UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL COMO BASE DE MEIO DE CULTURA PARA LEVEDURAS DE INTERESSE COMERCIAL
Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação Mestrado em Biotecnologia
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Programa de Pós-Graduação Mestrado em Biotecnologia
UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL COMO BASE DE MEIO DE CULTURA PARA LEVEDURAS DE INTERESSE COMERCIAL
Cristiana de Souza Bastos
Orientador: Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão Co-orientadora: Prof. Dra. Leoneide Érica Maduro Bouillet
Ouro Preto, Julho de 2011.
Catalogação: [email protected]
B327u Bastos, Cristiana de Souza
Utilização de resíduos da produção de biodiesel como base de meio de cultura para leveduras de interesse comercial [manuscrito] / Cristina de Souza Bastos. - 2011.
xix, 92f.: il., color; graf.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Rogélio Lopes Brandão
Co-orientadora: Profª Drª Leoneide Érica Maduro Bouillet
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a Processos e
ao Tratamento de Doenças.
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"Porque a cabeça da gente é uma só, e as coisas que há e que estão para haver são demais de muitas, muito maiores diferentes, e a gente tem de necessitar de aumentar a cabeça, para o total."
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Aos meus pais, Álvaro e Neuza por fazerem de mim quem sou. E a minha irmã Flaviana pela constante confiança, incentivo e apoio.
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Agradeço a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão deste trabalho.
À Universidade Federal de Ouro Preto e ao NUPEB pelo ensino de qualidade e possibilidade de pós graduar-me, e à FAPEMIG pelo incentivo à capacitação e ao desenvolvimento da ciência através de apoio financeiro.
Ao Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão pela confiança em mim depositada e oportunidade que me foram concedidas. Muito obrigada.
À Prof. Dra. Leoneide Érica Maduro Bouillet pela co-orientação científica e pessoal, e amizade que levarei para sempre. Sou muito grata.
Ao Prof. Dr. Ieso de Miranda Castro pela disponibilidade em ajudar-nos e preocupação em manter condições de trabalho no LBCM.
À professora Dr. Riva de Paula Oliveira pelo exemplo de profissionalismo, competência e simplicidade.
Aos demais laboratórios e professores da UFOP que contribuíram para a realização deste trabalho, em especial ao Prof. Dr. Robson J. de Cássia Franco Afonso, Prof. Dr. Maurício Xavier Coutrim e Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino pela ajuda nas análises químicas. Ao Prof. Dr. Diego Luiz Nunes pelas elucidações a respeito de Biodiesel.
Ao aluno de iniciação científica Max Ihara que me acompanhou por quase todo o processo de elaboração dessa dissertação, e sem o qual não existiria grande parte dos dados aqui apresentados.
Aos colegas do LBCM, ainda presentes ou àqueles que não mais trabalham no nosso laboratório. Obrigada Bruna, Eduardo, Renata, Érica Milena, Soraya, Gabriela, Priscila, Fernando, Karoline, Aninha, Débora, Laura, Gutto, Florencia, Thaís, Proust, Filippe, Thiago, Magalhães e Edilene, pelo excelente convívio e apoio.
À Zezé, que nos ensina a dar os primeiros passos no laboratório, está sempre disposta a nos ajudar com nossos problemas e em tudo que precisamos. Muito obrigada.
Ao Sr. Braz pela cooperação para o funcionamento do laboratório.
Aos amigos do mestrado pela parceria, e especialmente à Baju pela amizade.
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À Franciny pela experiência e conhecimentos compartilhados, David pelo olhar abrangente sobre todos os aspectos, Valquíria sempre disposta a estender uma mão amiga, PEP pelos conselhos inovadores, e à Bruna pela ponderação. Vocês estão entre os maiores amigos que fiz, são especiais para mim e os levarei sempre comigo.
Novamente a Bruna, obrigada pelo apoio, companhia e crescimento que compartilhamos ao longo desses anos. Você é um exemplo de força pra mim.
Ao Rafael pela companhia nos momentos fáceis e difíceis, e pelo carinho e preocupação.
Agradeço à Tia Ana e Tia Áurea por ajudarem-me a chegar onde estou. E obrigada a toda minha família pelo suporte desde pequena.
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Resumo
Em uma economia movida pelo transporte, a dinâmica dos combustíveis líquidos faz parte de sua engenharia. A mudança do consumo de energia baseado em combustíveis fósseis para os de fontes renováveis é um desafio e uma necessidade de ordem econômica e ambiental. Uma vez que o petróleo é a principal fonte fóssil utilizada e possui reservas de fácil acesso limitadas, o consumo destas irá eventualmente exaurir sua oferta. Uma alternativa que tem mostrado-se promissora nos últimos anos é o uso dos Biocombustíveis. Dentre estes, o maior destaque é dado ao Bioetanol e Biodiesel. A partir do processo produtivo de Biodiesel industrialmente utilizado são obtidos ésteres monoalquílicos de ácidos graxos (Biodiesel) e co-produtos dos quais o mais importante é o glicerol. Muitos microrganismos são capazes de utilizar o glicerol como única fonte de carbono, e um exemplo são as leveduras. O objetivo deste projeto foi desenvolver um processo, industrialmente vantajoso, para utilizar um co-produto de baixo custo da produção de Biodiesel como base para meio de cultura para diferentes leveduras. Utilizou-se três linhagens de interesse comercial, Saccharomyces cerevisiae LBCM 653C (produtora de
cachaça) e do fermento de panificação FLEISHMANN, e S. boulardii, e uma linhagem
laboratorial, S. cerevisiae BY4741. Cresceu-se essas linhagens em diluições de resíduo
glicérico bruto de Biodiesel fornecido pelo CETEC (Centro Tecnológico de Minas Gerais/Belo Horizonte-MG) e pela BIOMINAS (Biominas Indústria e Comércio de Biodiesel LTDA/Itaúna-MG). As diluições foram acrescidas de diferentes fontes nitrogenadas (YP – Extrato de levedura e Peptona, Sulfato de Amônio e Uréia) e analisadas quanto ao crescimento celular. As preparações nas quais obteve-se crescimento celular similar àquele obtido em meio laboratorial YPGlicerol foi com o acréscimo de YP como fonte nitrogenada, e o crescimento celular em resíduo diluído com ou sem a adição Sulfato de Amônio e Uréia não foi apreciável quando comparado àquele obtido com YP. Análise dos dados mostrou que o crescimento celular em cada preparação de resíduo de Biodiesel diluído depende da linhagem utilizada. Sugere-se que a manutenção do pH em valores mais baixos estimule o crescimento celular em resíduo de Biodiesel diluído. Além disso, a estocagem parece promover modificações no resíduo que inibem o crescimento celular da linhagem S. boulardii sob as condições ensaiadas. Devido ao fato de que as
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Abstract
In an economy driven by transport, the dynamics of liquid fuels is part of its engineering. The change of energy consumption based on fossil fuels to renewable sources is a challenge and an economic and environmental necessity. Since oil is the main fossil source used and its easy access reserves are limited its use will eventually exhaust your supply. An alternative that has shown some promise in recent years is the use of biofuels. Among these, the greatest emphasis is given to the Bioethanol and Biodiesel. From the Biodiesel industrial production process used are obtained fatty acid alkyl esters (Biodiesel) and by-products of which the most important is glycerol. Many microorganisms are able to use glycerol as sole carbon source, and an example are the yeasts. This project aimed to develop a process, industrially advantageous, to use the low cost by-product of Biodiesel production as basis for a culture medium for different yeasts. Were used three commercial interest strains, Saccharomyces cerevisiaeLBCM 653C (cachaça producer) and the baker’s
yeast Fleishmann, and Saccharomyces boulardii, and a laboratory strain, Saccharomyces
cerevisiae BY4741. These strains were grown in dilutions of crude glyceric Biodiesel
wastes provided by CETEC (Centro Tecnológico de Minas Gerais / Belo Horizonte-MG) and by BIOMINAS (Biominas Indústria e Comércio de Biodiesel LTDA/Itaúna-MG). The dilutions were added of different nitrogen sources (YP – Yeast Extract and Peptone, Ammonium Sulfate and Urea) and analyzed for their cell growth. The preparations in which was obtained similar growth to that in YPGlycerol had the addition of YP as nitrogen source, and the growth in diluted residue with or without addition of Urea and Ammonium Sulfate was not appreciable when compared to that obtained with YP. The data analysis show that cell growth depends on the strain used. It is suggested that maintaining the pH at lower values encourage cell growth in Biodiesel residue diluted. In addition, the storage appears to promote changes in the residue that inhibit the growth of S.
boulardii under the conditions tested. Once the yeasts studied were able to grow in
dilutions of Biodiesel wastes, the use of this residue in biotechnological process is feasible.
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Lista de abreviaturas
Ag2SO4 Sulfato de Prata
ANP Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis
B100 Biodiesel puro
BIOMINAS Biominas Indústria e Comércio de Biodiesel Ltda
BTU British Thermal Unit
BX Diesel acrescido de X% de Biodiesel
Ca(OH)2 Hidróxido de Cálcio
CaSO4 Sulfato de Cálcio
CETEC Centro Tecnológico de Minas Gerais
CH3CH2OH Etanol
CNPE Conselho Nacional de Política Energética DAK1 Isogene 1 da Diidroxicetona quinase DAK2 Isogene 2 da Diidroxicetona quinase
DHA Ácido Docosa-hexanóico
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DO Densidade Óptica
DQO Demanda Química de Oxigênio
EIA U.S. Energy Information Administration
EUROSCARF European Saccharomyces cerevisiae Archive for Functional
Analysis
FAEEs Fatty-acids ethil esthers (Ésteres etílicos de ácidos graxos)
FAMEs Fatty-acids methyl esthers (Ésteres metílicos de ácidos graxos)
Fps1p Canal protéico de transporte de glicerol por difusão facilitada
g Grama
G Unidade de Força Rotacional
GCY1 Gene putative envolvido em via alternative de catabolismo de glicerol
GEEs Gases de Efeito Estufa
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Gpd2p Glicerol-3-fosfato desidrogenase isoforma 2 GPP1 Isogene 1 da Glicerol-3-fosfatase
Gpp1p Glicerol-3-fosfatase isoforma 1 GPP2 Isogene 2 da Glicerol-3-fosfatase Gpp2p Glicerol-3-fosfatase isoforma 2
GRAS Generally Regarded As Safe
GUT1 Gene da Glicerol quinase
Gut1p Glicerol quinase
GUT2 Gene da Glicerol-3-fosfato dedidrogenase mitocondrial Gut2p Glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial
HCl Ácido Clorídrico
H2NCONH2 Uréia
H2O Água
H2SO4 Ácido Sulfúrico
HgSO4 Sulfato de Mercúrio II
HOG High Osmolarity Glycerol Response Pathway
K2Cr2O7 Dicromato de Potássio
IPCC Intergovernmental Panel on Climate Change
KOH Hidróxido de Potássio
L Litro
LBCM Laboratório de Biologia Celular e Molecular MES Ácido 2-morfolinoetanosulfónico Monohidratado
Mg Miligrama
mL Mililitro
NaCl Cloreto de Sódio
NAD+ Dinucleotídeo de Nicotinamida-Adenina oxidado NADH Dinucleotídeo de Nicotinamida-Adenina resuzido
NaOH Hidróxido de Sódio
Na2SO4 Sulfato de Sódio
(NH4)2SO4 Sulfato de Amônio
NUPEB Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
P.A. Pró Análise
xi
pH Potencial Hidrogeniônico
ppm Partes Por Milhão
RPM Rotação Por Minuto
STL1 Gene do transportador ativo de glicerol Stl1p Transportador ativo de glicerol
UFOP Universidade Federal de Ouro Preto
UV Ultra Violeta
YP Meio Yeast Extract e Peptone
YPD Meio Yeast Extract e Peptone com dextrose
YPGlicerol Meio Yeast Extract e Peptone com glicerol
nm Nanômetro
xii
Figura 1. Demanda mundial de energia 1990 - 2035 (Fonte: International Energy Outlook
2010) ... 1
Figura 2. Emissões globais de GEEs antropogênicos (1970 - 2004) (Fonte: Climate Change 2007: Synthesis Report) ... 2
Figura 3. Consumo mundial de energia por tipo de combustível 1990 - 2035 (Fonte: International Energy Outlook 2010) ... 3
Figura 4. Cadeia produtiva de Biodiesel [Fontes: Resolução nº 25/2008 (AGÊNCIA NACIONAL DE PETRÓLEO, 2008b), adaptado de (CONSELHO DE ALTOS ESTUDOS E AVALIAÇÃO TECNOLÓGICA, 2003) e (SOUZA, 2005)] ... 6
Figura 5. Equação geral para a reação de transesterificação [Fonte: Adaptado de (SCHUCHARDT et al., 1998)] ... 7
Figura 6. Processo geral de produção de Biodiesel (SÁ PARENTE, 2003) ... 10
Figura 7. Desenho Experimental ... 21
Figura 8. Resíduo da produção de Biodiesel produzido pelo CETEC ... 22
Figura 9. Resíduo da produção de Biodiesel produzido pela BIOMINAS ... 23
Figura 10. Análise química de glicerol por oxidação de matéria orgânica com K2Cr2O7 em meio ácido ... 28
Figura 11. Representação da análise de determinação de crescimento em diluição do resíduo fornecido pelo CETEC com e sem adição YP como fonte nitrogenada ... 31
Figura 12. Representação da análise de determinação de crescimento em diluição do resíduo fornecido pelo CETEC com e sem adição de YP, (NH4)2SO4 e H2NCONH2 como fontes nitrogenadas ... 34
Figura 13. Esquema da análise de S. cerevisiae Fermento FLEISHMANN em pH livre X pH constante (5,5) ... 37
Figura 14. Determinação de crescimento das quatro linhagens sob estudo em concentrações crescentes de NaCl ... 39
Figura 15. Determinação do crescimento de S. cerevisiae BY4741 sob estresse hiper-osmótico ... 40
xiii
Figura 17. Aparência das diluições aquosas do resíduo glicérico bruto fornecido pelo CETEC ... 43 Figura 18. Teste para verificar a presença de sabão, empregando-se (a) 0,50; (b) 1,0; (c) 2,5 e (d) 5,0% m/m de catalisador nas transesterificações (Fonte: (RINALDI et al., 2007)) ... 44
Figura 19. Teste de extração de glicerol com e sem adição de agente de quebra de emulsão Etanol absoluto ... 45 Figura 20. Formação de precipitado branco durante a extração utilizando solução a 1M de Ca(OH)2 ... 46 Figura 21. Curva analítica para oxidação de matéria orgânica (Glicerol) ... 47 Figura 22. Medidas do pH das linhagens sob estudo crescidas em diluição do resíduo CETEC para 8,5% de glicerol usando YP como fonte nitrogenada. ... 51 Figura 23. Variação do crescimento celular das linhagens sob estudo cultivadas em diluição do resíduo CETEC para 8,5% de glicerol usando YP como fonte nitrogenada. ... 53 Figura 24. Medidas do pH das linhagens sob estudo crescidas em diluição do resíduo CETEC para 2,8% de glicerol usando YP, (NH4)2SO4 e H2NCONH2 como fontes nitrogenadas. ... 55 Figura 25. Variação do crescimento celular das linhagens sob estudo crescidas em diluição do resíduo CETEC para 2,8% de glicerol usando YP, (NH4)2SO4 e H2NCONH2 como fontes nitrogenadas. ... 58 Figura 26. Medidas do pH das linhagens sob estudo cultivadas em diluição do resíduo BIOMINAS para 3,0% de glicerol usando YP, (NH4)2SO4 e H2NCONH2 como fontes nitrogenadas. ... 60 Figura 27. Variação do crescimento celular das linhagens sob estudo cultivadas em diluição do resíduo BIOMINAS para 3,0% de glicerol usando YP, (NH4)2SO4 e H2NCONH2 como fontes nitrogenadas. ... 62 Figura 28. Variação do crescimento celular de S. cerevisiae BY4741 em diluição do
resíduo CETEC e BIOMINAS ... 63 Figura 29. Variação do crescimento celular de S. cerevisiae LBCM 653C em diluição de
resíduo CETEC e BIOMINAS ... 64 Figura 30. Variação do crescimento celular de S. cerevisiae do fermento de panificação
FLEISHMANN em diluição de resíduo CETEC e BIOMINAS ... 64 Figura 31. Variação do crescimento celular de S. boulardii em diluição de resíduo CETEC
xiv
Figura 32. Determinação do crescimento celular de S. cerevisiae FLEISHMANN sob
manutenção do pH ... 66 Figura 33. Efeito de concentrações crescente de NaCl sob o crescimento celular das linhagens estudadas. Cada coluna em cada uma das concentrações de NaCl (0, 50, 100, 500mM e 1M), mostram as seguintes diluições dos meios de cultivo: meio sem diluição (s/d), e diluídos para 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5 em água destilada estéril. A: S. cerevisiae
BY4741; B: S. cerevisiae LBCM 653C; C: S. cerevisiae do fermento de panificação
FLEISHMANN; D: S. boulardii. ... 67
Figura 34. Medidas do pH de S. cerevisiae BY4741 crescida em diluição de resíduo de
Biodiesel e em YPGlicerol na presença e ausência de estresse hiper-osmótico ... 68 Figura 35. Variação do crescimento celular de S. cerevisiae BY4741 em diluição de
resíduo de Biodiesel e em YPGlicerol na presença e ausência de estresse hiper-osmótico 68 Figura 36. Variação do pH do crescimento de S. boulardii em resíduo diluído estocado sob
diferentes condições ... 69 Figura 37. Variação do crescimento de S. boulardii em resíduo diluído estocado sob
diferentes condições ... 70 Figura 38. Aspecto da diluição de resíduo CETEC para 2,8% de glicerol com adição de YP como fonte nitrogenada após cultivo de S. cerevisiae FLEISHMANN e após centrifugação
à 4ºC ... 71 Figura 39. Quantidade de provavelmente de óleo ou gordura presente em diluição de resíduo CETEC para 2,8% de glicerol com adição de YP como fonte nitrogenada após cultivo de S. cerevisiae FLEISHMANN ... 72
xv
Lista de tabelas
Tabela 1. Linhagens de leveduras estudadas ... 23 Tabela 2. Testes de crescimento com resíduo CETEC e YP como fonte nitrogenada ... 30 Tabela 3. Composição dos testes A e B (diluições do resíduo), C (padrão) – resíduo CETEC + YP ... 30 Tabela 4. Teste de crescimento com resíduo CETEC com YP, (NH4)2SO4 ou H2NCONH2 ... 32 Tabela 5. Composição dos testes A, B, C, D, E, F e G – resíduo CETEC ... 33 Tabela 6. Composição dos testes A, B, C, D, E, F, e G – resíduo BIOMINAS ... 35 Tabela 7. Testes S. cerevisiae fermento de panificação FLEISHMANN em fermentador . 36
xvi
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1 PANORAMA ENERGÉTICO MUNDIAL ... 1
1.2 BIOCOMBUSTÍVEIS NO BRASIL ... 4
1.3 BIODIESEL ... 5
1.3.1 Matérias-primas ... 6
1.3.2 Reação de transesterificação ... 7
1.3.3 Catalisadores ... 8
1.3.4 Alcoóis ... 9
1.3.5 Co-produtos ... 10
1.3.6 Usos do glicerol do Biodiesel ... 11
1.4 LEVEDURAS ... 13
1.4.1 Aplicação biotecnológica de leveduras ... 14
1.4.2 Saccharomyces cerevisiae e glicerol ... 15
1.4.2.1 Síntese de glicerol ... 15
1.4.2.2 Assimilação de glicerol ... 16
1.4.2.3 Transporte de glicerol ... 17
2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ... 19
3. OBJETIVOS ... 20
4. DESENHO EXPERIMENTAL ... 21
5. METODOLOGIA ... 22
5.1 RESÍDUOS DE BIODIESEL UTILIZADOS ... 22
5.2 MICRORGANISMOS ... 23
5.3 SOLUÇÕES E MEIOS DE CULTURA ... 24
5.3.1 Soluções estoque de glicose e glicerol ... 24
5.3.1.1 Solução estoque de Glicose 40% ... 24
5.3.1.2 Solução estoque de Glicerol 40% ... 24
5.3.2 Meios contendo YP ... 24
5.3.2.1 Meio YPD (glicose) ... 24
5.3.2.2 Meio YPGlicerol ... 24
5.3.2.3 Meio YPD-Ágar ... 24
xvii
5.3.3.1 Diluição CETEC para 8,5% de glicerol ... 25
5.3.3.2 Diluição CETEC para 2,8% de glicerol ... 25
5.3.3.3 Diluição BIOMINAS para 3% de glicerol ... 25
5.3.4 Soluções estoque das fontes nitrogenadas ... 25
5.3.4.1 Fonte nitrogenada YP ... 25
5.3.4.2 Fonte nitrogenada Sulfato de Amônio [(NH4)2SO4] ... 25
5.3.4.3 Fonte nitrogenada Uréia [H2NCONH2] ... 26
5.3.5 Solução de Biotina ... 26
5.4 ANÁLISE QUÍMICA DE GLICEROL NO RESÍDUO BRUTO: ANÁLISE POR OXIDAÇÃO DE MATÉRIA ORGÂNICA PELO DICROMATO DE POTÁSSIO EM MEIO ÁCIDO ... 26
5.5 DETERMINAÇÃO DO VALOR DE pH DE DILUIÇÕES DOS RESÍDUOS ANALISADOS ... 29
5.6 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR EM DIFERENTES ... 29
DILUIÇÕES DE RESÍDUOS DE BIODIESEL ... 29
5.6.1 Determinação do crescimento celular em diluições do resíduo de Biodiesel fornecido pelo CETEC ... 29
5.6.1.1 Determinação de crescimento celular utilizando YP como fonte nitrogenada ... 29
5.6.1.2 Determinação de crescimento celular utilizando YP, Sulfato de Amônio [(NH4)2SO4] e Uréia [H2NCONH2] como fontes nitrogenadas ... 31
5.6.2 Determinação do crescimento celular em diluições do resíduo de Biodiesel fornecido pela BIOMINAS ... 34
5.6.2.1 Determinação de crescimento utilizando YP, Sulfato de Amônio [(NH4)2SO4] e Uréia [H2NCONH2] como fontes nitrogenadas ... 35
5.7 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR DE S. cerevisiae DO ... 36
FERMENTO DE PANIFICAÇÃO FLEISHMANN SOB MANUTENÇÃO DE pH ... 36
5.8 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR EM ... 38
CONCENTRAÇÕES CRESCENTES DE NaCl ... 38
5.9 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR SOB ESTÍMULOS ... 39
xviii
5.10 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR EM RESÍDUO DE
BIODIESEL DILUÍDO ESTOCADO SOB DIFERENTES TEMPERATURAS... 41
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 43
6.1 ANÁLISE QUÍMICA DE GLICEROL NO RESÍDUO BRUTO: ANÁLISE POR OXIDAÇÃO DE MATÉRIA ORGÂNICA PELO DICROMATO DE POTÁSSIO EM MEIO ÁCIDO ... 43
6.2 DETERMINAÇÃO DO VALOR DE pH DE DILUIÇÕES DOS RESÍDUOS ... 49
ANALISADOS ... 49
6.3 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR EM DIFERENTES ... 49
DILUIÇÕES DE RESÍDUOS DE BIODIESEL ... 49
6.3.1 Determinação do crescimento celular em diluições do resíduo de Biodiesel fornecido pelo CETEC ... 49
6.3.1.1 Determinação de crescimento celular em resíduo diluído para 8,5% de glicerol utilizando YP como fonte nitrogenada ... 49
6.3.1.2 Determinação de crescimento celular em resíduo diluído para 2,8% de glicerol utilizando YP, (NH4)2SO4 e H2NCONH2 como fontes nitrogenadas ... 54
6.3.2 Determinação do crescimento em diluições do resíduo de Biodiesel fornecido pelo BIOMINAS ... 59
6.3.2.1 Determinação de crescimento celular em resíduo diluído para 3,0% de glicerol utilizando YP, (NH4)2SO4 e H2NCONH2 como fontes nitrogenadas ... 59
6.3.3 Comparação do crescimento celular por linhagens sob estudo crescidas em diluição de resíduo CETEC e BIOMINAS ... 63
6.4 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR DE S. cerevisiae FERMENTO DE PANIFICAÇÃO FLEISHMANN SOB MANUTENÇÃO DE pH ... 65
6.5 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR EM CONCENTRAÇÕES CRESCENTES DE NaCl ... 66
6.6 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR SOB ESTÍMULOS HIPER-OSMÓTICOS ... 67
6.7 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR EM RESÍDUO DE BIODIESEL DILUÍDO ESTOCADO SOB DIFERENTES TEMPERATURAS... 69
7. CONCLUSÕES ... 73
8. PERSPECTIVAS ... 75
xix
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 PANORAMA ENERGÉTICO MUNDIAL
O crescimento populacional e desenvolvimento da economia acarretam crescentes necessidades por energias. Segundo dados e projeções da U.S. Energy Information
Administration (EIA) o crescente consumo mundial de energia chegará a aproximadamente
740 quadrilhões de BTU em 2035 (Figura 1) (KNOTHE et al., 2004; EIA, 2010).
Figura 1. Demanda mundial de energia 1990 - 2035 (Fonte: International Energy Outlook 2010)
Cerca de 90% das necessidades globais por energias concentram-se em três fontes fósseis primárias: petróleo – 40%, carvão mineral – 30%, e gás natural – 20% (DALE, 2008). Atualmente está-se à volta do “Peak Oil”, ponto em que novas descobertas de
reservatório não compensam a redução da produção das reservas atuais. Uma vez que o petróleo possui reservas limitadas seu consumo irá eventualmente exaurir sua oferta (SIVAKUMAR et al., 2010). O declínio é gradual, não mais que 2-3% ao ano, porém em
2
regiões politicamente instáveis, o que pode resultar em enormes flutuações na sua oferta e, conseqüentemente, no preço do barril (SIVAKUMAR et al., 2010). Exemplo disso é que
devido aos conflitos na Líbia e no Oriente Médio em Abril deste ano o barril de petróleo chegou ao valor de U$121,00 na bolsa de Londres (EFE, 2011).
A mudança do consumo de energia, o qual é majoritariamente baseado em combustíveis fósseis para combustíveis de fontes renováveis, além de um desafio, é uma necessidade de ordem econômica e ambiental. Por um lado, o preço da commodity do
petróleo alterou-se substancialmente nos últimos anos. Por outro, as concentrações de Gases de Efeito Estufa (GEEs) na atmosfera cresceram rapidamente. As emissões globais aumentaram em 70% entre 1970 e 2004 (época pré-industrial até atualmente). O CO2 é o mais importante GEE antropogênico e suas emissões anuais representaram em 2004 77% do total de emissões desses gases derivados de atividades humanas. Neste mesmo ano, 56,8% das emissões de CO2 deveram-se à queima de combustíveis fósseis (Figura 2) (IPCC, 2007). Para minimizar o aquecimento global e os impactos das mudanças climáticas, as emissões de GEEs deveriam ser reduzidas para menos da metade dos níveis de emissões de 1990 (WEILAND, 2009).
3
Neste panorama, os Biocombustíveis, fontes de energia renováveis, aparecem como uma alternativa promissora aos combustíveis de origem fóssil. Biocombustíveis são derivados de biomassa renovável que podem substituir parcial ou totalmente os combustíveis derivados de petróleo e gás natural em motores a combustão ou em outro tipo de geração de energia (ANP).
As características principais de um Biocombustível sustentável adequado são: ter potencial de substituir os combustíveis fósseis, porém não devem afetar o suprimento global de alimentos; ter saldo líquido positivo de energia, ou seja, fornecer mais energia do que aquela utilizada para produzi-lo; e, ter menor impacto ambiental ou proporcionar benefícios ambientais como a redução de GEEs (SIVAKUMAR et al., 2010) e (JOHNSON
et al., 2007).
Dos 740 quadrilhões de Btu citados inicialmente (Figura 1), 100 serão em energias renováveis (Figura 3) (EIA, 2010).
4
Dentre as energias renováveis, o maior destaque é dado para o Bioetanol e o Biodiesel.
1.2 BIOCOMBUSTÍVEIS NO BRASIL
O histórico brasileiro em relação ao Bioetanol começou em 1975, quando para fazer frente aos sucessivos aumentos do preço do petróleo foi criado o Proálcool, uma iniciativa governamental. O programa tinha como objetivo garantir o suprimento de etanol no processo de substituição da gasolina. Tinha também como meta apoiar o desenvolvimento tecnológico da indústria sucroalcooleira. O Bioetanol tem sua dinâmica produtiva bem sedimentada no Brasil, e toda gasolina vendida possui atualmente adição de 25% de Bioetanol anidro (ANP).
A iniciativa governamental nacional para produção de Biodiesel é bem mais recente. Em 2005 foi publicada a Lei nº 11.097, que introduziu o Biodiesel na matriz energética brasileira. Desde então a ANP assumiu a atribuição de regular e fiscalizar as atividades relativas à produção, controle de qualidade, distribuição, revenda e comercialização do biodiesel e da mistura óleo diesel-biodiesel (BX) (ANP).
A legislação brasileira dispõe que todo produtor de Biodiesel deve vender sua produção para a ANP através de leilões realizados mensalmente. O objetivo inicial dos leilões foi gerar mercado e, desse modo, estimular a produção de biodiesel em quantidade suficiente para que refinarias e distribuidores pudessem compor a mistura (BX) determinada por lei, e para assegurar que todo o óleo diesel comercializado no país contenha o percentual de biodiesel determinado em lei (ANP).
Desde 1º de janeiro de 2010, o óleo diesel comercializado em todo o Brasil contém 5% de Biodiesel, o que é conhecido como B5. Esta regra foi estabelecida pela Resolução nº 6/2009 do Conselho Nacional de Política Energética (CNPE), publicada no Diário Oficial da União (DOU) em 26 de outubro de 2009, que aumentou de 4% para 5% o percentual obrigatório de mistura de biodiesel ao óleo diesel. A contínua elevação do percentual de adição de biodiesel ao diesel demonstra o sucesso do Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel e da experiência acumulada pelo Brasil na produção e no uso em larga escala de Biocombustíveis (ANP).
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após ter visto o funcionamento do motor por ele desenvolvido com óleo de amendoim em uma exposição em Paris em 1900, apresentou-se favorável à idéia. O primeiro relato do que hoje é conhecido como Biodiesel parece ter ocorrido em 1937 na Bélgica, quando o cientista G. Chavanne da Universidade Bruxelas patenteou um "Procedimento para a
transformação de óleos vegetais para seu uso como combustíveis” (KNOTHE et al., 2004).
Mas a primeira patente de um processo produtivo industrial para Biodiesel veio em 1977 concedida ao pesquisador brasileiro Expedito José de Sá Parente (LIM & TEONG, 2010).
O Biodiesel tem composição e características similares ao diesel de petróleo. Portanto, quando misturado ao petrodiesel pode ser usado em motores Diesel sem qualquer modificação. Várias de suas vantagens tais como diminuição na emissão de GEEs, número de cetano comparável ao petrodiesel, maior capacidade de lubrificação, tornaram o Biodiesel um dos biocombustível mais comuns no mundo (LIM & TEONG, 2010).
1.3 BIODIESEL
Segundo a Resolução ANP nº 7/2008 Biodiesel – B100 – é um combustível composto de alquil ésteres de ácidos graxos de cadeia longa, derivados de óleos vegetais ou de gorduras animais conforme especificação contida no Regulamento Técnico, parte integrante desta Resolução (AGÊNCIA NACIONAL DE PETRÓLEO, 2008a).
Na cadeia produtiva do Biodiesel, deve-se levar em consideração fatores relacionados à escolha dos insumos ou matérias-primas para a produção agrícola, o armazenamento, a caracterização e controle de qualidade, a co-produção e, por fim, a própria comercialização e distribuição (COSTA & HOESCHL, 2006). Ou seja, os principais elos dessa cadeia são: a produção do grão, a extração do óleo, a produção do biodiesel a partir do grão, a distribuição e a revenda ao consumidor (LEIRAS et al., 2006)
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Figura 4. Cadeia produtiva de Biodiesel [Fontes: Resolução nº 25/2008 (AGÊNCIA
NACIONAL DE PETRÓLEO, 2008b), adaptado de (CONSELHO DE ALTOS ESTUDOS E AVALIAÇÃO TECNOLÓGICA, 2003) e (SOUZA, 2005)]
1.3.1 Matérias-primas
Existem muitas opções para a utilização de diferentes matérias-primas na produção de Biodiesel. Além de oleaginosas como a Colza, Soja, e Girassol também podem ser usadas microalgas, gorduras de animais e óleos residuais (RUTZ & JANSSEN, 2008). Uma das maneiras de reduzir a dependência do óleo comestível é a utilização de óleos não-comestíveis, como o do Pinhão-manso, Mamona e Pongamia pinnata, por exemplo. Há
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rendimento na produção de óleos não-comestíveis e por não competirem com terra para produção de alimentos (JANAUN & ELLIS, 2010). Embora muitos estudos sejam realizados, ainda não há produção industrial de microalgas visando à fabricação de Biodiesel devido aos altos custos produtivos (FENG et al., 2011).
Os óleos vegetais devem passar por processamento para tornarem-se combustíveis de qualidade uma vez que devido à alta viscosidade e baixo ponto de fulgor daqueles, não são adequados para o uso direto em motores Diesel (GERPEN, 2005) e (LIM & TEONG, 2010). A alta viscosidade é o maior dos problemas, portanto, quatro métodos para reduzi-la foram investigados ao longo do tempo: mistura com petrodiesel (diluição), pirólise (craqueamento), microemulsão (mistura com co-solvente) e transesterificação. A transesterificação é o método mais comum, e somente este leva ao produto conhecido como Biodiesel, ou seja, ésteres alquílicos de óleos e gorduras (KNOTHE et al., 2005).
1.3.2 Reação de transesterificação
A transesterificação, ou alcoólise, é o processo pelo qual os óleos e gorduras orgânicas são transformados em biocombustível. Esses óleos e gorduras orgânicas são compostos por triacilgliceróis, que são três cadeias de ácidos graxos ligadas por uma molécula de glicerol (RUTZ & JANSSEN, 2008). Na reação de transesterificação uma molécula de triacilglicerol reage com três moléculas de álcool formando três moléculas de ésteres monoalquílicos de ácido graxos (Biodiesel) e uma molécula de glicerol (Figura 5).
Figura 5. Equação geral para a reação de transesterificação [Fonte: Adaptado de (SCHUCHARDT et al., 1998)]
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em duas fases, a glicerina na parte inferior e o biodiesel na superior (SCHUCHARDT et
al., 1998).
A reação é um equilíbrio, e a transformação ocorre essencialmente pela mistura dos reagentes. Porém, a presença de um catalisador acelera consideravelmente o processo reacional. Os catalisadores primordialmente utilizados são bases ou ácidos fortes. Com o intuito de aumentar o rendimento de ésteres, o álcool é adicionado em excesso (SCHUCHARDT et al., 1998). No processo industrial, após a separação das fases o
excesso de álcool é recuperado tanto do Biodiesel quanto da glicerina. Estas fases seguem para posteriores etapas de purificação.
O glicerol é removido dos alquil ésteres por decantação ou centrifugação devido à baixa solubilidade do glicerol em ésteres. Alcoóis podem agir como co-solventes aumentando a solubilidade do glicerol no Biodiesel o que torna a separação mais lenta. Contudo, o excesso de álcool normalmente não é retirado até que as fases estejam separadas para evitar a reversão da reação de transesterificação (GERPEN, 2005; KNOTHE et al., 2005).
1.3.3 Catalisadores
Diferentes tipos de catalisadores podem ser usados. Dentre os mais estudados estão hidróxidos e alcóxidos de metais alcalinos, ácidos de Bronsted, bases orgâncias, enzimas hídrolíticas e polímeros contendo guanidina imobilizada (SCHUCHARDT et al., 1998).
No entanto, nos processos produtivos industriais a transesterificação por catálise alcalina é a utilizada.
Embora a reação ocorra na ausência de catalisadores, o seu uso deve-se à razões econômicas. O processo sem a adição de catalisador ocorre muito lentamente e com grande quantidade de energia para aquecimento é necessária. A vantagem seria a obtenção de ésteres puros e glicerina livre de sabão (RUTZ & JANSSEN, 2008).
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formação de sabão devido à presença de base forte no meio. Pode ocorrer saponificação dos ésteres (Biodiesel) ou dos próprios triacilgliceróis através de hidrólise básica (RINALDI et al., 2007). A reação de saponificação decorrente diminui consideravelmente
o rendimento de ésteres e dificulta a recuperação do glicerol devido à formação de emulsão (SCHUCHARDT et al., 1998). Contudo, a catálise em meio alcalino é mais rápida, simples
e mais eficiente, e é a escolha para a produção industrial de Biodiesel (SOLDI et al., 2009).
Os hidróxidos de metais alcalinos, em especial Hidróxido de Potássio (KOH) e Hidróxido de Sódio (NaOH) são os mais utilizados devido ao baixo preço e fácil disponibilidade.
Para reduzir o sabão gerado, recomenda-se conduzir a reação de transesterificação utilizando matérias-primas (triacilgliceróis) com baixo conteúdo em ácidos graxos livres e água, e ao mesmo tempo reduzir a quantidade de catalisador no processo (OOI et al.,
2004). O uso de alcoóxidos também leva à produção de glicerol com maior grau de pureza, pois nesse caso não há a formação de água ou sabão (KNOTHE et al., 2005; KNOTHE,
2010).
As enzimas hidrolíticas utilizadas no processo por catálise são razoavelmente estáveis e muitas vezes toleram solventes orgânicos. Além disso, sua seletividade as torna ferramentas valiosas. Porém, os custos não são favoráveis comparando-se com os sistemas catalisados por álcalis (SCHUCHARDT et al., 1998).
1.3.4 Alcoóis
Os alcoóis utilizados na reação de transesterificação para produção de Biodiesel são primordialmente o metanol ou o etanol, e respectivamente serão obtidos ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMEs) ou ésteres etílicos de ácido graxos (FAEEs) (DUAN et al.,
2011). A composição mais comum do Biodiesel é de FAMEs, principalmente devido ao fato que o metanol é mais barato que o etanol na maioria dos países (o que não é o caso do Brasil, onde os ésteres etílicos são usados como combustível) (KNOTHE et al., 2005). A
transesterificação metílica apresenta maior rendimento que a etílica uma vez que o metanol é mais reativo que o etanol. Além disso, os ésteres metílicos são mais facilmente separados da glicerina por serem menos miscíveis nesta que os ésteres metílicos (SCHUCHARDT et
al., 1998). A favor do etanol estão os fatos que este é muito menos tóxico que o metanol,
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produzido em larga escala no Brasil a partir de fontes renováveis, o que permite a produção de Biodiesel totalmente renovável (RUTZ & JANSSEN, 2008).
De maneira geral, o processo produtivo de Biodiesel está esquematizado na Figura 6.
Figura 6. Processo geral de produção de Biodiesel (SÁ PARENTE, 2003)
1.3.5 Co-produtos
Após a reação de transesterificação são formadas duas fases líquidas: a superior, composta principalmente pelos ésteres monoalquílicos (Biodiesel) e a fase mais densa, cuja maior proporção é em glicerol (OOI et al., 2004; RIVALDI et al., 2007; GOMES et al.,
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de álcool, impurezas inerentes à matéria-prima, e por vezes sabão (OOI et al., 2004;
FERRARI et al., 2005; HASHEMINEJAD et al., 2011). O sabão é formado quando há
presença de muitos ácidos graxos livres na matéria-prima. Esses reagem com o metal do catalisador alcalino usado formando sabão e água (GERPEN, 2005; RINALDI et al., 2007;
HASHEMINEJAD et al., 2011).
O glicerol é o principal co-produto da reação de transesterificação de trigliacilgliceróis para a produção de Biodiesel (COLIN et al., 2001; SILVA et al., 2009;
HASHEMINEJAD et al., 2011), sendo que 10% do peso de Biodiesel produzido
correspondem a glicerol (GONZÁLEZ-PAJUELO et al., 2004; DASARI et al., 2005; MU
et al., 2006; RIVALDI et al., 2007; SUN & CHEN, 2008; SILVA et al., 2009).
O resíduo bruto da produção de Biodiesel o qual contém glicerol é um líquido viscoso pardo escuro, que também contém quantidades variáveis de sabão (devido à presença de água ou ácidos graxos livres), mono e diacilgliceróis, álcool e catalisador usados no processo, impurezas inerentes à matéria-prima e água, o que lhe confere baixo custo (OOI et al., 2004; KNOTHE et al., 2005; RIVALDI et al., 2007; HASHEMINEJAD
et al., 2011). O aspecto do glicerol bruto está relacionado ao conteúdo de sabão presente, o
que garante a aparência de viscoso e escuro (OOI et al., 2004).
1.3.6 Usos do glicerol do Biodiesel
O glicerol possui uma grande variedade de utilizações, como em cosméticos, tintas, alimentos, medicamentos, tecidos e couro, tabaco, celulose e papel (SILVA et al., 2009).
Porém, sua aceitação na indústria é dependente do seu grau de pureza. Quando refinado para uma substância quimicamente pura, é um valioso co-produto do Biodiesel. No entanto, a purificação até alto grau de pureza é um processo caro e inviável para produtores de médio e pequeno porte. Dessa forma, estudos que viabilizem o uso do glicerol bruto tornariam o processo produtivo de Biodiesel mais competitivo (ITO et al., 2005;
THOMPSON & HE, 2005).
Existem diversos estudos para aplicações do glicerol bruto, como: conversão catalítica do glicerol para propilenoglicol, ácido propínico, ácido acrílico, propanol, acroleína, propanediol entre outro (NEMETH & SEVELLA, 2008; ZHENG et al., 2008;
ZHOU et al., 2008); conversão biológica para ácido cítrico, 1,3-propanodiol (GU et al.,
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como o acetal (2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il, um aditivo para gasolina) (GARCIA et al.,
2008); produção de H2 e Syngas (gás sintético formado por monóxido de carbono, dióxido de carbono e hidrogênio) (ITO et al., 2005; ADHIKARI et al., 2008); como fonte de
carbono para reatores de Drenagem Ácida em Minas; como ração para frangos e porcos (CERRATE et al., 2006; DELLA CASA et al., 2009; JANAUN & ELLIS, 2010).
Muitas pesquisas procuram utilizar o glicerol como matéria-prima para a indústria química na síntese de outros compostos. A produção de ácido dodecanóico e monoésteres de glicerina (PEREIRA-SOARES & SIMONE, 2007) e olefinas (SCIENCEDAILY, 2009, June 30), ou para síntese de monolaurina através da reação de glicerol por esterificação direta com ácido láurico (FREITAS et al., 2009), são exemplos. Alguns estudos analisam a
utilização de glicerol bruto como solvente para tratamento de biomassa lignocelulósica (SUN & CHEN, 2008). Células de combustível microbianas têm sido estudadas utilizando-se glicerol puro como substrato para produção de energia elétrica (CLAUWAERT et al.,
2008; ZUO et al., 2008; CANTERINO et al., 2009; FENG et al., 2011).
O glicerol é considerado como futura matéria-prima para fermentações industriais (WANG et al., 2001). Muitos microrganismos podem utilizar naturalmente o glicerol como
única fonte de carbono (SILVA et al., 2009).
As características físicas, químicas e nutricionais do glicerol bruto dependem do tipo de ácido graxo (gordura animal ou óleo vegetal) e do tipo de catalisador empregado na produção de biodiesel. No entanto, a procura pela glicerina purificada é muito maior, devida ao seu valor econômico. Por outro lado, o glicerol bruto contém elementos nutricionais, como, fósforo, enxofre, magnésio, cálcio, nitrogênio, originários dos óleos, e sódio ou potássio dos catalisadores, que podem ser utilizados pelos microrganismos durante processos fermentativos (THOMPSON & HE, 2005; RIVALDI et al., 2007). Além
disso, também possuem proteínas, gorduras e carboidratos (KOLESAROVA et al., 2011).
Já foi investigada a aplicabilidade do resíduo de glicerol bruto para a alimentação animal (HASHEMINEJAD et al., 2011). Resultados sugerem que o glicerol modula as
enzimas ou os microrganismos do trato digestivo de ruminante de uma forma dose dependente (WANG et al., 2009). Alguns trabalhos analisam a adição da glicerina bruta
para a alimentação de ruminantes, estudando as proporções, potencial toxicidade e metabolismo (FERRARO et al., 2009; KANSEDO et al., 2009; WANG et al., 2009).
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em meio contendo glicerol bruto obtido a partir de óleo de mamona e produziu lipases capazes de hidrolisar substratos com ácidos graxos de cadeia média (GODOY et al., 2010).
Outro estudo rastreou 162 espécies de bactérias na tentativa de identificar se existiam entre elas linhagens capazes de produzir ácido glicérico a partir de glicerol (HABE et al., 2009),
porém o estudo não foi realizado em resíduo bruto. Um trabalho investigou a produção de DHA (Ácido Docosa-hexanóico) e a qualidade da biomassa produzida pela alga
Schizochytrium limacinum crescida em meio contendo glicerol bruto obtido da produção
de Biodiesel a partir de diferentes matérias-primas (PYLE et al., 2008). Outros estudos
analisaram a fermentação anaeróbica de glicerol pela bactéria Paenibacillus macerans
(GUPTA et al., 2009) e modificações no metabolismo de Escherichia coli por engenharia
genética levou a produção de 1,2-PDO (1,2-propanodiol), etanol, formato, succinato e lactato a partir de glicerol (YAZDANI & GONZALEZ, 2007; SHAMS YAZDANI & GONZALEZ, 2008; BLANKSCHIEN et al., 2010; CLOMBURG & GONZALEZ, 2010;
MAZUMDAR et al., 2010). Diferentes bactérias foram estudas quanto a capacidade de
crescerem em glicerol bruto e produzirem biogás (KOLESAROVA et al., 2011).
Leveduras são exemplos de outros microrganismos capazes de crescerem em glicerol como única fonte de carbono (GANCEDO et al., 1968; MATSUZAWA et al.,
2010).
1.4 LEVEDURAS
Leveduras são células com formas esféricas, ovais ou elípticas, podendo ainda ser bastante alargadas, e por não possuírem flagelos são seres imóveis. O tamanho das células depende, por exemplo, da espécie, estado nutricional ou idade. Reproduzem-se por brotamento e a esporulação lhes garante a viabilidade das espécies durante variações do meio em que estão presentes. Quimicamente são compostas em sua maior proporção por água (68% a 83%), e também por substâncias nitrogenadas, carboidratos, lipídeos, vitaminas e minerais como principais constituintes (TORTORA et al., 2002;
GUIMARÃES, 2005).
Para o seu crescimento e reprodução as leveduras necessitam basicamente de compostos como água, fontes de carbono e nitrogênio, de oxigênio e minerais (TORTORA
et al., 2002). A maioria das espécies de leveduras estudadas assimila açúcares simples
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primários, polióis, ácidos orgânicos, pentoses, tetroses, hidrocarbonetos e lipídeos são utilizados seletivamente por algumas espécies. O carbono pode ser fornecido às leveduras na forma de açúcar, aldeídos, sais de alguns ácidos orgânicos, glicerol ou etanol, e ocasionalmente de alguma outra forma, dependendo do tipo da levedura. No entanto, as leveduras apresentam diferenças entre a capacidade de assimilar um açúcar ou de fermentá-lo (MADIGAN et al., 1997). A disponibilidade de fonte de carbono, assim como
de oxigênio no meio de cultivo levam a escolha entre o metabolismo aeróbico ou anaeróbico das leveduras (PASTERIS & STRASSER DE SAAD, 1998).
1.4.1 Aplicação biotecnológica de leveduras
A aplicação biotecnológica das leveduras está presente em setores industriais como alimentos, bebidas, biocombustíveis, produtos químicos, farmacêuticos, agrícolas e produção de enzimas (GUIMARÃES, 2005). A produção tradicional de etanol e de biomassa de leveduras fornece a maior quantidade de produtos de origem fermentativa no mundo, e espera-se que assim continuará.
Saccharomyces cerevisiae é uma levedura unicelular pertencente ao reino Fungi
(GERSHON & GERSHON, 2000). É um organismo utilizado em processos biotecnológicos há séculos, o que permitiu a seleção de inúmeras linhagens capazes de gerar diferentes subprodutos (MIGUEZ et al., 2003). Devido a sua longa história de
utilização para obtenção de produtos com fins alimentícios, Saccharomyces cerevisiae foi
classificada como microrganismo geralmente seguro (GRAS –generally regarded as safe).
A não patogenicidade aliada ao fato de sua susceptibilidade à modificação genética por tecnologia do DNA recombinante, principalmente após ter tido seu genoma completamente seqüenciado (GOFFEAU et al., 1996), tornaram esse organismo extremamente atraente
para aplicações tanto industriais quanto em pesquisas (OSTERGAARD et al., 2000), e
pode ser considerado o eucarioto mais estudado e cujo metabolismo é o mais conhecido (AQUARONE et al., 2001). Saccharomyces cerevisiae é utilizada na obtenção de produtos
de pequeno volume e alto valor agregado, como importantes enzimas, substâncias químicas, proteínas terapêuticas e outros produtos farmacêuticos (PRETORIUS et al.,
2003).
Outra levedura de interesse comercial é a Saccharomyces boulardii. Esta linhagem
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é uma alternativa comercialmente disponível na Europa, África e América do Sul para o tratamento dessa enfermidade. Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces boulardii são
membros da mesma espécie, embora apresentem diferenças específicas tanto genômicas quanto fisiológicas (EDWARDS-INGRAM et al., 2007).
1.4.2 Saccharomyces cerevisiae e glicerol
O glicerol é um importante composto em leveduras (SIDERIUS et al., 2000), pois
além de ser fonte de carbono e agir como um osmólito, sua síntese contribui para a manutenção do balanço redox celular (ANSELL et al., 1997). O glicerol também é um dos
precursores de fosfolipídeos, os quais estão envolvidos em sinalização celular (SIDERIUS
et al., 2000).
1.4.2.1 Síntese de glicerol
Saccharomyces cerevisiae possui a capacidade de responder rápida e efetivamente
às mudanças ambientais. Em resposta ao aumento da osmolaridade no meio de crescimento, Saccharomyces cerevisiae produz e acumula glicerol internamente
(ALBERTYN et al., 1994). Aumento nos níveis de Glicerol-3-fosfato desidrogenase
dependente de NAD+ (Gpd1p) foi observado sob choque osmótico (BLOMBERG & ADLER, 1989). O controle da produção de Gpd1p é regulado pela expressão do gene GPD1 através de um sinal específico pela via HOG (High Osmolarity Glycerol Response
Pathway), resultando em aumento da formação de glicerol (ALBERTYN et al., 1994;
WANG et al., 2001).
Além disso, em Saccharomyces cerevisiae, glicerol é uma das principais
substâncias produzidas durante a fermentação alcoólica além do etanol e dióxido de carbono (PASTERIS & STRASSER DE SAAD, 1998) a fim de que haja a manutenção do balanço redox (WANG et al., 2001). Em condições anaeróbicas há a necessidade da
produção de aceptores de elétrons endógenos (ANSELL et al., 1997). A síntese de glicerol
consome NADH compensando as reações celulares que produzem este intermediário reduzido (WANG et al., 2001).
O glicerol é produzido por um ramo lateral da glicólise (SIDERIUS et al., 2000). É
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etapas que são catalisadas pelas enzimas glicerol-3-fosfato desidrogenase (codificada pelo gene GPD) e glicerol-3-fosfatase (codificada pelo gene GPP). Cada enzima possui duas isoenzimas, osmoticamente induzidas, Gpd1p e Gpp2p, e constitutivas, Gpd2p e Gpp1p. A síntese de glicerol através de glicerol-3-fosfato foi investigada em Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Schizosaccharomyces pombe, Candida glycerinogenes, Zygosaccharomyces rouxii e Debaryomyces hansenii, sugerindo que essa
via é bastante comum em leveduras. Das duas enzimas citadas, Gpd1p parece ser a enzima-chave da síntese de glicerol em Saccharomyces cerevisiae. Glicerol-3-fostato e
diidroxicetona também são intermediários metabólicos importantíssimos para a síntese de outras substâncias além do glicerol, como fosfolipídeos e glicerolipídeos. Diidroxicetona fosfato também é precursora da síntese de aminoácidos (SIDERIUS et al., 2000; WANG et
al., 2001).
1.4.2.2 Assimilação de glicerol
Saccharomyces cerevisiae é capaz de utilizar o glicerol como única fonte de
carbono. Esse consumo é mediado principalmente por duas enzimas, Glicerol quinase (Gut1p), localizada no citosol e codificada pelo gene GUT1 e, Glicerol-3-fosfato desidrogenase (Gut2p), uma flavina-adenina dinucleotídeo específica localizada na mitocôndria, codificada pelo gene GUT2 (GRAUSLUND et al., 1999; WANG et al.,
2001). Após ser convertida em glicerol-3-fosfato pela Glicerol Quinase (Gut1p) no citosol, esse composto passa para o interior da membrana mitocondrial onde é oxidado à diidroxicetona fosfato pela Glicerol-3-fosfato Desidrogenase mitocondrial (Gut2p). Este retorna ao citosol onde é catabolisado na glicólise e usado para a síntese de glicose-6-fosfato durante a gliconeogênese. Essa mesma via foi identificada em outras leveduras como D. hansenii, Z. rouxii, C. glycerinogenes e S. pombe (GRAUSLUND et al., 1999;
WANG et al., 2001).
Muitas leveduras assimilam o glicerol via diidroxicetona. Inicialmente o glicerol é oxidado à diidroxicetona pela Glicerol Desidrogenase e, então, fosforilado à diidroxicetona fosfato pela Diidroxicetona Quinase. Em S. cerevisiae, estão presentes ambos os genes que
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deficientes em GUT1 ou GUT2 são incapazes de utilizar glicerol como única fonte de carbono, o que sugere que a via fosforilativa através de glicerol-3-fosfato é a principal na assimilação de glicerol por S. cerevisiae (GRAUSLUND et al., 1999; WANG et al., 2001).
1.4.2.3 Transporte de glicerol
O transporte de glicerol através da membrana celular em Saccharomyces cerevisiae
ocorre pelo mecanismo de difusão facilitada através do canal protéico Fps1p ou por um transporte ativo simporte glicerol/H+ (LAGES & LUCAS, 1997; GRAUSLUND et al.,
1999). Apesar de a difusão passiva ocorrer em ambas direções, o canal protéico Fps1p é a principal forma de exportação do glicerol especialmente em condições fermentativas (TAMAS et al., 1999; WANG et al., 2001). Sob condições de estresse hiper-osmótico,
esse canal fecha-se conservando o glicerol dentro da célula e mantendo o equilíbrio osmótico com o meio externo. Na ausência da alta osmolaridade externa esse canal permanece aberto e o glicerol permeia livremente a célula (LUYTEN et al., 1995; TAMAS
et al., 1999; HOHMANN et al., 2000; SIDERIUS et al., 2000; WANG et al., 2001). O
canal Fps1p regula mais a saída de glicerol da célula do que sua entrada. Foi demonstrado que mutantes deficientes de Fps1p são sensíveis ao choque hipo-osmótico. Esses mutantes também são pouco viáveis sob condições anaeróbicas, quando a produção de glicerol é estimulada pela regulação redox, provavelmente devido ao turgor desfavoravelmente alto (TAMAS et al., 1999; HOHMANN et al., 2000).
A captação ativa de glicerol foi descrita em muitas espécies (LAGES et al., 1999) e
caracterizada fisiologicamente como um simporte glicerol/H+. Esse transportador é codificado pelo gene STL1 (FERREIRA et al., 2005) e os genes GUP1 e GUP2 foram
identificados e caracterizados como envolvidos nesse transporte (OLIVEIRA & LUCAS, 2004). A regulação de STL1 é extremamente complexa. A expressão desse gene é reprimida por glicose e induzida pelo crescimento em fontes de carbono não-fermentáveis, e transitoriamente, mas altamente expressa durante a transição diáuxica, ou ainda mediante um choque osmótico súbito (FERREIRA et al., 2005). Não foram encontradas publicações
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2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Desde 1º de janeiro de 2010, o óleo diesel comercializado em todo o Brasil contém 5% de Biodiesel (Resolução nº6/2009), o que é chamado de B5. Segundo dados da própria ANP no ano de 2010 foram produzidos praticamente 2.400.000 m3 de Biodiesel no país. A capacidade instalada para produção de Biodiesel no ano de 2011 é de 6.269,74x103 m3, porém, apesar do aumento gradual da produção, a estimativa é que somente serão produzidos 582,12x103 m3 (AGÊNCIA NACIONAL DE PETRÓLEO, 2011). Alguns motivos levam a essa diferença, como a sazonal disponibilidade de matéria-prima, especialmente devido à competitividade dos preços de venda dos óleos refinados em relação ao preço de venda do Biodiesel. Considerando-se que o custo de produção de Biodiesel é mais elevado que do Petrodiesel, iniciativas que diminuam este custo tornariam o Biocombustível em questão mais competitivo.
Do total de Biodiesel produzido 10% em peso são compostos de glicerol. No mês de Abril de 2011 foram produzidos 185.060 m3 de Biodiesel, e consequentemente, obtidos cerca de 18.506 m3 de glicerol. Nesse contexto, a produção de Biodiesel gera um excedente de glicerol residual que necessita ter aplicações a fim de não se tornar um rejeito industrial poluente. O glicerol é considerado a fonte de carbono que será usada futuramente em processos industriais biotecnológicos, uma vez que diversos microrganismos são capazes de crescer em meios contendo glicerol como única fonte de carbono. Assim, o presente trabalho insere-se na procura do reaproveitamento do barato resíduo glicérico bruto da produção de Biodiesel como fonte de energia para leveduras de interesse comercial (Saccharomyces cerevisiae LBCM 653C, do fermento de panificação
FLEISHMANN, e Saccharomyces boulardii) e uma linhagem laboratorial (Saccharomyces
cerevisiae BY4741).
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3. OBJETIVOS
Geral:
Utilizar o resíduo glicérico bruto da produção de Biodiesel como base para meio de cultura para leveduras a fim de obter biomassa celular.
Específicos:
Analisar o crescimento das linhagens Saccharomyces cerevisiae
BY4741, LBCM653C e Fermento de Panificação FLEISHMANN, e
Saccharomyces boulardii, em diluições de resíduos de Biodiesel com
diferentes suplementações de fontes nitrogenadas;
Estabelecer as melhores condições de cultivo para que essas linhagens sejam capazes de utilizar parcialmente o resíduo da produção de Biodiesel como meio de cultura para produção de biomassa celular;
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4. DESENHO EXPERIMENTAL
Figura 7. Desenho Experimental
DETERMINAÇÃO DE CRESCIMENTO CELULAR DAS
LINHAGENS SOB ESTUDO EM:
Análise química por oxidação de matéria orgânica com K2Cr2O7 RESÍDUO DE BIODIESEL
DETERMINAÇÃO DE GLICEROL NO RESÍDUO ANALISADO
7: Presença de estímulos
hiper-osmóticos 1: Diferentes diluições de
resíduo de Biodiesel
2: Resíduos de Biodiesel de diferentes origens
3: Adição de diferentes fontes nitrogenadas
4: Adição de vitamina do
complexo B 5: pH estabilizado
6: Resistência a estresse salino (NaCl) 8: Diluição de resíduo
estocado sob diferentes condições
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5. METODOLOGIA
5.1 RESÍDUOS DE BIODIESEL UTILIZADOS
Os resíduos da produção de Biodiesel utilizados foram fornecidos pelo CETEC (Centro Tecnológico de Minas Gerais) localizado em Belo Horizonte/MG e BIOMINAS (Biominas Indústria e Comércio de Biodiesel LTDA) localizado em Itaúna/MG.
O resíduo procedente do CETEC (Figura 8) apresenta coloração amarelo clara, aspecto gelatinoso, possui partículas em suspensão e odor característico de óleo. Segundo informado pela instituição fornecedora contém cerca de 85% em glicerol e foi sintetizado a partir de óleo de soja limpo. Considerou-se os 85% de glicerol nas diluições analisadas.
Figura 8. Resíduo da produção de Biodiesel produzido pelo CETEC
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Figura 9. Resíduo da produção de Biodiesel produzido pela BIOMINAS
5.2 MICRORGANISMOS
No desenvolvimento deste trabalho foram utilizadas quatro linhagens do gênero Saccharomyces como mostrado pela Tabela 1.
Tabela 1. Linhagens de leveduras estudadas
Linhagem Origem
Saccharomyces cerevisiae
BY4741 EUROSCARF
Saccharomyces cerevisiae
LBCM653C
Linhagem utilizada na produção de cachaça e selecionada pelo Laboratório de Biologia Celular e
Molecular/UFOP
Saccharomyces cerevisiae
(Fermento de Panificação)
Fermento de Panificação FLEISHMANN, Lote 01/04 1
Saccharomyces boullardii Floratil 100,
24 5.3SOLUÇÕES E MEIOS DE CULTURA
5.3.1 Soluções estoque de glicose e glicerol
5.3.1.1 Solução estoque de Glicose 40%
Preparada a 40% de D(+) GLICOSE ANIDRA P.A. ACS VETEC.
5.3.1.2 Solução estoque de Glicerol 40%
Preparada a 40% de GLICEROL P.A. VETEC (>99,5%).
As soluções estoque de glicose e glicerol foram esterilizadas em autoclave.
5.3.2 Meios contendo YP
5.3.2.1 Meio YPD (glicose)
Foi preparado a 2% de PEPTONA DE CARNE HIMEDIA e 1% de EXTRATO DE LEVEDURA HIMEDIA em água destilada.
5.3.2.2 Meio YPGlicerol
Foi preparado a 2% de PEPTONA DE CARNE HIMEDIA e 1% de EXTRATO DE LEVEDURA HIMEDIA em água destilada.
5.3.2.3 Meio YPD-Ágar
Foi preparo a 2% de PEPTONA DE CARNE HIMEDIA, 1% de EXTRATO DE LEVEDURA HIMEDIA, 1,5% de ÁGAR MERCK em água destilada.
25 5.3.3 Diluições dos resíduos de Biodiesel
5.3.3.1 Diluição CETEC para 8,5% de glicerol
Foi informado que o resíduo fornecido CETEC continha 85% de glicerol e este foi diluído 10x em água destilada. Visto que o resíduo é muito viscoso, o preparo da diluição foi feito de forma seriada ou caso contrário não haveria dissolução total da quantidade pesada.
5.3.3.2 Diluição CETEC para 2,8% de glicerol
Para obter-se a diluição do resíduo CETEC com 2,8% de glicerol o resíduo foi diluído 30x.Procedeu-se à diluição seriada em água destilada.
5.3.3.3 Diluição BIOMINAS para 3% de glicerol
Foi informado que o resíduo BIOMINAS continha 60% de glicerol e, portanto, foi diluído 20x. Procedeu-se à diluição seriada em água destilada.
O pH das diluições de resíduos de Biodiesel foi acertado para 6,5 com solução estoque de HCl acrescentada gota à gota, e a esterilização foi feita em autoclave
5.3.4 Soluções estoque das fontes nitrogenadas
5.3.4.1 Fonte nitrogenada YP
Preparou-se o YP em água destilada a 5% de EXTRATO DE LEVEDURA HIMEDIA e 10% de PEPTONA DE CARNE HIMEDIA.
5.3.4.2 Fonte nitrogenada Sulfato de Amônio [(NH4)2SO4]
26 5.3.4.3 Fonte nitrogenada Uréia [H2NCONH2]
Preparou-se uma solução em água destilada a 15% de URÉIA (>99,5%) MERCK.
As soluções de YP e Sulfato de Amônio foram esterilizadas em autoclave, a solução de Uréia foi esterilizada por filtragem em filtro de seringa BIOFIL 0,22µm. No momento do uso, as fontes nitrogenadas foram diluídas 5 vezes no resíduo sob análise. As fontes nitrogenadas foram preparadas e esterilizadas separadamente do resíduo diluído.
5.3.5 Solução de Biotina
A Biotina utilizada foi obtida a partir de comprimido Polivitamínico do Complexo B. Cada comprimido continha 2mg de Biotina, 2mg de Riboflavina, 5mg de Cloridrato de Tiamina, 20mg de Nicotinamida e 2,76mg de Ácido Pantotênico.
O intuito dessa dissolução foi obter uma solução de Biotina para adição aos meios de cultura testados. Fez-se solução estoque de Biotina na concentração de 50mg/L por dissolução do comprimido em água destilada e esterilização por filtragem em filtro de seringa BIOFIL 0,22µm. A concentração de Biotina nos testes foi de 0,05mg/L.
5.4 ANÁLISE QUÍMICA DE GLICEROL NO RESÍDUO BRUTO: ANÁLISE POR OXIDAÇÃO DE MATÉRIA ORGÂNICA PELO DICROMATO DE POTÁSSIO EM MEIO ÁCIDO
Para averiguar a concentração de glicerol presente e proceder às diluições, o resíduo CETEC foi analisado quimicamente por medida da matéria orgânica oxidável pelo Dicromato de Potássio, K2Cr2O7, em meio ácido.
O protocolo utilizado baseou-se no procedimento contido no “Standard Methods
for Examination of Water and Wastewate 20th Edittion” (APHA, 1995), procedimento
denominado Oxigen Demand (Chemical,) Closed Reflux. Utilizamos leitura
fotocolorimétrica a 585nm. Os resultados não foram calculados na forma de Demanda Química de Oxigênio (DQO), e sim através de curva analítica de soluções com conhecidas concentrações de glicerol padrão.
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proceder-se à reação, uma vez que no resíduo de Biodiesel existem outras substâncias orgânicas que não o glicerol.
Todas as vidrarias e materiais utilizados foram limpos segundo procedimento para eliminação de matéria orgânica. A água utilizada foi Milli-Q, e as vidrarias volumétricas eram classe A.
O procedimento de limpeza para retirada de possíveis resíduos de matéria orgânica presentes nas vidrarias e materiais consistiu em deixá-los submersos em solução de HNO3 2,5% por 24 horas ou por uma hora em aparelho de ultra-som. Vidrarias e materiais foram posteriormente retirados da solução de HNO3 e lavados três vezes com água Milli-Q.
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5.5DETERMINAÇÃO DO VALOR DE pH DE DILUIÇÕES DOS RESÍDUOS ANALISADOS
Soluções dos resíduos de Biodiesel em água destiladas tiveram seus valores de pH medidos em potenciômetro a fim de verificar qual o acerto deveria ser feito no momento das análises de crescimento.
5.6 DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR EM DIFERENTES DILUIÇÕES DE RESÍDUOS DE BIODIESEL
A fim de analisar a capacidade das linhagens sob estudos crescerem em resíduos de Biodiesel, essas foram ensaiadas em diluições dos resíduos fornecidos pelo CETEC e BIOMINAS, com e sem adição de diferentes fontes nitrogenadas e no meio laboratorial YPGlicerol em diferentes concentrações.
5.6.1 Determinação do crescimento celular em diluições do resíduo de Biodiesel fornecido pelo CETEC
5.6.1.1 Determinação de crescimento celular utilizando YP como fonte nitrogenada
As linhagens listadas na Tabela 1 foram crescidas em duas diluições do resíduo de Biodiesel fornecido pelo CETEC. A diluição 1 continha 8,5% de glicerol e a diluição 2, 2,8%. Utilizou-se YP como suplementação de fonte nitrogenada nas concentrações de 1% de Extrato de Levedura e 2% de Peptona de Carne, como mostrado na Tabela 2.
A concentração de glicerol de 2,8% foi escolhida uma vez que 3% é a concentração de glicerol conhecidamente utilizada para multiplicação celular de leveduras usando glicerol como única fonte de carbono no LBCM, assim como em outros trabalhos como por (TININIS & GATTÁS, 2002; FONSECA, 2006; TABOSA et al., 2009). A
