1 Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais
Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
MeT 05/2016
Processos de Fermentação Alcoólica com Reciclo de Células
Celina Kiyomi Yamakawa Jairo Silvestre Moura Leal
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RESUMO
O desenvolvimento da pesquisa em fermentação alcoólica com reciclo de células envolvem as etapas de propagação celular, formulação do substrato e a fermentação alcoólica propriamente dita. Todas essas etapas devem ser bem delineadas para alcançar resultados reprodutivos e conclusivos em relação ao efeito das variáveis estudadas. Neste memorial técnico são apresentados os métodos bases para pesquisa, desenvolvimento e validação de processos.
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1 INTRODUÇÃO
A pesquisa aplicada ao desenvolvimento e validação de uma nova tecnologia em fermentação alcoólica é testada primeiramente em bancada para reproduzir condições similares à um processo industrial, cujo objetivo é testar a robustez e estabilidade de um novo processo ou novo produto, nova cepa ou novo micro-organismo, e também desenvolver soluções de desengargalamentos técnicos. As configurações empregadas em experimentos de bancada dependem da maturidade do produto ou do processo. São eleitas preferencialmente sistema batelada e batelada alimentada, entretanto, não se exclui a configuração contínua.
A fermentação em batelada pura tem sido aplicada para obter dados cinéticos fundamentais para analisar o comportamento do micro-organismo frente à ampliação de escala, tensão de cisalhamento, inibições por substrato, células ou produtos. Essas primeiras informações norteiam a configuração do processo. Quando essas informações são conhecidas, o objeto de pesquisa é testado na configuração batelada alimentada em que altas produtividades e conversões são alcançadas.
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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Há inúmeras referências sobre a quantidade necessária para avaliar o desempenho de um processo de fermentação alcoólica com reciclo de células. Andrade et al. (2013) realizaram estudo cinético de fermentação alcoólica em batelada com reciclo de células com substrato a partir de licor hidrolisado celulósico de bagaço e melaço de cana de açúcar em 7 fermentações sucessivas. O rendimento fermentativo estabilizou a partir do 4° ciclo, entretanto a produtividade específica de etanol oscilou entre 1,75 a 2,25 a partir do 2° ciclo. Silva et al. (2015) validaram a produção de licor hidrolisado celulósico de bagaço de cana de açúcar em 5 sucessivas fermentações alcoólica em batelada com reciclo de células enriquecendo o licor com extrato de levedura e KH2PO4. A
produtividade específica de etanol aumentou conforme o reciclo, sendo no 1° ciclo de 1,94 g/L.h e no último ciclo de 5,81 g/L.h. O rendimento fermentativo oscilou entre 85% e 88%. Rivera et al. (2013) propuseram um procedimento para estimar os parâmetros cinéticos utilizando dados de 3 sucessivas fermentações alcoólica em batelada alimentada com reciclo de células com caldo de cana de açúcar. Exceto o primeiro ciclo, as duas fermentações seguintes apresentaram perfis semelhantes de substrato, células e etanol. Marques & Serra (2004) realizaram estudo de reciclagem de células em batelada com melaço de cana de açúcar em baixa e alta concentração. O rendimento fermentativo foi praticamente igual a partir do 4° ciclo no meio de baixa concentração de açúcares diferentemente das fermentações com alta concentração de açúcares em que houve uma variação do rendimento fermentativo.
6 O processo em batelada é caracterizado pela transferência do meio ao biorreator em uma única vez seguida de inoculação do micro-organismo. É uma maneira simples e largamente utilizada em laboratório e industrialmente. No processo contínuo há suplementação contínua de meio ao biorreator e uma retirada contínua dos produtos, subprodutos e células. Após um determinado tempo, as concentrações de substrato, produtos e células se mantêm constantes. O processo contínuo fornece condições constantes para o crescimento celular e a formação de produtos dentro de um padrão de qualidade. O processo em batelada alimentada, substrato e nutrientes são continuamente ou semi-continuamente alimentados enquanto que o produto é removido intermitentemente é usualmente empregada para superar a inibição por produto ou repressão catabólita e dessa maneira, melhorar a produtividade (Shuler & Kargi, 1992).
O processo industrial brasileiro para produção de etanol combustível por fermentação de caldo e melaço de cana de açúcar com reciclo de células é predominantemente conduzido em batelada alimentada e poucas em processo contínuo (Andrietta et al. 2011). A fermentação em batelada alimentada com reciclo de células é também chamada de fermentação Melle-Boinot uma vez que este foi baseado no processo desenvolvido pela Usina Melle e por Fimin Boinot em 1936 (Patente US2230318A). O processo Melle-Boinot permitiu aumentar a produtividade e rendimento da fermentação por meio da alta densidade celular, alimentação gradativa de substrato que minimizaram inibições e dessa forma, reduziu o tempo total de fermentação. Além disso, o reciclo de células eliminou a demanda de açúcares e nutrientes somente para propagação celular.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
O experimento de fermentação alcoólica pode ser dividido nas seguintes etapas:
Propagação celular;
Formulação do substrato;
7 Neste item são apresentados os protocolos básicos de propagação celular, formulação do substrato e fermentação alcoólica.
3.1 Propagação celular
A propagação celular inicia com a transferência da cultura pura estoque, armazenada em criogenia em glicerol ou em placa ou em tubo slant em meio de cultura sólido, para um meio líquido YPD formulado de acordo com a Tabela 1 denominado de pré-inoculo.
Tabela 1. Formulação do pré-inoculo
Reagentes Concentração (g/L)
Extrato de levedura 10,00
Bacto peptona 20,00
Glicose 20,00
Extrato de levedura e bacto peptona estão no estado sólidos e são autoclavados a 121°C/ 15 minutos com quantidade de água correspondente. A solução de glicose é preparada separadamente a aproximadamente 500 g/L e esterilizada em autoclave. Usualmente o pré-inoculo é preparado em frasco
Erlenmeyer de 1 L com 200 mL de volume útil. As quantidades dos reagentes
correspondentes estão apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2. Quantidade dos reagentes para 200 mL
Reagentes Quantidade Unidade
Extrato de levedura 2,000 g
Bacto peptona 4,000 g
Solução de glicose a 500 g/L 8,000 mL
Água 192,000 mL
A solução de glicose e a cultura estoque são transferidos ao frasco estéril sob o fluxo laminar e em seguida é incubado em um shaker orbital a 250 rpm e temperatura entre 30 e 34°C durante 24 horas. Essas condições são variáveis e dependem da cepa do micro-organismo. Se a cultura estoque estiver em placa ou slant são transferidas 3 alçadas para o meio líquido.
8 os nutrientes para a multiplicação celular. A Tabela 3 mostra uma formulação típica. As soluções termosensíveis, ureia e DAP, são filtradas em membranas de 0,45 ou 0,22 micra. Os sais, extrato de levedura e água são autoclavadas juntas a 121°C/ 15 min. O substrato convencional de processos industriais de etanol por via bioquímica é preparado com melaço e caldo de cana de açúcar. Usualmente formula-se com 79% de ART (açúcar redutor total) proveniente do caldo/ xarope e o restante do melaço. O xarope é de difícil estoque uma vez que é suscetível a contaminação, uma boa alternativa é o uso de açúcar cristal comercial. Para isso é necessário preparar uma calda previamente. O inoculo é incubado nas mesmas condições do pré-inoculo, mas em um tempo menor entre 6 a 12 horas.
Tabela 3. Formulação do inoculo
Reagentes Concentração Un.
Ureia (NH2)2CO 5,00 g/ L
DAP (NH4)2HPO4 1,10 g/L
Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) 1,00 g/ L
Sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) 5,00 mg/ L
Substrato- ART 80,00 g/ L
Extrato de levedura 5,00 g/ L
9 Figura 1. Set up experimental de uma propagação de levedura
Em um fermentador de 2 L o volume inicial da batelada é de 800 mL e o volume a ser alimentado é de 1.200 mL. A formulação dos dois meios é igual exceto pela quantidade de açúcares. O meio batelada possui 50 g/L e o meio da batelada alimentada possui 150 g/L. A Tabela 4 apresenta a formulação do meio de propagação celular em fermentador. O inoculo obtido na etapa anterior em frascos é centrifugado e o pellet é diluído em água estéril até o volume total de 50 mL e transferido à um frasco mariote para inocular. A temperatura é ajustada entre 30 e 34°C e os parâmetros de agitação de vazão de ar são controlados de forma a manter o DO acima de 30% por controle em cascata ou ajuste manual.
Tabela 4. Formulação do meio de propagação
Reagentes Concentração Un.
Ureia (NH2)2CO 5,00 g/ L
DAP (NH4)2HPO4 1,10 g/L
Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) 1,00 g/ L
Sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) 5,00 mg/ L
10 A alimentação do meio inicia-se normalmente após 1 hora em que os açúcares já estão abaixo de 20 g/L e quando observa-se o turvamento do meio. A vazão é ajustada de acordo com a taxa de consumo de açúcares, mas também pode-se adotar uma alimentação linear de forma a manter a limitação em ART. O tempo total de propagação é entre 20 e 24 horas.
Os valores típicos de velocidade máxima específica de crescimento (max) na fase exponencial é entre 0,30 a 0,45 h-1 e na fase estacionária é entre
0,10 a 0,15 h-1.
O meio fermentado, após a finalização da propagação, é bombeado frasco schott que serviu de alimentação. Antes desse procedimento é necessário aumentar a vazão de ar em 1,0 L/min para evitar a sucção do ar através do condensador e resfriar o meio entre 15 °C e 20 °C para evitar a formação de vácuo durante a centrifugação. Em seguida, de forma estéril, no fluxo laminar, o meio fermentado é dividido em dois frascos de centrífuga de 1 L estéril ou sanitizado para centrifugação em uma centrífuga Avanti J-26 XP (Beckman Coulter, EUA) com rotor JLA-9100 a 8.000 rpm (13225,3 x g) durante 20 minutos. Em seguida, o sobrenadante é descartado e o pellet é diluído em água no volume requerido para compor a solução de leveduras comumente chamada de pé de cuba, da fermentação alcoólica. Caso o tempo para o início da fermentação alcoólica superar 20 dias, recomenda-se o armazenamento no refrigerador em solução salina com 1% de peptona.
11 As análises recomendadas durante a propagação são açúcares, etanol, absorbância a 600 nm, e microscopia óptica. A Figura 2 mostra uma microscopia típica com uma lente objetiva de 40x, de levedura Saccharomyces cerevisiae durante a propagação celular, nota-se a presença de brotos na maioria das células adultas.
3.2 Formulação do substrato
O substrato ou comumente chamado de mosto nas usinas, para fermentação alcoólica pode ser formulado em diferentes concentrações e proporções de caldo e melaço de cana de açúcar. Também pode ser sintético a partir de sais, minerais e outros açúcares. Outras matérias primas também podem são utilizadas para compor o mosto, por exemplo, licor celulósico de bagaço de cana de açúcar. Em todos os casos recomenda-se um tratamento físico-químico e de forma separada no caso de formulações de diferentes fontes de açúcar ou proteínas para evitar reações indesejáveis durante a esterilização. Basicamente um tratamento físico-químico do substrato ocorre com a adição de ácido fosfórico, H3PO4 a 85%, adição de leite de cal até atingir pH de
6,4, seguido de aquecimento até 95°C e então adição de polímero não-iônico. Em seguida mantém em repouso para a formação de flocos seguida de resfriamento e separação por centrifugação ou decantação. O tratamento físico-químico visa formar flocos para agregar os sólidos suspensos que possam decantar a uma velocidade satisfatória, fornecer condições de temperatura, pH e concentração de íons que maximizam a precipitação das impurezas solúveis e enfim produzir um meio clarificado de alta qualidade com mínima turbidez e baixa concentração de cálcio. A função do H3PO4 é remover corantes e parte dos
coloides. O leite de cal somado ao aquecimento induzem a precipitação de fosfato de cálcio, sais de ácidos orgânicos, proteínas desnaturadas, gorduras, ceras e gomas. O polímero adicionado no final do processo tem por objetivo formar cadeias longas de massa molecular alta para arrastar as impurezas (Coopersucar, 1987). As quantidades de ácido fosfórico e polímero são determinadas previamente em um teste de bancada inicial.
Após o tratamento físico-químico, o mosto é dividido em frascos
Erlenmeyer na quantidade necessária para cada fermentação para ser
12 de esterilização dependerá da concentração do mosto e do volume. Recomenda-se usar no máximo 50% do volume total do frasco para permitir uma troca térmica efetiva.
O cálculo da concentração de ART no mosto é definido em função da concentração de etanol final desejado e da conversão aproximada de substrato à etanol (YP/S). Assim são necessários definir os principais parâmetros listados a
seguir:
Concentração de etanol final: a faixa típica industrial é entre 67 g/L (8,5% v/v) e 75 g/L (9,5% v/v), mas há usinas que operam acima desse valor e há linhas de pesquisas para obter vinhos de alto teor alcoólico (15%v/v) devido às inúmeras vantagens. Para esse cálculo é necessário considerar o etanol que é reciclado juntamente com a suspensão celular após o tratamento de células (pé de cuba);
Taxa de reciclo (R): relação da quantidade de pé de cuba sobre soma de pé de cuba e mosto. O valor usual é de 0,3 no processo batelada alimentada, ou seja, 1/3 do volume total do fermentador é dedicado ao pé de cuba e 2/3 do fermentador é para o mosto;
Conversão aproximada (YP/S): conversão de açúcares fermentescíveis a
etanol. O valor teórico estequiométrico é de 0,511 g/ g. Comumente adotamos o valor de 0,46 g/g que corresponde a um rendimento de 90% para considerar o desvio de substrato para crescimento e manutenção celular, produção de ácidos orgânicos, glicerol e outros subprodutos;
Concentração de células (X): tipicamente o processo Melle-Bonoit opera com 10% (v/v) ou cerca de 30 g/ L (base seca). Portanto, com uma taxa de reciclo de 0,3, a concentração do pé de cuba deve ser de 90 g/ L para atingir 30 g/ L após o término da alimentação de mosto. Tipicamente a relação de base seca para base úmida é de 3. Essa relação pode alterar em função da cepa de levedura e das condições de fermentação.
É apresentado um exemplo para ilustrar o cálculo para definir a concentração do mosto.
Teor alcoólico do vinho final: 9,5 °GL ou 75 g/L;
Taxa de reciclo (R): 0,3;
Conversão aproximada (YP/S): 0,46;
13 O volume útil do fermentador é de 2,1 L. Assim, a quantidade de pé de cuba corresponderá a 700 g e a quantidade de mosto será de 1633 g. A quantidade final será de aproximadamente 2.100 g descontando quantidade de CO2 liberado e a quantidade de perda por amostragem considerando 15 g em 5
amostragens.
Quantidade de CO2 produzido = Etanol produzido x 0,956.
Etanol produzido = massa de ART x 0,46 + massa de pé de cuba x concentração de etanol no pé de cuba/ densidade.
Estimativa da concentração de etanol no pé de cuba = concentração de etanol no vinho final x massa úmida de células/ massa de pé de cuba => 75 g/ L x 189 g / 700 g = 20,25 g/ L.
A quantidade de ART necessário obtém através do cálculo interativo, por exemplo com o solver do Excel, considerando as restrições de taxa de reciclo e volume final.
Figura 3. Exemplo de cálculo no Excel
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3.3 Fermentação alcoólica
A diferença da fermentação alcoólica em batelada e batelada alimentada é a maneira que ocorre a transferência de substrato. Em ambos os casos a suspensão de células estará no fermentador previamente. No caso da batelada alimentada, após o tratamento celular, todo mosto é bombeado de uma só vez. Já na batelada alimentada, o mosto é bombeado gradativamente.
Figura 4. Diagrama de blocos de fermentação alcoólica com reciclo de células
A Figura 4 apresenta esquematicamente o processo base de fermentação alcoólica com reciclo de células. A fermentação alcoólica inicia com a transferência primeiramente da suspensão celular ao fermentador e em seguida transfere-se o substrato previamente formulado, tratado e esterilizado. Durante a fermentação há exaustão de CO2 pelo condensador, assim espera-se
que o peso final do vinho seja menor que a soma da massa do que entrou, suspensão celular e substrato. Durante a exaustão dos gases há arraste de componentes voláteis que representam cerca de 1 a 2% de etanol produzido. Após o término da fermentação, o meio fermentado chamado de vinho é centrifugado. O meio fermentador isento de células é descartado ou destilado. É interessante fixar a massa úmida de pellet para iniciar a próxima fermentação com aproximadamente a mesma quantidade de células iniciais. Após ajustar a quantidade de biomassa úmida, acrescenta-se água potável estéril para diluir o
pellet e transferir de volta ao fermentador. O tratamento ácido é realizado no
mesmo vaso de fermentador. Se a próxima fermentação não começar imediatamente, a suspensão celular deve ser mantido refrigerado a 10°C e aerado para manter a pressão positiva no biorreator. Assim a fermentação seguinte inicia com o ajuste da temperatura e tratamento ácido.
Fermentação
alcoólica Centrifugação
Tratamento ácido
Vinho Creme de levedura
15 O balanço mássico para calcular rendimento fermentativo, produtividade de etanol e de células é realizado no volume de controle em destaque (V. C.). As massas de suspensão celular, substrato e meio fermentador são medidas por peso em balança semi-analítica e a massa de CO2 liberado é calculado
indiretamente em função da quantidade de etanol produzido. Os componentes são analisados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A determinação da concentração de células é realizada por gravimetria. A densidade de cada corrente é consultada em tabelas que correlacionam com a quantidade de sólidos solúveis (°Brix) ou medidas.
Durante a fermentação são realizadas análises de monitoramento por meio de espectroscopia de infravermelho com curvas calibradas de sacarose, açúcares redutores (glicose e frutose) e etanol. A concentração celular é monitorada por análise de absorbância a 600 nm e também por analisador on
line de capacitância. Outras técnicas podem ser aplicadas para controlar e
monitorar o desenvolvimento de processos de fermentação alcoólica.
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
De Andrade, R.R. et al., 2013. Kinetics of ethanol production from sugarcane bagasse enzymatic hydrolysate concentrated with molasses under cell recycle. Bioresource Technology, 130, pp.351–359.
Andrietta, M., Andrietta SR & Stupiello, E., 2011. Bioethanol what has Brazil learned about yeasts inhabiting the ethanol production processes from sugar cane? , pp.67–84. Available at: http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/20057.pdf.
Rivera, C. E. et al., 2013. A Procedure for Estimation of Fermentation Kinetic Parameters in Fed-Batch Bioethanol Production Process with Cell Recycle.
Chemical Engineering Transactions, 32, pp.1369–1374.
Coopersucar, Cooperativa de produtores de cana, açúcar e álcool do estado de São Paulo (1987): Fermentação. São Paulo.
Marques, T.A. & Serra, G.E., 2004. Estudo da reciclagem de células na produção biológica de etanol. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 24(4), pp.532–535. Boinot, F. & Melle,1936. Process for carrying out industrial alcoholic
fermentations. Patent US2230318A.
Silva, V.F.N. et al., 2015. Using of cell recycle batch fermentations to validate a setup for cellulosic ethanol production. Journal of Chemical Technology &
Biotechnology, (February), p.n/a–n/a. Available at:
http://doi.wiley.com/10.1002/jctb.4778.
