Estudo das reações das vitaminas b12o e b12r com pesticidas clorados

especialização em f í s i c o-o u í m i c a e a p r o v a v a e m s u a forma final

PELO CURSO VE PÕS-GRA VUAÇKO

?nob. FARUK J K l J O M E AGUILERA, Ph. V . 0n.izntad.ofi ;

PKoi. I Ç m / V A l E GAULT, Ph. V. Coordznadon.

Banca zxaminadora

Pno FAR AGUILERA, Pk. V,

Pk o&. 3UAH JAC0B EVUAR V Q/ H UM ER E S ALLENVE, Ph. V

£LV\,

ESTUVO VAS REAÇÕES VAS VI TAMINAS B ) u E 'B 12si

COM PEST1C1 VAS CLORAVOS

T ES E S UB METI VA Ã UNI VERSIVAVE FEVERAL VE SANTA 'CATARINA PARA A . OBTE NÇÃO VO GRAU VE M E STRE EM ClBN,CIAS

MAURO C É S A R M A R G H E 7 T I LARAN JEIRA

t nab a Z h o .

Extzndo oò mzu6 agnadzcZmznto 6 ao& ?n.o{tz66on.z& Juan •

Jacob E d u a n d o H u m z n z ò KZZzndz z LavinzZ .G.^lonzòcu pzZoò AubàZ- dZo& ZmpontantzA quz ^onnzczAam.. ...

GoòtatiZa dz agn.ad.zczn. ao6 mzuò coZzgaó do cuJiòo dz pÕ6-gn.aduaç.ãozm FZòZco-QuZmlca, pzZa coZabon.aç.ão z z&tZmuZo quz izmpKz mz dzn.am.

Agn.adzç.0, tambzm 5. UnZvzn.4Ídadz FzdznaZ dz Santa Cata n.Zna z a CAPES/CNPq pzZo AupoKtz dado nz&tz tn.abaZh.0.

■ ' . . ■ ■ ■ • ■ ■ / \

Não poòAo dzZxan dz agnadzczn. ã datiZÕgn.afaa NZZza SIZ vz6tn.Z dz Souza pzZa coh^zcção dz&ta tz&z. '

2. Química dos p e sti c ida s d o r a d o s ... 2.1. Família do no rb or n e n o ... ... 2.2. Família do DDT ... ... 3. Qu í mi c a da v i t a m i n a • • ... . 3.1. E s t r u t u r a m o l e cul a r e n o m e n c l a t u r a ... 3.2. Estados de oxidação da B 2 ... 3.3. Q u í mi ca da ligação co bal t o - c a r b o n o ... 3.3.1. Reações n uc le of íl ic a s com (I) e por radicais

livrej(CoII) ... ... ... ... 3.3.2. Reações com transf erê n cia de alquilas ... 3.4. E q ui lí b r i o qu ímico ... .

3.5. E s p ectros de absorção de cobalaminas ... 3.6. Funções b ioq u ími c as da B 12 ... .... 3.6.1. B ioss ínt e se da m e t i o n i n a ... ... 3.6.2. Formação de me t a n o ... ... ... 3.6.3. Síntese de acetato ... ... .

CAPÍTULO II - MATERIAIS E M ÊTOVOS

1. E qu ipamentos ... ... ... . . . .. 2. Materiais . . ... ... ... .^T>.

3. Métodos ...

3.3. D o s a g e m de cloretos ... ... ... 35

4. E s qu e ma de reação ... ... . 36

4.1. Sistema de p u r i f i c açã o de nit r og é n i o e de reação ... 36

4.2. Reações de pesticidas clorados da família dos no rbor nenos c o m v i t a m i n a B,, _lZs ... *... 37

4.3. Reação do DDT com v i t a m i n a B ^ g • •••■... ... 38

4.4. Reações de p es ti ci da s clorados da classe do DDT com v i t a m i n a B j2r ... . . . ... ... 39

CAPÍTULO III - RESULTAVOS E V1SCUSSÃ0 1. Reações de p esticidas clorados d a f amíl ia do nor borne-no com v i t a m i n a B ^2S ... .. ... 41

2. Reação do DDT com v i t a m i n a B ^ g ... . 48

3. Reações de p es ti ci da s clorados da classe do DDT com v i t a m i n a B ^2r ... ... '... 54

3.1. Reação do DDT ... ... ... . . ... 54

3.2. Reação do DDD ... ... . 61

3.3. Reações do DDM ... . 61

3.4. Reações do DDE e DDMU ... 65

3.5. A na l i s e geral . . . ... ... ... 67

4. Conclusões ... ... ... 69

BIBLIOGRAFIA . ... ... . 70

APEHVICE I - E&truturaA e nomenclatura, de. peòticidaò 1.1. Família do norborneno ... t... . 1.2. Família do DDT ... ... . ... 76

ÁPtNVlCE II - Vado-ò espectro ^otométrlco6 UV de algunò peó tlcldaò cloradoò da ciaiòe do VVT e do tranò-e&tilbeno .. 79

FIGURA 1 - Cr om at og ra ma dos produtos entre DDT e cromo(II) 12 FIGURA 2 - Est ru tu ra da v i t a m i n a B-^ ... 14 FIGURA 3 - Est rutura abreviada da c oenzima B ^ ... .... 16 FIGURA 4 - Sistema do anel corrínico, com as densidades

\ de carga calculadas para um íon metálico dipo

s.itivo ... . 16 FIGURA 5 - Formulas estruturais planas dos compostos:

(a) p orf i na

(b) ft alocianina

(c) clo r ofila ... 18 F IGURA 6 - Diagrama de orbital m o lec ular e os níveis e l£

trônicos da or ga noc o bal a min a ... ... 20 FIGURA 7 - Espectro de absorção: h i d r o x o c o b a l a m i n a ; B ^2r

FIGURA 8 - Espectro de absorção: metilcob.alamina; m etilco

balamina pr o ton a da ... ... ... •..., 27 FIGURA 9 - Espectros do complexo vit a m i n a B ^ - a l d r i n em

meio ácido antes da fotolise e dos produtos

depois da fotõlise .... ... . ... 44 FIGURA 10 - Cromatog r ama dos produtos da reação entre DDT

FIGURA

FIGURA

FIGURA

pâg. 11 - Espectro UV dos produtos DDE e DDD da reação

do DDT com a vita m i n a ... 57 12 - Espectro UV - VIS dos padrões B ^ a e M e - B ^

e do pr od ut o v i t a min a do da reação entre DDT

13 - Espectros UV dos produtos D D M , DDNU e DDO da

TABELA II TABELA III

TABELA I - Constantes de ve l oci d ade e parâmetros de ativação da reação de desidr ocl oraçã o de h id róxido de sódio em 92,61 de etanol > aquoso dos compostos do tipo I (R— C l ) ..

• p Ka para uma serie de a l q u i l c o b a l a m i n a s . • D eterminação do cloreto produzido nas

reações entre vi t ami n a B-^s e os pesticji das n o rbornenos ... .

■ Dados cromatograficos dos produtos da reação do DDT com v ita m i n a B ^ s ... ■ C ro m ato g raf i a gasosa e cromatografia em

camada d elgada dos produtos da reação do DDT com a B ^2r ... .

■ An alise cr om atografica dos produtos da reação do DDT apõs tratamento com : KOH alcoólico ... .

An a lise cromat o gra f ica dos produtos, da reação do DDD com a vita m i n a B-^2r ... TABELA VIII - Analise cro m atografica dos produtos da

reação do D DM com a v itam ina B ^2r ... TABELA IV TABELA V TABELA VI TABELA VII 10 24 42 49 56 58 62 64

R E S U M 0

Foram e*tudada* a* reàçõe* da* vitamina* B j ^ £ ^I2r com pe*tlclda* clorado* do tipo norborneno e VVT.

A r eti r a d a de. um átomo de cloro do* pesticida* aldrin e dleldrln e de trê* á t o m o * de cloro do y-clordane, e con*i*ten te com o* re*ultado* já obtido* na reação de p e * t l c l d a * norborne no4 com NaBHj na pre*ença d e diferente* Z o n 4 m e t á l i c o 4.

A remoção de t r ê 4 átomo* de cloro no y - c l o r d a n e l n d l ca a po**lbilldade de ocorrer a ligação Co-C tanto no lugar de um do* cloro* da ponte metilênlca, quanto no l u g a r do* dol* clo_ r o * ligado* ao* doi* carbono* * e c u n d a r l o * *aturado*. õ produto B j2~R da* reaçoe* da vitamina B ^ 4 com P-4 pesticida* d e r i v a d o * do norborneno,e bn*tante ln*tãvel, me*mo na au*e n c i a de luz e em baixa temperatura, deco m p o n d o - * e em um dia em pre& e n ç a de o x i g ê ­ nio .

0 m a i o r produto, da reação entre 1,1,1- t r l c l o r o - 2 ,2 - bl* [p-cloroienll) etano (VVT) e vitamina £ o t r a n * p p ’ di -cloroe*tllbeno (VCS), *eguido de 1, í -bl* (p-cloro faenil)- 2 , 2-dlclo_ roetileno (VVE) e 1, 1 - d i c l o r o - 2 , 2-bl* (p-cloro fienil) etano (W9), alem de outro* produto* menore*. 0 aparecimento de 1,1-bi* (p-clorofie- n i D - l - m o no cio roetileno (VVMii), 1,1-bl* (p-cloroienil)-etlleno

(VVMU) e 2 ,2-bi*(p-clorofienil)etano (VVÕ) como o* menore* produ to* de*ta reação, * ugere a participação da e*pecle. 8 ?^ no meca ni*mo da reação. A vitamina g e r a d a pela {sotoli*e da metllco_ balamina, reage imed i a t a m e n t e com o V V T , removendo um átomo de cloro via radical livre, formando a vitamina Bj^-Cl, a qual e

04 maZoAZò pAodutoÁ da Azação zntfte vZta m Z n a e PPT, ião 0 VVE e 0 P P P . Embora 0 1 -cZ.oa.o-2, 2-bZ& {p-cZoAo ^znZZ) e-

tanOr (VVM) não froAa Z&oZado n a t a A z a ç ã o , zZz ^oZ compAovado co_ mo Um poóòZvzZ Z n t z A m z d Z ã A Z O , AzagZndo com a B ^ ^ e 04 pAodutoò :VVMU z VVO.

Eòtu-do da ação da vZtamZna B j ^ &obAZ 0 6 pz&tZcZdaò

VVT, VVV, VVM, VVE e VVMU, con^ZAmam o& AZ&uZtado& com 0 VVT. A

pzAczntagzm dz òubAtAato AzàgZdo iu g z A Z quz a. oAdzm dz A z a t Z v Z d a dz z VVT > VVV < VVM, znquanto quz VVE z VVMU não -ião AzatZvoò.

A B S T R A C T

T/ie n.zaction oh vitamin chlon.inatzd pz6tici-dz6 oh thz typz o h notiboA.ne.nz and W T u)a-6 6tudizd.

The. n.zmoval oh onz atom oh chlon.inz hn.om thz pzôtici dz6 al dn.in ànd dizldn.in and thfizz atom& oh chlon.inz h^om y-chloA. danz Í6 con6i6tznt with N a B H ^ i n thz pn.z6zncz oh van.iou6 m z t a l i o n 6 .

’ Thz Azmoval oh thnzz atomô oh chl.on.inz in thz ca&z oh y-chloAdanz it, conòiòtznt with zxiòtzncz oh a Co-C bond in pla cz oh onz oh thz chlon.inz atom6 oh the. m z t h y l z n z bn.idgz a& wzZl a& in thz pZacz oh £hz two ch.Zon.inz6 bond to thz two òzcondatiy 6atun.atzd canbon a t o m ò .

Thz pn.odue.t6 oh thz A z a c t i o n oh vitamin Bj^-R with. noAboAnznz pz6ticidz6 an.z n.ath.zn. un&tablz, z v z n i n the abòzncz oh light and at l o w tzmpzn.atun.z6 and t h z y d z c o m p o 6 Z in onz day in thz pAZ6zncz oh oxigzn.

Thz m a j o A p A o d u c t oh £hz A z a c t i o n oh vitamin Bj ^ and 1,1,1- t A i c h Z o A o - 2 ,2 - b i 6 ( p - c k Z o A o p h z n y Z ) z t h a n z ( W T ) Í6 tn.an&— p — p ' - d i c h Z o Ao6tiZbznz (VCS), j$o££oo;eci by 1, Í-bió {p-chZoAophznyZ) — 2 , 2-dichZoAozthyZznz \ W E ) and 1,1- d i c h Z o A o - 2 - 2 - b Í 6 - {p-chZoAophz nyl) zthanz ( V W ) along loith othzn. minon. onz6. Thz h0,LmaiZon oh 11 bi6 {pchZoAophznyZ)1 monoc h l c n o z t h y l z n z {VVMU), 11bi6{ p -chloAophznyl) -zthylznz (VVNU) and 2-2-bi6 (p-chtoAophznyl) zthanz

( W O ) a& thz minon. pn.oductó 0 6 thi6 Azaction, 6 ugg Z6t6 thz pan.ti

cipation oh thz B 6 p c c i z 6 in thz mzchani6m. Vitamin B j g z nzAatzd by thz photolyòiò oh mzthtjlcobalamin, Azact6 i m m z d i a t z l y

with V V T , removing a chZorine atom via. a firee radicaZ mechanism and, forming vitamin B ^ - C Z , which i 4 a Co {111} S p e c i e * . This com pZex is r a p i d Z y hydrated and resuZts in the formation ofa vitamin B j2a and firee chZoride ion.

The major products ofa the r e a c t i o n o & vitamin B ^ ^ ^ a n d VVT are VVE and VVV. Even though VVH was not i.soZated during this reaction, it was shown to react with vitamin B ^ ^ forming VNNU and W O and it was confirmed as a possi.bZe intefLmedi.ate ofa the former fieaction.

The study o £ the action o& vitamin B j ^ on the p e s t i ­ cides VVT, VVV, VVM, VVE and W M U confirms the resuZts with VVT. The percentage Oj$ r e a c t e d substrate suggests that the order ofa r e a c tivity is VVT > VVV < VVM and that VVE and VVMU do not react.

A B R E V I A Ç V E S

M e B^ 2 " m e t i l c o b a l a m i n a B ^2“R “ pr oduto vi ta m i nad o

DDT - 1 , 1 , l - t r i c l o r o - 2 ,2 -bi s (p-c lor ofeni l)e tano DDD - 1 , l - d i c l o r o - 2 ,2 - bis ( p-cl oro fenil )et ano DDM - l - c l o r o - 2 ,2 -b is(p - clo r ofen il)e tan o DDO - 2 , 2- bi s( p- cl or o f eni l )eta no

DDE - 1, 1 - b i s ( p - c l o r o f e n i l ) - 2 , 2- dicloroetileno DDMU - 1 , 1- bi s( p- cl o r o f e n i l ) - 2 - m o n o c l o r o e t i l e n o DDNU - 1 , 1 - b i s ( p - c l o rof e nil ) etil eno

DCS - t r a n s - 4 - 4 '-d ic lor o estilbeno

Dicofol - 1 , 1 - b i s ( p - c l o r o f e n i l ) - 2 , 2 , 2-tricloroetanol DBP - p - p '- d i c lo ro be n z ofe n ona .

DDOH - 1 , 1 - b i s ( p - c l oro f eni l )-2- eta nol DDA - 1, 1 - b i s ( p - c l oro f eni l )-ãç idú acético DDMF - 1 - c l o r õ - l ,2 - b i s ( p-c l orof enil )ét ano

1 . Importância e objztivoò do zòtudo

0 c rescimento da po p ul a ç ã o mundial requer um aumento considerável de suprimentos essenciais para a sua sobrevivência, em vista disto a agricu ltu r a d everá ter um grande d e s e n v o l v i m e n ­ to. Um p r oblema serio deste d e s e n vo lvim ento ê a pre s e n ç a das pej; tes nas colheitas.

Atualmente, os pesticidas que se pode m obter, apre s entam a ma i o r i a dos requisitos para u m bom controle das enfernú dades e pestes^ e x i s t e n t e s . é essencial, entretanto, que as com

panhias produtoras tenham dados mais apurados nas condições tro picais e que eles dêem mais atenção à educação dos agricultores

i no uso correto destes materiais.

Os hi d roc a rbo n eto s clorados persiste nte s (estáveis) são no m ome nt o de grande interesse público. Estes pesticida s po dem ocorrer em alimentos, água p o tável e no ar que se respira. Entretanto, uma exposição ma c i ç a dos seres humanos aos p e s t i c i ­ das durante as suas produções e aplicações ou me s m o através de seus resíduos encontrados nos alimentos, pode resultar em graves efeitos tõxicos sobre os seus organismos. Portanto, seria ideal ter pesticidas que fossem biodegr a dáv eis e que sua b i o d egr ada çã o terminasse em produtos não tõxicos.

Muito interesse tem-se concentrado na de gra dação do

^ ' ' 2

DDT em varios animais, tecidos isolados e culturas bacterianas.

0 objetivo geral deste trabalho, foi contribuir ao es^ tudo dos possíveis mecani sm o s biológicos de d e s i n to xicaç ão de

pesticidas clorados da classe do DDT e do h e x a c l o r o n o r b o r n e n o a traves de reações de desclo r açã o com v i t a m i n a B ^2r (Co II) e v i t a m i na B ^ s (Co I). A vi t a m i n a B ^2r pode iniciar uma reação com haletos de alquila segundo radicais livres, enq uanto que a v i t a ­ mi n a B ^2S (alta d ens idade de carga e alta p o l a r i z i b i l i d a d e nõ

átomo de cobalto) a presenta-se como u m forte nucleõfilo, sendo

. . . 3

capaz de reagir com agentes alquilantes.

A fim de me l h o r e s c l a r eci mento do tema, a p r e s e ntar - s e -ã uma breve introdução dividida em duas partes: química, de pesti^ cidas clorados (estruturas, e n o m e n c l a t u r a ver A p ê n d i c e I) e. qujC m i ca da vitam i na B ^ *

*

2. Química, do4 pcst-icidai clorados

As reações de transformações m e t a b ó l i c a s dos hi dr o c a r bonetos clorados são essenc i alm e nte reações de descloração, hi-droxilação, d e s i d r o c l o r a ç ã o , epoxida ção da ligação C = C e

oxida-- b

Çao.

A seguir, d i s c u t i r-s e -á a i m p o r tân cia rel ativa destes caminhos para as famílias do aldrin e do DDT.

2.1. FamZlia do norborne.no

Inseticidas ciclodienos como aldrin, d i e l d r i n , y-clor dane, endrin, isodrin e heptaclor são su bstâncias q u i m i cam en te muito similares (ver Apêndice I), embora seus m et a b o l i s m o s e suas.

toxidades são muito diferentes. Estas substâncias de um modo ge ral prati cam e nte não. são transformadas biologicamente. Em micro organismos, somente apos tratamento intensivo com estes insetici.

das detectaram-se m e t a b o l ito s que realmente rep resen tav am produ- tos de decomposição.

o-D e si dr oc lo ra çã o o x idativa nos mamíferos e insetos dó fotodieldrin (resíduo terminal de aldrin, dieldrin e fotoaldrin) dã como produto dieldrin-cetona, que ê mais toxico que o

foto-5 '

dieldrin. (Esquema 7)

Reduções Catali sa d as com íons metálicos sobre pestici_ das ciclodienos faz com que h aja uma descloraçãõ seletiva, como

6:

e m o st r ad o no EAquzma 2.

As reações de d e scl o raç ã o dos pesticidas aldrin (I) , isodrin (II), d i e l d r i n (III) e endriri ( I V ) , catalisadas com- cia n o cobalamina (vitamina na p r es e n ç a de um agente redutor,

( N a B H ^ ) , causam m o n o d e s c l o r a ç ã o originando os produtos Ia, . I b , lia. Ilb, Illa, Illb, IVa e IVb respectivamente. Observa-se que em to

‘ - 6

dos os casos um dos cloros da p onte me tile n i c a e removido. E_s te resultado ê co ns is te nt e com um me can ismo de substituição nu cleofílica, pois sabe-se que os cloros vinílicos são póuco reãti^ vos, assim como os cloros da cabeça cie ponte., justificando por tanto a seletividade da descloração.

Reação do aldrin com N a B H ^ , era hexam eti lfosf oro tria n ú da produz o composto Ic alem dos isômeros Ia e Ib. 0 isômero Ic ê p ro d uzido pela saída de um dos cloros vinílicos. È importante realçar qué formação de Ic por mecanismos de eliminação redutiva, não tinha sido descrito, e c onsidera-se altamente surpreendente. Sua formação somente tinha sido detectada anteriormente como um

7

micr ob­ er. luz microb. Cl luz Fot o d i e i d r in - c e t o n a ESQUEMA 1

I : to H_{' R 2 :■ R 3 '}= Cl _{■ ' 11 : R 1} = R 2 = C l l a : % = H, R 2 ■ U! II _{C l l i a :} R 1 = H, R 2 ~ C l l b : R 2 = H, R 1 - R 3 ’ ci I l b : R 1 = C l , r2 = H Ic: R3 ” H , R r =. R 2 " C l III: R 1 = R 2 = Cl IV: R x = R 2 = Cl Ilia: ^ = H, R 2 = Cl IVa: R 1 = H, R 2 .= Cl Illb: R x = Cl, R 2 - H - IVb: R 1 = Cl, R 2 = H

I : kldhin III: V-i2.tdh.in.

II: lAodhin IV: Endhin

-lação aos da classe do aldrin,. porque eles podem ser facilmente identificados por mé t odo s sensíveis como por exemplo, a espectro fotometria U.V, ao p as so que os pesticidas tipo aldrin não pos suem grupos' cromõforos em suas estruturas (não apresentam duplas ligações c o n j u g a d a s ) n ã o sendo p ortanto sensíveis a este mêtodò. A identificação desta classe de pesticidas requer por tan to uma

instrumentação mais s o f i s t i c a d a como cromatografo gasoso (em ge ral com detector de c aptura eletrônica), aparelho de ressonância nuclear magnética, e esp e c t r ô m e t r o de massa. Al ém disso, os pro cessos de síntese dos. p es ti c i d a s da família do DDT são mais sim p lificados do qúe os do tipo aldrin.

Co m p e s t i c i d a s da família do DDT e do aldrin, as rea ções de descloração c o n s t i t u e m u m m ecan ism o de d esintoxicação muito importante nos m icr o organismos, plantas e mamíferos. Os ci^ cloedienos clorados como h é p t a c l o r e clordane também são desclo

.5 r a d o s .

2.2. FamZtia do VVT

Três caminhos são indicados para degradação do DDT Zn vivo: de s i d r o c l o r a ç ã o p r o d u z i n d o DDE, descloração redutiva que resulta na f or mação de DDD e hi d rox ilaçã o no C(2) pro duzin do d_i c o f o l .2

A seguir^ serão descritas algumas propriedades de de gradação do DDT e seus der i vad o s in vivo e i n y i t n o .

■ - *

DDT e seu m e t a b o l i t o DDE, foram concentrados em organismos huma- nos principal m ent e no tecido gorduroso. A mosca domestica p o £

8 ' tationa ativada que converte DDT para DDE.

• - i

Visto que homem, ratos e m acac os exc r e t a m DDA, s u p õ e ­ -se que exista uma via met a bó l i c a q u e m e t a b o l i z a DDT p a r a DDA, sem passar através do DDE como etapa intermediária. Esta suposi. ção foi p ro va da pela id en tificação dos produtos de d e g r a d a ç ã o do DDT em ratos.** Porém, um caminho de d egra dação em ratos de DDE

2

pára DDA via DDNU tem sido t ambém descrito. [Eiquzma 3)

0 maior pr oduto de degradaçã o de DDT em m i c r o o r g a n i s

--* ■ 9

mos, e s pe cialmente em condições anaerób icas é o DDD. 0 m e c a n i £ mo m e t a b ó l i c o de espécies de sangue quente que ocorre, ex clu s i v a mente, com sistemas enzimáticos de r a t o s , não êt ainda garantido, visto que o DDD não foi ide n tif i cad o q uando a análise foi r e a l i ­

zada imediatamente após a mort e dos animais; DDD aparece somente

. . i o

mais t a r d e .

0 DDT submetido a deu ter a ç ã o no c a r b o n o - 2 foi injeta do em ratos, dando como p ro dutos de degr ad a ç ã o DDE e DDD deute ra

do no m es m o átomo de carbono, ao invés de DDD não deuterado, d £ m o n s t r a n d o po rt an to que o DDE não ê um intermediário na produ ç ã o de DDD.

/

E x perimentos feitos sob condições não enzimáticas com DDT deram como p rodutos de trans f orm ação DDD e DDE. P o s s i v e l m e n ­ te, simples reações químicas redox, por exemplo com coenzimas re duzidas, porfir in as e proteínas contendo centros metálicos, são r esponsáveis pelos resultados observados. 11

A de c omp o siç ã o de DDT em águas, ocorre t ambém por ação redutora de microorganismos. E x per i ment os in v-Lt-io com complexos p orfirina-Fe (II), sugerem.a p o s s i bi lida de de serem

res da reaçao.

Um estudo das cinéticas de desid r o c l o r a ç ã o de vários 2 , 2-diarIl-c l or o eta n os com hid r óxi d o de sodio etanõlico foi fe_i

- . 13

to a varias temperaturas.

Os compostos estudados foram do tipo I

12

R — (( ) \ C|' X c —

onde X e Y p o d e m ser átomojs de h i d r ogê nio ou cloro. A reaçao e_s tudada p ara este composto ê m o s t r a d a em

(1)-; i i : \ / _

HO + H ---C --- C --- Cl --- ► H o0 + C = r— C + Cl m

I I 2 / \

Valores satisf at o rio s foram obtidos com a expressão da cons tante de v e l oc i d a d e de segunda o r d e m , p ara todos os compostos estudados. Em cada caso quase exatamente um mol de íon cloreto foi produzjl do por um mol do composto ha l oge n a d o apés um longo intervalo de tempo. A T a b e l a i apresenta os dados e resultados destes e x p e r i ­ mentos. A pa r ti r desta tabela, foram calculadas as energias e en tropias de ativação para a de s idr ocloração. Observ a-se que o DDT

^ 0

tem constantes especif.icas de ve l o c i d a d e (a 30 C) , 2,4 a 4,3 ve zes maior que DDD, e que DDD possui constantes e specíficas de velocidade maior que DDM. Isto indica que a ordem de r e a t i vi da d e para a de s i d r o c l o r a ç ã o com NaOH alcoolico ê DDT > DDD > DDM.

Esta ordem de reativ i dade ê devida ao aumento na ener gia de ativação de apr o xim a dam e nte 1,6 kcal/moi,para o DDD

compara-TABELA I: Conòtantzò dz ve.locida.dz z panamztnoò dz ativação da nzação dz dzàidnocZonação dz kidnÕxido dz AÕdio zm

a 92,6% dz ztanol aquoAo doò compo&t"o6 do tipo I (R=C£)

k . 10° 1/ s .m o 1 DDT 7110 DDD 1660 DDM 282 kcal/moi AH^ kcal/mol A S ^3 0o cal/moi.k° AG^ kcal/mol 18,3 17,7 -5,5 19,4 2 0 , 1 19,5 -2,3 20,2 2 0 , 2 19,6 -5,8 21,4

do ao D D T , sendo compensado par c ial m ent e por um d esc rêsci mo rta entropia de ativação m o l a r , enquanto que as energias de ativação do DDM e DDD são pratica me nte idênticas; e o decrésc imo n a reati^ vidade do DDM comparado com o DDD é devido totalmente ao decrês- cimo na entropia de ativaçao. (Ta.be.Za l)

'Os dados exp erimentais na reação de desi dro clora ção de DDT, DDD e DDM são consistentes com u m m e c a ni smo de e l i m i n a ­ ção bimolecular ÇE2D » (2) ,

. • ! ! V \ / .

OH + H — C — C — X -- ► C r r ^ C ' --- »■ C = C + X + H 90,

' I í I / V

,H : . (2)

H0~

como um processo concertado de um único estagio, envolvendo s i ­ multaneamente a perda de próton, formação da dupla ligação car- b o no-carbono e a saída dó íon haleto.

Foi descob e rto que cloreto de cromo (II) reage com DDT, resultando uma ext e nsi v a d esc l ora ção e rearranjo p ara produ

2

zir tr a n s-di cloroestilbeno (DCS) com cerca de 501. V a n o s outros produtos foram detectados alem do DCS e ã Figura 1 descreve um traço do cromatograma dos produtos.

1 DCS tem sido pr o duz i do também na redução do DDT u sa n

^ ^ 15 — 1 ®

do zinco em acido clorídrico ou ãcido acético.

3. QuZni.ica da v itam ina 6 j ^

3.7. Eòtrutura molcc u l a t e nomenclatura

A vitamina B-^2 e seus derivados são complexos organo metálicos contendo um átomo de cobalto no centro da molécula.

T e m p o de Re í en ç a o , m i n

F IG u R A 1: Cnomatogtiama doé ptiodutoò cntfie. V V T e. c n o m o ( J J ) , o b t i ­

do numa c o l u n a ( 2 mx 3 , 2mm) c m p a c o t a d a com 3% de. OV-1 7 cm 80- 1 00 mc ò k ckstom-W-AW-VMCS.

A importância da v ita m i n a B ^ . c i a n o c o b a l a m i n a , esta refletida na atenção extensiva que ela tem recebido de uma grande

varieda-17

*-de *-de disciplinas. Sua pe s qui s a no campo da m e d i c i n a tem sido relatada princip al me nt e pa r a a anemia perniciosa, uma doenç a se

18 •

ria resultante da d e f i c ie nc i a da vi t a m i n a 2 .

Bioquímicos têm estudado o mec ani smo da ação das enzi mas dependentes da v i t a m i n a B ^ 2 , a biossínte se da coenz ima análo ga e o papel da v i t a m i n a B-j 2 nas diferentes rotas

biossintêti-17 ^

cas. Tem-se demonstr a do que m e t i l c o b a l a m i n a reage com me rcú ri o ■ JLn vivo e in vitno formando m e t i l - m e r c ú r i o , uma espêçie química

^ 1 2

com propriedades t e r a t o g e n i c a s .

Ê interessante observar que a p r o d u ç ã o ' d e - m e t a n o pela metanobactêria, a qual ê dependente da v ita m i n a B ^ 2 » ê :f o r t e m e n ­

te inibida por DDT e DDD.

A Vigufia 2 m o s t r a a estrutura da vita m i n a B ^ 2 cujas características principa i s são o íon central de cobalto(III) l i­ gado por quatro átomos de nitr'ogênio dos grupos p irr olico s de um anel corrínico macrocíçlico. 0 anel corrínico assemelha -se apa rentemente ao anel porfi r í n i c o , mas não sendo totalmente c o n j u g a ­ do, ê portanto muito d i ferente quimica ment e da porfirina. 0 anel corrínico não ê planar; entretanto, as varias analises por rai os-X mostrara m que as conformações atuais do anel depende muito da natureza dos grupos funcionais ligados na sua periferia. Por causa da ausência de conjugação, o anel corrínico ê muit o f l e x í ­ vel e as mudanças confor m aci o nai s podem, portanto ocorrer muito

1 9 „

facilmente. Al em dos quatro ligandos pirrolicos, e xiste m nos derivados da B, -> mais dois ligandos axiais. Os- vários derivados

CO N H

C Q N H

GONH2 5

CH

CONH

ÇO

h

N H 2

| V

H3

£ H 3 CH 2

C H ,

'

H O m 2 C ' '

O

' h

da B^ 2 r e s u l t a m das trocas nos ligandos axiais u nidos ao cobalto. Em g e r a l , todas as mo l éc ul as exibindo o anel cor rínico são refe- ridas como corrinoides. 0 ligando axial oc upando a 5- p os i ç ã o de c o o r d en aç ão na Figura 2 ê um a - 5 ,6 - d i m e t i l - b e n z i m i d a z ò l . Q u a n do este grupo e stiver pr e sente na estrutura, as mo léc u l a s são ut sualmente r e f e r i d a s como cobalaminas. Assim, se R = C N ~ , a m o l é c u ­ la é cianocobalamina. é também p r o p r i a m e n t e chamada de v i t a m i n a B ^2 ‘ Outras co b ala m ina s comuns são m e t i l c o b a l a m i n a ( R ^ C H ^ ) , aquo cobalamina (R-I^O) , h i d r o x o c o b a l a m i n a (R=OH ) e 5' -deoxiadenosi_l cobalamina (R=5’- d e o x i a d e n o s i n a) (Figura 3 ). Por m e i o de hidrólise, o b e n z i m i d a z o l pode ser eliminado, para dar uma classe de de ri v a dos chamados d e cobinamidas. Nestas, uma m o l é c u l a de água ocupa o lugar do b enzimidazol. Tal como as cobalaminas, o nome de u m derivado da c o b i n a m i d a depende da n a t u r e z a do ligando axial s u p £ ridr, por exemplo, m et il cobinamida, aquocobinamida. Em alguns ca sos outros ligandos (usualmente cianeto) ocup am a 5- p o s i ç ã o de coordenação (axial inferior). Neste caso, a m o l é c u l a serã c h a m a ­ da de d i c i a n ò c o b i n a m i d a ou á q u o c i a n o c o b i n a m i d a quando R= CN ou

1 9 '

H2O, r e sp ectivamente.

A s e g u i r , serã d esc r ita um a breve c ompar açã o entre os anéis corrínicos e p o r f i r í n i c o s .

Os anéis corrínicos são saturados exceto nos ãtomos

•»

de n i t r og ê n i o e ãtomos de carbono m a i s próximos, e além disso a conjugação não é totalmente cíclica de vido a au sência de uma das pontes m e t i l ê n i c a s . 0 s i s t e m a de densida des de carga no anel cor

v - 2 0 ^

r m i c o e m o s t r a d o na Fi.gura 4. Os ligandos po r f i r í n i c o s são sistemas m a c r o c í c l i C o s tetrap irr ó lico s com ligações duplas (Figu ra 5a) e vã r i o s grupos ligados ào perímetro.

FIGURA 3 Eitn.atun.0. abfizvZada da co&nz-Lma B ^ ^ Ma. ^guA.a o nz-

tângulo n.zpn.zbznta. o an&t c.ofinZnÁ.c.0 , z a {Zzc-ha. tizptiz

âznta o gsiupo bznzZmÃdazoZ doon.dzvia.do

FIGURA 4: S-í-òtzma do anal c.on.tilni.c.0 , com ciò dzn&À.dadzt> de. casiga

As p orfirinas podem aceitar dois íons hi drogê nio para formar dia cido+2 ou doar dois prótons e tornar-se ânion-2. N esta ul t i m a

A»

forma, ê que as porfir in as c o mplexam com íons metálicos, u s u a l ­ mente dipositivos, para formar complexos m e t a l o p o r f i r í n i c o . 0 ta manho do buraco no centro do anel po r f i r í n i c o ê ideal para acomo dar m etais da pr im ei ra serie de transição. 0 sistema p o r f i rí ni c o ê razoave lme nt e rígido. Um grupo de compostos correlaci ona dos, a s

2 0

ftalocianinas (Flgafia. 5b), são isoeletronicos com as porfirinas. 0 buAaco no anel ftalocianínico ê cerca de 0,1 A° me

* “

nor que os porfirí n ico s devido ao m enor tamanho do átomo de ni^ trogênio formando ponte, comparado com o carbono. As m e t a l o p o r f r rinas são compostos bi ol o g i c a m e n t e importantes, cujas funções po dem variar pela troca do metal, seus estados de oxidação ou a na tureza dos substituintes orgânicos na est rut ura porfirínica.

Uma interessante m e t a l o p o r f i r i n a ê a clorofila, (FXgu tia. 5c) presente nas plantas verdes, um complexo de magnésio con tendo um sistema de anel porfirínico, na qual a dupla ligação num dos anêis pirrólicos tem sido reduzida. Um anel fundido de

20

ciclop en tano n a também esta presente.

Finalmente, a v i t a m i n a B-^ é um complexo cobalto cor relacionado ;de estrutura um p o uco diferente. A m o l é c u l a ê c o n s ­ truída ao redor de um anel corrínico (um anel porfi rín ico m o d i ­ ficado) contendo um átomo de c o b a l t o ( I I I ) . É interessante notar que embora porfirinas de cobalto análogas i B^ 2 tem sido sinteti^ sadas, elas não po d em ser reduzidas para cobalto(I) em meio aquo s o .

(a) (b)

(c)

FIGURA 5: FÕsimu.la.6 <Lt>£Ku.tu.KOi<Lî> p&anaò doò co m p o ò t o ü ( а ) PoA^-ína

(б) Ftaloc-ian-ina (c) Cl oKo&ila

3.2. Eòtadoò dz oxidação da 8 j2

Ci an o cob a lam i na ou qualquer das al qui lcobalaminas con têm formalmente cobalto no estado de oxid ação +3. Estas cobalamji nas são d i a m a g n ê t i c a s . As espécies c o b a l t o ( I I I ) , usualmen te uma ciáno o u 'a q ú o c o b a l a m i n a , pode ser re duzi da em etapas de um elê tron para uma espécie cobalto(II) C^i2r^ e entao P ara espécies cobalto(I) CB1 2 s )* (3)

h 2o

^ c ó ^ i r e l . Co^II --- ® Z - ^ C o ^ ' (3)

^ l \ / l \ / \

B 12a B 12r B 12s

Esta redução pode ser ac o m p a n h a d a por vários agentes redutores como bor i dre t o de sódio, íon cromo (pH 5), zinco em ã- cido acético, ãcido ascorbico, etc...

Um m ét od o m u i t o conven ien te p a r a pr od u z i r B-^j. é a fotolise anaerõbica de alquilcobalaminas. B 12r ’ uma espécie mar

-• 7

rom de c o b a l t o ( I I ) , é um complexo d de bai xo spin. Como tal,con têm um e l étron não empare l had o e ê o único d erivado da pára- magnêtico. 0 elétron não emparelhado reside no orbital 3.d 2. Ná m a i o r i a das condições, a ê um complexo de coordenação 5. 0

composto pode ser muito facilmente oxidado retornando â aq uocoba lamina pelo oxigênio atmosférico e po rt a n t o devè ser armazenado a n a e r o b i c a m e n t e . Tem sido descrito que B ^2r em solução é capaz

^ 19

de sofrer dismuta ça o para e &i2a'

A seguir, ê mo strado na FiguAa 6 um diagrama esquemati. co de orbital molec ul ar descrev e ndo . os efeitos dos ligandos axi^

FIGURA 6: V Í agfiama de orbital molzculan. e oi nlve.ii o.lttfidnic. 0 0

„ ^ 21 ais nos m v e i s eletronicos.

- g

® 1 2 s ’ ® um comP l exo verc^e “ acinzentado d de baixo spin; É diamag nê ti co e ê um n u cíe o fil o extrema men te forte (nucleo

' - 3

filo mais forte que existe em solução aquosa). Vi ta m i n a B ^ s e um intermediário m u ito importante na síntese de derivados alqui.1 cobalaminas. Por exemplo, a síntese da m e t i l c o b a l a m i n a gera pri^ meiro B ^ g cjue reagirá rapidame n te com iodeto de me t i l a para o b ­

ter o produto desejado. A m a i o r i a dos alquilas primários dão co balaminas estáveis. A estabilidade da alq u i l c o b a l a m i n a ê g e r a l ­ mente inversamente relaci on a d a ao volume do ligando alquila.

Grupos ligeiramente vol u mosos como sec-butil r eagirão

— — — 19 -*

com o nucíeofilo, mas nao formam produtos estáveis. As e sp £ cies reduzidas Co(I) têm índice de c oord enaçã o 4 em solução. Em soluções aquosas neutras o ligando b e n z i m i d a z o l não está c o o r d e ­ nado, mas pode ser trocadopor uma m o l é c u l a de solvente fracamente ligada. Tem-se descrito r ecentemente que a redução de hidroxoc o - balamina em ácido acético glacial dá u m p rod uto que ê largamente protonado ao qual se ê referido como h i d r e t o c o b a l a m i n a , que rea ge com olefinas não ativadas como etileno para dar etilcobála mi

-1 9 ,

na. (4)

H

Co I H = = r rt, Co' (4)

/ \ ' / | \

3.3. Qu.Zmi.ccL da ligação cobalto-carbono

3.3.7. Reaçõe-ò nuclco^Zlicaò com (I ) e pon. tiadicaib livfic-ò [Coll) Vi ta m i n a B ^2S está em equ ilíb rio com a' vi ta m i n a B ^ r e hidrogênio molecular. Nas soluções alcalinas, a forma p r e d o m i ­

nante da v i t a m i n a B ^2S é a espécie Co(I) de spin emparelha do na qual o átomo de cobalto tem a pr o prie dad e de um forte nucleõfilo.

.(V

A concen traçã o do ácido instável (H-Co) ê muito p equena em solu ções alcalinas ou em soluções á c i d a s . (5)

H

I - H ?° I II

(Co ) Co (Co11 ) + 0,

5H-0 H “ CS).

M uitos agentes alquilantes convencionais r eagem com v i tamina para pr od u z i r derivados o r g a n o c o b a l t o . Estas r e a ­ ções po d em ser formuladas como proce ssos de deslocamè nto

nucleo-3

fílico e seu caráter S.^2 tem sido r i g o r os ame nte estabelecido. (6)

(Co1) + R - X X t Ri Co R (Co) + X" (6)

E m reações de espécies Co(II), uma a l t e rna tiva m e c a ní stica fora alquilação, seria um p r o c e s s o de d e s a l og enaçã o e n ­ v o l vendo radicais livres seguido da reação do radical orgânico, com excesso de Co II. (7)

(Co11) + R (Co11) + R. rápida — — * Co — X + R R (Co) (7)

A seguir e st ud ar -se - á a f otoq uím ica de alquilcobalanvi nas. Embora os alquil corrinõides são surp ree ndent eme nte estáveis numa va r iada vi zi nh a n ç a química tais como ácido ou base diluída, a ligação cob al to - car b ono ê ro mpida muito facilmente pela luz visível. A naturez a dos produtos formadòs depende das condições sob as quais a fotõlise é realizada. Quando uma solução aquosa

de m e t i l c o b a l a m i n a S fotoli s ada na pr es e n ç a de oxigênio, os pro

d u t o s s ã o a q u o c o b a l a m i n a e f o r m a l d e í d o . Porém, fotólise anaerSbi

ca dá B , 2 r , m etano e etano, (8), sendo este u m mé t o d o mu i t o con 2 2 v e ni e n t e para gerar B-^r P u r a * 0 II CH, x i / Co

\

3 í 3.2. Rzaç-ozò com tn.anò izAÍncZa. de. alquilai

A ligação a lqu i l-c o bal t o pode ser também q uebrada e transferida para outras espécies químicas. A transf erê ncia de m £ tila da m e t i l c o b a l o x i m a para a v i t a m i n a tem sido descrita. Tem-se m ostr ado que nâ p r e s e n ç a de H g (II), ^ P d C l ^ e P t ( I V ) , ajL quil de cobalto corrinõides s ofrem re ações de d e a l q u i l a ç ã o , nas quais o ataque e l e t r o fí li co do me t al r e s u l t a na remoção do grupo

- * ■ 1 9

alquila xomo u m carbanio. (9)

R H ?0

\ l / , 2 + . \ | /

Co + H , 0 t Kg 1 --- ► RHg + Co . (9)

/ | \

' / | X

3.4. EquiíZbKio químico

Em soluções neutras, a m a i o r i a das cobalaminas tem o ligando 5,6-dimet i lbe n zim i daz o l coordenado na 5- posição ao c o ­ balto. Ò N-3 do b enzimidazol pode ser p rot onado causando o rómpi mento da cadeia n u c l e o t í d i c a com o metal. Quanto isto acontece,

uma m ol é cula de agua troca o grupo b e n z i m i d a z o l . (10) h3° Co (10) H 2? H N

O pKa para este equilíbrio de proto naç ão d epende prin cipalmente da n at ur ez a do ligando que ocupa a 6- posição de coor

19 denação (axial superior) num típico res ult ado do efeito t r a n s .

{Tabela II)

TABELA II: pKa pana ama dz aZqu.Ã.Z.cobalaminaA

Grupo alquila CH, n-C^Hg n - C 7H 15 5'-deoxiadenosil HOOCCH., pKa 2,7 3,93 4,01 3,52 1,50

3.5. EàpeciAoó dz abòofição de. c.obatami.naA

A seguir, serão apresentados os espectros de abs orção das espécies ®i2à* ®12r e ® 1 2s na fZgutLa e os espectros da M e - B ^ e M e - B ^ p r oto n a d a n a F>cgu.tia.8.

3.6. Funçõeò bi.oquZmZca.-0 da.

Finalmente dar-s e-ã u m a breve introdução da p a r t i c i p a ção da vita m i n a B ^ em sistemas biolõgicos.

Geralmente, as enzimas de pende nte s da B ^ são c l a s s i ­ ficadas em duas difere nte s categorias: (1) aquelas usando coenzi^ m a B^ 2 (5'-de ox ia de no silcobalamina) comò o cofator e (2) aquelas u sa n d o m e t i l c o b a l a m i n a como cofator. As enzimas usa ndo coenzima como cofator, conduz à uma r eação c atalí tic a que envolve a tran_s ferência de um átomo de hidrogênio. Portanto, estas enzimas são as vezes, chamadas de enzimas de transfe renci as de hidrogênio. (11)

X H H X ’

l i l i

— --- ► - S r - Çb— M

Aqui um átomo de h idr o gên io é removido do carbono-b de uma mo lé cu la substrato, e o grupo X e transferi do do carbono-a para o carbono-b. 0 átomo d e - h idr o gên io r e t o r n a n d o p ara a mol.êcu la substrato não ê n e c e s s a ria m ent e o m e s m o átomo que foi origina riamente removido. Al g uma s destas enzimas são a glutâmate mutase,

1 9

m et i l m a l o n i l - C o A isomerase, e d i o l d e s i d r a s e .

A segunda c ate goria das enzimas depend ent es da B ^ que usa m e t i l c o b a l a m i n a como cofator, está en volvi da no m e t a b o l i s m o

A b s o rb d n c ia

F IG U R A 7 : Eópect-io de, a b 6 o tição : { ...) h Z d f i o x o c o b a t a m Z n a ;

12>i' •) B 126

tas reações são descritas a seguir.

3.6.1. da me.t4.oni.na

M e t i o n i n a ê um dos aminoãci dos importantes. A etapa terminal na b ios s ínt e se da m e t i o n i n a envolve a m e t i l a ç ã o do á t o ­ mo de enxofre da h o m o c i s t e í n a . 19 (12) NH + N H 3 + I ' j C H 3B 12 + H S C H 2C H 2CHG00- ---- *• B 12 r e duz i d a + H + + CH3SCH2CH2CHCOO h o m o c i s t e í n a m e t i o n i n a

(

)

E xi st em muitas bact érias anaerõ bicas que geram m e t a n o como um produto final de seu m e t a b o l i s m o (Metanobacillus ome- l i a n s k i i , m e t a n o s o r e i n a b á r k e r i ) . Uma das etapas terminais na produção do m etano ê m o s t r a d a a seguir. (13)

C H 3B 12 + JL_ H 2 --- A "TP > B i~2r ■*' C H 4 (13) ‘

3.6.3. SZntete do acetato

Um número de m i cro o r g a n i s m o s p roduz uma grande quanti/ dade de acetado. Alguns dest.es acetatos são sintetisados à\ par t i r d o dioxido de carbono. Enzimas d e p e n dent es da B ^ 2 (Cl ost r i ­ dium termoaçeticum) estão envolvidas nas etapas terminais da sín

19

tese do acetado a partir do C 0 2 . (14") C H 3

B I CO

CAPÍTULO II - MATERIAIS E MÍTOVOS

\

1. Equipamento-ò

Os espectros UV - VIS das substânc ias pa drão e dos p rodutos de reações foram obtidos u s a n d o u m e s p e c t r o f otô metro Va rian 634-UV - VIS, equipado com u m r e g i str ador p o t e n c i o m ê t r i c o ECB (Equipamentos Científicos dò Brasil) - mo d e l o RB 101 ou u m e s p ec t r ofotômetro Hitachi - Perkin - El mer 139 - UV - VIS, na temperatura ambiente.

D et e rmi n açã o dos pontos de fusão, foi feita num a p a ­ relho da Metler, m o d e l o FP-52 equipado com um mi c r o s c ó p i o Zeiss- Jena, m odelo NU. Os pontos de fusão não f oram corrigidos.

C ro m a t o g r a f i a g a sosa foi r e a l i z a d a num aparelhoVarian m odelo 2440-D, equipado com u m re g is trad or p ote nc i o m ê t r i c o mode

lo 261 M M - Linear Instrument Corp. Irving, Cali fór nia - USAiequi_ pado com um detetor de ionização de chamas (DIC) e uma coluna (2 m x 3,2 mm) e mpa c ota d a com 3% de OV-17 em 80-100 m e s h C h r o m W - A W - DMCS.

C r o m a t o g r a f i a em camada de l g a d a foi real izada u san d o o equipamento da De saga - Heidelberg, com placas d.e 20 x 20 cm e 20 x 5 cm. Foi u t i l i z a d a uma. lâmpada de luz mineral UV - SL - 25, com onda curta e onda longa para v isu al i z a r os componentes não coioridos sobre as placas.

2 . Mate.n.iaÁ.6

u t i lizada conforme r e c e b i d a . ^ V i t a m i n a foi pr eparada a p a r ­ tir da h i d r o x o c o b a l a m i n a por m e i o de uma redução com b o r i d ret o de sodio, em ambiente nitrogenado. Vit am i n a B^j. foi p r e p arad a a partir da m e t i l c o b a l a m i n a por m e io de fotólise u til izand o-s e de uma lâmpada de 300 watts.

M e t i l c o b a l a m i n a foi p rep a r a d a por redução da h i d r o x o ­ cobalamina através de b o r i d r e t o de sodio, seguida pór adição oxó^

2 3

dativa de iodeto de metila. Soluções de hid r o x o c o b a l a m i n a (500 mg em 20 ml de I^O) e NaBH^ (400 mg em 5 ml de I^O) foram p u r g a ­ das por 30 m in ut os s e p a r a d a m e n t e por n itr ogêni o purif ica do e m re cipientes fechados.

A seguir as duas soluções foram misturadas, reagind o até que a redução deu como p r oduto a B ^ g de cor verde escuro (15 minutos). 0 re c e p i e n t e da reação foi então coberto com a fo lha de alumínio pa ra excluir a luz. Iodeto de me t i l a (3 ml) foi a dicionado ã solução e a r eação seguiu por 30 minutos.. 0 n i t r o g £ nio continuou p ur g a n d o durante o tempo de reação. Todas as opera ções de pu ri fi ca çã o f o r a m conduzidas no escuro. A mi s t u r a de rea ção foi extraída num funil de separação com 60 ml de solução a- quosa de fenol a 901 p/p. A m e t i l c o b a l a m i n a foi separada na fase fenolica. A fase a quosa foi des p rez ada e a camada fenõliça foi lavada duas vezes com 25 ml de H2G. A seguir, adicinou-se a ca. mada fenolica 200 ml de m i s t u r a éter/acet ona (4:1).

A solução or gâ ni ca foi extraída três .vezes com 35 ml de H^Q. Toda a m e t i l c o b a l a m i n a foi removida para a fase aquosa, sendo esta lavada duas vezes cada com 50 ml de éter etílico, Às camadas etéreas foram desprezadas. 0 volume d.a solução aquosa d c

me t i lc o b a l a m i n a foi reduzi do a poucos mili li t r o s nu m evaporador rotatório â temperatura menor qüe 35°.Ç. A solução da m e t i l c o b a l a ­ mina' foi purific a da , pa ss an d o - a através da coluna OH - DEAE - C e lulose. 0 elüente foi concen t rad o no evaporador rotatório

(t 0 < 35°C) e adicionou-se acetona gota a gota atê aparecer tur bidez, sendo que os cristais foram formados na solução r efr ige r a da durante uma noite. 0 sobrenadante foi decantado, e os c r i s ­ tais vermelhos foram recolhidos. A m e t i l c o b a l a m i n a pr epa rada foi

secada numa n istola A b d e r H ald e n com s í l i c a ^ g e l , dando um r e n d ^ mento superior a 90%. A pureza da m e t i l c o b a l a m i n a foi observada por espectrofotometria, o bse rvando-se a ausência do pico da B-j^a com X - _{m a x .} igual a 350 nm

Os compostos aldrin, d i e l d r i n e y-clordane eram p a ­ drões cromatograficos e foram uti l izad os conforme recebidos da Chem Service (West C h e s t e r , P a , U S A ) .

Os compostos DDT, DDD, DDE e DDA, foram utiliz ado s con forme recebidos da A l d r i c h Chemical Company, Inc., M i l w a u k e e Wis 53233, USA) e suas purezas foram c onsideradas satisfatórias por cromatografia em fase ga sosa e cromatografi.a em camada delgada.

Os compostos DDMU, DDNU, DDD, DDM, DDOH e DCS foram sintetisados conforme descrito pr e v i a m e n t e e nao serao d i s c u ­ tidos por extenso.

0 Eòquzma 4 descreve as sínteses de DDMU, DDNU, DDO, DDOH e DCS?. DDMU, DDNÜ e DCS foram preparados por desidroclóração de DDD, DDM e DDMF respectivamente. DDO foi pr epara do por hidro genação catalítica de DDMU. Redução de DDA cóm hi'dreto de aluiní^ nio e lítio em dietil eter resultou na formação do DDOH.

*H

DDMÜ

DDA

1

4

DDOH

DDMF

DCS

No Eòquima. 5 esta descrito o método da síntese do DDM. Reação com clorobenzeno com cloreto de cl oroacetila na presença, de AlCl^ resultou na formação de a - 4 - d i c l o r o a e e t o f e n o n a . T r a t a ­ m ento desta com isopropõxido de alumínio, seguido de reação do produto seco.com clorob en ze no na presen ça de ^ S O ^ deu como re sultado a formação de DDM.

Sílica-gel G F2^^, . usado na cro matografia em cama da de 1^ gada foi comprada da M é r c k § Co. Os solventes utiliza dos foram de grau p ro-anãlise (P.A.) e foram obtidos da M erc k e dà Reagen. Todos os demais reagentes u t ili z ados foram do m elhor gráu de pu réza disponível. < 0 Ci C!-C H 2-C0C! ---^ HC Cl H2 S O4 Ç -C H 2 CI 0 (iso-propl^A^ : o > - c i .+ c í-<o / - ?h -c h2ci OH ESQUEMA 5

3. lÁetodoò

3 . 1 . Cx.omcLtoQn.ahia. em camada delgada

As placas para a CCD foram p rep arada s segundo o méto 25

do recomen da do por Stahl em placas de 20.x 20 cm e 20 x 5 cm. Foi usado como suporte sólido sílica-gel (Merck). Para a e spessura de 0,30 m m usou-se a p r op or ção de 1:2 de s ílica-ãgua

(40 g de sílica-gel em 80 ml de í^O) . Após v i g o r o s a agitação e espalhamento sobre as placas , est a s foram ativadas à 110°C numa estufa por 30 minutos. As amostras d issolvidas em solventes vola teis foram introduzidas no suporte sólido usando tubos capilares. 0 eluente ut il i z a d o foi éter de petróleo, fração 30 - 60°C, da Reagen. As placas com as amostras e p adrões adsorvidos eram i n ­ t r o d u z i d a s numa câmera cromatogrãfica, onde tinha início a elui-

ção. Quando o solvente atingia certa altura, a co rrida era in terrómpida, com a m a r c a ç ã o da frente do solvente. Com o auxílio da lâmpada UV éram m ar c a d a s as áreas das manchas dos componentes e padrões. Então, eram calculados os Rf, ou seja, a razão entre a altura do compone nt e e a altura d a frente do solvente.

3.2. CKomatoQfia^ia em faa&e ga&oòa

A c oluna (2 m x 3,2 mm) em pac o t a d a com 31 de OV-17 em 80-100 m e s h Chrom - W - A W - DMCS, foi c o n d i c ion ada por 3 dias a 225°C com u m fluxo mo de r a d o de nitrogênio. As condições de õpe ração c r o m a to gr ãfi c a foram ás seguintes: temperatura da- coluna 190°C, bloco de injeção 215°C e d e tetor 200°C; fluxo de nitrogê nio 40 ml/min, at en uação em 1, é s en si bili dad e 10- ^ . 26

ram preparadas em ciclohexano (Merck, p.a.)* For am medid os os res pectivos tempos de retenção. Sob as condições descritas, a efjL

^ ^ 2 7 / D \ 2

ciência da coluna foi c a lculada pela formula n = j . 16 , onde n ê o número de pratos teóricos, D a di stâ ncia de r etenção

(distância:..em centímetros do pico mãx imo atê o início da injeção), e L o comprimento do pico, dando como resultado 2150 pratos teõ ricos em relação ao DDT.

Retenções relativas, definido- como a razão entre as distâncias ou tempos de ret enção de vãrios componentes e a d i s ­ tância ou tempo de retenção, de um d e t e r min ado componente, foram tomadas segundo o pa d rão DDD. Portanto, o é igual a u n i d a ­ de, ou seja, nn = D PDD = tDDD = q

-DDD DDDr) tDDE)

3.3. VoòaQzm de, c.JLone.to&

Foram u sados dois métodos, u m g r a v i metr ico e u m volu métricp. No m e t o d o g r a v i m e t r i c o u m det e r m i n a d o volume de solução aquosa (amostra) contendo cloretos foi tratado com algumas gotas de HNOg concen tr ad o e u m volume adequado de Ag NO^ 0 , 1 N (precipi_ t a n t e ) . A mi s t u r a foi aq uecida durante 1 0 minutos, para ajudar a coagulação do pre c i p i t a d o de cloreto de prata. Decantou-se, lo go após filtrou-se e o p r e c i p i t a d o foi lavado com HNO^ diluído. A seguir foi levado a estufa a 110°C, por 2 horas. Toda a opera ção anterior foi r eal i zad a na penumbra, devido à d e c o m p o s i ç ã o do AgCl pela luz. Após esse tempo n e c e s s á r i o para o p r e c i p i t a d o ser levado a peso constante, foi ca l culado o peso de cloreto ex isten te na amostra, segundo a relação:

peso cloreto = peso a m ostra x á t o m o -gr ama Cl . mo l e c u l a - g r a m a AgCl

0 m é t o d o gr avimétrico é pouco pre c iso no caso onde as quantida- des são de ordem de m i l i g r a m a s , tendo u m erro de ap roxim ada men t e 101 neste caso.

Um volume total da amostra contendo cloretos foi medi^ do. O pH da solução foi corrigido para 7. Alí qu o t a s desta s o l u ­ ção (geralmente 3 alíquotas de 20 ml) foram tituladas com s o l u ­ ção de AgNOj 0,1 N, usando como indicador 1 ml de I^CrO^ a 5%. O p onto final da titulação foi aco m pan hado áo de u m bsianco (CaCO^ em água desti l ada e l^CrO^ a 51), dado a cor c a r a c t e r í s t i c a ver melho tijolo. Os volumes gastos de AgNO^ 0,1 N foram medidos, e o v a l o r médio destes volumes foi usado no c álculo na q uan tid a d e de cloretos (mg) existente na am ostra total, segundo a seguinte r e l a ç ã o :

peso Cl = vA g N o 3 • NA g N 0 3 x 3 5 ’5 (15) No m é t od o vo l u m é t r i c o o erro foi de a p r o x i madam ent e 31.

4. E^quzma dz Azaç.ão.

4.1. Sí& t m a . dz pu.hi{tic.açÕLO dz nitAogznZô z dz tiza.q.ÕLO

Como todas as reações dos pesticidas clorados da fam_í lia do norborneno ou da família do DDT com a v i t a m i n a B - ^ s ’ n e c e s s i ­ tavam ser realizadas em ambientes nitrogenados, p r o c u r ou-se u t i ­ lizar de um sistema de p u r i f ica ç ão de gás nitrogênio, como foi

, . . Zk

4.2. Uzaçõzò de. p&òticidaÁ alosiado4 da família doò non.bosine.no4 tom vitamina B j .

Foram feitas v árias reações de pesticid as como aldrin, dieldrin, e y-clor dan e com a vi t a m i n a B ^ 2 s , nas mesmas condições de quantidades de reagentes e de. p r o c e d i m e n t o s . Em v i s t a d i s t o , será descr it o a seguir em detalhes todo o esquema da reação da. v it a m i n a B ^ 2s cpm pestic ida s da f a mília dos norbornenos.

Soluções de h idr o xoc o b a lamina (40 mg de B ^ 2a em 10 m l de l^Oje pe s ti ci da (100 mg de p e s t i ci da em 50 ml de m e t a n o l , a p r o x ima d a m e nt e 9 vezes de excesso de p esticida) fo ram se par ada m e n te purgadas com n i tro g ê n i o pu r ifi c a d o em récep ien tes fechados por 30 minutos. A seguir adiciono ü -sè NaBH^ em excesso a solução da v it a m i n a B ^ 2 a , deixan do -s e reagir até que a c olo ração ficou ver de escuro,ou seja, formação da B ^ 2g por redução. 0 reci pie nte foi então coberto com folha de alu mínio p a r a excluir toda a luz. So lução de p es t i c i d a foi a di cio n a d a a solução da d eix ando- se reagir por 30 minutos. 0 n i t r o g ê n i o con tinuou p u r g a n d o d urante todo o processo.

A m i s t u r a da reação foi ex tr a í d a n u m funil de separa ção com éter etílico ( R e a g e n ) . A solução da v i t a m i n a ficou s e p a ­ rada na fase aquosa juntamente com os cloretos liberados na rea ção, enquanto que a fração orgânica ficou na fase etérea. A solu. ção contendo vi ta m i n a e cloretos, foi então e xtraída com fenol a 901, tal como fói d es c r i t o p r e v i a m e nte na síntese da m e t i l c o b a l a

2 3

m m a .

Finalmente, a solução aquosa de v i t a m i n a foi sumétida a análise por e s p e c t r o f otometria UV - VIS, enquanto que a solução.

aquosa contendo cloretos, foi submetida a dosa gem de cloretos por gravimetria e titulação (método de M o h r ) .

4.3. Reação do VVT com vitamina B ? ^

Soluções de DDT (100 mg de DDT em 60 ml de metanol) e h i d r o x o cobal am ina (Merck) (50 mg de B ^ a em 6 ml de ^ 0 ) foram pur gadas com Nt 2 sep a rad a men t e por 30 minutos. Logo após foi a d i c i o ­ nado na solução da B ^2a 100 mg de bor id r e t o de s ó d i o , seguindo-se a redução em ambiente n it ro g ena d o atê formar a B 12s m i n u t o s ) .

M i s t u r o u - s e então, as soluções de DDT 6 B 12 s ’ deixan do-se reagir por 1 hora. A seguir, a m i s t u r a da reação foi . e x ­ traída com clorofórmio, sendo empregado volumes pequenos de cio rofõrmio e agua. Sucessivas extrações (volume pequeno) foram fei_ tas, sendo que a v i t a m i n a e componentes inorgânicos fic ara m na fase aquosa, enquanto que todos os derivados do DDT fi caram na fase orgânica. A solução clorofõ r mic a foi então evaporada atê a secura. A fração or gânica foi então a n a l isada p o r cro m a t o g r a f i a gasosa (ver seção 3.1) e por c r o m a t o g r a f i a em camada delg ada (ver seção 3.2).

A seguir f or am realizadas reações em bsianco entre DDT e N a B H ^ , sem a p r e s e n ç a da v i t a m i n a B-j^s* Soluções de DDT (100 mg em 40 ml de MeOH) e b o r i d r e t o de sódio (250 mg em 5 ml de I^O) foram purgadas com ni t rog ê n i o por 15 minutos. A seguir m i s t u r o u -se as soluções. Após 30 min u t o s de reação, a m is t u r a foi extraí^ da com clorofórmio. A solução aquosa foi submetida â d o s a g e m de cloretos ( M o h r ) , en quanto que a solução clorofõ rmica foi submetjl da â cromatogra f ia em camada delgada.

4.4. Reaçõe-ò de pe.Atie.Á.da& cloAadoò da c.la&&z do VVT ç.om vítami

9

na 8 7 2*.

Va ri as reações de cada p e s t i c i d a .como DDT, DDD, DDM, DDE e DDMU foram feitas; mol a mol com a v i t a m i n a B, ~ , nas _12r mes_— mas condições de procedimentos. Portanto, será.des cri to à seguir, u m esquema geral das reações destes p e s t ic idas com a v i t a m i n a B i2r> tomando como exemplo a reação do DDT.

0 gás ni t rog ê nio p u r i f i c a d o conforme de scrito pr e v i a m e nt e ê introduzido num sistema da reação constituído de u m b a ­

lão de uma boca onde foram colocadas soluções de m e t i l c o b a l a m i n a (200 mg de M é - B ^ era 25 ml de e de DDT (52%7 mg de DDT em 90 ml de M e O H ) .

O ambiente da reação foi pu r g a d o com ni t r o g ê n i o por 30 minutos na ausência de luz; após este tempo fechou-se o siste

ma para impedir a entrada de oxigênio. Logo após, ainda na ausên cia de oxigênio, foi feita a fotõlise da m e t i l c o b a l a m i n a com uma lâmpada de 300 watts, a fim de gerar, a v i t a m i n a B-j^r’ P ara ^nA ciar a reação com o DDT no m e smo sistema de reação. Apos 2 dias em p r e s en ça de luz, a m ist u ra da reação foi extraída com cloro formio. A solução aquosa da v i t a m i n a foi extraída com fenol como foi p r e v i a ment e descrito, sendo do s eada p ara análise de cloretos, enquanto que a camada clorofõrmica com os produtos derivados do DDT foi submet id a â evaporação ate a secura num e vaporador r o t a ­ tório.

Uma parte da fração org ânica foi separada por cromato grafia pr e p a r a t i v a em camada de l gada e analisada em UV, cromato grafia em camada delgada e •cro m ato g rafi a em fase gasosa.

A outra parte da fração or gâ n i c a foi subme tid a a rea ção com KOH alcoólico 3 N. A seguir foi feita extração com cloro fórmio, sendo que a fração org ânica foi analisada por cro mat o g r a fia em camada delgada e por c r o m a t o g r a f i a em fase gasosa. Em con dições similares, fotólise do DDT não d e u nenh u m a formação de produtos.

A fim de seguir e s p e c t r o f o t o m e t r i c a m e n t e o p e r c u r s o da reação, pr ep ar ou -s e 1 0 ml de solução contendo m e t i l c o b a l a m i n a de concentração 10 ^ M e DDT de c o n c e n t r a ç ã o 10 ^ M (0,0013 g de Me-Biz e m 2 ml de e 0,0035 g de DDT em 8 ml de M e O H ) . Colo cou~se 3 ml desta solução numa cubeta de q u a r t z o , onde na ausência de lUz foi purgada com nitrogênio por 30 minutos. L o g o t em seguida, foi , obtido um espectro UV-VIS.. Após isto, f o r a m feitas 3 fotólises com umá lâmpada de 300 watts com intérválos de 3 minutos, sendo que- no final de cada intervalo foi r e g i s t r a d o o espectro UV-VIS. Este a c om panhamento e s p e c t r o f o t o m é t r i c o foi feito apenas p a r a a reação do DDT com a v i t a m i n a B ^2r *

Na reação do DDM com a v i t a m i n a B-j^r’ a ^r a Ção o r g â n ^ ca após analise por C C D , foi p a s s a d a ; a t r a v é s de u m a coluna de sílica-gel us an do como eluente ci c l o h e x a n o (Merck). A se par aç ão dos componentes foi acomp anh a da nu m a b a t e r i a de tubos através do es pe c tr o fotô m etr o UV. Os p rodutos da r eaç ão do DDM t ambém foram analisados por c rom a tog r afi a em fase gasosa.

CAPÍTULO III - RESULTAVOS E VlSCUSSXõ

J. Reaçõe* dz pzòtZcldai clofiadoò da família do no/cbo/imno com vZtamZna .Bj

A reação da v i t a m i n a B ^ s ’ 2 erac*a por r edu ção da v i t a mina B ^2a em ambiente nitrogenado* com pesticidas norb orn enos foi estudada com re sp e ito aos produtos. F o r a m feitas d e t e r m ina çõ es com a solução a quosa contendo a v i t a m i n a e doseou-se o cloreto retirado durante o p e rcu r so da r eação (Tab&Za I I I ).

A solução aquosa da v i t a m i n a B ^ resultante da reação com os pesticidas norborn e nos a p rese n t o u uma coloração vermelha, semelhante à aquela da v i t a m i n a B ^2a * Porém, u ma alíquota des t a solução, colocada em m e io acido, r esu l t o u em troca de coloração para amarelo nítido, d e m o n s tra n do que o derivado da v i t a m i n a B ^ formado durante o pe r cur s o da reação apre sen tou u m e q u i líbr io do tipo bat>z on - baòz ofafc. Esta troca de cor representa u m aumento de aproximadamente 5 unidades nq valor do pKa do b en z i m i d a z o l li gado na 5- posição de c oordenação com par ado com a v i t a m i n a ®i2a e representa um fenômeno típico, de d eri vados da v i t a m i n a B ^ con

o ^

tendo um radical alquila ligado ao car bono na 6- p osi ção de c o o r ­ denação.

A solução amarela, su b metida a fptõlise d e c o m p unha- se rapidamente, trocando de col o ração nov am e n t e para v e r m e l h o . Esta é também uma e vi dência da. formação de a l q u i l c o b a l a m i n a ( B ^ - R ) * As reações em bAanco entre os mesmos pesticidas norbornenos e ex cesso de NaBH^ nas mesmas condições, apresentaram, traços de cio retos comparados aos valores teóricos da tabela III.

•* 3. b

Pe s t i c i da Cloreto teorico Cloreto experimental N 9 de Cloros

(mg) (mg) retirados

aldrin 9,7 . 9 , 6 ~ x

dieldrin 9,3 7,8 = 1

Y-clor d a n e 8,7 . • 24,0 ~ 3

a - calculado a pa/itin. da & a Z d a dz 1 clon.o zm 100 mg pz&tlci.- da pon. mzio dz n.zlaçõzò zAtzquiomztn.ica&