PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
WALESKA RAYANE DANTAS BEZERRA DE MEDEIROS
PRODUÇÃO, CONCENTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE Aspergillus niger IOC 4003 EM FERMENTAÇÃO
EM ESTADO SÓLIDO
NATAL-RN 2020
WALESKA RAYANE DANTAS BEZERRA DE MEDEIROS
PRODUÇÃO, CONCENTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE Aspergillus niger IOC 4003 EM FERMENTAÇÃO
EM ESTADO SÓLIDO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Caninde de Sousa Junior
Coorientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
NATAL - RN 2020
Medeiros, Waleska Rayane Dantas Bezerra de.
Produção, concentração e caracterização parcial de enzimas lipolíticas de Aspergillus niger IOC 4003 em fermentação em estado sólido / Waleska Rayane Dantas Bezerra de Medeiros. -2020.
81f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)
-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2020.
Orientador: Francisco Canindé de Sousa Junior. Coorientador: Everaldo Silvino dos Santos.
1. Aspergillus niger Dissertação. 2. Atividade enzimática -Dissertação. 3. Planejamento experimental - -Dissertação. 4. Resíduos agroindustriais - Dissertação. I. Sousa Junior, Francisco Canindé de. II. Santos, Everaldo Silvino dos. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 582.282.123.4
PRODUÇÃO, CONCENTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE Aspergillus niger IOC 4003 EM FERMENTAÇÃO
EM ESTADO SÓLIDO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
AGRADECIMENTOS
Não teria como começar sem agradecer primeiramente a Deus. Foi Ele quem permitiu que eu tivesse essa oportunidade. Foi Ele quem foi meu sustento nas horas de cansaço e de agonia. Foi Ele quem abriu caminhos e mentes para que essa etapa fosse concluída.
Ao meu orientador Prof. Francisco, que conduziu comigo esse trabalho entendendo as peculiaridades de trabalhar e fazer pós-graduação simultaneamente. Sem a sua compreensão seria muito mais difícil.
Ao meu coorientador Prof. Everaldo, que me passou conhecimentos valiosos de metodologias e teorias que não eram do meu conhecimento; e pela sua generosidade em permitir que eu tocasse os trabalhos acadêmicos juntamente com a “gestão” do LEB.
A todos os meus parceiros do LEB que colaboraram direta e indiretamente na realização desse trabalho. E a tantos que deram literalmente suas mãos para me ajudar no bem-fazer desse mestrado. Dentre tantos (que com certeza esquecerei) gostaria de citar Carlos, Cleitiane, Wendell, Ana Laura, Pedro Ferreira, Sinara, Stephanie, Wildson...
Agradeço também a Jessica dos Santos e a Fábio de Medeiros que não mediram esforços para auxiliar na disponibilidade dos equipamentos e na troca de conhecimentos. Agradeço muitíssimo às queridas alunas de iniciação científica Wilza e Dara. Vocês não sabem o quanto vocês contribuíram para esse trabalho! A duração e a quantidade de experimentos nos deixavam exaustas e às vezes sem ânimo, mas saber que eu tinha vocês já me dava uma grande força!
Aos meus familiares que literalmente rezaram por mim. Obrigada aos meus avós que mesmo distantes rezavam para que tudo fluísse. Agradeço a minha mãe por ter me apoiado, ter se preocupado com o andamento da pesquisa e até levado meu almoço nos dias mais intensos!
Agradeço ao meu marido por estar tão presente nesse trabalho... Por ter ficado várias noites no laboratório comigo; por ter ido trocar água de diálise no meu lugar quando eu não conseguia acordar de madrugada. Pela sua compreensão e pela sua companhia, eu te agradeço e digo que já já estou de volta.
RESUMO
As lipases são enzimas com diversas aplicações nas áreas alimentícia, farmacêutica e cosmética em virtude da sua versatilidade. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a produção de lipases de Aspergillus niger IOC 4003 por fermentação em estado sólido utilizando os substratos de baixo custo torta de algodão, farelo de trigo e óleo de vísceras de tilápia; e realizar a purificação parcial das lipases obtidas. Uma seleção das variáveis para o cultivo de A. niger foi conduzida utilizando um planejamento experimental Plackett-Burman (PPB) com 15 ensaios e 11 fatores (proporção torta de algodão/farelo de trigo, óleo de vísceras de tilápia, tempo de cultivo, pH, concentração de inóculo, umidade, glicose, ureia, extrato de levedura, KH2PO4 e MgSO4). Em seguida, realizou-se um Delineamento Composto
Central Rotacional 23 com 19 ensaios e as variáveis mais significativas do PPB: tempo de
cultivo, proporção torta de algodão/farelo de trigo e umidade. A variável resposta (atividade lipolítica) foi mensurada nos extratos enzimáticos por espectrofotometria utilizando o substrato p-nitrofenil-palmitato. As combinações de substrato com menor porcentagem de torta de algodão e maior porcentagem de farelo de trigo, bem como as condições extremas testadas de tempo de cultivo e umidade contribuíram para o incremento da atividade enzimática. A maior atividade lipolítica (0,091 U/g) foi obtida com 30% de torta de algodão, 50% de umidade e 240 horas de cultivo. Essa condição foi reproduzida com suplementação dos indutores azeite, tween 80 e triton X-100. No entanto, não houve diferença estatística entre os cultivos com e sem suplementação. O extrato enzimático bruto foi submetido à precipitação com acetona e etanol. Os maiores fatores de purificação foram verificados nas frações acetona 20% (16,0 ± 7,78), acetona 40% (4,50 ± 0,71) e etanol 20% (4,91 ± 0,17). Na fração acetona 40% foi revelada a predominância de uma banda com massa molecular de 115 kDa, sugestiva da presença de lipases. A estabilidade da fração acetona 40% contendo lipases pré-purificadas foi avaliada nos pHs 3 a 10 e nas temperaturas de 30 a 60 °C durante 6 horas. A menor estabilidade ocorreu no pH 3 mantendo atividade residual de 74,62%. Quanto à temperatura, a maior perda de atividade foi de 15,10%, que ocorreu apenas com 60 °C. Desse modo, os subprodutos torta de algodão e farelo de trigo como substrato de A. niger IOC 4003 em fermentação em estado sólido proporcionaram a produção de lipases. Além disso, a enzima precipitada com acetona 40% mostrou boa estabilidade em uma larga faixa de temperatura e pH, o que pode ser de grande interesse em processos industriais.
ABSTRACT
The lipases are enzymes with various applications in the food, pharmaceutical and cosmetic areas because of their versatility. The goals of the present study were to evaluate the production of Aspergillus niger IOC 4003 lipases by solid state fermentation using low cost substrates cottonseed cake, wheat bran and tilapia viscera oil and to perform partial purification of the obtained lipases. The cultivation of A. niger was initially conducted using multivariate analysis. To select the variables with the greatest effect, Plackett-Burman (PB) experimental design was performed with 15 tests and 11 factors (cottonseed cake/wheat bran ratio, tilapia viscera oil concentration, cultivation time, pH, concentration of inoculum, moisture, glucose, urea, yeast extract, KH2PO4 and MgSO4). After a 23 Central Rotational
Composite Design was carried out with the three most significant PB variables: cultivation time, cottonseed cake/wheat bran ratio and moisture. The response variable (lipolytic activity) was measured in the enzymatic extracts by spectrophotometry using p-nitrophenyl-palmitate. The results showed that the substrate combinations with the lowest percentage of cottonseed cake and the highest percentage of wheat bran and the tested extreme conditions of cultivation time and moisture contributed to the increase in enzymatic activity. The highest lipolytic activity (0.091 U/g) was obtained with 30% cottonseed cake, 50% moisture and 240 hours of cultivation. This condition was reproduced with supplementation of the inducers olive oil, tween 80 and triton X-100. However, there was no statistical difference with and without supplementation. The crude enzymatic extract was submitted to precipitation with acetone and ethanol. The major purification factors were found in the fractions 20% acetone (16.0 ± 7.78), 40% acetone (4.50 ± 0.71) and 20% ethanol (4.91 ± 0.17). In 40% acetone fraction also showed predominance of a band with a molecular mass of 115 kDa, suggestive of the presence of lipases. The stability of the fraction containing pre-purified lipases was evaluated at pH 3 to 10 and at temperatures from 30 to 60 °C for 6 hours. The lowest stability occurred at pH 3 maintaining a residual lipolytic activity of 74.62%. The most important loss of activity was 15.10%, which occurred only at 60 °C. Therefore, low cost substrates cottonseed cake and wheat bran as substrates of A. niger IOC 4003 in solid state fermentation provided the production of pre-purified lipases with good stability at temperatures and pHs, which can be of great interest in several industrial processes.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Hidrólise de triacilglicerol catalisada por lipase 15 Figura 2 - Torta de algodão triturada (A) e farelo de trigo in natura (B) 29
Figura 3 - Óleo de vísceras de tilápia 30
Figura 4 - Crescimento de A. niger IOC 4003 em meio Ágar Batata Dextrose 31 Figura 5 - Diagrama de Pareto do Planejamento Plackett-Burman sobre a
resposta da atividade lipolítica 47
Figura 6 - Diagrama de Pareto do DCCR sobre a resposta da atividade lipolítica 52 Figura 7 - Superfícies de resposta para atividade lipolítica em função das
variáveis proporção torta de algodão/farelo de trigo, umidade e tempo de
cultivo 53
Figura 8 - Atividades lipolíticas após suplementação com surfactantes e azeite 58 Figura 9 – Eletroforese em gel de poliacrilamida das frações obtidas na
precipitação de lipases com acetona 62
Figura 10 – Eletroforese em gel de poliacrilamida das frações obtidas na
precipitação de lipases com etanol 63
Figura 11 – Efeito do pH na estabilidade de lipases pré-purificadas 64 Figura 12 – Efeito da temperatura na estabilidade de lipases pré-purificadas 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Matriz do Planejamento Plackett-Burman 33
Tabela 2 – Fatores e níveis usados no Planejamento Plackett-Burman 34
Tabela 3 - Matriz do DCCR 37
Tabela 4 – Fatores e níveis utilizados no DCCR 38
Tabela 5 – Caracterização físico-química da torta de algodão e do farelo de
trigo. 42
Tabela 6 – Perfil de ácidos graxos do óleo de vísceras de tilápia 44 Tabela 7 - Matriz do Planejamento Plackett-Burman e atividades lipolíticas
obtidas 46
Tabela 8 - Matriz do DCCR mostrando os valores codificados e reais e atividades
lipolíticas obtidas 51
Tabela 9 – Análise de variância para o modelo estatístico DCCR 53 Tabela 10 – Resultados das etapas de precipitação de lipases com acetona 60 Tabela 11 – Resultados das etapas de precipitação de lipases com etanol 60
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 11 2 OBJETIVOS 13 2.1 Objetivo geral 13 2.2 Objetivos específicos 13 3 REVISÃO DE LITERATURA 14 3.1 Enzimas 14 3.2 Lipases 15 3.2.1 Fontes de lipases 16 3.2.2 Aplicações de lipases 17 3.3 Aspergillus niger 19
3.4 Cultivos microbianos para produção de lipases 19
3.4.1 Cultivo submerso 20
3.4.2 Cultivo em estado sólido 20
3.4.2.1 Fatores que influenciam o cultivo em estado sólido 21
3.4.2.1.1 Temperatura 21
3.4.2.1.2 pH 21
3.4.2.1.3 Inóculo 22
3.4.2.1.4 Fonte de carbono e indutor 22
3.4.2.1.5 Fonte de nitrogênio 23
3.4.2.1.6 Micronutrientes 23
3.4.2.1.7 Tamanho de partícula 23
3.4.2.1.8 Tensoativos 23
3.4.2.1.9 Umidade e atividade de água 24
3.5 Recuperação e purificação de lipases 24
3.6 Caracterização de lipases 25
3.7 Resíduos agroindustriais 26
3.7.1 Torta de algodão 26
3.7.2 Farelo de trigo 27
3.7.3 Óleo de vísceras de tilápia do Nilo 28
4 METODOLOGIA 29
4.1.1 Torta de algodão e farelo de trigo 29
4.1.2 Óleo de vísceras de tilápia 30
4.2 Micro-organismo 31
4.3 Propagação de esporos e manutenção da cepa 31
4.4 Preparo do inóculo 32
4.5 Planejamento Plackett-Burman 32
4.6 Extração enzimática 35
4.7 Determinação da atividade enzimática da lipase 35
4.7.1 Método espectrofotométrico (Método 1) 35
4.7.2 Método titulométrico (Método 2) 36
4.8 Delineamento Composto Central Rotacional 36
4.9 Suplementação com surfactantes e azeite 38
4.10 Precipitação com solventes orgânicos 39
4.10.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida 39
4.11 Estabilidade ao pH e à temperatura 40
4.12 Análise estatística 41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 42
5.1 Caracterização físico-química da torta de algodão e do farelo de trigo 42 5.2 Caracterização físico-química do óleo de vísceras de tilápia 43
5.3 Planejamento Plackett-Burman 45
5.4 Delineamento Composto Central Rotacional 50
5.5 Determinação da atividade lipolítica por método titulométrico 56
5.6 Suplementação com surfactantes e azeite 57
5.7 Precipitação com solventes orgânicos 59
5.8 Estabilidade ao pH e à temperatura 64
6 CONCLUSÕES 67
REFERÊNCIAS 68
APÊNDICE A - Relação umidade vs atividade de água 79 APÊNDICE B – Curva de calibração de p-nitrofenol 80 APÊNDICE C – Curva de calibração de albumina bovina (Método Lowry) 81
1 INTRODUÇÃO
As lipases são enzimas com função biológica de catalisar a hidrólise das ligações éster de triacilgliceróis em diacilgliceróis, monoacilgliceróis e ácidos graxos livres (GEOFFRY; ACHUR, 2018). Possuem muitas aplicações em virtude da sua versatilidade, além de diversas vantagens como: capacidade de atuar em amplas faixas de pH e temperatura, estabilidade frente a solventes orgânicos, potencial para substituição de catalisadores químicos convencionais, biodegradabilidade, especificidade e seletividade (THAKUR, 2012; TORRES et al., 2006).
A fermentação em estado sólido (FES) é um dos processos empregados na produção de lipases, no qual os micro-organismos crescem na superfície ou entre os fragmentos de matrizes sólidas com baixa quantidade de água livre. A FES é influenciada por fatores como: temperatura, pH, inóculo, umidade, atividade de água, fonte de nitrogênio, fonte de carbono, indutor, micronutrientes, tensoativos e tamanho de partícula do suporte (GEOFFRY; ACHUR, 2018; YAZID et al., 2017).
Os fungos filamentos constituem o grupo de micro-organismos mais empregado em FES, com destaque para a espécie Aspergillus niger. Esse é o fungo filamentoso mais estudado para produção de lipases por FES, uma vez que tem maior rendimento quando comparado a outros micro-organismos, além de produzir lipases extracelulares. Ademais, consegue fermentar grande variedade de resíduos orgânicos de baixo custo (GAUTAM et al., 2011; KODA et al., 2005; MURUCI, 2012).
Os subprodutos agroindustriais são constituídos principalmente de carboidratos, minerais e proteínas, que podem ser usados como substratos em bioprocessos, fornecendo condições adequadas de crescimento, com mínimo ou nenhum tratamento prévio; agregando valor às matérias-primas por meio da produção de substâncias de maior interesse econômico, como enzimas (SALIHU et al., 2012; SANTOS, 2012).
O farelo de trigo é o subproduto com produtividade máxima de lipases em FES quando associado ao azeite de oliva como indutor. O azeite, entretanto, por ser considerado um substrato “nobre”, pode elevar os custos de produção (KUMAR; RAY, 2014). Assim, torna-se necessária a avaliação de subprodutos de baixo custo como substratos na produção de lipases, entre eles a torta de algodão e o óleo de vísceras de tilápia (KAMINI; MALA; PUVANAKRISHNAN, 1998; NEMA et al., 2019; REBAH; MILED, 2013).
A torta de algodão é o material que permanece após a extração de óleo de sementes de algodão. É constituída de 24,0 g/100g de proteína bruta, 63,6 g/100g de carboidratos totais.
7,6 g/100g de extrato etéreo e 4,9 g/100g de cinzas (PEREIRA et al., 2016). Apesar da pequena utilização como substrato para fermentação (KAMINI; MALA; PUVANAKRISHNAN, 1998; NEMA et al., 2019), os teores de proteína bruta e extrato etéreo são fatores importantes, que podem ser usados pelo micro-organismo como fonte de nitrogênio e de carbono, respectivamente; sobretudo os lipídios, como indutores da produção de lipase microbiana (GEOFFRY; ACHUR, 2018; SALIHU et al., 2012).
De modo semelhante, os subprodutos de peixes são uma excelente fonte para o crescimento microbiano, podendo ser explorados na produção de metabólitos (REBAH; MILED, 2013). A tilápia do Nilo é uma das espécies mais indicadas para a piscicultura intensiva (MARTINS et al., 2015) e apenas 35% dos resíduos gerados a partir da filetagem são aproveitados (SANTOS et al., 2017).
Embora existam estudos para produção biotecnológica utilizando subprodutos de algumas espécies de peixes (MARTINS et al., 2015; MEDEIROS et al., 2019; THIRUNAVUKARASU et al., 2015), não foi encontrada pesquisa investigando o potencial para produção enzimática a partir do óleo de vísceras de tilápia do Nilo. A presença de ácidos graxos poli-insaturados, principalmente de ácido oleico no óleo de vísceras (LEMOS, 2015) é um atributo de grande interesse para indução de lipases. No entanto, a qualidade do óleo utilizado é indispensável e precisa ser garantida para a manutenção de suas propriedades.
Neste contexto, o presente estudo investigou as melhores condições de cultivo para produção de lipases de A. niger IOC 4003 em FES utilizando os substratos de baixo custo farelo de trigo, torta de algodão e óleo de vísceras de tilápia. Foram utilizados planejamentos experimentais Plackett-Burmann e Delineamento Composto Central Rotacional, além de ensaios na presença de indutores já bem descritos: azeite e surfactantes.
O extrato enzimático da melhor condição de cultivo foi submetido à precipitação com os solventes orgânicos, acetona e etanol, para obtenção de uma fração mais concentrada na enzima de interesse e com menos contaminantes. O desempenho das técnicas de concentração foi verificado em eletroforese em gel de poliacrilamida e auxiliou a seleção da melhor fração.
A fração enriquecida em lipases pré-purificadas foi caracterizada quanto à estabilidade em diferentes pHs e temperaturas, direcionando as lipases produzidas para futuras aplicações.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a produção de lipases de Aspergillus niger IOC 4003 por fermentação em estado sólido utilizando substratos de baixo custo e realizar a purificação parcial das lipases obtidas.
2.2 Objetivos específicos
1. Realizar análises físico-químicas dos subprodutos agroindustriais torta de algodão, farelo de trigo e óleo de vísceras de tilápia;
2. Realizar triagem das variáveis mais importantes para a produção de lipases através de planejamento experimental Plackett-Burman;
3. Investigar a influência das variáveis selecionadas sobre a atividade lipolítica utilizando Delineamento Composto Central Rotacional (23 com quintuplicata no ponto central); 4. Avaliar a suplementação de indutores na atividade lipolítica;
5. Analisar a recuperação e pré-purificação da enzima lipase por precipitação com solventes orgânicos;
3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1 Enzimas
As enzimas são macromoléculas com atividade catalítica. Sua estrutura é majoritariamente constituída por aminoácidos, podendo estar integrada a outras moléculas como carboidratos e lipídios. Algumas enzimas requerem a participação de moléculas menores de natureza não-protéica como cofatores e coenzimas (SANT’ANNA JUNIOR, 2001).
A nomenclatura das enzimas é comumente realizada mencionando o substrato no qual ela exerce sua ação, acrescentado do sufixo “ase”. Entretanto, devido à crescente descoberta de novas enzimas, essas moléculas foram categorizadas de forma sistemática em um sistema proposto pela Enzyme Commission (EC), órgão da IUPAC, de acordo com as reações gerais catalisadas. O sistema EC associa cada enzima a um código numérico de quatro dígitos. O primeiro dígito descreve a classe geral de reação enzimática (oxido redutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases) e os dígitos subsequentes indicam a subclasse, a sub-subclasse e o número de série específico atribuído a cada enzima individualmente (BABBITT, 2003).
A atividade de uma enzima é mensurada pela velocidade de reação determinada em condições experimentais estabelecidas (temperatura, pH e concentração de substrato). A concentração do produto gerado aumenta de forma linear durante certo tempo. Todavia, a partir de um dado tempo, a velocidade da formação de produto diminui em virtude de fatores como redução da concentração do substrato, inativação parcial da enzima no decorrer da reação e inibição por produto (SANT’ANNA JUNIOR, 2001).
As enzimas têm ganhado espaço nas áreas de pesquisa e desenvolvimento em virtude de vantagens ambientais (que corroboram com a tecnologia verde) e técnico-econômicas, como: substituição de catalisadores químicos convencionais com maiores rendimentos de reação e produtos mais seletivos; atuação sob condições brandas de temperatura, pressão e pH, contribuindo para economia de energia; e biodegradabilidade, sendo uma opção de catalisador renovável (THOMAS; LARROCHE; PANDEY, 2013; SANTOS, 2012; YAZID et al., 2017). Além disso, os campos para aplicações de enzimas continuam a crescer devido ao desenvolvimento de novas tecnologias e ao uso da engenharia genética na sua produção (COLLA et al., 2016).
O mercado de enzimas com aplicações industriais é dividido em três segmentos: enzimas para alimentos e bebidas; enzimas para ração animal; e técnicas, destinadas às indústrias têxteis e de produtos de limpeza. O mercado de enzimas especiais pode ser dividido em quatro aplicações principais: terapêutica (anticoagulantes, antitumorais, antibióticos, entre outras), diagnóstica, pesquisa científica e química fina (SANTOS, 2012).
Em 2018, o mercado global de enzimas industriais movimentou mais de US$ 5,5 bilhões. Além disso, espera-se uma taxa de crescimento anual composta de 4,9% ao ano, alcançando US$ 7 bilhões em 2023 (ARUN, 2017).
Dada a sua complexidade estrutural, a síntese química das enzimas não é exequível. Industrialmente, a obtenção desses biocatalisadores se dá por processos fermentativos utilizando micro-organismos (SINGHANIA et al., 2015). Dentre as enzimas de origem microbiana, as mais comercializadas são proteases, amilases e lipases (RIGO et al., 2010).
3.2 Lipases
As lipases (triacilglicerol hidrolases, EC 3.1.1.3) são enzimas pertencentes à classe das hidrolases, cuja função biológica é catalisar a hidrólise das ligações éster de triacilgliceróis em diacilgliceróis, monoacilgliceróis e ácidos graxos livres (Figura 1) (GEOFFRY; ACHUR, 2018).
Figura 1 - Hidrólise de triacilglicerol catalisada por lipase
TAG: Triacilglicerol; DAG: Diacilglicerol; MAG: Monoacilglicerol. Em todas as etapas (como representado na etapa final com glicerol) há formação de ácidos graxos.
Estas enzimas também são ativas na presença de solventes orgânicos e com teores restritos de água, catalisando, ainda, reações de esterificação (reação entre álcoois e ácidos carboxílicos com eliminação de água), transesterificação (alcoólises, acidólises, interesterificação), aminólise (síntese de amidas) e lactonização (esterificação intramolecular) (GEOFFRY; ACHUR, 2018; PAQUES; MACEDO, 2006).
Uma característica estrutural peculiar das lipases confere a essas enzimas a capacidade de atuar sobre substratos insolúveis em água, diferentemente das esterases, que hidrolisam preferencialmente ésteres simples e triglicérides com ácidos graxos de até seis carbonos (SANTOS, 2012).
O sítio ativo das lipases fica localizado dentro de uma cavidade hidrofóbica coberto por elementos estruturais secundários, que funcionam como tampas. Quando há ligação do substrato na superfície da lipase, esta tampa move-se alterando a conformação fechada para a aberta, expondo a superfície hidrofóbica interna, favorecendo a ligação da lipase à interface hidrofóbica-hidrofílica e tornando o centro ativo acessível ao substrato (CASTRO; MENDES; SANTOS, 2004; TURATI, 2015). Esterases, em contrapartida, não exibem uma estrutura de tampa e, portanto, não atuam na interface entre a região hidrofóbica e hidrofílica (SANTOS, 2012).
As lipases são muito versáteis e possuem vantagens como: capacidade de atuar em amplas faixas de pH (3 a 11) e de temperatura (30 a 60 °C), estabilidade frente a solventes orgânicos, especificidade e seletividade (THAKUR, 2012; TORRES et al., 2006).
As lipases são classificadas em três grupos com base na especificidade em relação ao substrato:
a) Lipases regiosseletivas: lipases inespecíficas, que hidrolisam moléculas de acilgliceróis em posições aleatórias, produzindo ácidos graxos livres e glicerol com mono e diacilgliceróis como intermediários; e as lipases 1,3 específicas, que catalisam a liberação de ácidos graxos nas posições 1 e 3 do triacilglicerol (SANTOS, 2012); b) Lipases quimiosseletivas: só atuam de acordo com o tamanho da cadeia carbônica e/ou
ao número de insaturações do grupo acila (SANTOS, 2012);
c) Lipases enantiosseletivas: catalisam a derivatização enantiosseletiva de compostos quirais e várias reações de esterificação, transesterificação e interesterificação (SANTOS, 2012).
Lipases são produzidas por algumas espécies de animais, vegetais e micro-organismos. As enzimas microbianas possuem vantagens pois são facilmente produzidas em larga escala via fermentação e são excretadas através da membrana para o meio de cultura. Portanto, os processos de produção e purificação de lipases microbianas têm custo diminuído, sendo essa fonte preferida industrialmente (HASAN; SHAH; HAMEED, 2006; SENA et al., 2006).
Dentre as bactérias produtoras destaca-se as espécies pertencem aos gêneros Bacillus, Pseudomonas e Burkholderia. Com relação às leveduras produtoras de lipases, foram relatadas espécies dos gêneros Candida e Pichia. Os fungos filamentosos, por sua vez, são os micro-organismos mais utilizados na produção de lipases. As espécies pertencentes aos gêneros Geotrichum, Penicillium, Aspergillus e Rhizomucor são relatadas como as melhores produtoras (THAKUR, 2012).
3.2.2 Aplicações de lipases
As lipases são utilizadas com dois objetivos principais: na catálise biológica, a fim de produzir componentes químicos importantes para as indústrias, e na aceleração da degradação de resíduos gordurosos (COLLA; CHRISTIAN; JORGE, 2012; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
As aplicações das lipases incluem: atuação nas indústrias de couro para remoção de gordura animal (FOTOUH; BAYOUMI; HASSAN, 2016; KUMAR; RAY, 2014), tratamento de efluentes industriais para remoção de produtos oleosos (DORS et al., 2013; ROVEDA; HEMKEMEIER; COLLA, 2010), indústria de alimentos (KUMAR; RAY, 2014; RENGE; KHEDKAR; NANDURKAR, 2012; THAKUR, 2012); indústria farmacêutica e cosmética (GHORAI; SHUKLA; BHATTACHARYYA, 2012; NAGARAJAN, 2012; SETHI; NANDA; SAHOO, 2016; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012), produção de biodiesel (BAJAJ et al., 2010; BHARTI et al., 2013; KAZANCEV; SENDZIKIENE; KAZANCEVA, 2015) e fabricação de detergentes (HASAN et al., 2010).
Na indústria alimentícia, as lipases apresentam diversas aplicações como no desenvolvimento de aromas, na maturação de queijos, na produção de emulsificantes, no aumento do teor de ácidos graxos insaturados e na produção de margarinas (KUMAR; RAY, 2014).
Óleos vegetais são modificados estruturalmente pelas lipases a fim de apresentarem triacilgliceróis com maior valor nutricional. Óleos com baixo custo podem ser transformados
em produtos de maior valor agregado tais como triacilgliceróis de baixo teor calórico e óleos enriquecidos em ácido oleico (CARVALHO et al., 2003; HASAN; SHAH; HAMEED, 2006).
As lipases são utilizadas na síntese de ésteres de ácidos graxos de cadeia curta e álcoois, que são compostos voláteis responsáveis por aromas (HASAN; SHAH; HAMEED, 2006). O acetato de butila, que proporciona aroma de abacaxi, é oriundo da reação de esterificação entre butanol e ácido acético catalisada por lipases (SALAH et al., 2007). A produção de ésteres de terpenos, utilizados como aromatizantes frutais, ocorre similarmente (HABULIN et al., 2007). Na fabricação de queijos, a gordura do leite é hidrolisada utilizando lipases, liberando ácidos graxos que contribuem diretamente no aroma e aceleram a maturação dos queijos (ALBERTON, 2009).
A interesterificação e a hidrogenação são processos usados para a preparação de gliceróis na fabricação de manteigas e margarinas. A reação conduzida com lipases como catalisadores é muito mais específica se comparada à interesterificação convencional conduzida por catalisadores como o hidróxido de sódio (HASAN; SHAH; HAMEED, 2006).
O emprego de lipases na área farmacêutica decorre das condições suaves de processo que evitam reações de isomerização, epimerização, racemização e rearranjo; capacidade de reutilização das lipases imobilizadas; além da economia do processo de produção (SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
A enantioseletividade e a enantioespecificidade das lipases são utilizadas na resolução de misturas racêmicas para obtenção de fármacos opticamente puros, já que frequentemente apenas um dos enantiômeros apresenta atividade terapêutica (MURUCI, 2012). Além disso, o tratamento de insuficiência pancreática é auxiliado pela suplementação com lipases de origem microbiana. Anteriormente eram utilizadas lipases de fontes animais, no entanto a facilidade dessas serem inativadas em pH baixo aumentou a produção de lipases microbianas, que são mais estáveis em pH ácido. As lipases também podem ser usadas como instrumentos de diagnóstico para doenças relacionadas ao pâncreas (NAGARAJAN, 2012; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012). Outra aplicação das lipases microbianas para a indústria farmacêutica é a produção de lactonas sintéticas, as quais não apresentam atividade citotóxica (SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
Na indústria cosmética, por sua vez, as lipases vêm sendo empregadas na produção de aromas, surfactantes e emolientes (MURUCI, 2012). A empresa Unichem International, utiliza lipases para obtenção de matérias-primas como palmitato de isopropila, miristato de isopropila e 2-etilhexilpalmitato, empregados como emolientes em cremes para pele, bronzeadores e óleos de banho. O uso da lipase ao invés do catalisador ácido convencional
aumenta a qualidade do produto e diminui as etapas de purificação (SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
3.3. Aspergillus niger
Aspergillus niger é um fungo filamentoso popularmente conhecido como “mofo negro”. Possui micélio vegetativo com hifas longas (400-3000 μm) e lisas, vesículas globosas na extremidade recobertas por esporos esféricos relativamente grandes (15-130 μm) de cor negra. Macroscopicamente, o início do crescimento é caracterizado por colônias brancas, que são células vegetativas, que se tornam marrons escuras ou pretas após o aparecimento dos esporos; o reverso das colônias se caracteriza por uma cor pálida, creme ou amarelada (TRIBST, 2008).
O emprego de A. niger em processos fermentativos possui vantagens pela capacidade deste em se desenvolver em meios sólidos e líquidos, podendo fermentar uma grande variedade de matérias-primas de baixo custo e possuir esporulação rápida (GAUTAM et al., 2011; MURUCI, 2012).
De acordo com Nigam e Pandey (2009), as enzimas produzidas dependerão do tipo de substrato utilizado no cultivo. Dependendo do indutor, A. niger pode produzir diversas enzimas hidrolíticas, tais como poligalacturonase, celulase, hemicelulase, protease e amilase (MURUCI, 2012; SANTOS, 2012). Esse fungo também é uma fonte importante de lipases extracelulares, uma vez que produz quantidades maiores que outros micro-organismos (KODA et al., 2005).
A. niger é reconhecido como GRAS (generally recognized as safe) pela Food and Drug Administration (FDA). Assim, a ingestão oral do fungo e produtos derivados desta espécie é considerada inócua pela Organização Mundial de Saúde (MHETRAS; BASTAWDE; GOKHALE, 2009). Dessa forma, os produtos desse micro-organismo podem ser utilizados com segurança nas indústrias de produtos farmacêuticos e alimentícios (BALAJI; EBENEZER, 2008).
3.4 Cultivos microbianos para produção de lipases
Na produção de lipases microbianas são frequentemente empregados dois tipos de cultivo: cultivo submerso e cultivo em estado sólido (GEOFFRY; ACHUR, 2018).
3.4.1 Cultivo submerso
Apresenta como característica principal o uso de meio de cultura líquido, normalmente, com nutrientes dissolvidos e com agitação. Tem como vantagens a mistura homogênea de micro-organismos, nutrientes e metabólitos; maior eficiência da absorção de nutrientes e excreção de metabólitos tornando o processo mais rápido; e maior facilidade no controle de condições do processo como temperatura, pH e oxigênio dissolvido (GEOFFRY; ACHUR, 2018; SADH et al., 2018).
Em contrapartida, o meio líquido desfavorece a transferência de gases de modo que há maiores gastos com fornecimento de energia para aeração e agitação; pode ocorrer formação de espuma; apresenta maior demanda de água e maior risco de contaminação. Além disso, produz grandes volumes de rejeitos durante a recuperação das biomoléculas, uma vez que os metabólitos se encontram diluídos (SADH et al., 2018).
3.4.2 Cultivo em estado sólido
O cultivo em estado sólido, também chamado de fermentação em estado sólido (FES), é definido como o cultivo de micro-organismos em matriz sólida insolúvel na ausência ou em baixa quantidade de água livre, na qual o crescimento ocorre na superfície ou entre os fragmentos do suporte sólido (GEOFFRY; ACHUR, 2018; YAZID et al., 2017).
O suporte sólido, também chamado de matriz, é classificado em dois grupos: inerte e não inerte. Na matriz inerte, esta atua apenas como suporte para as células microbianas, não fornecendo nutrientes. Na matriz não inerte, também chamada de substrato, a natureza do material é capaz de fornecer nutrientes ao micro-organismo (LÓPEZ et al., 2010; SADH et al., 2018).
As desvantagens da FES dizem respeito à baixa homogeneidade do meio, dificultando o acompanhamento de parâmetros como aeração, pH, temperatura e umidade; restrição a micro-organismos capazes de crescer em ambientes com baixa atividade de água (geralmente fungos filamentosos e leveduras) e dificuldades no aumento de escala (GEOFFRY; ACHUR, 2018; SADH et al., 2018; YAZID et al., 2017).
As conveniências da escolha da FES abrangem as perspectivas biotecnológicas e ambientais. Uma vez que esse cultivo proporciona vantagens na obtenção de produtos de interesse mais concentrados, com maior rendimento, maior estabilidade e menor repressão catabólica. Além disso, há menor risco de contaminação, redução de efluentes, baixo
consumo de energia e a possibilidade de aproveitamento de resíduos como matriz de baixo custo e condições semelhantes aos habitat naturais (GEOFFRY; ACHUR, 2018; SADH et al., 2018; YAZID et al., 2017).
3.4.2.1 Fatores que influenciam o cultivo em estado sólido
A FES é afetada por variáveis físico-químicas bem como pela constituição dos meios. A composição do meio de cultivo deve fornecer elementos imprescindíveis ao crescimento microbiano e formação de produto. Os micro-organismos necessitam de carbono, nitrogênio, minerais, água e, eventualmente, fatores de crescimento (AMORIM, 2011; GEOFFRY; ACHUR, 2018).
3.4.2.1.1 Temperatura
A temperatura é um fator importante na FES em virtude do acúmulo do calor metabólico gerado, da baixa condutividade térmica da maioria das matrizes e da dificuldade de homogeneidade do meio sólido, podendo gerar gradientes de temperatura no biorreator. A formação de zonas de alta temperatura e baixa concentração de oxigênio afeta negativamente a produtividade de biomassa e metabólitos desejáveis (AMORIM, 2011).
A temperatura deve ser escolhida de acordo com a temperatura ótima específica para o micro-organismo bem como com a adequação do metabólito desejado (em caso de proteínas) de modo que esse não seja desnaturado (GEOFFRY; ACHUR, 2018). Temperaturas entre 26,5 °C e 32 °C foram utilizadas em muitos estudos de produção de lipases envolvendo fungos, leveduras e bactérias, sendo 30 °C a temperatura utilizada com maior frequência (FLEURI et al., 2014; NEMA et al., 2019; REINEHR, 2015).
3.4.2.1.2 pH
O pH do meio de cultivo influencia a ação das enzimas do metabolismo microbiano de modo que algumas rotas metabólicas podem ser favorecidas ou inibidas (THOMAS; LARROCHE; PANDEY, 2013). Na maioria dos casos mede-se o pH após colocar, em suspensão, uma parte da amostra sólida em 3 a 4 partes de água. Porém, essa metodologia não é representativa nos microambientes como no filme aquoso onde ocorrem as reações bioquímicas. Portanto, a medição exata do pH em matrizes sólidas só é realizada no início e
no final do processo fermentativo. Em contrapartida, a fim de amenizar as mudanças de pH, podem ser utilizadas soluções-tampão durante a etapa de umidificação da matriz (AMORIM, 2011).
3.4.2.1.3 Inóculo
Entre os fatores que afetam o desenvolvimento do fungo e a produção da biomolécula de interesse, podem ser mencionados a quantidade, o tipo (esporos ou hifas vegetativas) e a idade do inóculo (REINEHR, 2015).
Na FES, geralmente utiliza-se os esporos, que são contabilizados antes da inoculação. Concentrações menores que 106 esporos por cada grama de meio de cultivo aumentam o tempo de obtenção dos produtos, enquanto concentrações acima de 108 esporos por grama de
meio não promovem aumento da produtividade. Em concentrações entre 106 e 108
esporos/grama de meio, podem ter diferenças nos resultados de produtividade, porém a cinética de produção de lipase tende a se mostrar semelhante (GULATI et al., 1999).
3.4.2.1.4 Fonte de carbono e indutor
O carbono é um elemento necessário para a biossíntese de diversos constituintes celulares, como carboidratos, proteínas, lipídios e ácidos nucléicos (SANTOS, 2012). Como substrato para o crescimento microbiano e a produção de lipase, as fontes mais frequentes desse elemento são os carboidratos, os ácidos orgânicos, os álcoois e os ácidos graxos (GONÇALVES, 2007). O emprego matérias-primas como fonte de carbono enriquecendo os meios de cultivo e reduzindo o impacto ambiental tem sido recorrente (MARQUES et al., 2014).
O carbono oriundo de óleos é o principal fator para produção de lipase fúngica, atuando como indutor (BINDIYA; RAMANA, 2012). O efeito indutivo dos substratos à base de óleo, no entanto, varia consideravelmente entre as espécies fúngicas, havendo relatos indicando o azeite de oliva como melhor indutor da atividade de lipase. Atribui-se esse efeito à sua elevada constituição de ácido oleico (WANG; XU; SHAN, 2008). No entanto, concentrações muito altas de indutor lipídico, podem dificultar a difusão de gases e nutrientes no meio e, consequentemente, diminuir o crescimento fúngico e a produção de enzimas (DAS et al., 2017).
Diversos estudos têm mostrado a repressão da atividade lipolítica em meios contendo carboidratos e indutores de substrato oleoso, quando comparados aos mesmos meios contendo óleo como único substrato (CIHANGIR; SARIKAYA, 2004; NIAZ; IFTIKHAR; ZIA, 2013). Ademais, a diminuição na produção de lipase fúngica pode ser atribuída ao carboidrato fermentescível que eleva a acidez do meio (DALMAU et al., 2000).
3.4.2.1.5 Fonte de nitrogênio
Nitrogênio no meio de cultivo é essencial para a formação estrutural dos fungos e produção de enzimas (GEOFFRY; ACHUR, 2018). A maioria dos fungos assimila mais facilmente o nitrogênio inorgânico (nitrato ou amônia). Os aminoácidos e pequenos peptídeos obtidos de hidrolisados de proteínas (peptonas) podem ser transportados diretamente para o interior da célula, no entanto, peptídeos maiores e proteínas são antes hidrolisados por enzimas extracelulares (AMORIM, 2011). O tipo de nitrogênio adicionado ao meio influencia diretamente no nível de produção de lipases e tal influência varia amplamente entre as estirpes microbianas (GEOFFRY; ACHUR, 2018).
3.4.2.1.6 Micronutrientes
Alguns fungos requerem fatores de crescimento, como vitaminas, ferro, cobre, manganês, zinco e molibdênio, que, por serem micronutrientes, são demandados em baixíssimas quantidades (AMORIM, 2011).
3.4.2.1.7 Tamanho de partícula
O tamanho desejado das partículas do substrato deve garantir a acessibilidade dos nutrientes e a disponibilidade de oxigênio. Partículas pequenas favorecem a compactação do sólido, dificultando a difusão de gases no meio de cultivo, enquanto partículas grandes favorecem a aeração, mas limitam a superfície de contato do substrato para o micro-organismo (NIGAM; PANDEY, 2009).
Os surfactantes podem aumentar a permeabilidade celular, facilitando o transporte de moléculas através da membrana celular e a secreção protéica (VOLKERING; BREURE; RULKENS, 1997).
O aumento na atividade lipolítica foi observado com suplementação de triton X-100 ao cultivo de A. niger NCIM 1207 (NIAZ; IFTIKHAR; ZIA, 2013). De maneira análoga, a adição de brometo de cetiltrimetilamônio (0,5%, m/v) ao meio de cultivo contendo Aspergillus tamarii também provocou um aumento na produção de lipase (DAS et al., 2016). No entanto, o efeito varia de acordo com os surfactantes e as cepas, sendo muito relevante a escolha do tensoativo compatível (GEOFFRY; ACHUR, 2018).
3.4.2.1.9 Umidade e atividade de água
A água possui papel muito expressivo nos bioprocessos, pois é responsável pela absorção celular e difusão de solutos, gases e metabólitos inibitórios (DUTRA, 2007).
A água presente nos substratos está na forma de molécula livre (disponível para diversas reações químicas) ou ligada ao substrato (comprometida com as moléculas da matriz). A umidade é uma determinação da quantidade de água total de uma amostra expressa em massa percentual. Em contrapartida, a atividade de água (Aa) é uma medida que mensura a disponibilidade de água livre em uma amostra (SCOTT, 1957).
A atividade de água no cultivo em meio sólido influencia o crescimento do micro-organismo, a produção de metabólitos e de enzimas (GRAMINHA et al., 2008). Baixos níveis de Aa significam baixa disponibilidade de água nas proximidades das células, dificultando a troca de solutos na fase sólida; consequentemente acarretando menores taxas de crescimento e/ou de síntese de metabólitos. Em contrapartida, elevados níveis de Aa acarretam a redução da porosidade do substrato, alteram a estrutura da matriz e promovem o desenvolvimento de aderência, que limita a difusão de oxigênio na camada de substrato (OLIVEIRA et al., 2016).
Os níveis de atividade de água e umidade das matrizes in natura devem ser avaliados. Caso esses não sejam ideais para o desenvolvimento do micro-organismo, água ou soluções tampões podem ser adicionadas (CORREIA, 2004).
3.5 Recuperação e purificação de lipases
O extrato enzimático bruto é obtido através do contato do meio fermentado com um líquido extrator (geralmente uma solução tampão) por determinado tempo. No entanto, esse
extrato possui grande diversidade de substâncias e precisa ser submetido a etapas de redução de contaminantes e concentração da enzima de interesse. Após a obtenção do extrato bruto, a primeira etapa consiste na separação das células microbianas por meio de centrifugação, filtração e/ou microfiltração (MURUCI, 2012).
A redução de impurezas no extrato é desejável pois aumenta a atividade enzimática, permitindo a utilização de menores quantidades da enzima. No entanto, não há um processo de purificação que seja de aplicação geral. Assim, as estratégias utilizadas para a separação e purificação de uma enzima são determinadas de acordo com o grau de pureza necessário para a sua aplicação (MURUCI, 2012; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
Usualmente após a remoção das células microbianas, as técnicas utilizadas são a concentração das enzimas por precipitação com solventes orgânicos, precipitação com sulfato de amônio ou ultrafiltração. Os métodos sequenciais de purificação podem envolver técnicas como cromatografia de interação, gel filtração, purificação em líquidos iônicos e sistemas de duas fases aquosas (NAGARAJAN, 2012; REINEHR, 2015; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
3.6 Caracterização de lipases
Lipases produzidas por diferentes fontes ou condições podem apresentar propriedades distintas entre si, inclusive no desempenho quando submetidas às mesmas condições de reação. O estudo das propriedades bioquímicas das enzimas é de relevância para conhecer as particularidades da atuação enzimática e as condições ideais do processo. Com isso, é possível selecionar as lipases mais adequadas para cada aplicação (BACHA et al., 2005; CARVALHO et al., 2008).
A caracterização das lipases purificadas geralmente abrange a descoberta da massa molecular; ponto isoelétrico; pH e temperatura ótimos de atividade; efeito de íons, surfactantes e solventes orgânicos na atividade; efeito do pH e temperatura sobre a estabilidade enzimática bem como avaliação da especificidade da lipase por substratos (TURATI, 2015).
Na maioria dos casos, as lipases microbianas apresentam massa molecular entre 11 e 60 kDa, pH ótimo em condições neutras a alcalinas, temperatura ótima em torno de 30 a 50 °C e são estáveis na presença de solventes, surfactantes, sais e em uma ampla faixa de temperatura (TURATI, 2015).
A avaliação da especificidade da lipase por substratos com distintos tamanhos da cadeia carbônica é determinada pela atividade enzimática da enzima frente a diferentes substratos sintéticos de p-nitrofenil (palmitatos, lauratos, octanoatos, butiratos, acetatos, entre outros) (TOSCANO et al., 2013).
3.7 Resíduos agroindustriais
Os resíduos agroindustriais são gerados em grande quantidade nos países em desenvolvimento de modo que o destino correto é um desafio para esses países. Geralmente são encaminhados para incineração ou aterros sanitários. Todavia, práticas incorretas de gerenciamento de resíduos como a contaminação de lençóis freáticos em aterros bem como a poluição do ar pela incineração acarretam problemas ambientais e de saúde pública. Ademais, outra destinação dos subprodutos agroindustriais é o aproveitamento na ração animal. Porém, esse uso é limitado quando há presença de compostos tóxicos (SALIHU; BALA; BALA, 2013; YAZID et al., 2017).
Os resíduos orgânicos são constituídos de carboidratos, minerais e proteínas que podem ser usados como substratos em bioprocessos. Uma vez que o cultivo microbiano requer nutrientes e umidade, os resíduos orgânicos são potenciais candidatos para fornecer as condições adequadas de crescimento com custos baixos, com mínimo ou nenhum tratamento prévio; agregando valor às matérias-primas por meio da produção de substâncias de interesse econômico, como as enzimas (PINTO et al., 2005; SALIHU et al., 2012).
Dessa forma, muitos resíduos agrícolas e agroindustriais podem ser usados como substratos para a FES, contribuindo para minimização de impactos ambientais e sendo uma alternativa economicamente viável pela redução de custos de produção. Dentre os resíduos agroindustriais utilizados para produção de enzimas por FES estão farelo de trigo, torta de soja, casca de arroz, torta de óleo de amêndoas, torta de azeite, bagaço de cana, torta de babaçu e torta de amendoim (FLEURI et al., 2014; SALIHU; BALA; BALA, 2013).
3.7.1 Torta de algodão
A torta de algodão, também chamada de torta de sementes de algodão, é a matéria residual que permanece após a extração de óleo de sementes de algodão. Tendo em vista a crescente produção mundial de algodão, estimada em 27,7 milhões de toneladas em 2027 (OECD, 2018), a geração desse resíduo também aumenta proporcionalmente.
Atualmente a torta de algodão é usada como uma boa fonte nutricional para alimentação animal, apresentando altos níveis de proteína e energia (BOMFIM; SILVA; SANTOS, 2009). No entanto, várias espécies são sensíveis aos efeitos tóxicos de um composto polifenólico presente, denominado gossipol. Particular importância é dada para as espécies monogástricas (como pássaros, porcos e roedores) nos quais pequenas quantidades desse composto podem causar efeitos negativos como dificuldade respiratória, imunotoxicidade, redução do crescimento, doenças reprodutivas e anormalidades intestinais. Intoxicação menos intensa acontece também com os ruminantes (GADELHA et al., 2014; GREWAL; KHARE, 2017; MAGESHWARAN; PARVEZ, 2016).
Dada essa toxicidade e os níveis máximos estritamente permitidos para o gossipol livre, a torta de algodão precisa ser processada para diminuir a concentração dessa molécula até os níveis permitidos (em caso da alimentação de não ruminantes) (MAGESHWARAN; PARVEZ, 2016). A composição da torta de algodão, em contrapartida, é adequada para o crescimento microbiano, de modo que o seu uso como substrato em processo fermentativo é uma alternativa para a desintoxicação, tornando possível sua posterior utilização como ração animal, além de ser útil na produção de compostos químicos com alto valor agregado (GREWAL; KHARE, 2017).
3.7.2 Farelo de trigo
O farelo de trigo é um dos subprodutos da moagem de grãos de trigo. Em virtude da grande produção mundial desse cereal, no qual foi estimada em 754 milhões de toneladas no biênio 2019/2020 (FAO, 2020), esse subproduto é gerado em grande quantidade.
Atualmente, é utilizado como ração animal, em processos biotecnológicos e, em menor grau, para aplicações alimentícias (JAVED et al., 2012). O custo reduzido, a acessibilidade e a composição nutricional heterogênea justificam o interesse pelo seu uso (PRUECKLER et al., 2014).
Em bioprocessos, é utilizado para produção de bioetanol e como substrato de fermentações para produção de enzimas como celulases, xilanases e lipases (WOICIECHOWSKI et al., 2013). A combinação de farelo de trigo com azeite de oliva proporcionou produtividade máxima de lipases em FES. A contribuição positiva do farelo de trigo é atribuída à composição nutricional e por permanecer solto mesmo em condições úmidas, proporcionando uma grande área de superfície para o inóculo (KUMAR; RAY, 2014).
3.7.3 Óleo de vísceras de tilápia do Nilo
Oreochromis niloticus (também conhecida como tilápia do Nilo) é uma das espécies mais indicadas para a piscicultura intensiva pois possui alta taxa de crescimento, adequabilidade em várias condições climáticas e grande aceitação do mercado consumidor (MARTINS et al., 2015).
De acordo com a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura, é uma das espécies mais cultivadas mundialmente na modalidade produção aquícola. Em 2015, no Brasil a produção foi de 219 mil toneladas (FAO, 2016).
Os resíduos gerados a partir do processo de filetagem de peixes representam 65% do peso do peixe vivo, com apenas 35% sendo aproveitado (SANTOS et al., 2017). A geração de resíduos da piscicultura é um problema ambiental porque sendo sua maioria descartada por queima, descarga ou aterro não planejado (SADH et al., 2018). Atualmente, os usos alternativos dos resíduos dos processos de pesca restringem-se à produção de ração animal e de biodiesel (MEDEIROS et al., 2019).
Os óleos de peixe apresentam alto teor de ácidos graxos poli-insaturados, sendo extraídos por cozimento, silagem ácida ou prensagem (MEDEIROS et al., 2019).
Nos últimos anos, as pesquisas investigando o potencial biotecnológico de óleos de peixe têm crescido, sendo alguns exemplos as produções de lipases usando óleo de sardinha como indutor por Geotrichum sp. FO 274A (IKEMOTO; OTA, 1996) e por Cryptococcus sp. (KAMINI et al., 2000); bem como a utilização de farinha e óleo de fígado de bacalhau, de tubarão e de sardinha para produção de lipase por Cryptococcus sp. MTCC 5455 (THIRUNAVUKARASU et al., 2016).
4 METODOLOGIA
4.1 Subprodutos agroindustriais e caracterização físico-química
A utilização dos subprodutos torta de algodão, farelo de trigo e óleo de vísceras de tilápia foi autorizada pelo Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) sob número de cadastro AD83CB1.
4.1.1 Torta de algodão e farelo de trigo
A torta de algodão (Figura 2A) e o farelo de trigo (Figura 2B) foram obtidos no comércio local de Natal – RN e armazenados em recipientes fechados à temperatura ambiente. A torta de algodão, por ter aglomerados de tamanhos distintos, foi triturada em moinho de facas tipo Wiley (Tecnal, TE-680) e tamisada a 20 mesh.
Figura 2 - Torta de algodão triturada (A) e farelo de trigo in natura (B)
Fonte: A autora (2019)
A caracterização físico-química foi realizada de acordo com as metodologias do Instituto Adolfo Lutz (2008) e de Garcia-Amoedo e Almeida-Muradian (2002). Foram executadas as seguintes determinações: umidade (balança por infravermelho), cinzas (método 018/IV), extrato etéreo (método 032/IV), proteína bruta (método 036/IV), fibra bruta (método 044/IV) e carboidratos totais (por diferença).
A atividade de água (Aa) dos subprodutos foi mensurada de acordo com Oliveira Junior (2018). Em recipientes plásticos, 2,0 gramas de cada amostra foram misturados com diferentes volumes de água (0 – 2500 μL) e deixados em repouso durante 30 minutos. Em seguida, foi realizada determinação por leitura direta utilizando o aparelho Aqua Lab (Decagon Devices, EUA, S3TE) com controle de temperatura das amostras em 24 ± 2 °C.
metodologia apresentada por Lopéz et al. (2018). As amostras (1,0 g) foram pesadas (Shimadzu, AUW-220D) em tubos falcon e suspensas em 10 mL de água destilada. Os tubos foram agitados durante 1 min em agitador de tubos tipo vórtex (Phoenix, AP 56) e centrifugados (Solab, SL706) a 4000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado; o precipitado e o tubo falcon foram pesados. O IAA foi calculado conforme Equação 1 e o resultado foi expresso em grama de água por grama de substrato seco. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
𝐼𝐴𝐴 = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑓𝑎𝑙𝑐𝑜𝑛 𝑐𝑜𝑚 𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑡𝑎𝑑𝑜 − 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑓𝑎𝑙𝑐𝑜𝑛 𝑣𝑎𝑧𝑖𝑜 (1)
4.1.2 Óleo de vísceras de tilápia
O óleo de vísceras de tilápia (Figura 3) foi doado pela empresa PISCIS Indústria e Comércio LTDA, localizada em Jaguaribara – Ceará. A amostra foi recebida em recipiente plástico. Em seguida, armazenada em local protegido da luz à temperatura ambiente. O óleo foi caracterizado de acordo com as metodologias do Instituto Adolfo Lutz (2008) quanto ao teor de cinzas (método 018/IV), índice de acidez (método 325/IV) e índice de peróxido (método 326/IV). As análises foram realizadas em triplicata.
Figura 3 - Óleo de vísceras de tilápia
Fonte: A autora (2019)
O perfil de ácidos graxos do óleo foi determinado em colaboração com o Laboratório de Combustíveis e Materiais, do Departamento de Química da Universidade Federal da Paraíba, em Cromatógrafo Gasoso acoplado à Espectrômetro de Massas GCMS-QP2010 (Shimadzu, Kyoto, Japão). Inicialmente foi realizada metilação dos ácidos graxos para produzir os ésteres metílicos correspondentes. Os perfis cromatográficos foram registrados e
as porcentagens foram determinadas por uma curva de calibração com padrões de ésteres metílicos. As condições cromatográficas foram as seguintes: coluna Durabound DB-23 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) a temperatura de 90 °C; temperaturas do injetor e do detector de 230 °C; gradiente de eluição de 90 a 150 °C (10 °C/min), 150 a 200 °C (2 °C/min) e 200 a 230 °C (10 °C/min) no tempo total de corrida 39 minutos. O Hélio foi utilizado como gás de arraste (ALCÂNTARA et al., 2019).
4.2 Micro-organismo
O fungo Aspergillus niger IOC 4003 foi doado pela Coleção de Culturas de Fungos Filamentosos do Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz. O crescimento do micro-organismo ocorreu em placas de Petri contendo meio Ágar Batata Dextrose (ABD) (BD Difco) em estufa (Tecnal, TE-392/I) a 30 ± 2 °C por período de 5 a 10 dias, até expressiva esporulação (Figura 4). Em seguida, em cabine de fluxo laminar (Pachane, PA610), com auxílio de alça de platina foi realizado segundo repique em meio ABD.
Figura 4 - Crescimento de A. niger IOC 4003 em meio Ágar Batata Dextrose
Fonte: A autora (2019)
4.3 Propagação de esporos e manutenção da cepa
Após a ativação do fungo em meio ABD, em cada placa foram pipetados 5 mL de tween 80 (0,5 %, m/v) e a superfície do meio foi raspada com ponteira estéril a fim de desprender os esporos. Em seguida, 1,0 mL da suspensão de esporos foi transferido para frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 4,6 g de sabugo de milho triturado a fim de realizar a propagação de esporos de acordo com a metodologia descrita por Guilherme, Pinto e Rodrigues (2008). Cada frasco foi suplementado com 6,0 mL de solução nutriente constituída por peptona (56 g/L), KH2PO4 (0,76 g/L), ZnSO4 (0,02 g/L) e FeSO4 (0,02 g/L). Os frascos
foram incubados em estufa incubadora BOD (Tecnal, TE 371)a 30 ± 2 °C até esporulação com agitação manual diária.
Os frascos contendo esporos de A. niger IOC 4003 em sabugo de milho foram mantidos sob refrigeração por até 3 meses para manutenção do micro-organismo.
4.4 Preparo do inóculo
A preparação do inóculo foi realizada de acordo com metodologia adaptada de Rocha (2018). Aos frascos contendo o fungo crescido em meio sabugo de milho foram adicionados 15,0 mL de solução tween 80 (0,5 %, m/v) seguido de homogeneização. Posteriormente, foi realizada filtração em gaze estéril para a obtenção da suspensão de esporos. Em tubo de ensaio autoclavado, foi colocado o máximo do conteúdo filtrado. Em seguida, realizou-se uma diluição 1:100 da suspensão utilizando solução tween 80 e transferiu-se 20.0 μL da mesma para câmara de Neubauer e leitura em microscópio óptico (Olympus, BX 51). A contagem de esporos foi realizada no quadrante central contendo 25 sub-compartimentos e calculada conforme Equação 2. Os inóculos foram padronizados em 106, 107 e 108 esporos/mL, que equivalem a 2 ×105, 2 ×106 e 2 ×107 esporos/grama de resíduo, respectivamente.
𝐼𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜 (𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑜𝑠/𝑚𝐿) = 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑜𝑠 𝑥 1000 𝑥 100 (2)
4.5 Planejamento Plackett-Burman
Com o intuito de selecionar os parâmetros que influenciavam de forma significativa a produção de lipases por A. niger IOC 4003 em FES foi conduzido um planejamento experimental fracionado Plackett-Burman. Foram avaliados 11 fatores em 2 níveis (-1; +1) e realizados 12 ensaios com repetição em triplicata no ponto central, totalizando 15 ensaios. A matriz do modelo Plackett-Burman (Tabela 1) foi obtida utilizando o software Statistica 7.0 (StatSoft/EUA).
Tabela 1 - Matriz do Planejamento Plackett-Burman Ensaio Variáveis independentes (níveis codificados)
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 2 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 3 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 4 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 5 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 6 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 7 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 8 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 9 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 10 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 11 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X1: Tempo de cultivo (horas); X2: pH; X3: inóculo (esporos/g de resíduo); X4: umidade (%); X5: óleo de vísceras de tilápia (%); X6: glicose (%); X7: ureia (%); X8: extrato de levedura (%); X9: KH2PO4
(%); X10: MgSO4 (%); X11: proporção torta de algodão/ farelo de trigo Fonte: Software Statistica 7.0 (adaptado)
Foram avaliados os seguintes parâmetros (variáveis independentes) do processo: tempo de cultivo, pH, concentração de inóculo, umidade, óleo de vísceras de tilápia, glicose, ureia, extrato de levedura, KH2PO4, MgSO4 e proporção torta de algodão/ farelo de trigo. Os
valores reais e codificados são apresentados na Tabela 2. No que diz respeito à variável proporção torta de algodão/farelo de trigo, foram adotadas condições semelhantes ao estudo de Costa et al. (2017), sendo testado o substrato farelo de trigo isolado (nível -1), combinação (1:1) dos substratos (nível 0) e torta de algodão isolada (nível +1).
Tabela 2 – Fatores e níveis usados no Planejamento Plackett-Burman
Fatores Níveis
-1 0 +1
X1 - Tempo de cultivo (h) 96 144 192
X2 - pH 5 6 7
X3 - Inóculo (esporos/g de resíduo) 2 x 105 2 x 106 2 x 107
X4 - Umidade (%) 40 50 60
X5 - Óleo de vísceras de tilápia (%) 0 4 8
X6 - Glicose (%) 0 1 2
X7 - Ureia (%) 0 0,35 0,7
X8 - Extrato de levedura (%) 0 1,5 3
X9 - KH2PO4 (%) 0 0,2 0,4
X10 - MgSO4 (%) 0 0,1 0,2
X11 - Torta de algodão/ farelo de trigo 0/100 50/50 100/0
Fonte: A autora (2019)
A FES foi realizada em frascos Erlenmeyers de 250 mL contendo 5,0 gramas de substrato (torta de algodão e/ou farelo de trigo) e óleo de vísceras de tilápia pesados de acordo com a matriz do planejamento. Os Erlenmeyers foram esterilizados durante 20 minutos a 1,0 atm e 121ºC em autoclave (Phoenix; AV-137).
O pH do meio de cultivo foi ajustado pela adição de soluções tampão ácido cítrico-fosfato (pH 5, 6 e 7), que também foram utilizadas para ajuste da umidade. Soluções concentradas dos nutrientes glicose, ureia, extrato de levedura, KH2PO4 e MgSO4 foram
autoclavadas separadamente e adicionadas aos Erlenmeyers com técnica asséptica em cabine de fluxo laminar, conforme matriz do planejamento. A todos os substratos foi adicionada solução de micronutrientes contendo CaCl2 (0,31 g/L), FeSO4.7H2O (0,006 g/L),
MnSO4.7H2O (0,019 g/L) e ZnSO4.7H2O (0,037 g/L). É válido ressaltar que o volume de
tampão utilizado para alcance da umidade desejada foi definido pela construção da curva de umidade vs atividade de água (Apêndice A) e deduzido dos volumes inseridos no meio de cultivo previamente. A inoculação foi realizada conforme descrito no tópico 4.4. e os cultivos incubados em estufa BOD a 30 ± 2 °C com agitação manual diária.
A atividade enzimática das lipases produzidas foi selecionada como variável resposta (variável dependente) e foi mensurada logo após cada cultivo conforme descrito no tópico 4.7.1. As análises do planejamento experimental foram desenvolvidas utilizando o software Statistica 7.0 (StatSoft, EUA).
4.6 Extração enzimática
Após o cultivo, foi realizada a extração das enzimas presentes no meio fermentado de acordo com metodologia adaptada de Rocha (2018). Foi utilizado tampão Tris-HCl (0,05 M, pH 8) na proporção 10,0 mL de tampão para cada 1,0 g de resíduo e incubado sob agitação de 150 rpm em incubador rotativo (Tecnal, TE 421) a 30 ± 2 °C por 30 minutos. Em seguida, o micélio fúngico foi separado do extrato enzimático por filtração a vácuo. O extrato foi submetido à centrifugação por 3500 rpm durante 15 minutos e filtrado com membrana de 0,22 μm. A determinação da atividade enzimática foi realizada e o extrato enzimático foi armazenado em microtubos a -20 °C.
4.7 Determinação da atividade enzimática da lipase
4.7.1 Método espectrofotométrico (Método 1)
A atividade das lipases produzidas foi determinada por espectrofotometria em leitora de microplaca (Asys, UVM 340) utilizando o substrato cromogênico p-nitrofenil-palmitato (pNPP), que é hidrolisado pela lipase liberando o composto de coloração amarela p-nitrofenol e ácidos graxos (GUIMARÃES et al., 2014).
Inicialmente, foram preparadas solução de 3,0 mg/mL de pNPP (Sigma-Aldrich) em isopropanol e solução de 55,5 mg de goma arábica e 222,2 mg de triton X-100 em 50 mL de tampão Tris-HCl (0,05 M, pH 8). Ambas foram mantidas em banho-maria (Tecnal, TE 056) a 37 ºC por cerca de 10 minutos. Em seguida foi preparada emulsão ao gotejar a solução de pNPP vagarosamente na solução de goma arábica e triton X-100 em agitador magnético na proporção 1:9 (v/v). Após incubação em estufa (Tecnal, TE 393/2) a 37 ºC, 10,0 μL de cada amostra e 90,0 μL da emulsão foram pipetadas em microplaca e lidas em espectrofotômetro a 410 nm para mensuração da absorbância inicial. A microplaca foi incubada por 30 minutos a 37 ºC e realizada nova leitura a 410 nm (absorbância final) (GUIMARÃES et al., 2014).
O cálculo da atividade enzimática foi realizado usando a equação da reta previamente obtida com a curva padrão de p-nitrofenol (Sigma-Aldrich) nas concentrações de 0 a 16,0 nmol de p-nitrofenol/poço (Apêndice B) e as Equações 3 e 4.
