PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS ANTI-RICINA*
Roselayne Ferro Furtado1; Rosa Amália Fireman Dutra2; Carlucio Roberto Alves3; Maria Izabel Florindo Guedes3; Mayrla Rocha Lima3; Vitor Paulo Andrade da Silva3
1Embrapa Agroindústria Tropical, roselayne@cnpat.embrapa.br; 2Universidade Estadual de Pernambuco, rfiremandutra@yahoo.com.br; 3Universidade Estadual do Ceará, alvescr@yahoo.com,
florinfg@terra.com.br, lia-lima@hotmail.com, vitorvolt@hotmail.com
RESUMO - O trabalho teve o objetivo de produzir anticorpos policlonais anti-ricina e avaliar os mesmos
visando uma futura aplicação em métodos sorológicos de detecção de ricina presente em torta de mamona submetida a processo de destoxificação. A torta foi preparada em laboratório e utilizada em procedimentos de extração e purificação da ricina. Consecutivamente, inoculações de ricina retiradas de gel de poliacrilamida foram administradas em coelhos para produção dos anticorpos. Ao final, os anticorpos anti-ricina foram analisados quanto à sensibilidade e especificidade.
Palavras-chave: Ricina, anticorpos policlonais, ensaio sorológico
INTRODUÇÃO
A torta da mamona tem elevado valor nutritivo, sendo rica em proteínas, fibras, minerais e gordura (BELTRÃO, 2003). Por apresentar essas características a torta da mamona apresenta grande potencial para ser utilizada como ração na pecuária. Porém, para ser utilizada como alimento, ela precisa passar por um processo de destoxificação, para eliminação de substâncias presentes na semente com propriedades de toxicidade ou alergenicidade. Entre essas substâncias pode-se destacar a ricina, uma proteína inibidora de ribossomos (RIP) do tipo II, heterodimérica.
A ricina é constituída de enzima inibidora de ribossomo (aproximadamente 32 kDa, cadeia A ou RTA) ligada por ponte dissulfeto a uma lectina galactose (aproximadamente 34 kDa, cadeia B ou RTB) (LORD et al., 1994). A toxicidade desta proteína é conhecida no mundo inteiro, sendo cerca de cem vezes maior quando administrada pela rota parenteral. As doses letais mínimas de ricina injetada para camundongos varia entre 5 a 10 g/kg e para cachorros varia entre 1 a 1,75 g/kg (FODSTAD et al., 1979). A ingestão de cerca de cinco sementes de mamona pode ser letal para seres humanos (OLSNES, 2004). Diante deste contexto, embora o processo de destoxificação da torta de mamona seja considerado eficaz, recomenda-se uma análise rápida quanto à presença de ricina que ateste a atoxicidade da torta a cada processamento, visto que o procedimento pode não ter sido satisfatoriamente realizado e quantidades mínimas da proteína são suficientes para conduzir animais a óbito.
As principais técnicas de determinação da ricina empregadas se baseiam em métodos sorológicos, cromatográficos e eletroforéticos. Os métodos sorológicos, isto é, métodos que empregam anticorpos, ganham cada vez mais importância no meio científico por serem bastante sensíveis e específicos na detecção de patógenos e contaminantes. Atualmente, sabe-se que anticorpos são capazes de detectar uma molécula de um antígeno protéico dentre mais de 108 moléculas similares (JANEWAY et al., 2007).
Diferentes métodos sorológicos podem ser utilizados na detecção de um determinado antígeno (molécula que se liga especificamente a um determinado anticorpo), sendo o imunoenzimático ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) o mais comumente utilizado. Diferentes kits comerciais, a maioria deles importados, empregam o princípio do ELISA no diagnóstico de doenças e detecção de contaminantes.
Este trabalho teve o objetivo de produzir e avaliar a sensibilidade e especificidade de anticorpos anti-ricina pelo método de ELISA e técnica de Western blot, respectivamente.
MATERIAL E MÉTODOS
As sementes de mamona da cultivar Nordestina do Banco de Germoplasma da Embrapa Algodão foram utilizadas para a preparação da torta de mamona e extração da ricina. A ricina foi extraída segundo metodologia de Funatsu et al. (1971) e Tavares (1998).
Os anticorpos foram produzidos em coelho da raça Nova Zelândia com aproximadamente seis meses de idade. Os coelhos foram imunizados via subcutânea com 93 g de ricina, retiradas de gel de poliacrilamida em condições desnaturantes, adicionado do reagente de Freud’s. Como controle do ensaio, antes da primeira inoculação, foi feita uma sangria de cerca de 10 mL para a coleta do soro pré-imune. Sangrias do animal foram realizadas a cada sete dias para a coleta do soro, e três semanas após a primeira imunização foi aplicado um reforço com a mesma quantidade de proteína da imunização inicial. A sangria foi realizada até o 42º dia após a imunização do animal e os soros obtidos foram armazenados a -4ºC. Para testar a sensibilidade e especificidade dos anticorpos produzidos realizou-se o método de ELISA indireto (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) e a técnica de
Western blot, respectivamente.
Para o ensaio de ELISA, as placas foram sensibilizadas com 0,3 µg do antígeno (ricina)/poço e bloqueadas com PBS-BSA (albumina sérica bovina) (1%). O estudo do nível de detecção dos anticorpos policlonais produzidos (título) foi realizado a partir da diluição inicial dos anticorpos na proporção 1:100, calculando-se o cut off do ELISA (média das absorbâncias negativas para cada título mais três vezes o desvio padrão das médias).
Para o Western blot foi utilizada a membrana de nitrocelulose e gel de poliacrilamida a 12,5% em condições nativas. Utilizou-se para este ensaio extrato bruto de mamona. A transferência das proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose foi realizada por duas horas aplicando 38 mA e 38 V. O bloqueio foi feito com PBS (tampão fosfato de sódio) adicionado de leite desnatado 5% e a diluição dos anticorpos primários foi de 1:100 em PBS (indicar uma referência).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A cinética dos anticorpos do animal imunizado inicialmente com 93 g apresentou produção de anticorpos crescente até o 21º dia e após a aplicação do reforço (mais 93 g), neste mesmo período, verificou-se diminuição progressiva na quantidade de anticorpos. Diante disso, verificou-se que a dose de 93 g estimulou satisfatoriamente a produção de anticorpos (Figura 1).
O estudo do título dos anticorpos produzidos pelo coelho imunizado mostrou alta sensibilidade para os soros coletados aos 7, 14, 21 e 28 dias, visto que reagiram até a diluição 1:12.800. O soro de 35 dias reagiu até 1:6400 e o de 42 dias até 1:800 (Figura 2).
A técnica de Western blot se baseia no reconhecimento da proteína pelos anticorpos contidos no soro após transferência para membrana de nitrocelulose. Verificou-se que a partir do 14º dia houve a visualização de bandas de peso molecular correspondente ao da ricina (cerca de 66 kDa) na membrana de nitrocelulose, indicando a especificidade dos anticorpos produzidos para detecção de ricina frente a outras proteínas extraídas da torta de mamona (Figura 3).
CONCLUSÃO
A análise dos anticorpos policlonais produzidos indicou alta sensibilidade e especificidade dos mesmos na detecção de ricina.
Os autores agradecem ao FINEP pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BELTRÃO, N. E. de M. Informações sobre o biodiesel, em especial feito com o óleo de mamona. Campina Grande: Embrapa Algodão, 2003. 3 p. (Embrapa Algodão. Comunicado Técnico, 177).
FODSTAD, O.; OLSNES, S.; PIHI, A. Toxicity, distribution and elimination of the cancerostatic lectins abrin and ricin after parenteral injection into mice. British Journal of Cancer, v. 34, p. 418-425, 1976.
FUNATSU, M.; FUNATSU, G.; ISHIGURO, M. M.; NANNO, S.; HARA, K. Structure and toxic function of ricin. Proc. Japan. Acad, n. 91, p. 713-717, 1971.
JANEWAY, C. A.; TRAVERS, P.; WALPORT, M.; SHLMCHIK, M. J. Imunobiologia: o sistema Imunológico na saúde e na doença. Porto Alegre: Artmed, 2007. 848 p.
LORD, J. M.; ROBERTS, L. M.; ROBERTUS, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. The FASEB journal, v. 8, p. 201-208. 1994.
OLSNES, S. The history of ricin, abrin, and related toxins. Toxicon, v. 44, p. 361-370, 2004.
TAVARES, R. O. Galactomanana de Adenanthera pavonina L.: aplicação para o isolamento de lectinas galactose-específicas. 1998, 85 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Pré-imune 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias
A b s o rb â n c ia ( 4 9 2 n m )
Figura 1. Cinética de anticorpos de coelho anti-ricina. Os soros foram diluídos 1:100, após imunização
com 93 g de ricina e reforço com mesma quantidade ao 21º dia.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200* 1/6400* 1/12800*
Título dos anticorpos
A b s o rb a n c ia ( 4 9 2 n m ) Pré-imune 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias
Figura 2. Determinação do grau de titulação dos anticorpos produzidos por coelho imunizado com 93
Figura 3. Eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% desnaturante com proteínas totais presentes na
torta de mamona (A); Western blot das proteínas totais da torta de mamona utilizando o anticorpo policlonal de coelho (B).
