µg/mL) em EtOH. Nesse ensaio, também foram utilizados quercetina (1), ácido gálico ou pirogalol como substâncias-referências considerando o poder de seqüestrar 100% dos radicais. As determinações foram realizadas no sistema contendo 3,0mL da solução de DPPH e 50µL de etanol para o controle, ou o mesmo volume para as soluções de padrão e amostras. As leituras das absorbâncias, a λ=517nm, foram realizadas imediatamente e
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
% de inibição
50 100 200
Concentração
1 7 8 9 10
após 30min de incubação da reação à temperatura ambiente, protegida de luz, em espectrofotômetro.
Todas as análises foram realizadas em triplicatas.
3 Discussão dos Resultados
Os resultados da atividade antioxidante das substâncias avaliadas foram expressos em percentual de inibição da oxidação (Figuras 3 e 4), mostram que algumas delas apresentam potencial antioxidante, que varia de acordo com o tipo de composto e do método utilizado.
No teste da inibição da oxidação do β-caroteno, o potencial antioxidante da substância testada é medido pela capacidade deste em seqüestrar o radical livre, gerado durante a peroxidação do ácido linoléico, ou seja, quanto mais fácil for sua oxidação, mais ele competirá com o β-caroteno na reação com os radicais, protegendo-o. O teste utilizando o radical estável DPPH mede a capacidade das substâncias testadas em doar hidrogênio radicalar a este radical, assim, quanto maior o número de hidroxilas presentes na amostra, maior sua atividade antioxidante. A estabilidade do radical formado é outro fator que influencia no potencial antioxidante, sendo maior nas substâncias que possuem maior capacidade de deslocalizar o radical pela estrutura (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).
Nos testes realizados, observou-se que as substâncias 7 e 8 apresentaram excelente atividade antioxidante, chegando a ser, em algumas concentrações, mais efetivas que 1 utilizada como padrão (quercetina). A substância 10 apresentou atividade moderada em ambos os métodos e a substância 9 não apresentou atividade.
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0 20 40 60 80 100 120
% de seqüestro
25 50 100
Concentração 1 7 9 10 11
0 20 40 60 80 100
30 60 120
Concentração
% de sequestro
Ac. Gálico 12
Figura 3: Gráfico do teste da inibição da oxidação do β-caroteno dos flavonóides 7-10
Figura 4: Gráfico do teste do seqüestro de radicais livres (DPPH) dos flavonóides 7-10
Figura 5 – Gráfico do teste do seqüestro de radicais livres (DPPH) do flavonóide 12 em relação ao ácido gálico
Nas Tabelas 1 e 2 encontram-se descritos os resultados de atividade antioxidante observados para as substâncias 12-15. Dentre esses flavonóides, o que apresentou atividade mais considerável foi a laricetrina 5-galoil-3-β-D-xilopiranosídeo (15) para o teste de inibição da auto-oxidação do β- caroteno e a laricetrina (12) no seqüestro do DPPH. Estes resultados estão de acordo com os observados para os flavonóides, de um modo geral, uma vez que substâncias planares, com grupos catecóis e sistema conjugado são melhores seqüestrados de radicais livres. A presença de substituintes em 13-15 (resíduos de açúcares e grupos galoil) diminui a atividade seqüestradora de
radicais, pois a estrutura do flavonóide perde a coplanaridade devido a presença de grupos volumosos. É digno de nota que a presença do galactosídeo em 15, quando comparado com o glicosídeo (13), diminue a atividade antioxidante da substância.
Tabela 1: Determinação da AA de 13-16 através do método da autooxidação do β-caroteno
Substância AA*
% AA Intervalo de confiança 95%
Laricetrina (13) 15.5 13.7 – 17.3
Substância AA*
Laricetrina 3-β-glicosídeo (14) 17.8 16.0 – 19.6
Laricetrina 3-β-galactosídeo (15) 25.9 23.1 – 28.7 Laricetrina 5-galoil-3-β-D-
xilopiranosídeo (16) 55.3 54.2 – 56.4
* 1mg/mL. % em relação ao ácido gálico (100%)
Tabela 2: Determinação do IC50 a partir do teste de seqüestro do DPPH para 13-16*
Substância IC50 (µM) Intervalo de confiança 95%
Laricetrina (13) 1.8 1.7 – 1.9
Laricetrina 3-β-glicosídeo (14) 7.5 7.1 – 7.9
Laricetrina 3-β-galactosídeo (15) 3.0 2.8 – 3.2
Laricetrina 5-galoil-3-β-D- xilopiranosídeo (16)
6.5 6.2 – 6.8
* dados obtidos a partir da comparação com o pirogalol
Referências
BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. P.; DAVID, J. M.. Estresse Oxidativo: Relação entre geração de espécies reativas e a defesa do organismo. Química nova v. 29, p. 113-123, 2006.
CAO, G. H.; SOFIC, E.; PRIOR, R. L. Antioxidant and Prooxidant Behavior of Flavonoids:
Structure-Activity Relationships. Free Radical Biology & Medicine v. 22, p. 749-760, 1997.
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YANG, B.; KOIANI, A.; ARAI, K.; KUSU, F.. Relationship of electrochemical oxidation of catechins on their antioxidant activity in microsomal lipid peroxidation. Chemical Pharmaceutical Bulletin v. 49, p. 747-751, 2001.
VALE, A. E. Do; DAVID, J. M. ; BRANDÃO, H. N. ; DAVID, J. P.. A New Flavonol Glycoside Derivative from Leaves of Moldenhawera nutans. Zeitschrift Für Naturforschung C-A Journal Of Biosciences v. 60c, p. 45-49, 2005.
MARCO, G.J. A rapid method for evaluation of antioxidants. Journal of the American Oil Chemists’ Society v.45, p.594-598, 1968.
MILLER, H.E. A simplified method for the evaluation of antioxidants. Journal of the American Oil Chemists’ Society v. 48, p.91, 1971.
BRAND-WILLIAMS, W.; CUVELIER, M.E.; BERSET, C. Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft Und-Technologie v. 28, p. 25-30, 1995.
DUARTE-ALMEIDA, J. M.; SANTOS, R. J. Dos; GENOVESE, M. I.; LAJOLO, F. M. Avaliação da atividade antioxidante, Ciência e Tecnologia de Alimentos v. 26, p. 446-452, 2006.
Agradecimentos
Os autores agradecem a FAPESB, CNPq e CAPES pelos auxílios financeiros e bolsas de estudos
