UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS PESQUEIROS E ENGENHARIA DE PESCA
POLIANA GONÇALVES COSTA
Efeito toxicológico da exposição aguda e crônica do anti-incrustante MXD-100 sobre o jundiá (Rhamdia quelen)
Toledo-PR 2016
POLIANA GONÇALVES COSTA
Efeito toxicológico da exposição aguda e crônica do anti-incrustante MXD-100 sobre o jundiá (Rhamdia quelen)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação Stricto Sensu em Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca – Nível de Mestrado, do Centro de Engenharias e Ciências Exatas, da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca.
Área de concentração: Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca.
Orientador: Prof. Dr. Gilmar Baumgartner
Toledo-PR 2016
FOLHA DE APROVAÇÃO
POLIANA GONÇALVES COSTA
Efeito toxicológico da exposição aguda e crônica do anti-incrustante MXD-100 sobre o jundiá (Rhamdia quelen)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca – Nível de Mestrado, do Centro de Engenharias e Ciências Exatas, da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca, analisada pela Comissão Julgadora composta pelos membros:
COMISSÃO JULGADORA
____________________________________________
Prof. Dr. Gilmar Baumgartner
Universidade Estadual do Oeste do Paraná (Presidente)
____________________________________________
Prof. Dr. Paulo Vanderlei Sanches Universidade Estadual do Oeste do Paraná
____________________________________________
Prof. Dr. Luciano Caetano de Oliveira Universidade Federal do Paraná, Campus Palotina
Aprovada em: 03 de junho de 2016
Local de defesa: Auditório do Grupo de Pesquisa em Recursos Pesqueiros e Limnologia (GERPEL), da Unioeste/ Campus Toledo.
O homem é parte da natureza e sua guerra contra a natureza é inevitavelmente uma guerra contra si mesmo.
Temos pela frente um desafio como nunca a humanidade teve, de provar nossa maturidade e nosso domínio, não da natureza, mas de nós mesmos.
Primavera Silenciosa – Rachel Carson
Dedico este trabalho a Deus e ao alicerce da minha vida terrena: minha família. Em especial, aos meus pais Maria do Carmo e Dorivaldo e a minha querida irmã Daiane.
AGRADECIMENTOS
Nesta página, gostaria de agradecer a algumas pessoas que se tornaram peças fundamentais para a realização deste trabalho. Agradeço primeiramente ao meu orientador Prof. Dr. Gilmar Baumgartner que me aceitou como sua orientanda, me socorreu e aconselhou em todos os momentos que precisei.
Ao meu querido amigo Rafael, pessoa de extrema sensibilidade e humildade da qual tenho imenso carinho. Obrigada por ter me ajudado em “tudo” e por ter enxugado minhas lágrimas nos momentos de dificuldades, sem você eu estaria realmente sozinha e perdida.
A minha família, em especial os meus pais Maria do Carmo e Dorivaldo e minha irmã Daiane. Obrigada, vocês são especiais para mim, sei que sempre torceram e rezaram por minha felicidade.
A equipe do Laboratório de Citogenética e Histologia da Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE), Campus Cascavel em especial a minha querida e doce amiga Mírcea, obrigada por sua paciência e sua dedicação em ensinar-me todos os detalhes dos procedimentos histológicos, sua sinceridade e humildade conquistaram minha amizade.
Espero um dia retribuir tudo o que fez por mim. Aos Professores Rafaela Maria Moresco e Vladimir Pavan Margarido por disponibilizarem o laboratório e todas as condições necessárias para a realização dos procedimentos histológicos, pelo apoio e por todos os conselhos. Aos queridos Lucas Baumgartner e Leo Paiz pela colaboração. A todos vocês muito obrigada! Foi uma experiência enriquecedora passar todo este tempo com vocês.
Aos amigos Fabiana, Anderson, Jaqueline e Daniel pelo carinho e amizade, vocês sempre farão parte da minha vida e da minha história. Com total certeza posso afirmar que, o período em que morei pertinho de vocês foi muito importante para mim e para o meu crescimento pessoal.
A equipe do Instituto de Pesquisa em Aquicultura Ambiental (InPAA), vinculado à Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE), Campus Toledo, em especial ao Prof. Dr. Robie Bombardelli e aos técnicos Alexandre, Giordani e Regis. Muito obrigada pelo suporte oferecido! De modo especial, a Fundação Parque Tecnológico de Itaipu (FPTI), pelo apoio financeiro, ao Grupo de Pesquisa em Recursos Pesqueiros e Limnologia (GERPEL) e ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca da Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE), Campus Toledo.
Obrigada!
Efeito toxicológico da exposição aguda e crônica do anti-incrustante MXD-100 sobre o jundiá (Rhamdia quelen)
RESUMO
Em virtude da rápida dispersão do mexilhão-dourado (Limnoperna fortunei) e dos inúmeros impactos ecológicos e econômicos que a espécie vem causando no Brasil, diversas pesquisas estão sendo realizadas na elaboração de estratégias para a erradicação e controle desta espécie. Uma das alternativas químicas atualmente utilizadas é o composto MXD-100, um desnaturador de proteínas com formulação a base de extratos tânicos e sais quaternários de amônio utilizado em aplicações industriais por apresentar grande potencial biocida. Com isso, este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade aguda e crônica do composto MXD-100 sobre o jundiá (Rhamdia quelen), em diferentes fases do ciclo de vida (larval, pós-larval e juvenil). Para cada teste agudo foram utilizadas concentrações diferentes e um grupo controle, além disso, os parâmetros físicos e químicos da água, alterações comportamentais e organismos mortos/imóveis foram observados a cada 12 horas em um período de 48 horas e para o teste crônico a cada 24 horas em um intervalo de 7 dias. A concentração subletal de 0,05 mg/L-1 estabelecida pelo fabricante como segura para organismos aquáticos, não foi letal à espécie R. quelen, porém dosagens, superiores a 1,00 mg/L-1 ocasionaram altos índices de mortalidade sobre indivíduos nas fases larval e pós-larval. As concentrações letais medianas (CL50-48h) obtidas para as três fases do ciclo de vida do R. quelen foram 0,93; 2,57 e 5,50 mg/L-1. As alterações histopatológicas encontradas nos tecidos branquiais dos juvenis de R.
quelen, foram hiperplasia das lamelas secundárias e fusão parcial das mesmas. Com base nos resultados faz-se necessária a realização de novas pesquisas a respeito dos efeitos agudos e crônicos do biocida MXD-100sobre organismos não-alvo, principalmente em fases iniciais de desenvolvimento, período que costumam apresentar maior sensibilidade.
Palavras-chave: Biocida. Sensibilidade. CL50. Histopatológicas.
Toxicological effects of acute and chronic exposure of the anti-fouling MXD- 100 on the silver catfish (Rhamdia quelen)
ABSTRACT
Because of the rapid spread of the golden mussel (Limnoperna fortunei) and many ecological and economic impacts that this species has caused in Brazil, several studies are being conducted in developing strategies for the eradication and control of this species. One of the chemical alternatives currently used is the MXD-100 compound, a protein denaturator with formulation based on tannic extracts and quaternary ammonium salts used in industrial applications due his great biocide potential. Therefore, this study aimed to evaluate the acute and chronic toxicity of MXD-100 compound on the silver catfish (Rhamdia quelen) at different stages of the life cycle (larval, post-larval and juvenile). For each acute test were user different concentrations and a control group, furthermore, the physical and chemical parameters of the water, behavioral changes and mortalities/immobility were observed every 12 hours for a period of 48 hours, for the chronic test each 24 hours in an interval of 7 days.
The sublethal concentration of 0.05 mg.L-1 established by the manufacturer as safe for aquatic organisms, was not lethal to the species R. quelen, however dosages higher than 1.00 mg.L-1 caused high mortality of individuals in post-larval and larval stages. The median lethal concentrations (CL50-48h) obtained for the three phases of the life cycle R. quelen were 0.93;
2.57 and 5.50 mg.L-1. The histopathological changes found at the gill tissues on juvenile of R.
quelen were hyperplasia of secondary lamellae and partial melting of the same. Based on the results it is necessary to conduct further research on the acute and chronic effects MXD-100 biocide on non-target organisms, especially in early stages of development, period that usually have higher sensitivity.
Keywords: Biocide. Sensitivity. CL50. Histopathological.
Dissertação elaborada e formatada conforme as normas da publicação científica Neotropical Ichthyology.
Disponível em: http://www.scielo.br/revistas/ni/1.pdf
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 10
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 11
3. RESULTADOS ... 14
4. DISCUSSÃO ... 19
5. CONCLUSÃO ... 23
6. REFERÊNCIAS ... 24
10 1. INTRODUÇÃO
A globalização do comércio trouxe consigo a criação de novas tecnologias como a utilização de lastro úmido em navios mercantis. Juntamente com a água utilizada na movimentação desses navios também foram transportadas acidentalmente, inúmeras espécies para diferentes áreas geográficas (Fernandes & Larsen, 2008). Entre os organismos exóticos introduzidos no Brasil está o Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), popularmente conhecido como mexilhão-dourado. Trata-se de um bivalve de pequeno porte (2 a 4 cm), pertencente à família Mytilidae, introduzido acidentalmente na América do Sul (década de 90), no rio da Prata (Argentina) através da água de lastro de navios vindos do continente Asiático (Oliveira et al., 2015). Em virtude de sua rápida dispersão, a espécie vem causando inúmeros impactos ecológicos e econômicos. As larvas ou véligers quando transportadas, podem atingir sistemas de águas industriais prejudicando o funcionamento de usinas hidrelétricas, térmicas, estações de tratamento de água ou qualquer empreendimento que utilize água bruta proveniente de bacias contaminadas (Darrigran & Damborenea, 2009).
Deste modo, diversas pesquisas estão sendo realizadas na elaboração e avaliação de estratégias físicas, químicas e biológicas para a erradicação e controle de moluscos invasores no Brasil. Uma das alternativas químicas atualmente empregadas é o composto MXD-100, utilizado em aplicações industriais por apresentar grande potencial biocida no controle e prevenção de organismos invasores como o L. fortunei (Claudi & Oliveira, 2015). Trata-se de um desnaturador de proteínas com formulação baseada em extratos tânicos e sais quaternários de amônio, Cloreto de Didecil Dimetil Amônio e Cloreto de Alquil Amido Propil Dimetil Benzil Amônio (MAX CLEAN, 2011).
Para avaliar os efeitos de compostos como este sobre organismos não-alvo, são utilizados os ensaios de toxicidade aguda e crônica. Na exposição aguda são administradas quantidades elevadas da substância teste e observados os efeitos tóxicos instantâneos (0 a 96 horas) letais aos organismos. Na exposição crônica são administradas dosagens subletais da substância teste e os efeitos somente serão observados após um longo tempo de exposição (dias, meses e anos) (Oliveira-Filho & Sisinno, 2013).
Apesar dos ensaios ecotoxicológicos serem padronizados, utilizando espécies como o Danio rerio e Pimephales promelas, no presente trabalho optou-se pela espécie jundiá, Rhamdia quelen (Quoy & Gaimard, 1824) como espécie bioindicadora, devido a sua ampla
11 distribuição, representação da fauna nativa (Baldisserotto, 2004) e importância econômica (Carneiro, 2004).
Deste modo, considerando que o composto MXD-100 é um produto amplamente utilizado no controle de organismos invasores (Netto, 2011) e que na literatura há falta de informações a respeito de seus efeitos letais e não letais sobre a biota aquática, o presente estudo teve como principal objetivo avaliar os efeitos toxicológicos da exposição aguda e crônica do anti-incrustante MXD-100 sobre a espécie R. quelen. Para isso, partiu-se do pressuposto de que a concentração do composto, utilizada para controlar a presença do L.
fortunei nos sistemas de refrigeração das usinas hidrelétricas pode ser letal para a espécie R.
quelen nas diferentes fases do seu ciclo de vida.
2. MATERIAL E MÉTODOS
A manutenção dos exemplares, bem como os ensaios de toxicidade aguda e crônica foram realizados entre fevereiro e maio de 2015, no Instituto de Pesquisa em Aquicultura Ambiental (InPAA), vinculado à Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE), Campus Toledo.
Para a aclimatação e os experimentos de toxicidade aguda foram adotadas as normas CETESB-L5. 019 (1994) e ABNT/NBR- 12715 (1993). A solução estoque foi preparada pouco antes do início dos ensaios agudos e crônico, baseando-se nos resultados dos testes agudos preliminares. O produto químico utilizado na forma pura e líquida (100%) foi diluído seguindo a proporção de 3:1000 sendo, 3 ml de MXD-100 para 1000 ml de água destilada.
Antes do início dos testes de toxicidade aguda e crônica as larvas em pré-flexão foram aclimatadas em incubadoras com capacidade para 200/L, enquanto que as pós-larvas e juvenis foram aclimatados em tanques de fibra de vidro com capacidade para 5000/L. Estes organismos permaneceram durante 48 horas, em uma temperatura de 23±1,5°C (água de poço artesiano), sob sistema semiestático, com renovação total de água a cada 24 horas, aeração artificial constante e fotoperíodo de 12 horas de luz. Durante este período, os peixes foram alimentados ad libitum, três vezes ao dia (8:00; 13:00 e 17:00 h), com náuplios de Artemia para larvas e ração comercial (40% de proteína) para pós-larvas e juvenis, sendo a alimentação suspensa 24 horas antes da experimentação aguda.
Os parâmetros físicos e químicos da água como: oxigênio dissolvido (% saturação e mg/L-1), pH e temperatura (oC) foram medidos antes do início de cada experimento, a cada 12
12 horas para os testes de toxicidade aguda e 24 horas para os testes de toxicidade crônica. Os valores de oxigênio dissolvido foram mensurados por meio do medidor de oxigênio (YSI 550A) e os de pH e temperatura através do pHmetro portátil (Digimed DM- 2P).
Foram realizados três ensaios de toxicidade aguda com exemplares de R. quelen nas fases larval (pré-flexão e pós-flexão da notocorda) e juvenil (Nakatani et al., 2001), obtidos de uma mesma piscicultura comercial (Tab. 1).
Tabela 1. Média e desvio padrão dos dados biométricos dos peixes utilizados nos ensaios de toxicidade aguda.
Ensaio Total de indivíduos
(n) Fase Peso
(g)
Comprimento total (cm)
1 280 Larval 5 dias de vida
2 240 Pós-larval 3,7 5,3
3 96 Juvenil 8,2 9,5
Os ensaios de toxicidade aguda (1- larval; 2- pós-larval e 3- juvenil) foram realizados num período total de 48 horas, com análise comportamental, quantificação de mortalidade e remoção dos organismos mortos/imóveis a cada 12 horas. No ensaio agudo 1 (larval) (Fig. 1), foram utilizados 28 recipientes plásticos com capacidade para 1L, mantidos em sistema estático e aeração artificial constante e sete concentrações do produto comercial MXD-100 (Tab. 2), com quatro repetições. Em cada recipiente foram acondicionadas 10 larvas em fase de pré-flexão da notocorda, totalizando 40 larvas por tratamento.
Figura 1. Experimento de toxicidade aguda com larvas de R. quelen.
13 Tabela 2. Concentrações de MXD-100 utilizadas nos ensaios de toxicidade aguda com larvas, pós- larvas e juvenis de R. quelen.
Concentrações de MXD-100 (mg/L-1)
Ensaio 1 (Larval) Ensaio 2 (Pós-larval) Ensaio 3 (Juvenil)
0,00 0,00 0,00
0,05 2,00 3,50
0,10 2,50 4,00
0,50 3,00 4,50
1,00 3,50 5,00
1,50 4,00 5,50
2,00 - -
Nos ensaios agudos 2 (pós-larval) e 3 (juvenil) (Fig. 2) os exemplares foram distribuídos em 24 recipientes plásticos com volume útil aproximado de 15L, mantidos sob sistema estático e aeração artificial constante sendo administradas seis concentrações (Tab. 2) do composto. Para o ensaio 2, foram acondicionados 10 exemplares por recipiente, com quatro repetições cada, enquanto que no ensaio de toxicidade 3, em cada recipiente foram acomodados 4 exemplares. As dosagens utilizadas nos testes de toxicidade aguda foram estabelecidas conforme a sensibilidade observada para cada fase do ciclo de vida do R.
quelen, partindo da concentração de 0,05 mg/L-1 de MXD-100 estabelecida pela empresa como dose não nociva ao meio ambiente (MAX CLEAN, 2007).
No teste de toxicidade crônica foram utilizados 75 exemplares de R. quelen em fase juvenil (massa corporal 8,2±1,2g e comprimento total 9,5±1,1cm), obtidos de piscicultura comercial. O ensaio teve duração de 7 dias e as concentrações do composto utilizadas foram 0,25 e 0,50 mg/L-1, doses equivalentes a 1/10 e 1/5 da concentração letal média (CL50: 2,57 mg/L-1) determinada no ensaio de toxicidade aguda com MXD-100 sobre pós-larvas de R.
quelen, conforme sugerido por Albinati et al., (2007) e um controle com cinco repetições.
Foram utilizados 15 recipientes plásticos com volume útil aproximado de 15L, mantidos sob Figura 2. Experimento de toxicidade aguda com pós-larvas e juvenis de R. quelen.
14 sistema semiestático com renovação total de água a cada 24 horas e aeração artificial constante. Durante o experimento os peixes foram alimentados com ração comercial (40% de proteína), duas vezes ao dia (8:00 e 17:00 h) havendo renovação das dosagens, análise comportamental, quantificação de mortalidade, remoção dos organismos mortos/imóveis a cada 24 horas.
Ao término do experimento de toxicidade crônica foram selecionados aleatoriamente 10 exemplares de cada tratamento para procedimentos histológicos. Os animais coletados foram transportados vivos ao Laboratório de Citogenética e Histologia da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus Cascavel, onde foram mantidos em aquários com areação artificial até a realização dos procedimentos histológicos. Os exemplares foram anestesiados com o uso de benzocaína e em seguida sacrificados por secção medular para a retirada do tecido branquial e demais etapas histológicas.
Após a extração os tecidos foram imersos e fixados em Karnovsky (tampão fostato Sörensën 0.1M, tampão fosfato pH 7.2 contendo paraformaldeído 5% e glutaraldeído 2.5%) por um período de 48 horas e encaminhados à rotina histológica (Ribeiro & Lima, 2000) para serem desidratados em série alcoólica e incluídos em historesina (Technovit® 7100 kit). Foram feitas secções de 3μm de espessura e coradas com Hematoxilina-eosina (H.E). Para cada exemplar foram analisados 9 campos e estes foram fotografados com objetiva de 40x em microscópio de epifluorescência BX 61, acoplado com câmera digital Olympus DP 71 utilizando-se do software de captura de imagem DP Controller 3.2.1.276.
Os procedimentos utilizados nos ensaios de toxicidade aguda e crônica estiveram de acordo com os princípios éticos na experimentação animal, recomendados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA), protocolo 069/14, da Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE). Os dados de mortalidade obtidos a partir dos ensaios de toxicidade aguda foram analisados através do programa estatístico Trimmed Spearman-Karber, versão 1.5 (Hamilton et al., 1977), a fim de estimar a concentração letal média (CL50-48h) e os respectivos limites de confiança (95%) do composto MXD-100 sobre as fases larval, pós- larval e juvenil de R. quelen.
3. RESULTADOS
Os valores das variáveis físicas e químicas da água avaliadas durante a execução dos testes de toxicidade aguda, não diferiram significativamente ao longo do tempo de exposição
15 e dos diferentes tratamentos, a ponto de interferirem na sobrevivência dos organismos-teste (Tab. 3).
Tabela 3. Média e desvio padrão das variáveis físicas e químicas da água dos ensaios de toxicidade aguda.
Ensaio
Oxigênio Dissolvido
(mg/L-1)
Oxigênio Dissolvido
(%)
pH Temperatura
(OC)
1 Larval 6,7±1,2 70,0±4,1 7,3±0,4 25,6±0,5
2 Pós-larval 7,0±0,8 72,3±3,7 7,6 ±0,1 23,4±1,2
3 Juvenil
3 Juvenil
7,5±0,9 78,6±4,9 7,5±0,2 21,5±0,7
Nas concentrações próximas de 0,05 mg/L-1, o composto MXD-100 não foi letal aos organismos expostos, sendo que nas dosagens de 0,05; 0,10 e 0,50 mg/L-1 a taxa de sobrevivência foi de 97,50 e 95,00% (Fig. 3). A partir da concentração de 1,00 mg/L-1 os índices de mortalidade foram maiores, aproximando-se de 100% na dosagem de 2,00 mg/L-1. A concentração letal mediana (CL50-48h) do composto estimada para larvas de R. quelen foi de 0,93±0,13 mg/L-1.
Figura 3. Resultados do experimento de exposição aguda com larvas de R. quelen às diferentes concentrações de MXD-100.
No ensaio de toxicidade com pós-larvas de R. quelen, na dosagem de 2,00 mg/L-1 não foram observados efeitos significativos do composto sobre os organismos, sendo que a taxa de sobrevivência nesta concentração foi de 92,50% (Fig.4). Em dosagens superiores a 3,00 mg/L-1, os índices de mortalidade foram muito elevados chegando à 72,5% nas primeiras 12 horas de exposição ao anti-incrustante, sendo que nas concentrações agudas de 3,50 e 4,00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Mortalidade (%)
Concentração (mg/L-1)
CL50-48h: 0,93 mg/L y= 55,956x - 5,0964
R2 =0,9357 CL50-48h= 0,93
CL50-48 h= 0,93
16 mg/L-1 a taxa de mortalidade foi de 100%. Para os organismos em fase pós-larval a CL50-48h de MXD-100estimada foi de 2,57±0,08 mg/L-1.
Figura 4. Resultados do experimento de exposição aguda com pós-larvas de R. quelen às diferentes concentrações de MXD-100.
No ensaio de toxicidade com MXD-100 sobre exemplares juvenis de R. quelen, nas dosagens de 3,50 e 4,00 mg/L-1 foi observado 100% de sobrevivência dos organismos, enquanto que nas concentrações de 4,50 e 5,00 mg/L-1 a letalidade foi próxima de 50% (Fig.
5). Para a concentração de 5,50 mg/L-1 a taxa de mortalidade foi igual a 50%. Por tanto, a concentração letal mediana (CL50-48h) do composto MXD-100 para juvenis de R. quelen foi de 5,50 mg/L-1.
Figura 5. Resultados do experimento de exposição aguda com juvenis de R. quelen às diferentes concentrações de MXD-100.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Mortalidade (%)
Concentração (mg/L-1) CL50-48h: 2,57 mg/L
y = 29,25x - 13,958 R² = 0,8008
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
Mortalidade (%)
Concentração (mg/L-1)
CL50-48h: 5,50 mg/L y = 9,0323x - 10,954
R² = 0,4975
17 No decorrer dos ensaios de toxicidade aguda foi possível observar altas taxas de mortalidade e sinais clínicos de intoxicação dos organismos percebidos especialmente durante a administração do composto, nas primeiras horas de exposição e nas concentrações mais elevadas. Dentre as alterações, foi verificado para pós-larvas e juvenis de R. quelen telangiectasia da região bucal e opercular, inchaço e alteração da coloração da região abdominal, hiperatividade, dispnéia, natação errática, perda de equilíbrio e paralisia.
Durante o tempo de exposição crônica não foi observada mortalidade dos organismos nos tratamentos contendo MXD-100 (0,25 e 0,50 mg/L-1). No entanto, para juvenis de R.
quelen também foram constatadas alterações comportamentais como, rejeição alimentar, movimento em direção à superfície da água e distúrbio de coordenação natatória. Estes sinais clínicos foram observados em ambas as diluições especialmente no período de renovação das dosagens.
Quanto aos parâmetros físicos e químicos da água avaliados durante a execução do teste de toxicidade crônica, não foram constatadas diferenças significativas ao longo do tempo de exposição e dos diferentes tratamentos. Os valores de oxigênio dissolvido estiveram em 7,5±0,9 mg/L-1 e 78,6±4,9 %; os de pH 7,5±0,2 e temperatura 21,5±0,7 oC.
Os peixes expostos aos tratamentos de 0,00 e 0,25 mg/L-1 do biocida não apresentaram alterações histopatológicas expressivas nas brânquias. Entretanto, nos juvenis expostos à concentração de 0,50 mg/L-1 do anti-incrustante foram constatadas alterações morfológicas para estes tecidos (Fig. 6). Das alterações frequentemente encontradas foi observada dilatação das lamelas secundárias em 70% das amostras, hiperplasia com fusão parcial das lamelas secundárias em 40%, deslocamento do epitélio das lamelas secundárias em 20% e vasodilatação do seio venoso central das lamelas primárias em 15% das amostras.
18 Figura 6. Fotomicrografia do tecido branquial de R. quelen exposto ao anti-incrustante MXD-100. A- Tratamento (0,00 mg/L-1):Tecido branquial normal, mostrando o filamento branquial com lamela primária (seta), lamela secundária (ponta de seta) e seio venoso central (estrela); Tratamento (0,50 mg/L-1): B- Dilatação da lamela secundária (ponta de seta) e destacamento do epitélio lamelar (seta);
C- Fusão parcial de 4 lamelas secundárias (cabeça de seta) e dilatação da lamela secundária (seta); D- Destacamento do epitélio lamelar (setas); E- Congestão do seio venoso central (ponta de seta); H.E.
A
C
D
E
A B
C
E
D
19 4. DISCUSSÃO
O resultado da CL50-48h encontrado para larvas de R. quelen (0,93 mg/L-1) no presente experimento, foi semelhante ao valor obtido para larvas da espécie Pimephales promelas (0,97 mg/L-1) (ECOTOX, 2010). Em comparação com o microcrustáceo Daphnia similis em que a CL50-48h estimada foi de 0,12 mg/L-1 (MAX CLEAN, 2007), pode-se afirmar que as larvas de R. quelen apresentaram maior resistência ao composto MXD-100. Por outro lado, em estudos realizados com o camarão Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862), não foram observadas mortalidades dos organismos durante as 48 horas de exposição ao anti-incrustante, na concentração de 0,05 mg/L-1 (Ribeiro & Pelli, 2011).
Um valor próximo à CL50-48h de MXD-100 para o R. quelen em fase pós-larval (2,57 mg/L-1) também foi alcançado em testes de toxicidade aguda com o composto, sobre pós- larvas de Leporinus friderici, Prochilodus lineatus, Astyanax bimaculatus e Myleus tiete sendo a CL50-48h estimada em 2,62 mg/L-1 (BIOTEST, 2005; MAX CLEAN, 2011). Estes resultados permitem destacar que embora as espécies sejam diferentes, estas apresentaram sensibilidade análoga em relação ao biocida. Resultados semelhantes também foram observados em testes de toxicidade com metais pesados e Dicloro difenil tricloroetano, sobre as espécies Hemigrammus marginatus, Serrapinnus notomelas, Danio rerio e Poecilia reticulata onde todas demonstraram sensibilidade equivalente (Bertoletti, 2009).
Conforme sugere o fabricante, o MXD-100 é um biocida que oferece baixa toxicidade a biota aquática quando utilizado em concentração inferiores a 0,05 mg/L-1. Estudos relacionados à eficácia do anti-incrustante como medida de controle para a espécie L. fortunei, relataram valores de CL50-48h iguais a 0,051 mg/L-1 (CETEC, 2007; Dias et al., 2010) e 45,49 mg/L-1 (Montresor et al., 2013). De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho, na concentração subletal de 0,05 mg/L-1, o biocida não foi letal ao bioindicador R. quelen. No entanto, devido ao elevado efeito agudo observado sobre as larvas da espécie, em concentrações de 1,50 e 2,00 mg/L-1 pode-se presumir que, a utilização de dosagens superiores a 0,05 mg/L-1 para o controle da espécie L. fortunei, poderão oferecer riscos a sobrevivência da espécie R. quelen, especialmente na fase inicial de desenvolvimento.
Em decorrência do alastramento do L. fortunei nas principais bacias hidrográficas brasileiras, recentemente foi concedido pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) o número de registro com validade de dois anos para o composto MXD-100. A sua autorização surgiu como medida emergencial para o controle da
CL50-48h= 0,93
20 espécie L. fortunei em sistemas de resfriamento de usinas hidrelétricas no país, desde que sejam obedecidas condições de uso como a dose e frequência de aplicação deverão permanecer entre 1,00 e 7,00 mg/L-1, conforme o tamanho dos dutos e o nível de incrustação e as concentrações do biocida superiores a 2,00 mg/L-1 só poderão ser utilizadas pelo prazo máximo de 30 dias, sendo reduzidas entre 1,00 e 2,00 mg/L-1, após esse período (BRASIL, 2015). Através dos resultados de exposição aguda sobre a fase larval do R. quelen onde, dosagens entre 1,00 e 2,00 mg/L-1 foram altamente letais aos organismos e concentrações entre 2,50 e 4,00 mg/L-1 para pós-larvas acarretaram em taxas de mortalidade significativas, é importante salientar que as dosagens do composto autorizadas por questões emergenciais para o controle da espécie L. fortunei podem oferecer riscos iminentes para a espécie R. quelen, principalmente nas fases iniciais de seu desenvolvimento.
Com base no presente trabalho as concentrações letais medianas de MXD-100 foram diferentes para as três fases do ciclo de vida de R. quelen, demonstrando que larvas e pós- larvas apresentam maior sensibilidade ao anti-incrustante do que juvenis. A utilização de organismos em estágios iniciais do ciclo de vida permite uma avaliação mais cautelosa sobre o potencial impacto de contaminantes nos ambientes. Em alguns casos e quando possível, para a análise do risco ambiental podem ser necessárias avaliações de toxicidade das substâncias sobre o ciclo de vida completo das espécies bioindicadoras (Mckim, 1977; Aydın
& Köprücü, 2005; Magalhães & Ferrão-Filho, 2008).
A partir dos resultados obtidos durante as 48 horas de exposição ao anti-incrustante, para os ensaios de toxicidade aguda foi possível observar índices de mortalidade crescentes em resposta ao aumento das dosagens. Outros biocidas apresentaram o mesmo comportamento com espécies de peixes de água doce, como o inseticida Paration® metílico sobre Piaractus mesopotamicus (Cruz et al., 2004) e os pesticidas Diazinon® sobre Cyprinus carpio L. (Aydın & Köprücü, 2005) e Bardac® 2280 sobre Pimephales promelas (Farrell et al., 1998). Com relação ao tempo de exposição foram constatadas elevadas taxas de mortalidade apenas nas primeiras horas de experimentação (0 e 24h), permitindo supor que o potencial de ação do composto age de forma imediata sobre a espécie R. quelen. Resultados semelhantes também foram encontrados para a espécie M. amazonicum, na concentração de 5,00 mg/L-1, onde a mortalidade dos exemplares ocorreu logo após a diluição do biocida (Ribeiro & Pelli, 2011).
O MXD-100 em sua formulação tem como principais ingredientes ativos os sais quaternários de amônio (QACs) Cloreto de Didecil Dimetil Amônio e Cloreto de Alquil
21 Amido Propil Dimetil Benzil (10%). Os QACs são uma classe de compostos tensoativos catiônicos amplamente utilizados em produtos industrializados como em antissépticos, desinfetantes, detergentes, biocidas e entre outros (Rangel & Merçon, 2012; Tezel &
Pavlostathis, 2015). Embora sejam poucas as informações na literatura a respeito dos efeitos destes compostos em ambientes aquáticos, alguns estudos revelam que os sais quaternários de amônio podem causar consequências adversas sobre organismos aquáticos. Os mecanismos de toxicidade sobre bactérias resultaram em extravasamento do conteúdo celular devido à desnaturação das proteínas da membrana plasmática (Pelczar et al., 1993). Em peixes, através de testes de toxicidade com epiclorohidrina-dimetilamina sobre a espécie truta-arco-iris (Oncorhynchus mykiss), foram observadas interferências nos mecanismos de regulação osmótica em virtude da ligação dos polímeros deste composto à superfície dos tecidos branquiais, acarretando em quedas do pH sanguíneo, diminuição das concentrações de sódio e cloreto, aumento de íons de potássio e amônia total e consequentemente a asfixia dos indivíduos (Muir et al., 1997). Sobre dafnideos foram constatadas altos índices de mortalidade (Hall & Mirenda, 1991).
Em peixes, alterações comportamentais costumam servir como indicativos dos potenciais efeitos negativos dos poluentes presentes nos ambientes. No decorrer dos ensaios de toxidade aguda e crônica foram constatados sinais clínicos de intoxicação dos organismos.
Dentre as alterações foi verificado para pós-larvas e juvenis de R. quelen telangiectasia da região bucal e opercular, inchaço e alteração da coloração da região abdominal, hiperatividade, dispnéia, natação errática, perda de equilíbrio e paralisia. Resultados como esses são constantemente observados em espécies de peixes expostos a substâncias de diferentes naturezas e modos de ação. Como em estudos com o ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) sobre pós-larvas e adultos de Oreochromis niloticus L. (Sarikaya & Selvi, 2005), testes de toxidade com fenol sobre adultos de Oreochromis mossambicus (Saha et al., 1999) e com poliquaternário de amônio sobre adultos de Gambusia holbrooki (Cumming et al., 2008).
Quanto às alterações histopatológicas encontradas nos tecidos branquiais de juvenis de R. quelen expostos ao anti-incrustante MXD-100 não há informações disponíveis na literatura sobre os efeitos subletais deste composto para espécies de peixes. Sabe-se que apesar de exercerem um papel importante nos estudos ecotoxicológicos, os resultados dos ensaios de toxicidade aguda, podem ser insuficientes na avaliação dos efeitos das substâncias sobre determinados organismos, sendo necessária a realização de ensaios de toxicidade crônica (Oliveira-Filho, 2013). As alterações por contaminantes em peixes, quando manifestadas em
22 níveis teciduais podem ser detectadas através de análises histológicas. Para tanto, é necessária a escolha de órgãos que, através da exposição e sensibilidade ao contaminante possibilitem a avaliação de possíveis riscos ambientais (Lins et al., 2010). De forma geral, brânquias costumam atuar como biomarcadores por apresentarem-se suscetíveis às alterações e condições de estresses nos ambientes (Yildirim et al., 2006). Na maioria dos peixes teleósteos as brânquias funcionam como principal superfície respiratória (Feist, 2009) e de contato com o meio externo (Yildirim et al., 2006).
No presente trabalho foram observadas deformidades significativas nas lamelas secundárias. Em grande parte das amostras foi constatada hiperplasia das lamelas secundárias, seguida de fusão parcial das mesmas em virtude da proliferação das células do epitélio filamentar e da perda da capacidade de suporte das células pilares. Em alguns casos foi observado deslocamento do epitélio das lamelas secundárias e vasodilatação do seio venoso central das lamelas primárias. Muitos autores relataram alterações similares em tecidos branquiais, de espécies de peixes expostos a diferentes tipos de substâncias tóxicas, tais como efeitos da Deltametrina® sobre brânquias de Oreochromis niloticus L. (Yildirim et al., 2006), efeitos do Cádmio sobre brânquias de Oreochromis niloticus (Garcia-Santos et al., 2007), água contaminada de um ribeirão sobre Prochilodus lineatus (Camargo & Martinez, 2007), Zinco sobre Carassius gibelio (Velcheva et al., 2010), Glifosato® sobre Heteropneustes fossilis (Samanta et al., 2016) e efeitos da Atrazina® sobre Prochilodus lineatus (Paulino et al., 2012).
Com relação às alterações nos tecidos branquiais que apresentaram maior frequência, os processos hiperplásicos podem estar associados como uma reação compensatória em virtude da baixa absorção de oxigênio. Dificuldades no processo de trocas gasosas podem induzir a formação de novas células epiteliais, ocasionando a dilatação das lamelas secundárias e consequentemente a aderência das mesmas, proporcionando um aumento da superfície de contato com o meio externo (Velcheva et al., 2010).
5. CONCLUSÃO
O MXD-100 é um biocida composto por taninos e sais quaternários de amônio amplamente utilizado em instalações industriais no Brasil, no controle e prevenção contra organismos invasores como a espécie L. fortunei. No presente trabalho a concentração subletal de 0,05 mg/L-1 estabelecida pelo fabricante como sendo segura para organismos
23 aquáticos, não foi letal à espécie R. quelen no entanto, dosagens superiores a 1,00 mg/L-1 do anti-incrustante ocasionaram altos índices de mortalidade sobre indivíduos nas fases larval e pós-larval durante as primeiras horas de exposição. As concentrações letais medianas (CL50- 48h)de MXD-100 obtidas para as três fases do ciclo de vida do R. quelen (larval, pós-larval e juvenil) foram 0,93; 2,57 e 5,50 mg/L-1, o que confirma o pressuposto desta análise, de que os efeitos do anti-incrustante são diferentes ao longo do ciclo de vida da espécie.
Quanto as alterações histopatológicas encontradas para a fase juvenil de R. quelen, foram observadas alterações nos tecidos branquiais como hiperplasia das lamelas secundárias, e fusão parcial das mesmas. Em alguns casos foi observado deslocamento do epitélio das lamelas secundárias e vasodilatação do seio venoso central das lamelas primárias. A junção das lamelas secundárias pode estar associada a uma ação compensatória do organismo através do aumento da área superficial branquial devido a dificuldades nas trocas gasosas.
Considerando que o composto obteve aprovação de registro e que, de acordo com a literatura, as concentrações utilizadas no controle do L. fortunei em sistemas de resfriamento de empreendimentos hidrelétricos costumam exceder a 1,00 mg/L-1, tendo em vista a autorização da utilização de dosagens superiores a 2,00 mg/L-1 no prazo máximo de 30 dias, faz-se necessária a realização de novas pesquisas a respeito dos efeitos do biocida MXD-100a níveis de toxicidade aguda e crônica em espécies não-alvo, com especial atenção as fases iniciais de desenvolvimento, período em que apresentam maior sensibilidade à alterações ambientais visto que, estudos referentes à toxicidade e complexidade química deste composto são ainda escassos.
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