A d e te rmina ç ã o d o c o nsumo d e g lic o se e g luta mina e p ro d uç ã o d e la c ta to , g luta ma to e a sp a rta to fo ra m re a liza d a s a p ó s a inc ub a ç ã o d e 1 x 106 c é lula s e m 1 ml d e me io d e inc ub a ç ã o c o mp o sto p o r (p a ra c o nc e ntra ç ã o fina l): PBS c o m c á lc io , BSA 2% (v/ v) e 100 µl d e sub stra to , 5 mM d e G lic o se o u 2 mM d e G luta mina .
As inc ub a ç õ e s fo ra m re a liza d a s e m fra sc o s d e vid ro p re via me nte silic o niza d o s (silic o ne a 1% e m a c e to na , v/ v) e p o ste rio rme nte la va d o s c o m á g ua d e stila d a . Ap ó s 1 ho ra , a 37 ºC , e m b a nho -ma ria c o m a g ita ç ã o , a
inc ub a ç ã o fo i fina liza d a c o m a a d iç ã o d e 200 µl d e á c id o tric lo ro a c é tic o (TC A) 25% (v/ v), e o me io d e inc ub a ç ã o fo i c e ntrifug a d o a 16.000 x g p o r 3 minuto s. O so b re na d a nte fo i c o le ta d o e ne utra liza d o c o m so luç ã o TRIS/ KO H 0,5M.
To d a s a s a mo stra s fo ra m c o ng e la d a s a -80 ºC p a ra p o ste rio re s d e te rmina ç õ e s e o s sub stra to s fo ra m d e te rmina d o s a p a rtir d e 100 µl d o so b re na d a nte ne utra liza d o . O s re sulta d o s fo ra m e xp re sso s e m nmo l / 1 ho ra / mg d e p ro te ína-1.
4.3.8.1 GLIC OSE
O c o nte úd o d e g lic o se p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o a tra vé s d o Kit e nzimá tic o La b te st (he xo q uina se e g lic o se 6 fo sfa to de sidro g e na se , G 6PDh). Ne ste p ro c e sso há p ro d uç ã o d e NADPH, q ue
é p ro p o rc io na l a c o nc e ntra ç ã o d e g lic o se d a a mo stra , se g und o a re a ç ã o (2):
Ap ó s inc ub a ç ã o d e 40 minuto s a 37 ºC , me d iu-se a a b so rb â nc ia a 340 nm.
4.3.8.2 LAC TATO
O c o nte úd o d e la c ta to p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o se g und o o mé to d o d e sc rito p o r Eng le e Jo ne s (1978), q ue c o nsiste na c o nve rsã o d e la c ta to a p iruva to a tra vé s d a e nzima la c ta to de sidro g e na se (LDh). Ne ste p ro c e sso há o c o nsumo d e NAD e fo rma ç ã o d e
NADH (p ro p o rc io na l a o c o nte úd o d e la c ta to ), c o mo na re a ç ã o (3):
O me io d e e nsa io fo i c o nstituíd o p o r g lic ina 0,55 mM, EDTA 11,3 mM, hid ra to d e hid ra zina 0,7 M e NAD 0,43 mM, e m p H 8,85. O hid ra to d e hid ra zina fo i utiliza d o p a ra imp e d ir a re ve rsã o d a re a ç ã o , fo rma nd o no va me nte o la c ta to . A re a ç ã o fo i inic ia d a c o m a a d iç ã o d a e nzima
la c ta to de sidro g e na se (LDh) (100 mg / ml), e a p ó s 1 ho ra e m te mp e ra tura
a mb ie nte , d e te rmino u-se a a b so rb â nc ia a 340 nm.
He xo q uina se
G LICO SE G -6-P 6-FO SFO G LUC O NATO
NADP NADPH G 6PDh (2) LDh PIRUVATO LACTATO NAD NADH (3)
4.3.8.3 GLUTAMINA
O c o nte úd o d e g luta mina p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o se g und o mé to d o d e sc rito p o r C o o ne y e t a l. (1971) e Kirste n e t a l. (1963), q ue utiliza a s e nzima s a sp a ra g ina se e g luta ma to de sidro g e na se
(G Dh). Ne ste mé to d o há c o nsumo d e NADH p ro p o rc io na l a c o nc e ntra ç ã o
d e g luta mina , se g und o a s re a ç õ e s (4) e (5):
O me io utiliza d o fo i c o mp o sto p o r KH2PO4 50 mM, g lic e ro l a 50% (v/ v), NADH 4 mM, BSA 10% (v/ v), g luta ma to de sidro g e na se 5 U/ ml, α-c e to g luta ra to 4 M, e a sp a ra g ina se 5 U/ ml. A a b so rb â nc ia fo i me d id a a 340 nm a p ó s 1 ho ra
d e inc ub a ç ã o a te mp e ra tura a mb ie nte .
4.3.8.4 GLUTAMATO
O c o nte úd o d e g luta ma to p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o se g und o mé to d o d e sc rito p o r Be rnt e Be rg me ye r (1974). A e nzima g luta ma to de sidro g e na se (G Dh) c a ta lisa a re a ç ã o p ro d uzind o α c e to g luta ra to e NADH, a p a rtir d o G luta ma to e NAD, se nd o a fo rma ç ã o d e NADH p ro p o rc io na l a o c o nte úd o d e g luta ma to p re se nte na a mo stra , c o mo na re a ç ã o (6):
Asp a ra g inase
G LUTAMINA + α-C ETO G LUTARATO G LUTAMATO + NH4
NH4 + α-C ETO G LUTARATO NAD NADH G Dh G LUTAMATO (4) (5) α-C ETO G LUTARATO G LUTAMATO G Dh NAD NADH (6)
O me io d e e nsa io fo i c o mp o sto p e lo ta mp ã o g lic ina -hid ra zina (g lic ina 0,5 M e hid ra to d e hid ra zina 0,4 M), NAD 7,5 mM, ADP 10,6 mM e á g ua d e io nisa d a , e m p H 9,0. O inic io d a re a ç ã o o c o rre u c o m a a d iç ã o d a e nzima
g luta ma to de sidro g e na se (G Dh, 4 U/ ml), e a p ó s 1 ho ra a te mp e ra tura
a mb ie nte a a b so rb â nc ia fo i me d id a a 340 nm.
4.3.8.5 ASPARTATO
O c o nte úd o d e a sp a rta to p re se nte no me io d e inc ub a ç ã o fo i d e te rmina d o se g und o mé to d o ind ire to d e sc rito p o r Be rg me ye r e t a l. (1974).
Este p ro to c o lo p o d e se r d ivid id o e m d ua s p a rte s. Na p rime ira , há p ro d uç ã o d e o xa lo a c e ta to (O AA) e g luta ma to a p a rtir d o a sp a rta to e α- c e to g luta ra to , a tra vé s d a re a ç ã o c a ta lisa d a p e la e nzima tra nsa mina se g lutâ mic a o xa lo a c é tic a (G O T), c o mo na re a ç ã o (7):
Na se g und a p a rte , há p ro d uç ã o d e ma la to e NAD a p a rtir d o o xa lo a c e ta to (O AA) e NADH, a tra vé s d a re a ç ã o c a ta lisa d a p e la e nzima
ma la to de sidro g e na se (MDh). O c o nsumo d e NADH é p ro p o rc io na l à
q ua ntid a d e d e o xa lo a c e ta to (O AA) fo rma d o , q ue c o nse q üe nte me nte c o rre sp o nd e à c o nc e ntra ç ã o d e a sp a rta to na a mo stra , se g und o a re a ç ã o (8):
O AA + G LUTAMATO
ASPARTATO + α-C ETO G LUTARATO
G OT (7) NAD NADH MALATO O AA MDh (8)
O me io d e e nsa io fo i c o mp o sto p o r K2HPO4 63 mM, KH2PO4 63 mM, α- c e to g luta ra to 3 mM, NADH 0,08 mM e ma la to de sidro g e na se (MDh) 6 U/ ml,
e m p H 7,5. A re a ç ã o fo i inic ia d a a p ó s a a d iç ã o d a e nzima tra nsa mina se g lutâ mic a o xa lo a c é tic a (G O T, 4 UI/ ml). A a b so rb â nc ia fo i me d id a a 340 nm,
a p ó s 1 ho ra d e inc ub a ç ã o a te mp e ra tura a mb ie nte .