Efeito do treinamento moderado sobre o metabolismo de macrófagos de ratos envelh...

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Te se d e Do uto ra d o a p re se nta d a a o Instituto d e C iê nc ia s Bio mé d ic a s d a Unive rsid a d e d e Sã o Pa ulo , p a ra o b te nç ã o d o Título d e Do uto r e m C iê nc ia s.

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MARC ELA MENEG UELLO C O UTINHO

Te se d e Do uto ra d o a p re se nta d a a o Instituto d e C iê nc ia s Bio mé d ic a s d a Unive rsid a d e d e Sã o Pa ulo , p a ra o b te nç ã o d o Título d e Do uto r e m C iê nc ia s.

Áre a d e C o nc e ntra ç ã o : Fisio lo g ia e Bio físic a

O rie nta d o r:

Pro f. Dr. Luís Fe rna nd o Bic ud o Pe re ira C o sta Ro sa

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DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

Coutinho, Marcela Meneguello.

Efeito do treinamento moderado sobre o metabolismo de

macrófagos de ratos envelhecidos / Marcela Meneguello Coutinho. -- São Paulo, 2004.

Orientador: Luís Fernando Bicudo Pereira Costa Rosa.

Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Fisiologia e Biofísica. Área de concentração: Fisiologia Humana. Linha de pesquisa: Exercício Físico e reposta imune.

Versão do título para o inglês: Effect of aerobic training on macrophae metabolism obtained from old rats.

Descritores: 1. Exercício 2. Envelhecimento 3. Macrófago 4. Sistema imune 5. Ratos 6. Metabolismo celular I. Costa Rosa, Luís Fernando Bicudo Pereira II. Universidade de São Paulo, Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Humana III. Título.

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE C IÊNC IAS BIO MÉDIC AS

C a nd id a ta : Ma rc e la Me ne g ue llo C o utinho

Te se : Efe ito d o Tre ina me nto Mo d e ra d o So b re o Me ta b o lismo d e Ma c ró fa g o s d e Ra to s Enve lhe c id o s

O rie nta d o r: Luís Fe rna nd o Bic ud o Pe re ira C o sta Ro sa

A C o missã o julg a d o ra d o s tra b a lho s d e De fe sa d a Te se d e Do uto ra d o , e m se ssã o p úb lic a re a liza d a a ______/ ______/ ______, c o nsid e ro u a :

( ) Ap ro va d o (a ) ( ) Re p ro va d o (a )

Exa mina d o r(a ): Assina tura _________________________________________ No me _____________________________________________ Instituiç ã o _________________________________________

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DEEDDIICCAATTÓÓRRIIAA

Pa ra :

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AGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS

Ag ra d e ç o :

8 Ao G G , p e la s o p o rtunid a d e s q ue me p ro p ic ia ra m um g ra nd e c re sc ime nto p ro fissio na l e p e sso a l.

8 Aq ue le s q ue tive ra m uma p a la vra d e a p o io e c a rinho na s ho ra s ma is d ifíc e is: C o rte z, Ma ri, Fe fa , Eivo r, C id a , Ro sa na e minha q ue rid a Ma rile ne .

8 Ao Pro f. Dr. Wo tha n Ta va re s d e Lima , De p to . Fa rma c o lo g ia d o Instituto d e C iê nc ia s Bio mé d ic a s – USP, p e lo s re a g e nte s e mé to d o d e d o sa g e m d e ó xid o nítric o (NO-_).

8 Ao Pro f. Dr. Ro g e r C ha ma s, De p to . d e Ra d io lo g ia d a Fa c uld a d e d e Me d ic ina – USP, p e lo mé to d o d e q uimio ta xia e p o r g e ntilme nte no s c e d e r a s p la c a s p a ra o s p rime iro s e xp e rime nto s.

8 A e sta tístic a C le id e Ro sa na Dua rte Prisc o , d o De p to . d e Ana to mia d o Instituto d e C iê nc ia s Bio mé d ic a s – USP, p e la c o nsulto ria e a uxílio na s a ná lise s e sta tístic a s.

8 As p e sso a s q ue tive ra m uma p a rtic ip a ç ã o d ire ta na re a liza ç ã o d e ste tra b a lho : Fe rna nd a Bre d a rio l Ve lho te , Anie lle C ristine Ag ne lo D’ Ang e lo , Da nie l Fe rna nd e s d e So uza , Ma rc us Viníc ius G ia mp ie tro , Le o na rd o L. Alve s, Ale x Shimura , e Wilto n Da rle a ns d o s Sa nto s C unha . Vo c ê s fo ra m d e ma is, muuuuiiiiitttto o o o o b rig a d a !

8 Ao p e sso a l d o la b : Ana C a ro lina , Bia , C id a , Fre d , G ra zie la , He lio , Julia na , Le a nd ro , Ma uro , Mig ue l, Na tá lia , Ro na ld o , Uc hid a , Ze c a .

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8 Ao Jo sé Ma ria , d a Se c re ta ria d o Pro g ra ma Pó s G ra d ua ç ã o d o De p to . d e Fisio lo g ia Huma na , IC B – USP, p o r e sta r se mp re d isp o níve l e no s ma nte r se mp re info rma d o s.

8 Ao p e sso a l d a b ib lio te c a : Anto nio Pa ulo G o me s d a Silva , Ed ilso n O live ira Be rna d ino , Elza d e So uza - in me mo ria n, Eva Ap a re c id a d a Silva O live ira , De lza Piruna Ma rtins, Isa b e l Te re za Lo p e s d e And ra d e , Ja c inta d e O live ira C a rva lho , Ma ria d o So c o rro Be ze rra Ro c ha , Ma ria Jo sé d e Je sus C a rva lho , Ma ria Va lmira d e Lima Lo p e s, Re na ta Ma ria d o s Sa nto s, Te re za C ristina So utto Ma yo r, Wilkizila nia Ka rla Pa iva , Yo shiyuki Na ka tsub o .

8 Ao p e sso a l d o xe ro x p e lo a te nd ime nto p re sta tivo e e fic ie nte : Juc a , Silma ra , Ta lita , De ise , Ke lly, La fa ie te , G e rso n, Julia ne , Ro g é rio .

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R

REESSUUMMOO

C O UTINHO , M.M. Efe ito d o tre ina me nto mo d e ra d o so b re o me ta b o lismo d e ma c ró fa g o s d e ra to s e nve lhe c id o s. 2004. 100 f. Te se (Do uto ra d o e m C iê nc ia s) – Instituto d e C iê nc ia s Bio mé d ic a s, Unive rsid a d e d e Sã o Pa ulo , Sã o Pa ulo .

C o m o a va nç o d a id a d e o b se rva mo s a q ue d a na e fic iê nc ia d o Siste ma Imuno ló g ic o , e sta nd o re la c io na d a a o a ume nto d a mo rb id a d e e mo rta lid a d e e m id o so s. De ntre a s c é lula s d o siste ma imuno ló g ic o e nc o ntra mo s o s ma c ró fa g o s q ue g a ra nte m a o o rg a nismo a c a p a c id a d e d e d e fe sa c o ntra infe c ç õ e s, p ro life ra ç ã o d e c é lula s tumo ra is e re p a ro d e te c id o s. Uma d a s fo rma s d e re ve rte r o u a té me smo re sta ura r a lg uma s d a s funç õ e s imuno ló g ic a s c o mp ro me tid a s c o m o p ro c e sso d e e nve lhe c ime nto é a utiliza ç ã o d a p rá tic a d e e xe rc íc io a e ró b io mo d e ra d o . Po r e ste mo tivo , e stud a mo s o e fe ito d o tre ina me nto mo d e ra d o e m na ta ç ã o so b re a funç ã o e o me ta b o lismo d e ma c ró fa g o s d e ra to s e nve lhe c id o s. Em ma c ró fa g o s o b tid o s d a c a vid a d e p e rito ne a l, o b se rva mo s uma me lho ra d a c a p a c id a d e func io na l, a tra vé s d o a ume nto d a s funç õ e s d e a d e rê nc ia , q uimio ta xia e p ro d uç ã o d e p e ró xid o d e hid ro g ê nio (H2O2) e ó xid o nítric o (NO-), q ue fo ra m a c o mp a nha d a s p e lo a ume nto no me ta b o lismo d e g lic o se (a ume nto d e c o nsumo e d a e nzima he xo q uina se ), c o ntrib uind o p a ra a me lho ra d a funç ã o imune no e nve lhe c ime nto .

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ABBSSTTRRAACCTT

C O UTINHO , M. M. Effe c t o f a e ro b ic tra ining o n ma c ro p ha g e me ta b o lism o b ta ine d fro m o ld ra ts. 2004. 100 f. Te se (Do uto ra d o e m C iê nc ia s) – Instituto d e C iê nc ia s Bio mé d ic a s, Unive rsid a d e d e Sã o Pa ulo , Sã o Pa ulo .

Diso rd e rs o f the immune func tio n c o ntrib ute to the hig h inc id e nc e o f infe c tio ns a nd c a nc e r a mo ng e ld e rly p e o p le . Ma c ro p ha g e s p la y a c ruc ia l ro le in immune re sp o nse , d e stro ying b a c te ria , p a ra site s, viruse s a nd tumo ur c e lls thro ug h va rio us me c ha nisms o f a c tio n. Exe rc ise is a b le to ind uc e c ha ng e s a nd mo d ula te the immune re sp o nse . The a im o f the p re se nt wo rk wa s to e va lua te the func tio n a nd me ta b o lism o f ma c ro p ha g e s o b ta ine d fro m o ld ra ts sub mitte d to mo d e ra te e xe rc ise tra ining . Se d e nta ry a d ult (2 – 4 mo nths), o ld (15 – 18 mo nths) a nd tra ine d o ld ra ts we re stud ie d . The re sults sho w a n inc re a se in the func tio n o f ma c ro p ha g e s o b ta ine d fro m the p e rito ne a l c a vity o f tra ine d o ld ra ts c o mp a re d with o ld ra ts, re g a rd ing c he mo ta xis, hyd ro g e n p e ro xid e a nd nitric o xid e p ro d uc tio n, a s we ll a e nha nc e d g luc o se c o nsump tio n a nd inc re a se d ma xima l a c tivity o f the e nzyme s he xo q uina se a nd g luta mina se . In summa ry, o ur re sults ind ic a te tha t e xe rc ise (mo d e ra te tra ining ) stimula te s so me func tio na l a sp e c ts o f ma c ro p ha g e s o f o ld ra ts, with a c o nc o mita nt inc re a se in g luc o se me ta b o lism.

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L

LIISSTTAA DDEEAABBRREEVVIIAAÇÇÕÕEESSEESSIIGGLLAASS11

(n) Núme ro d e a mo stra s

AD Anima is Ad ulto s

C D C o mp le xo d e d ife re nc ia ç ã o

C FU-G M Unid a d e fo rma d o ra d e c o lô nia -g ra nuló c ito s e ma c ró fa g o s

C o A C o e nzima A

C PM C o nta g e m p o r minuto

C S C itra to sinta se

DNA Ác id o d e so xirrib o nuc lé ic o EPM Erro p a d rã o d a mé d ia

EV Anima is Enve lhe c id o s

EV-TR Anima is Enve lhe c id o s-Tre ina d o s f-MLP N - fo rmyl - me t - le u - p he

g G ra ma s

H2O2 Pe ró xid o d e hid ro g ê nio

HK He xo q uina se

IC AM-1 “ inte rc e lula r a d he sio n mo le c ule -1” IFN “ Inte rfe ro n”

IL Inte rle uc ina

iNO S Ó xido nítric o sinte ta se

ITRS Infe c ç õ e s d o tra to re sp ira tó rio sup e rio r Km Q uilô me tro

LPS Lip o p o lissa c a ríd e o LT Le uc o trie no

MHC C o mp le xo de ma io r histo c o mp a tib ilida de

NADPH Nic o tina mid a a d e nina d inuc le o tíd e o fo sfa to re d uzid a NK “ Na tura l kille r”

NO-_{Ó xid o}_{nítric o} O2 O xig ê nio

ºC G ra us C e lsius

PAF Fa to r d e a tiva ç ã o d e p la q ue ta s PBS Ta mp ã o fo sfa to -sa lina PG Pro sta g la nd ina

PKC Pro te ína q uina se C

PMA Éste r d e fo rb o l-mirista to RNA Ác id o rib o nuc lé ic o

RNAm Ác id o rib o nuc lé ic o me nsa g e iro Th Linfó c ito T “ he lp e r” o u a uxilia r TNF Fa to r d e ne c ro se tumo ra l

1_{As sig la s e fó rmula s q uímic a s d o s re a g e nte s d e sc rito s no c a p ítulo Ma te ria is e Mé to d o s e stã o}

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SUMÁRIO

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1 IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

No s último s a no s, ho uve um a ume nto d a p o p ula ç ã o id o sa mund ia l, e a c re d ita -se q ue e ssa p o p ula ç ã o a ume nte c a d a ve z ma is e m p ro p o rç õ e s e xp o ne nc ia is. No Bra sil, se g und o o C e nso 2000, o s id o so s re p re se nta m c e rc a d e 8% d a p o p ula ç ã o , to ta liza nd o 14.538.988 d e ha b ita nte s (Instituto Bra sile iro d e G e o g ra fia e Esta tístic a - IBG E, 2003) e a s p e rsp e c tiva s p a ra o s p ró ximo s 20 a no s é q ue 16% d a p o p ula ç ã o b ra sile ira c o rre sp o nd a a ind ivíd uo s c o m id a d e a c ima d o s 60 a no s (O rg a niza ç ã o d a s Na ç õ e s Unid a s - O NU, 2000).

C o m e sse a ume nto d a p o p ula ç ã o id o sa , c re sc e a p re o c up a ç ã o c o m o s p ro b le ma s a sso c ia d o s à sa úd e , já q ue c o m o a va nç a r d a id a d e a ume nta muito a inc id ê nc ia d e d o e nç a s e m d e c o rrê nc ia d a s a lte ra ç õ e s fisio ló g ic a s q ue a c o mp a nha m o p ro c e sso d e e nve lhe c ime nto . C o m isso , o b se rva mo s uma d iminuiç ã o d a q ua lid a d e d e vid a , a c a rre ta nd o o a ume nto d a s d ific uld a d e s e nfre nta d a s p e lo s id o so s, e p rinc ip a lme nte , le va nd o a um ma io r g a sto fina nc e iro c o m a á re a d a sa úd e (WIC K e t a l, 2000). De ssa fo rma , o e stud o d a s a lte ra ç õ e s fisio ló g ic a s e a id e ntific a ç ã o d e e stra té g ia s q ue p o ssa m minimiza r o u a té me smo re ve rte r e sta s a lte ra ç õ e s sã o d e g ra nd e imp o rtâ nc ia p a ra o id o so e p a ra a p o p ula ç ã o e m g e ra l.

De ntre a s a lte ra ç õ e s e nc o ntra d a s c o m o a va nç o d a id a d e o b se rva mo s a q ue d a na e fic iê nc ia d e a lg uma s funç õ e s d o Siste ma Imuno ló g ic o , c o nhe c id a c o mo imuno se ne sc ê nc ia , e q ue se g und o Pa we le c

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se re s huma no s, a lé m d e se r re sp o nsá ve l p e la ma io r inc id ê nc ia d e infe c ç õ e s, d o e nç a s a uto -imune s e c â nc e r.

Vá ria s sã o a s c é lula s d o Siste ma Imuno ló g ic o q ue so fre m a lte ra ç õ e s c o m o p ro c e sso d e e nve lhe c ime nto e d e ntre e la s e nc o ntra mo s o s ma c ró fa g o s, q ue fa ze m p a rte d a p rime ira linha d e d e fe sa d o o rg a nismo . Atua lme nte sa b e -se q ue e sta c é lula p o ssui inúme ra s funç õ e s q ue vã o a lé m d a q ue la s e xe rc id a s na re sp o sta imune ina ta , d e vid o , p rinc ip a lme nte , à sua g ra nd e c a p a c id a d e se c re to ra e d e a d a p ta ç ã o a d ife re nte s c o nd iç õ e s me ta b ó lic a s. Po r e ste mo tivo o e stud o d e e stra té g ia s q ue a te nue m o s e fe ito s d o e nve lhe c ime nto so b re a funç ã o ma c ro fá g ic a p o d e re fle tir d ire ta me nte na c o nd iç ã o físic a d o id o so , me lho ra nd o sua q ua lid a d e d e vid a .

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2 RREEVVIISSÃÃOO BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAA

O e nve lhe c ime nto p o d e se r visto c o mo uma ina d e q ua ç ã o d o s me c a nismo s ho me o stá tic o s, imp lic a nd o num d e c ré sc imo d a via b ilid a d e o u a ume nto d a vulne ra b ilid a d e a o e stre sse (ta nto o e stre sse c o mo fa to r inte rno o u e xte rno a o o rg a nismo ) (G REEN, 1994; a p ud TIMIRAS, 1994).

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O siste ma imuno ló g ic o é c o mp o sto p o r inúme ra s c é lula s, q ue a tua m e m d ife re nte s e ta p a s na re sp o sta p ro vo c a d a p o r a g e nte s e xte rno s o u ma lig nid a d e s. O s ma c ró fa g o s, c é lula p e rte nc e nte a o siste ma imuno ló g ic o ina to , g a ra nte m a o o rg a nismo a c a p a c id a d e d e d e fe sa c o ntra infe c ç õ e s, p ro life ra ç ã o d e c é lula s tumo ra is, re p a ra ç ã o d e te c id o s, a lé m d e a tua re m c o mo c é lula s a p re se nta d o ra s d e a ntíg e no e c é lula s e fe to ra s (e stimula d o s p e lo s linfó c ito s) (LLO BERAS e C ELADA, 2002). Po r e ste mo tivo , e sta s c é lula s p o ssue m g ra nd e imp o rtâ nc ia na re sp o sta imuno ló g ic a , se nd o se u func io na me nto e sse nc ia l p a ra a ma nute nç ã o d o siste ma imuno ló g ic a no id o so .

2.1 O Ma c ró fa g o

O s ma c ró fa g o s sã o c é lula s d a p rime ira linha d e d e fe sa d o siste ma imuno ló g ic o q ue a tua m b a sic a me nte no s p ro c e sso s infla ma tó rio s e no c o ntro le d o surg ime nto d e c é lula s tumo ra is (TANG e t a l., 2000; WO O DS e t a l., 2000). Isto o c o rre e m d e c o rrê nc ia d e sua p a rtic ip a ç ã o e m múltip lo s e ve nto s re g ula tó rio s, d o s q ua is p o d e mo s d e sta c a r a p ro mo ç ã o o u inib iç ã o d a infla ma ç ã o , a tua ç ã o no re p a ro e re no va ç ã o d e te c id o s, a ç ã o tumo ric id a e mic ro b ic id a , e inte ra ç ã o d a imunid a d e ina ta e e sp e c ífic a (HANDEL-FERNANDEZ e LO PÉZ, 2000; WO O DS e t a l., 2000).

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ny-Fo rming Unit – G ra nulo c yte Ma c ro p ha g e, C FU-G M) (G ARTNER e HIATT, 1993). A C FU-G M d á o rig e m inic ia lme nte a o s mo no b la sto s q ue p ro life ra m e SE d ife re nc ia m e m p ró -mo nó c ito s e p o ste rio rme nte g e ra m o s mo nó c ito s (AUG ER e RO SS, 1992).

Uma ve z fo rma d o s, o s mo nó c ito s p e rma ne c e m na me d ula ó sse a p o r c e rc a d e 24 ho ra s a nte s d e e ntra r na c irc ula ç ã o p e rifé ric a (Furth e Va n And Sluite r, 1986; Me ure t e Ho ffma nn, 1973) a o nd e p e rma ne c e m, e m mé d ia , p o r 25 ho ra s (AUG ER e RO SS, 1992). Em huma no s, o s mo nó c ito s re p re se nta m c e rc a d e 1 a 6% d o to ta l d e le uc ó c ito s c irc ula nte s, c o rre sp o nd e nd o a 300-700 c é lula s p o r mic ro litro d e sa ng ue (LEWIS e Mc G EE, 1992).

Ap ó s c irc ula re m p e lo o rg a nismo , o s mo nó c ito s mig ra m e se fixa m no s te c id o s, to rna nd o -se ma c ró fa g o s re sid e nte s. Ele s sã o e nc o ntra d o s na ma io ria d o s te c id o s e p o d e m se r d e no mina d o s se g und o o lug a r o nd e se e nc o ntra m, c o mo no fíg a d o - c é lula s d e 'Kup p fe r', siste ma ne rvo so c e ntra l - c é lula s mic ro g lia is, o sso s - o ste o c la sto s, p ulmã o - ma c ró fa g o s a lve o la re s, b a ç o , me d ula ó sse a , inte stino , e ntre o utro s.

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Mo rfo lo g ic a me nte o s ma c ró fa g o s p o ssue m fo rma to irre g ula r me d ind o 25 a 50 µm d e d iâ me tro (G a rtne r e Hia tt, 1993) e fa ze m p a rte d o siste ma mo no nuc le a r fa g o c itá rio , q ue te m c o mo re sp o nsa b ilid a d e re mo ve r ma te ria l o u c é lula s e stra nha s a o o rg a nismo , a lé m d e a tua r no s p ro c e sso s d e re p a ro te c id ua l (RO ITT e t a l., 2000). Assim c o mo o s o utro s fa g ó c ito s mo no nuc le a re s, o s ma c ró fa g o s p o ssue m g ra nd e c a p a c id a d e d e p ro d uç ã o e se c re ç ã o d e mo lé c ula s, justific a nd o a ssim a s sua s inúme ra s a tua ç õ e s c e lula re s (Alla ve na

e t a l., 2000), c o mo no s mo stra o Q ua d ro 2.1.

De ntre a s funç õ e s e xe rc id a s p e lo s ma c ró fa g o s d e sta c a mo s a sua c a p a c id a d e d e mig ra ç ã o p a ra o s sítio s e m re sp o sta à p re se nç a d e fa to re s q uimio a tra tivo s (q uimio ta xia ), a d e sã o , fa g o c ito se e p ro d uç ã o d e mo lé c ula s c o m fina lid a d e re g ula tó ria (ALLAVENA e t a l., 2000; FERRANDEZ e DE LA FUENTE, 1999).

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Q ua dro 2.1 – Se le ç ã o d e p ro d uto s se c re ta d o s p o r fa g ó c ito s mo no nuc le a re s.

G rupo func io na l Mo lé c ula s

Mo lé c ula s tó xic a s d e vid a c urta

8 Inte rme d iá rio s re a tivo s d o o xig ê nio (Ex: H2O2)

8 Inte rme d iá rio s re a tivo s d o nitro g ê nio (Ex: NO-₎

Pro d uto s d a C ic lo o xig e na se / Lip o xig e na se

8 Pro sta g la nd ina s (PG E2)

8 Le uc o trie no s (LT B4) Enzima s e Fa to re s d e

c o a g ula ç ã o

8 Fa to re s tissula re s: Fa to r IX, X, V e p ro tro mb ina

8 Ativa d o re s / Inib id o re s d e

p la smino g ê nio , tip o uro q uina se C o mp o ne nte s d o Siste ma

C o mp le me nto

8 Via C lá ssic a (C 1, C 2, C 3, C 4, C 5)

8 Via Alte rna tiva (Fa to r B, D e p ro p e rd ina )

Fa to re s d e c re sc ime nto 8 Fa to re s d e c re sc ime nto d e riva d o s d e p la q ue ta s – (PDG F)

8 Fa to re s d e c re sc ime nto p a ra fib ro b la sto

Fa to re s he ma to p o ié tic o s 8 Fa to r e stimula d o r d a fo rma ç ã o d e c o lô nia s-ma c ró fa g o s

C ito c ina s p ro infla ma tó ria s p rimá ria s

8 Inte rle uc ina -1 (IL-1), TNF (Fa to r d e Ne c ro se Tumo ra l), IL-6, IL-12, IL-18 C ito c ina s p ro infla ma tó ria s

se c und á ria s

8 Q uimio c ina s (´mo no c yte c he mo ta tic p ro te in 1-4’ )

C ito c ina s a nti-infla ma tó ria s 8 IL-10; ´tra nsfo rming g ro wth fa c to r β´ Re c e p to re s d e c ito c ina s 8 Re c e p to r tip o II p a ra IL-1, Re c e p to r

p a ra TNF.

(Ad a p ta d o d e ALLAVENA e t a l., 2000).

Ne ste c a so , o linfó c ito T é re sp o nsá ve l p e la lib e ra ç ã o d e c ito c ina s q ue e stimula m a sua c a p a c id a d e mic ro b ic id a e a ntitumo ric id a (Lu e t a l., 1999) e

(21)

(AUG ER e RO SS, 1992). De sta fo rma , a lte ra ç õ e s na func io na lid a d e d o s ma c ró fa g o s p o d e m mo d ula r a p ro g re ssã o d e to d a a re sp o sta imuno ló g ic a .

O ma c ró fa g o , e m g e ra l, re sp o nd e a d o is e stímulo s se q üe nc ia is, o p rime iro c o rre sp o nd e a o e stímulo inic ia liza d o r e o se g und o , d isp a ra d o r. A a tiva ç ã o d o s linfó c ito s T o u 'Na tura l Kille r' (NK) re sulta na lib e ra ç ã o d e Inte rfe ro n γ (INF-γ) q ue inic ia liza a a ç ã o a ntitumo ric id a no ma c ró fa g o , a tra vé s d a p ro d uç ã o d e Fa to r d e Ne c ro se Tumo ra l (TNF-α) e d o ó xid o nítric o (NO-_{). Alé m d isso , o INF-}_γ_{a ume nta a se nsib ilid a d e d o ma c ró fa g o à s} sub stâ nc ia s q ue func io na m c o mo 'g a tilho s d isp a ra d o re s', e ntre a s q ua is se d e sta c a m o lip o p o lissa c a ríd e o (LPS), q ue e stimula a a tivid a d e b a c te ric id a e o é ste r d e fo rb o l-mirista to (PMA), q ue e stimula a p ro d uç ã o d e p e ró xid o d e hid ro g ê nio (H2O2) (PIC K e MIZEL, 1981).

2.2 Siste ma Imuno ló g ic o e Enve lhe c ime nto

(22)

Enq ua nto q ue p a ra linfó c ito s já e stá b e m e sta b e le c id a a re d uç ã o d e a lg uma s d e sua s funç õ e s d ura nte o p ro c e sso d e e nve lhe c ime nto , p a ra ma c ró fa g o s e xiste a ind a muita c o ntro vé rsia , c o mo p o d e mo s o b se rva r no Q ua d ro 2.2, q ue re sumid a me nte mo stra a lg uns tra b a lho s q ue a b o rd a m o a ssunto .

Q ua dro 2.2 – Estud o s so b re a s a lte ra ç õ e s func io na is no e nve lhe c ime nto .

Funç ã o Alte ra ç õ e s

Núme ro d e c é lula s ↔

Pro d uç ã o d e IL-1 ↓ (Ma kino d a n e Ka y, 1980)

Ativid a d e fa g o c itá ria

↓ (De La Fue nte , 1985) ↔ (Ma kino d a n e Ka y, 1980)

↑ (C o sta Ro sa e t a l., 1993; Fe rra nd e z e De La Fue nte , 1999)

Pro d uç ã o d e H2O2 ↓ (C o sta Ro sa e t a l., 1993)

↑ (Fe rra nd e z e De La Fue nte , 1999)

Le g e nd a : ↔ Ig ua l; ↑ Aume nto ; ↓ Re d uç ã o

Alg uns a uto re s sug e re m q ue a lé m d a s a lte ra ç õ e s func io na is no s ma c ró fa g o s, há ta mb é m mud a nç a s na lib e ra ç ã o d o s me d ia d o re s infla ma tó rio s, c o mo o Ó xid o Nítric o (NO-_{) e a s Pro sta g la nd ina s (PG s), c o mo} fo i o b se rva d o p o r Mo rriso n e t a l. (1993) e Alva re z e t a l. (1996) e m e xp e rime nto s re a liza d o s in vitro e c o m o uso d o LPS c o mo e stímulo .

(23)

q ue a s c é lula s fo ra m o b tid a s, d o e sta d o func io na l d o s ma c ró fa g o s (re sid e nte s, infla ma tó rio s o u a tiva d o s), d o e sta d o d e c o mp ro me time nto d e o utra s c é lula s d o siste ma imuno ló g ic o (já q ue há uma g ra nd e inte ra ç ã o e ntre e la s) e d a id a d e e m q ue o s a nima is fo ra m e stud a d o s, p o is se sa b e q ue a s a lte ra ç õ e s no Siste ma Imuno ló g ic o sã o te mp o -d e p e nd e nte (FERRANDEZ e DE LA FUENTE, 1999).

2.3 Exe rc íc io e Siste ma Imuno ló g ic o

Uma d a s fo rma s d e se mo d ula r a re sp o sta d o siste ma imuno ló g ic o é a tra vé s d o e xe rc íc io físic o (PEDERSEN e HO FFMAN-G O ETZ, 2000). Se ssõ e s a g ud a s d e e xe rc íc io o u a q ue le s re a liza d o s c ro nic a me nte (tre ina me nto ), p o d e m, e m d e c o rrê nc ia d a inte nsid a d e , d ura ç ã o , fre q üê nc ia e d o tip o (e stá tic o e d inâ mic o ) d e a tivid a d e , a lte ra r d ive rsa s funç õ e s d o siste ma imuno ló g ic o (MAC KINNO N, 1998; NIEMAN, 1997; PEDERSEN e HO FFMAN-G O ETZ, 2000).

(24)

e xe rc íc io , há ta mb é m uma re d uç ã o na ra zã o C D4+_{/ C D8}+_{, re sulta d o d e um} ma io r a ume nto d o s Linfó c ito s c ito tó xic o s (C D8+_{) (PEDERSEN e HO} FFMAN-G O ETZ, 2000).

Lo g o a p ó s a se ssã o d e e xe rc íc io há uma re d uç ã o d o núme ro d o s le uc ó c ito s c irc ula nte s (q ue e sta va m a ume nta d o s d ura nte o e xe rc íc io ), c o m e xc e ç ã o d o s Ne utró filo s, q ue a ume nta m a ind a ma is a p ó s o té rmino d e uma lo ng a se ssã o d e e xe rc íc io (Mc C ARTHY e DALE, 1988).

Dura nte a p rá tic a d e e xe rc íc io s, e stud o s re a liza d o s e m a nima is e se re s huma no s mo stra m uma re d uç ã o d a c a p a c id a d e p ro life ra tiva d o s linfó c ito s c irc ula nte s e stimula d o s p o r a g e nte s mito g ê nic o s (NIELSEN e PEDERSEN, 1997). Pa ra o s linfó c ito s T e sta re d uç ã o p e rma ne c e me smo a p ó s o té rmino d o e xe rc íc io , ma s p a ra linfó c ito B há um a ume nto o u ma nute nç ã o d a c a p a c id a d e p ro life ra tiva (FIELD e t a l., 1991).

(25)

a lg uns p a râ me tro s d o siste ma imuno ló g ic o (Hiro ka wa , 1997; Ma c kinno n, 1998; Nie ma n, 1997; Nie ma n e t a l., 1994; Pe d e rse n e t a l., 1998; She p ha rd e t a l., 1994); e nq ua nto q ue e xe rc íc io s a g ud o s e inte nso s c a usa m um e fe ito o p o sto (NIEMAN, 1997), c o mo ilustra d o s no Q ua d ro 2.3

Q ua dro 2.3 - Mo d ific a ç õ e s d o siste ma imuno ló g ic o e m d e c o rrê nc ia d o tre ina me nto físic o (p a râ me tro s a na lisa d o s e m re p o uso ).

Pa râ me tro Mo dific a ç ã o

C o nta g e m d e Le uc ó c ito s ↔

C o nta g e m d e Mo nó c ito s ↓ d a Fa g o c ito se se o tre ina me nto é Inte nsific a d o

C o nta g e m d e Linfó c ito s ↔

↓ linfó c ito T e linfó c ito Th se o tre ina me nto é inte nsific a d o

C é lula s “ Na tura l Kille r” (NK) ↑ d a a tivid a d e

↓ d a a tivid a d e se o tre ina me nto é inte nsific a d o

Ta xa d e Pro life ra ç ã o C e lula r

↑

Imuno g lo b ulina s ↑

↓ se o tre ina me nto é inte nsific a d o (ta mb é m na e stimula ç ã o in vitro) Fa to re s So lúve is ↑ IL-1

↓ d e a lg uns e le me nto s d o Siste ma C o mp le me nto se o tre ina me nto é inte nsific a d o

Le g e nd a : ↔ Ig ua l; ↑ Aume nto ; ↓ Re d uç ã o

(Ad a p ta d o d e SHEPHARD e t a l., 1994).

(26)

tre ina d o s (PEDERSEN e t a l., 1989; TVEDE e t a l., 1991). Ma s e m e stud o s lo ng itud ina is (c o m p e lo me no s 16 se ma na s d e tre ina me nto ) nã o se o b se rva q ua lq ue r e fe ito d o tre ina me nto mo d e ra d o so b re a s c é lula s “ Na tura l kille r” (NK) (NIEMAN e t a l., 1993). Ap e sa r d a c o ntra d iç ã o e ntre muito s e stud o s, Pe d e rse n e t a l. (1998) mo stra m uma re d uç ã o na inc id ê nc ia d e Infe c ç õ e s d o Tra to Re sp ira tó rio Sup e rio r (ITRS) e m d e c o rrê nc ia d o Tre ina me nto Mo d e ra d o , c o mo p o d e mo s o b se rva r na Fig . 2.1.

Q ua ntida de e inte nsida de do e xe rc íc io

R

is

c

o

d

e

I

TR

S

Se d e ntá rio Mo d e ra d o Muito inte nso Ab a ixo d a

mé d ia Mé d ia Ac ima d a mé d ia

Fig . 2.1 – Mo d e lo d e susc e p tib ilid a d e a infe c ç ã o .

2.4 Ma c ró fa g o s, Enve lhe c ime nto e Exe rc íc io

(27)

numa re sp o sta d e fa se a g ud a (inic ia d a p e la infiltra ç ã o d e c é lula s infla ma tó ria s) (No rtho ff e t a l., 1995); e le va ç ã o d a te mp e ra tura c o rp o ra l (Bre nne r e t a l., 1995), a lte ra ç ã o na d isp o nib ilid a d e d e fo nte s e ne rg é tic a s (Pa rry-Billing s e t a l., 1990) e a lte ra ç õ e s na p ro d uç ã o e se nsib ilid a d e d e mo lé c ula s re g ula tó ria s, c o mo a s p ro sta g la nd ina s d o tip o E2 (PG E2) (MAHAN e YO UNG , 1989).

Ag ud a me nte , o e xe rc íc io mo d e ra d o o u e xa ustivo p o d e mo d ula r vá ria s funç õ e s d o s ma c ró fa g o s, ta nto e m a nima is jo ve ns c o mo e nve lhe c id o s, c o mo p o d e mo s o b se rva r no Q ua d ro 2.4.

Já a o c o nsid e ra rmo s a p rá tic a d o e xe rc íc io c rô nic o , p o uc o s e stud o s inve stig a m se us e fe ito s so b re a funç ã o e o me ta b o lismo d o s ma c ró fa g o s, p ro va ve lme nte p o rq ue o e xe rc íc io p o d e le va r a d ife re nç a s fe no típ ic a s e func io na is na s p o p ula ç õ e s d e ma c ró fa g o s (WO O DS e t a l., 2000).

(28)

Q ua dro 2.4 - Efe ito d e a lg uns p ro to c o lo s d e e xe rc íc io a g ud o so b re a funç ã o d e ma c ró fa g o s .

Funç ã o Pro to c o lo Re sulta do s

8 Ma c ró fa g o s p e rito ne a is,

8 C a mund o ng o s e Po rq uinho s d a índ ia ,

8 Na ta ç ã o Exa ustiva .

↑ G rup o Exe rc ita d o x C o ntro le . ↑ G rup o Enve lhe c id o x Jo ve m.

8 C a mund o ng o s e Po rq uinho s d a índ ia ,

↑ Ime d ia ta me nte e 24 ho ra s a p ó s e xe rc íc io .

Q uimio ta xia

8 C a mund o ng o s Enve lhe c id o s,

Se m a lte ra ç õ e s

8 C a mund o ng o s,

↑ p ó s e xe rc íc io .

8 C a mund o ng o s,

8 Este ira .

↑ Fa g o c ito se e Ativid a d e

e nzimá tic a : Exe rc íc io e xa ustivo > Exe rc íc io Mo d e ra d o > C o ntro le . Fa g o c ito se

8 Ma c ró fa g o s d o s Te c id o s

C o ne c tivo s Huma no s,

8 Ante s e Ap ó s 15 Km d e c o rrid a .

↑ Fa g o c ito se e Ativid a d e e nzimá tic a p ó se xe rc íc io x p ré -e x-e rc íc io .

Le g e nd a : ↔ Ig ua l; ↑ Aume nto ; ↓ Re d uç ã o ; > ma io r q ue .

(29)

3

3 OOBBJJEETTIIVVOO

C o mo vimo s:

8 No e nve lhe c ime nto e nc o ntra mo s uma d iminuiç ã o d a re sp o sta Imuno ló g ic a q ue , c o mo c o nse q üê nc ia , a ume nta a inc id ê nc ia d e infe c ç õ e s, d o e nç a s a uto -imune s e c â nc e r;

8 De ntre a s c é lula s q ue so fre m p ro fund a s mo d ific a ç õ e s c o m o e nve lhe c ime nto , e nc o ntra mo s o ma c ró fa g o , q ue p o ssui p a p e l fund a me nta l na re sp o sta imuno ló g ic a ;

8 O e xe rc íc io mo d e ra d o p o ssui uma a ç ã o p o sitiva so b re a re sp o sta imuno ló g ic a , a tua nd o ta mb é m d ire ta me nte na re sp o sta d e ma c ró fa g o s.

Assim, p o d e mo s c o nsid e ra r viá ve l q ue a p rá tic a re g ula r d e a tivid a d e físic a mo d e ra d a p o ssa re ve rte r a lte ra ç õ e s me ta b ó lic a s e func io na is e m ma c ró fa g o s o b tid o s d e ra to s e nve lhe c id o s, c o ntrib uind o , e ntã o , p a ra uma me lho ria na q ua lid a d e d e vid a d o s id o so s.

De ssa fo rma , o o b je tivo d e ste tra b a lho fo i c a ra c te riza r o p a p e l q ue o tre ina me nto mo d e ra d o e xe rc e so b re o s ma c ró fa g o s d e ra to s e nve lhe c id o s.

(30)

4

4 MMAATTEERRIIAAIISSEEMMÉÉTTOODDOOSS

4.1 Anima is

Fo ra m utiliza d o s 122 ra to s Wista r, ma c ho s, ma ntid o s e m b io té rio c o m c ic lo c la ro / e sc uro d e 12/ 12 ho ra s, c o m iníc io d o p e río d o c la ro à s 7:00 ho ra s, te mp e ra tura a mb ie nte 22 ± 2 ºC e umid a d e re la tiva a 60%, d o De p a rta me nto d e Bio lo g ia C e lula r e d o De se nvo lvime nto no Instituto d e C iê nc ia s Bio mé d ic a s - USP. To d o s o s a nima is re c e b e ra m ra ç ã o Nuvila b C R1

(Nuvita l ®) e á g ua a d lib itum.

4.1.1 Sac rifíc io

O sa c rifíc io d o s a nima is fo i re a liza d o p o r d e c a p ita ç ã o se m a ne ste sia , se mp re no p e río d o e ntre 10:00 e 12:00 ho ra s, e a p ó s 24 ho ra s d o té rmino d a última se ssã o d e e xe rc íc io (p a ra o s a nima is tre ina d o s). Pa ra ma nte r o me smo e sta d o me ta b ó lic o no s a nima is, e ste s p e rma ne c e ra m 4 ho ra s e m je jum a nte s d o sa c rifíc io .

4.1.2 C o mitê de Étic a

(31)

4.1.3 De sc riç ão do s G rupo s e xpe rime ntais

O s a nima is fo ra m d ivid id o s e m 3 g rup o s e xp e rime nta is:

4.1.3.1 ADULTOS(AD)

Ra to s c o m id a d e e ntre 2 a 4 me se s.

4.1.3.2 ENVELHEC IDOS(EV)

Ra to s c o m id a d e e ntre 15 a 18 me se s (G O MMERS e t a l., 1983; MILLER e NADO N, 2000; PLAC KET e t a l., 2004).

4.1.3.3 ENVELHEC IDOS- TREINADOS(EV- TR)

Ra to s c o m id a d e e ntre 15 a 18 me se s, sub me tid o s a o tre ina me nto mo d e ra d o e m na ta ç ã o p o r 6 se ma na s.

4.2 Pro to c o lo de Tre ina me nto Ae ró bio e m Na ta ç ã o

O Tre ina me nto fo i re a liza d o e m Siste ma d e Na ta ç ã o p a ra ra to s, d e se nvo lvid o p o r Vie ra e t a l. (1988), c o nstituíd o p o r ta nq ue s ind ivid ua is, c o m á g ua c irc ula nte a uma te mp e ra tura c o nsta nte d e 32 ºC (± 2 ºC ).

O Pro to c o lo d e tre ina me nto a e ró b io e m na ta ç ã o fo i p rime ira me nte d e sc rito p o r La nc ha Junio r (1993) e p o ste rio rme nte a d a p ta d o p a ra ra to s e nve lhe c id o s p o r MENEG UELLO (2000).

(32)

a nima l, se nd o e ste p e so e xtra , a ta d o a c a ud a e c o rrig id o se ma na lme nte d e a c o rd o c o m a va ria ç ã o d o p e so (Ane xo 01).

Na s p rime ira s se ma na s o s a nima is fo ra m a d a p ta d o s a o me io líq uid o , e p o ste rio rme nte , ho uve o a c ré sc imo p ro g re ssivo d a so b re c a rg a e d o te mp o to ta l d e tre ina me nto , c o mo ilustra d o no Q ua d ro 4.1.

Q ua dro 4.1 – Re p re se nta ç ã o e sq ue má tic a d o Pro to c o lo d e Tre ina me nto Mo d e ra d o e m Na ta ç ã o .

Se ma na 2ª fe ira 3ª fe ira 4ª fe ira 5ª fe ira 6ª fe ira

1ª 15m / 0% 20m / 0% 30m / 0% 30m / 0,5% 40m / 0,5%

2ª 40m / 0,5% 40m / 1% 40m / 1% 50m / 1% 50m / 1%

3ª 50m / 1% 50m / 1,5% 50m / 1,5% 60m / 1,5% 60m / 1,5%

4ª 60m / 1,5% 60m / 2% 60m / 2% 60m / 2% 60m / 2%

5ª 60m / 2% 60m / 2% 60m / 2% 60m / 2% 60m / 2%

6ª 60m / 2% 60m / 2% 60m / 2% 60m / 2% 60m / 2%

Le g e nd a : te mp o = minuto (m); so b re c a rg a = p o rc e nta g e m (%) d o p e so c o rp o ra l.

4.3 De sc riç ã o do s Pro c e dime nto s Expe rime nta is

(33)

p o ste rio r d e te rmina ç ã o d a a tivid a d e má xima d a s e nzima s he xo q uina se e

g luta mina se fo sfa to de p e nde nte.

No Q ua d ro 4.2 e nc o ntra m-se e sq ue ma tiza d a s a s d e te rmina ç õ e s re a liza d a s ne ste e stud o .

Q ua dro 4.2 – Divisã o d o s e xp e rime nto s.

O bje tivo De te rmina ç õ e s

Ava lia ç ã o d o tre ina me nto mo d e ra d o

e m na ta ç ã o

8 De te rmina ç ã o d a a tivid a d e má xima d a e nzima C itrato Sintase d o Músc ulo Só le o .

C a ra c te riza ç ã o d o s a sp e c to s func io na is d e

ma c ró fa g o s

8 Ade rê nc ia

8 Q uimio ta xia

8 Fa g o c ito se

8 Pro d uç ã o d e H2O2 e Pro d uç ã o d e NO

-C a ra c te riza ç ã o d o s a sp e c to s me ta b ó lic o s d e

ma c ró fa g o s

8 Inc uba ç ã o: C o nsumo e p ro d uç ã o d e sub stra to s

8 De sc a rbo xila ç ã o d e G lic o se e G luta mina 8 De te rmina ç ã o d a a tivid a d e má xima e nzimá tic a : He xo quinase e G lutaminase

4.3.1 C itrato Sintase (E.C . 4.1.3.7)

(34)

A a tivid a d e má xima d a e nzima C itra to Sinta se (C S) fo i d e te rmina d a se g und o p ro to c o lo mo d ific a d o d e Alp e t a l. (1976), a p a rtir d a q ua ntific a ç ã o d o c o mp le xo a ma re lo fo rma d o e ntre a C o A lib e ra d a na re a ç ã o (1) c o m o DTNB p re se nte no ta mp ã o d e e nsa io :

O ta mp ã o d e e nsa io (900 µl p a ra c a d a a mo stra ) fo i c o nstituíd o p o r tris-a mino me ttris-a no 50 mM; EDTA 1 mM; DTNB 0,2 mM; tris-a c e til-C o A 0,1 mM e trito n X-100 1% (v/ v), e m p H 8,1.

A re a ç ã o fo i inic ia d a p e la a d iç ã o d e 50 µl d e o xa lo a c e ta to 1 mM a o me io d e e nsa io , e a le itura re a liza d a e m e sp e c tro fo tô me tro a 25 ºC e 412 nm.

O s re sulta d o s fo ra m e xp re sso s e m nmo l / minuto x mg p ro te ína-1_.

4.3.2 Ob te nç ão do s Mac ró fag o s Pe rito ne ais

O s ma c ró fa g o s re sid e nte s fo ra m o b tid o s d a c a vid a d e p e rito ne a l, a p ó s a d e c a p ita ç ã o d o s a nima is, se g und o mé to d o d e sc rito p o r C o sta Ro sa e t a l.

(1993). Po ste rio r à a sse p sia c o m e ta no l 70 % (v/ v), a p e le d a re g iã o a b d o mina l fo i re mo vid a e 10 ml d e PBS se m c á lc io , p H 7,4, fo ra m inje ta d o s na c a vid a d e p e rito ne a l p a ra , e m se g uid a , se r a sp ira d o c o m o a uxílio d e p ip e ta Pa ste ur d e p lá stic o . A susp e nsã o re tira d a , c o nte nd o PBS e ma c ró fa g o s, fo i c e ntrifug a d a a 250 x g d ura nte 10 minuto s a 4 ºC ; o so b re na d a nte fo i re mo vid o e a s c é lula s re ssusp e nsa s e m 500 µl d e PBS.

C ITRATO + C o A

C itrato Sintase

(35)

Uma a líq uo ta d e sta susp e nsã o fo i utiliza d a p a ra c o nta g e m to ta l d a s c é lula s e p a ra a d e te rmina ç ã o d a via b ilid a d e c e lula r, re a liza d a c o m a zul d e

Tryp a n (1:1, v/ v), e a va lia d a e m mic ro sc ó p io d e luz c o m o a uxílio d a C â ma ra d e Ne ub a ue r.

As a mo stra s utiliza d a s c o ntinha m c é lula s c o m via b ilid a d e sup e rio r a 98%.

4.3.3 Ade rê nc ia

Ap ó s a c o le ta , o s ma c ró fa g o s fo ra m ma nip ula d o s no fluxo la mina r e sté ril e re ssusp e nso s e m me io d e c ultura RPMI 1640 e sté ril, se nd o no va me nte c e ntrifug a d o s a 250 x g d ura nte 10 minuto s a 4 ºC . Ap ó s e sta última c e ntrifug a ç ã o , o so b re na d a nte fo i re mo vid o e a s c é lula s re ssusp e nsa s e m 500 µl d e me io RPMI 1640, d o q ua l re tiro u-se uma a líq uo ta p a ra a c o nta g e m d e c é lula s.

O e q uiva le nte a 1 x 106_{c é lula s fo ra m se me a d a s e m p la c a s d e 24} p o ç o s (C o rning) te nd o a o fund o d e c a d a p o ç o uma la mínula c irc ula r d e vid ro (G la sste c nic a , 00 X 13). Pa ra o c ultivo , a 37 ºC , so b a tmo sfe ra c o m 5% C O2: 95% a r, utilizo u-se o me io RPMI 1640 e nriq ue c id o c o m 10% d e so ro fe ta l b o vino , a ntib ió tic o (e stre p to mic ina - 2,5 µg / ml e p e nic ilina 2,5 U / ml) e g luta mina 2 mM.

(36)

a d e re nte s fo ra m c o nta d a s c o m o a uxílio d e um re tíc ulo milime tra d o (10 x 10, 1 mm) a d a p ta d o a o c ula r d o mic ro sc ó p io ó p tic o , c o m a o b je tiva fixa d a no a ume nto e q uiva le nte a 40 ve ze s.

O s re sulta d o s c o rre sp o nd e m à mé d ia o b tid a p e la c o nta g e m d a s c é lula s a d e rid a s a la mínula , e m 5 c a mp o s d o re tíc ulo , e sc o lhid o s a le a to ria me nte .

4.3.4 Quimio taxia

Pa ra o e nsa io d e q uimio ta xia in vitro fo ra m utiliza d a s p la c a s d e 24 p o ç o s c o m 2 c o mp a rtime nto s (Tra nswe l c ha mb e r - C o rning). C a d a p o ç o p o ssuía d o is c o mp a rtime nto s (um infe rio r e o utro sup e rio r), se p a ra d o s p o r uma me mb ra na d e p o lic a rb o na to c o m p o ro s 5,0 µm d e ta ma nho .

Ap ó s a c o le ta , o s ma c ró fa g o s fo ra m ma nip ula d o s no fluxo la mina r e sté ril e re ssusp e nso s e m me io d e c ultura RPMI 1640 e sté ril, se nd o no va me nte c e ntrifug a d o s a 250 x g d ura nte 10 minuto s a 4 ºC . Ap ó s a c e ntrifug a ç ã o , o so b re na d a nte fo i re mo vid o e a s c é lula s re ssusp e nsa s e m 500 µl d e me io RPMI 1640, d o q ua l re tiro u-se uma a líq uo ta p a ra a c o nta g e m d e c é lula s.

(37)

c é lula s, q ue fo ra m inc ub a d a s a 37ºC , e m e stufa so b a tmo sfe ra c o m 5% C O2: 95% a r.

Ap ó s 1 ho ra , a me mb ra na fo i re tira d a , la va d a c o m PBS, fixa d a c o m Me ta no l 70% (v/ v) e c o ra d a c o m he ma to xilina d e Ha rris. As c é lula s q ue mig ra ra m p a ra a p o rç ã o infe rio r d a me mb ra na fo ra m c o nta d a s c o m o a uxílio d e um re tíc ulo milime tra d o (10 x 10, 1 mm) a d a p ta d o a o c ula r d o mic ro sc ó p io ó p tic o , c o m a o b je tiva fixa d a no a ume nto e q uiva le nte a 40 ve ze s.

O s re sulta d o s c o rre sp o nd e m à mé d ia o b tid a p e la c o nta g e m d a s c é lula s a d e rid a s a me mb ra na (q ue re a liza ra m q uimio ta xia ), e m 5 c a mp o s d o re tíc ulo , e sc o lhid o s a le a to ria me nte .

4.3.5 Fag o c ito se

Inic ia lme nte , p a ra a a va lia ç ã o d a c a p a c id a d e fa g o c itá ria , fe z-se ne c e ssá rio a o b te nç ã o d e zimo za n o p so niza d o p a ra a ume nta r o re c o nhe c ime nto p e lo s ma c ró fa g o s (C O STA RO SA e t a l., 1993).

(38)

a g ita ç ã o . Ap ó s 30 minuto s, fo i c e ntrifug a d o a 150 x g p o r 15 minuto s, e o p re c ip ita d o re ssusp e nso e m PBS. Este p ro c e d ime nto fina l fo i re p e tid o p o r 3 ve ze s, p a ra fina lme nte o b te r a so luç ã o utiliza d a na inc ub a ç ã o .

As inc ub a ç õ e s fo ra m re a liza d a s e m fra sc o s d e vid ro p re via me nte silic o niza d o s (silic o ne a 1% e m a c e to na , v/ v) e p o ste rio rme nte la va d o s c o m á g ua d e stila d a . O s ma c ró fa g o s fo ra m inc ub a d o s a 37 °C , so b a g ita ç ã o , p a ra vo lume fina l ig ua l a 1 x 106_{c é lula s e m 1 ml d e me io d e inc ub a ç ã o . O} me io d e inc ub a ç ã o fo i c o mp o sto (p a ra vo lume fina l): PBS c o m c á lc io , BSA 2% (v/ v), g lic o se 5 mM, g luta mina 2 mM e p a rtíc ula s d e zimo za n o p so niza d a s na c o nc e ntra ç ã o d e 1 x 107_{c o mo d e sc rito p o r C O STA RO SA}_{e t a l.}_(1993).

Ap ó s 1 ho ra , uma a líq uo ta d o me io fo i re tira d a p a ra a re a liza ç ã o d a c o nta g e m d e c é lula s, a va lia d a e m mic ro sc ó p io d e luz, a p ó s a a d iç ã o d o c o ra nte a zul d e Tryp a n, na p ro p o rç ã o 1:1 (v/ v), c o m a uxílio d a C â ma ra d e

(39)

4.3.6 Pro duç ão de Pe ró xido de Hidro g ê nio (H2O2)

A p ro d uç ã o d e p e ró xid o d e hid ro g ê nio (H2O2) fo i me d id a utiliza nd o -se o mé to d o d e sc rito p o r Pic k e Mize l (1981) mo d ific a d o .

As inc ub a ç õ e s fo ra m re a liza d a s e m fra sc o s d e vid ro p re via me nte silic o niza d o s (silic o ne a 1% e m a c e to na , v/ v) e p o ste rio rme nte la va d o s c o m á g ua d e stila d a . O s ma c ró fa g o s fo ra m inc ub a d o s a 37 °C , c o m a g ita ç ã o , p a ra vo lume fina l ig ua l a 1 x 106_{c é lula s e m 1 ml d e me io d e inc ub a ç ã o . O} me io d e inc ub a ç ã o fo i c o mp o sto (p a ra vo lume fina l): PBS c o m c á lc io , BSA 2% (v/ v), g lic o se 5 mM, g luta mina 2 mM, fe no l ve rme lho 0,56 mM, 10 µl PMA (100 µg / ml PBS) e 100 µl Pe ro xida se (1 mg / 2ml PBS).

A fo rma ç ã o d e p e ró xid o d e hid ro g ê nio (H2O2) fo i inte rro mp id a a p ó s 1 ho ra d e inc ub a ç ã o c o m a a d iç ã o d e 20 µl d e Na O H 1N, e a p ó s 15 minuto s, o to ta l p ro d uzid o fo i q ua ntific a d o e m e sp e c tro fo tô me tro a 620 nm.

O s re sulta d o s fo ra m e xp re sso s e m nmo l / 1 ho ra x mg p ro te ína-1_.

4.3.7 Pro duç ão de Óxido Nitric o (NO-₎

(40)

c é lula s fo ra m se me a d a s e m p la c a s d e 24 p o ç o s (C o rning) e inc ub a d a s p re via me nte p o r 2 ho ra s a 37 ºC , so b a tmo sfe ra c o m 5% C O2: 95% a r.

Ap ó s e ste p e río d o , o s p o ç o s fo ra m la va d o s p o r d ua s ve ze s c o m me io RPMI 1640 p a ra a re tira d a d a s c é lula s nã o a d e rid a s. Se q üe nc ia lme nte , a s c é lula s a d e rid a s fo ra m c ultiva d a s p o r 24 ho ra s (Pe tre vic h e Alve s, 2000), a 37 ºC , so b a tmo sfe ra c o m 5% C O2: 95% a r, e m 1ml d e me io RPMI 1640 c o nte nd o (p a ra c o nc e ntra ç ã o fina l): 10% d e so ro fe ta l b o vino (v/ v), a ntib ió tic o (e stre p to mic ina - 2,5 µg / ml e p e nic ilina 2,5 U / ml), g luta mina 2 mM e LPS 10 µg / ml.

A c o nc e ntra ç ã o d e ó xid o nítric o (NO-_{) fo i me d id a ind ire ta me nte} utiliza nd o o p ro to c o lo d e sc rito p o r Ding e t a l. (1988), q ue se b a se ia na re a ç ã o d e G rie ss, no q ua l o c o nte úd o d e nitrito (NO2-) me d id o re fle te a p ro d uç ã o d e ó xid o nítric o (NO-_{) p e lo s ma c ró fa g o s (G re e n,}_{e t a l.}_{, 1982)}_._{Pa ra} a d e te rmina ç ã o d o ó xid o nítric o (NO-_{), 50}µ_{l d o so b re na d a nte d a c ultura d e} ma c ró fa g o s fo i inc ub a d o p o r 10 minuto s (a te mp e ra tura a mb ie nte ) na p re se nç a d e 50 µl d a so luç ã o d e G rie ss, c o nstituíd a p e la mistura 1:1 (v/ v) d a s so luç õ e s: sulfa nila mid a 0,1 M e á c id o o rto -fo sfó ric o 30% (v/ v); e e ne d ia mina 7,7 mM e á c id o o rto -fo sfó ric o 60% (v/ v). O c o nte úd o d e nitrito fo i d e te rmina d o utiliza nd o -se uma c urva d e nitrito d e só d io (Na NO2) c o mo p a d rã o e a le itura d a a b so rb â nc ia fo i re a liza d a a 540 nm.

(41)

4.3.8 C o nsumo e pro duç ão de sub strato s

A d e te rmina ç ã o d o c o nsumo d e g lic o se e g luta mina e p ro d uç ã o d e la c ta to , g luta ma to e a sp a rta to fo ra m re a liza d a s a p ó s a inc ub a ç ã o d e 1 x 106_{c é lula s e m 1 ml d e me io d e inc ub a ç ã o c o mp o sto p o r (p a ra} c o nc e ntra ç ã o fina l): PBS c o m c á lc io , BSA 2% (v/ v) e 100 µl d e sub stra to , 5 mM d e G lic o se o u 2 mM d e G luta mina .

As inc ub a ç õ e s fo ra m re a liza d a s e m fra sc o s d e vid ro p re via me nte silic o niza d o s (silic o ne a 1% e m a c e to na , v/ v) e p o ste rio rme nte la va d o s c o m á g ua d e stila d a . Ap ó s 1 ho ra , a 37 ºC , e m b a nho -ma ria c o m a g ita ç ã o , a inc ub a ç ã o fo i fina liza d a c o m a a d iç ã o d e 200 µl d e á c id o tric lo ro a c é tic o (TC A) 25% (v/ v), e o me io d e inc ub a ç ã o fo i c e ntrifug a d o a 16.000 x g p o r 3 minuto s. O so b re na d a nte fo i c o le ta d o e ne utra liza d o c o m so luç ã o TRIS/ KO H 0,5M.

To d a s a s a mo stra s fo ra m c o ng e la d a s a -80 ºC p a ra p o ste rio re s d e te rmina ç õ e s e o s sub stra to s fo ra m d e te rmina d o s a p a rtir d e 100 µl d o so b re na d a nte ne utra liza d o . O s re sulta d o s fo ra m e xp re sso s e m nmo l / 1 ho ra / mg d e p ro te ína-1_.

4.3.8.1 GLIC OSE

(42)

é p ro p o rc io na l a c o nc e ntra ç ã o d e g lic o se d a a mo stra , se g und o a re a ç ã o (2):

Ap ó s inc ub a ç ã o d e 40 minuto s a 37 ºC , me d iu-se a a b so rb â nc ia a 340 nm.

4.3.8.2 LAC TATO

O c o nte úd o d e la c ta to p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o se g und o o mé to d o d e sc rito p o r Eng le e Jo ne s (1978), q ue c o nsiste na c o nve rsã o d e la c ta to a p iruva to a tra vé s d a e nzima la c ta to de sidro g e na se (LDh). Ne ste p ro c e sso há o c o nsumo d e NAD e fo rma ç ã o d e NADH (p ro p o rc io na l a o c o nte úd o d e la c ta to ), c o mo na re a ç ã o (3):

O me io d e e nsa io fo i c o nstituíd o p o r g lic ina 0,55 mM, EDTA 11,3 mM, hid ra to d e hid ra zina 0,7 M e NAD 0,43 mM, e m p H 8,85. O hid ra to d e hid ra zina fo i utiliza d o p a ra imp e d ir a re ve rsã o d a re a ç ã o , fo rma nd o no va me nte o la c ta to . A re a ç ã o fo i inic ia d a c o m a a d iç ã o d a e nzima la c ta to de sidro g e na se (LDh) (100 mg / ml), e a p ó s 1 ho ra e m te mp e ra tura a mb ie nte , d e te rmino u-se a a b so rb â nc ia a 340 nm.

He xo q uina se

G LICO SE G -6-P 6-FO SFO G LUC O NATO NADP NADPH

G 6PDh (2)

LDh PIRUVATO

LACTATO

NAD NADH

(43)

4.3.8.3 GLUTAMINA

O c o nte úd o d e g luta mina p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o se g und o mé to d o d e sc rito p o r C o o ne y e t a l. (1971) e Kirste n e t a l. (1963), q ue utiliza a s e nzima s a sp a ra g ina se e g luta ma to de sidro g e na se

(G Dh). Ne ste mé to d o há c o nsumo d e NADH p ro p o rc io na l a c o nc e ntra ç ã o d e g luta mina , se g und o a s re a ç õ e s (4) e (5):

O me io utiliza d o fo i c o mp o sto p o r KH2PO4 50 mM, g lic e ro l a 50% (v/ v), NADH 4 mM, BSA 10% (v/ v), g luta ma to de sidro g e na se 5 U/ ml, α-c e to g luta ra to 4 M, e a sp a ra g ina se 5 U/ ml. A a b so rb â nc ia fo i me d id a a 340 nm a p ó s 1 ho ra d e inc ub a ç ã o a te mp e ra tura a mb ie nte .

4.3.8.4 GLUTAMATO

O c o nte úd o d e g luta ma to p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o se g und o mé to d o d e sc rito p o r Be rnt e Be rg me ye r (1974). A e nzima g luta ma to de sidro g e na se (G Dh) c a ta lisa a re a ç ã o p ro d uzind o α c e to g luta ra to e NADH, a p a rtir d o G luta ma to e NAD, se nd o a fo rma ç ã o d e NADH p ro p o rc io na l a o c o nte úd o d e g luta ma to p re se nte na a mo stra , c o mo na re a ç ã o (6):

Asp a ra g inase

G LUTAMINA + α-C ETO G LUTARATO G LUTAMATO + NH4

NH4 + α-C ETO G LUTARATO

NAD NADH

G Dh G LUTAMATO

(4)

(5)

α-C ETO G LUTARATO

G LUTAMATO

G Dh

NAD NADH

(44)

O me io d e e nsa io fo i c o mp o sto p e lo ta mp ã o g lic ina -hid ra zina (g lic ina 0,5 M e hid ra to d e hid ra zina 0,4 M), NAD 7,5 mM, ADP 10,6 mM e á g ua d e io nisa d a , e m p H 9,0. O inic io d a re a ç ã o o c o rre u c o m a a d iç ã o d a e nzima

g luta ma to de sidro g e na se (G Dh, 4 U/ ml), e a p ó s 1 ho ra a te mp e ra tura a mb ie nte a a b so rb â nc ia fo i me d id a a 340 nm.

4.3.8.5 ASPARTATO

O c o nte úd o d e a sp a rta to p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o se g und o mé to d o ind ire to d e sc rito p o r Be rg me ye r e t a l. (1974).

Este p ro to c o lo p o d e se r d ivid id o e m d ua s p a rte s. Na p rime ira , há p ro d uç ã o d e o xa lo a c e ta to (O AA) e g luta ma to a p a rtir d o a sp a rta to e α -c e to g luta ra to , a tra vé s d a re a ç ã o -c a ta lisa d a p e la e nzima tra nsa mina se g lutâ mic a o xa lo a c é tic a (G O T), c o mo na re a ç ã o (7):

Na se g und a p a rte , há p ro d uç ã o d e ma la to e NAD a p a rtir d o o xa lo a c e ta to (O AA) e NADH, a tra vé s d a re a ç ã o c a ta lisa d a p e la e nzima

ma la to de sidro g e na se (MDh). O c o nsumo d e NADH é p ro p o rc io na l à q ua ntid a d e d e o xa lo a c e ta to (O AA) fo rma d o , q ue c o nse q üe nte me nte c o rre sp o nd e à c o nc e ntra ç ã o d e a sp a rta to na a mo stra , se g und o a re a ç ã o (8):

O AA + G LUTAMATO

ASPARTATO + α-C ETO G LUTARATO

G OT (7)

NAD NADH

MALATO O AA

(45)

O me io d e e nsa io fo i c o mp o sto p o r K2HPO4 63 mM, KH2PO4 63 mM, α -c e to g luta ra to 3 mM, NADH 0,08 mM e ma la to de sidro g e na se (MDh) 6 U/ ml, e m p H 7,5. A re a ç ã o fo i inic ia d a a p ó s a a d iç ã o d a e nzima tra nsa mina se g lutâ mic a o xa lo a c é tic a (G O T, 4 UI/ ml). A a b so rb â nc ia fo i me d id a a 340 nm, a p ó s 1 ho ra d e inc ub a ç ã o a te mp e ra tura a mb ie nte .

4.3.9 De sc arb o xilaç ão de g lic o se e g lutamina

A d e sc a rb o xila ç ã o fo i a va lia d a a p ó s a inc ub a ç ã o d e 1 x 106_{c é lula s} e m 1 ml d e me io d e inc ub a ç ã o , c o mp o sto p o r (p a ra c o nc e ntra ç ã o fina l): PBS c o m c á lc io , BSA 2% (v/ v), 0,5 µC i d e [U-14_{C ]-g lic o se (e m 5 mM d e g lic o se )} o u 0,2 µC i d e [U-14_{C ]-g luta mina (e m 2 mM d e g luta mina ), c o nfo rme d e sc rito} p o r KO WALC HUC K e t a l. (1988).

O s ma c ró fa g o s fo ra m inc ub a d o s c o m o s sub stra to s ma rc a d o s, a 37ºC , so b a g ita ç ã o , e m e rle nme ye rs d e 25 ml. O s e rle nme ye rs p o ssuía m re se rva tó rio inte rno p a ra a mistura d e a d so rç ã o , e fo ra m p re via me nte silic o niza d o s (silic o ne a 1% e m a c e to na , v/ v), la va d o s c o m á g ua d e stila d a .

(46)

A mistura , re tira d a d o re se rva tó rio inte rno , fo i a c re sc id a d a so luç ã o d e c intila ç ã o Ec o Lume , e a ra d ia ç ã o d e te rmina d a e m C PM (c o nta g e m p o r minuto ).

O s re sulta d o s fo ra m e xp re sso s e m nmo l / 1 ho ra / mg d e p ro te ína-1_.

4.3.10He xo quinase (E.C . 2.7.1.1)

A e nzima He xo q uina se (HK) c a ta lisa a re a ç ã o d e fo sfo rila ç ã o d a g lic o se fo rma nd o G lic o se -6-Fo sfa to (G -6-P), se nd o a p rime ira e nzima d a via g lic o lític a . Sua a tivid a d e má xima fo i d e te rmina d a p e lo mé to d o d e sc rito p o r C ra b tre e e Ne wsho lme (1972) mo d ific a d o , e se b a se ia na fo rma ç ã o d e NADPH a tra vé s d a e nzima G lic o se -6-Fo sfa to De sidro g e na se (G 6PDh), na re a ç ã o (9):

As c é lula s, p re via me nte d e sc o ng e la d a s, fo ra m so nic a d a s e 20 µl inc ub a d o s e m me io d e e nsa io (930 µl p o r a mo stra ) c o nstituíd o p o r: Tris-HC l 75 mM, EDTA 0,8 mM; KC l 1,5 mM; Me rc a p to e ta no l 4 mM; NADP 0,4 mM; ATP 2,5 mM; c re a tina fo sfa to 10 mM; cre a tina q uina se 1,8 U; glic o se 6 fo sfa to de sidro g e na se (G 6PDh) 1,4 U; trito n X-100 0.05% (v/ v), e m p H 7,5. A re a ç ã o inic io u-se c o m a a d iç ã o d e g lic o se a o me io (50µl) e a s d e te rmina ç õ e s fo ra m re a liza d a s a 37 ºC e m 340 nm.

O s re sulta d o s fo ra m e xp re sso s e m nmo l / minuto / mg p ro te ína-1_. He xo quinase

G LIC O SE G -6-P 6-FO SFO G LUC O NATO

NADP NADPH

(47)

4.3.11G lutaminase fo sfato - de pe nde nte (E.C . 3.5.1.2.)

De te rmino u-se a a tivid a d e má xima d a e nzima g luta mina se fo sfa to -de p e n-de nte a tra vé s d o mé to d o ind ire to d e sc rito p o r C urtho ys e Lo wry (1973), b a se a d o no p rinc íp io d e q ue e sta e nzima c ha ve d a G luta minó lise é re sp o nsá ve l p e la fo rma ç ã o d e G luta ma to , na re a ç ã o (10):

As c é lula s, p re via me nte d e sc o ng e la d a s, fo ra m c o le ta d a s e m PBS se m c á lc io , so nic a d a s e 100 µl inc ub a d o s p o r 10 minuto s a 37 ºC e m me io d e e nsa io (800 µl p o r a mo stra ), fo rma d o p o r: ta mp ã o fo sfa to 50 mM (mistura e q uimo la r d e KH2PO4 e K2HPO4), ta mp ã o Tris/ EDTA (Tris-HC l 50 mM e EDTA 0,2 mM) e trito n X-100 0,05% (v/ v), p H 8,6. O iníc io d a re a ç ã o se d e u c o m a a d iç ã o d e 100 µl d e g luta mina 20 mM, e te rmino u c o m 200 µl d e TC A 25% (v/ v).

Ap ó s a inc ub a ç ã o , a s c é lula s fo ra m c e ntrifug a d a s a 16.000 x g , p o r 3 minuto s, e so me nte o so b re na d a nte fo i c o le ta d o e ne utra liza d o c o m so luç õ e s d e KO H 0,5 M e Tris/ KO H 2 M. To d a s a s a mo stra s fo ra m c o ng e la d a s e m – 80º C , p a ra p o ste rio r d o sa g e m d e g luta ma to (c o mo d e sc rito a nte rio rme nte no ite m 4.3.8.4 (p . 42).

O s re sulta d o s fo ra m e xp re sso s e m nmo l / minuto / mg p ro te ína-1_.

G LUTAMATO + AMÔ NIA

G lutaminase

(48)

4.3.12De te rminaç ão do c o nte údo de Pro te ína das amo stras

Utilizo u-se a me to d o lo g ia d e sc rita p o r Lo wry e t a l. (1951) p a ra o s ho mo g e ne iza d o s d e te c id o s e a mo stra s c e lula re s. O p rinc íp io c o nsiste na hid ró lise a lc a lina d a s p ro te ína s c e lula re s c o m p o ste rio r re a ç ã o c o m o re a g e nte c o lo rimé tric o d e Fo lin-C io c a lte a u, e m so luç ã o c o nte nd o Na2C O3 200 mM, Na O H 100 mM, ta rta ra to d e só d io e p o tá ssio 1 mM e sulfa to d e c o b re 20 mM. A le itura fo i re a liza d a a 750 nm e o va lo re s o b tid o s fo ra m c o mp a ra d o s a c urva p a d rã o d e a lb umina .

4.3.13So luç õ e s

A c o mp o siç ã o d o PBS se m C á lc io , usa d o p a ra a c o le ta d o s ma c ró fa g o s, c o nsistiu na mistura d e Na C l 0,12 mM; Na2HPO4 a nid ro 10 mM e KH2PO4 a nid ro 3,2 mM e m á g ua d e stila d a , p H 7,4 a 25 ºC .

O PBS c o m C á lc io , usa d o na s inc ub a ç õ e s, c o nsistiu na mistura d e Na C l 0,14 M; KC l 4,7 mM; Mg SO4 x 7 H2O 10 mM; KH2PO4 1,2 mM; Na2HPO4 4 mM e Na H2PO4 1,3 mM e m á g ua d e stila d a , p H 7,4 a 25 ºC . Po ste rio rme nte a d isso luç ã o d o s sa is, fo i a d ic io na d o C a C l2 x 2 H2O p a ra 1,3mM.

(49)

4.3.14Equipame nto s

Pa ra a re a liza ç ã o d a s d e te rmina ç õ e s utiliza ra m-se o s e q uip a me nto s lista d o s no Q ua d ro 4.3:

Q ua dro 4.3 – Eq uip a me nto s utiliza d o s.

Equipa me nto Ma rc a Mo de lo

C e ntrífug a He ttic h 35 R

C e ntrífug a Jo ua n MR 22

Mic ro sc ó p io ó p tic o Niko n Alp ha p ho t-2 YS2

So nic a d o r VirTis VirSo nic 100

Esp e c tro fo tô me tro Hita c hi U-2001

Esp e c tro fo tô me tro Be c kma n DU 640

C o nta d o r d e c intila ç ã o Pa c ka rd Tri-c a rb 2100TR Elisa Mo le c ula r De vic e s Sp e c tra Ma x Plus Fre e ze r – 80 ºC Fo rma Sc ie ntific Vip se rie s – 86 ºC

Estufa Sa nyo Mo d e l 3110

Ho mo g e ne iza d o r Bo sc h G G S 27L 27000 RPM

4.3.15Re ag e nte s

Pa ra a re a liza ç ã o d a s d e te rmina ç õ e s utiliza ra m-se o s re a g e nte s lista d o s no Ane xo 02.

4.4 Aná lise Esta tístic a

(50)

(51)

5

5 RREESSUULLTTAADDOOSS

O s re sulta d o s e stã o a p re se nta d o s na fo rma d e mé d ia , e rro p a d rã o d a mé d ia (EPM) e se u re sp e c tivo núme ro d e a mo stra s (n) p a ra c a d a g rup o a va lia d o . A se q üê nc ia d e a p re se nta ç ã o d o s re sulta d o s o b e d e c e à o rd e m e sta b e le c id a no q ua d ro 4.2 (p . 32).

5.1 Ava lia ç ã o do Tre ina me nto Mo de ra do e m Na ta ç ã o

Pa ra a va lia r a e fic á c ia d o p ro g ra ma d e tre ina me nto a e ró b io e m na ta ç ã o , fo i a va lia d a a a tivid a d e má xima d a e nzima C itra to sinta se no músc ulo só le o d o s a nima is e stud a d o s (HENRIKSSO N, 1992; KRIKETO S e t a l, 1995).

Ho uve um a ume nto e q uiva le nte a 47% na a tivid a d e d a C itra to sinta se

no s a nima is Enve lhe c id o s-Tre ina d o s (EV-TR: 106,8 ± 14,5 nmo l / minuto x mg d e p ro te ína-1_{) e m re la ç ã o a o s a nima is Enve lhe c id o s (EV: 72,5 ± 2,0 nmo l /} minuto x mg d e p ro te ína-1_{) e Ad ulto s (AD: 72,8 ± 4,1 nmo l / minuto x mg d e} p ro te ína-1_{), c o mo ilustra d o na Ta b e la / G rá fic o 5.1.}

5.2 Ca ra c te riza ç ã o do s Aspe c to s Func io na is de Ma c ró fa g o s

(52)

Ta be la / G rá fic o 5.1 - Ativid a d e má xima d a e nzima C itrato Sintase no músc ulo só le o d o s a nima is Ad ulto s (AD), Enve lhe c id o s (EV) e Enve lhe c id o s-Tre ina d o s (EV-TR). O s d a d o s c o rre sp o nd e m à mé d ia e m nmo l / minuto x mg d e p ro te ína-1_{± EPM (n).}

C ITRATO SINTASE (nmo l / minuto x mg d e p ro te ína-1₎

A

ADD 72,8 ± 4,1 (7)

EV 72,5 ± 2,0 (8)

EV- TR 106,8 ± 14,5 (7) ∗#

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0

A D EV EV-TR

C IT R A TO S IN TA SE (n m o l / m in u to x m g p ro te ín a -1 )

Le g e nd a : AD = Ad ulto s; EV = Enve lhe c id o s e EV-TR = Enve lhe c id o s-Tre ina d o s. Aná lise e sta tístic a : ANO VA, se g uid o p e lo Te ste d e Tuke y.

∗ p < 0,05 e m c o mp a ra ç ã o a o s a nima is ADULTO S (AD).

#_{p < 0,05 e m c o mp a ra ç ã o a o s a nima is ENVELHEC IDO S (EV).}

(53)

Na Ta b e la / G rá fic o 5.2, p o d e -se o b se rva r um a ume nto e q uiva le nte a 2,3 ve ze s na c a p a c id a d e d e a d e rê nc ia d o s ma c ró fa g o s d o s a nima is Enve lhe c id o s-Tre ina d o (EV-TR: 83,1 ± 12,0) e m c o mp a ra ç ã o a o s a nima is Ad ulto s (AD: 36,7 ± 8,2).

A a va lia ç ã o d a c a p a c id a d e e m re a liza r q uimio ta xia mo stro u-se e le va d a no s a nima is Enve lhe c id o s-Tre ina d o s (EV-TR: 129,2 ± 13,1), se nd o e ste a ume nto e q uiva le nte a 3,7 ve ze s e m re la ç ã o a o s a nima is Ad ulto s (AD: 35,3 ± 4,3), e 2,4 ve ze s e m re la ç ã o a o s a nima is Enve lhe c id o s (EV: 53,9 ± 13,7)(Ta b e la / G rá fic o 5.2).

Na a va lia ç ã o d a c a p a c id a d e d e fa g o c ito se d e p a rtíc ula s d e zimo za n o p so niza d a s nã o fo i o b se rva d a d ife re nç a e ntre o s g rup o s e stud a d o s, Ad ulto s (AD: 55,0 ± 10,5 %), Enve lhe c id o s (EV: 42,9 ± 3,6 %) e Enve lhe c id o s-Tre ina d o s (EV-TR: 49,2 ± 3,2 %), c o mo ilustra d o na Ta b e la / G rá fic o 5.2.

(54)

Ta be la / G rá fic o 5.2 - C a p a c id a d e d e Ade rê nc ia, Q uimio ta xia e Fa g o c ito se d e ma c ró fa g o s re sid e nte s o b tid o s d a c a vid a d e p e rito ne a l d o s a nima is Ad ulto s (AD), Enve lhe c id o s (EV) e Enve lhe c id o s-Tre ina d o s (EV-TR). O s d a d o s c o rre sp o nd e m à mé d ia e m núme ro d e c é lula s e p o rc e nta g e m ± EPM (n).

ADERÊNCIA Q UIMIO TAXIA FAG O CITO SE (núme ro d e c é lula s) (núme ro d e c é lula s) (%)

AD 36,7 ± 8,2 (5) 35,3 ± 4,3 (7) 55,0 ± 10,5 (5)

EV 45,8 ± 10,1 (6) 53,9 ± 13,7 (7) 42,9 ± 3,6 (9)

EV- TR 83,1 ± 12,0 (6) ∗ 129,2 ± 13,1 (7) ∗# _{49,2 ± 3,2 (6)}

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0

A DERÊNC IA Q UIMIO TA XIA

(n ú m e ro d e c é lu la s)

A d ulto s ( A D) Enve lhe c id o s ( EV) Env e lhe c id o s Tre ina d o s ( EV-TR)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0

A D EV EV-TR

FA G O C IT O SE (% )

*

#

(55)

Ta be la / G rá fic o 5.3 - Pro d uç ã o d e Pe ró xido de hidro g ê nio (H2O2) e Ó xido

nítric o (NO-₎_{p o r ma c ró fa g o s re sid e nte s o b tid o s d a} c a vid a d e p e rito ne a l d o s a nima is Ad ulto s (AD), Enve lhe c id o s (EV) e Enve lhe c id o s-Tre ina d o s (EV-TR). O s d a d o s c o rre sp o nd e m à mé d ia e m nmo l / 1 ho ra x mg d e p ro te ína-1_eµ_{M ± EPM (n).}

H2O2 NO

-(nmo l / 1 ho ra x mg d e p ro te ína-1₎ ₍_µ_M)

AD 15,9 ± 2,2 (4) 43,8 ± 4,3 (6)

EV 16,9 ± 2,5 (7) 41,6 ± 6,2 (6)

EV- TR 56,3 ± 7,5 (5) ∗# _{76,7 ± 12,6 (7)}#

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0

A D EV EV-TR

H 2 O 2 (n m o l / 1 h o ra x m g p ro te ín a -1) 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0

A D EV EV-TR

N O -( M )

*

#