Identificação de bactérias por análise dos ácidos graxos. - Portal Embrapa

(1)

M é to d o s U tiliza d o s no

B io c o n tro /e d e F ito p a tó g e n o s

Métodos usados no . . .

2007

LV- 2008.00018

(2)

EnJ^pa

E m p resa Brasileira d e P e sq u isa A g ro p e c u á ria E m b ra p a U va e Vinho

M in is té rio da A g ricu ltu ra , P e cu á ria e A b a s te c im e n to

M é to d o s usados no

B iocontrole de Fito p ató g en o s

E d ito re s :

Rosa M a ria V a ld e b e n ito S a n h u e z a Ita m a r S o a re s d e M e lo

Bento Gonçalves, RS 2007

(3)

E x e m p la re s d e s ta p u b lic a ç ã o p o d e m s e r a d q u ir id o s na: E m b ra p a U v a e V in h o Rua Livramento. 515 Caixa Postal 130 Fone: (0xx)54 3455 8 0 0 0 Fax: (0xx)54 3451 2792 h ttp ://w w w .cn p u v.e m b ra p a.b r sac@cnpuv.embrapa.br C o m itê d e P u b lic a ç õ e s

Presidente: Lucas da Ressurreição Garrido Secretária-Executiva: Sandra de Souza Sebben

Membros: Luiz A n te n o r fíizzon. Kátia M id o ri Hiwatashi, Osm ar Nickel.

Viviane M aria Zanelia Bello Fialho

Normalização bibliográfica: Kátia M id o ri Hiwatashi Elaboração da capa: Luciana Elena M endonça Prado

1f e d iç ã o

1S impressão (2007): 5 0 0 exemplares

T o do s os d ire ito s r e s e r v a d o s .

A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei ne 9.610).

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Embrapa Uva e Vinho

M étodos usados no biocontrole de fitopatógenos/E ditado por Rosa Maria Valdebenito Sanhueza e Itamar Soares de Melo. - Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho. 2007.

141 p.

ISBN 978-85-89921-05-3

1. Doença de planta. 2. Antagonismo. 3. M icrorganismo. I. Valdebenito Sanhuera, Rosa Maria, ed. II. Melo, Itamar Soares de. ed.

CDD 579 (21. Ed.) © Embrapia, 2007

(4)

A p r e s e n ta ç ã o

Em consonância com a missão institucional da Embrapa Uva e Vinho, desde longa data vêm sendo desenvolvidas ações de pesquisa e desenvolvim ento que têm gerado im portantes resultados no tocante ao com ponente am biental. E isto ocorre porque é com provada a necessidade de buscar-se o desenvolvim ento sustentado do espaço rural, tendo-se em vista as exigências de m ercado, dos produtores e dos órgãos ambientais em reduzir-se o im pacto am biental da atividade produtiva.

E neste contexto que o controle biológico se insere. Ao m axim izar o uso de organism os naturais no m anejo de pragas e doenças, esta tecnologia contribui decisivam ente para que a produção se dê com reduzido im pacto, em benefício da alm ejada sustentabilidade. Esta publicação é resultante de estudos de pesquisadores da Embrapa Uva e Vinho e de outras Unidades da Embrapa, além de essenciais parceiros, os quais, em parceria, tê m contribuído para a m elhoria do conhecim ento sobre esta im portante área.

Temos certeza que as inform ações aqui divulgadas servirão para o m aior conhecim ento e uso do controle biológico, bem com o de estím ulo e suporte para novas ações de pesquisa que resultem em tecnologias am bientalm ente lim pas e tecnicam ente viáveis.

Alexandre H offm ann Chefe-Geral Embrapa Uva e Vinho

(5)

S u m á rio

Isolam ento de antagonistas a pató ge n os que colonizam ferim entos de plantas

Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 9

O btenção de epífitas de frutos e seleção de antagonistas no controle de podridões de pós-colheita

Isolam ento de colonizadores de clam idosporos de Fusarium oxysporum

Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 17

Isolam ento de bactérias do rizoplano e endorizosfera e seu efeito na colonização de raízes e na p ro m o ção do crescim ento de plantas

Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 21

Isolam ento de antagonistas para controle de doenças vasculares

Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 27

A valiação do efeito p ro te to r e curativo de antagonistas a patógenos que colonizam folhas

Rosa M aria V aldebenito Sanhueza, M argareth Z am b on i-P in otti e A n a Elisa S ilveira Perez ... 31

M ultiplica ção de C lonostachys rosea

Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Gilberto D all Onder ... 35

Seleção de fungos e nd ofíticos em fruteiras e flores

Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e M argareth Zam boni-Pinoti ... 39

Isolam ento seletivo de bactérias ativas para nucleação de gelo

(6)

Isolam ento de fungos m icorrízicos

Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 45

Isolam ento seletivo de Bacillus

W agner B e ttio l ... 49

O btenção de m utantes e co m p etitivid ad e de isolados de bactérias resistentes a antibióticos

Ita m ar Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 53

O btenção de m utantes de Trichoderma spp. resistentes a fungicidas

Ita m a r Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 55

Identificação de bactérias por análise dos ácidos graxos

Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 59

Identificação de bactérias pelo seqüenciam ento de genes 16S ribossôm ico (16S rDNA)

Fernando D in i A n d re o te ... 67

Identificação e diferenciação de linhagens de leveduras antagônicas a fito pa tó ge no s utilizando sondas convencionais com o indicadores na reação de polim erização em cadeia

Luis Fernando Revers e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 75

Produção de sideróforos por rizobactérias

Ita m a r Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 79

Produção de a ntibióticos por m icrorganism os

(7)

Produção de bactérias para uso no controle biológico

Deise M aria Fontana C apalbo ... 97

Encapsulam ento de m icrorganism os

Roteiro para form ulação experim ental pó m olhável de biopesticida (sigla internacional WP)

Cláudia M ed ug no ... 109

Isolam ento de actinom icetos visando ao controle biológico de fitopatógenos

Joelm a M arcon, Jose A n to n io da S i Iva e M aria Ca rolina Quecine ... 117

Avaliação in vitro da colonização de raízes por rizobactérias

B rigida P. Vi la r Queiroz e Ita m a r Soares de M elo ... 121

Seleção de rizobactérias capazes de form arem biofilm es

Francisco Eduardo de C. Costa e Ita m a r Soares de M elo ... 125

Avaliação ecotoxicológica de m icrorganism os em organism os não-alvo, organism os aquáticos e mamíferos

Vera Lúcia de Castro e Cláudio Jonsson ... 129

Apêndice

(8)

M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos - 59

Id e n tific a ç ã o de bactérias por

an álise dos ácidos graxos

Itamar Soares de Melo ’ Márcia Maria Parma2

As m em branas de bactérias co ntê m lipídios com o principal com ponente. A com posição dos ácidos graxos desses lipídios é característica das diferentes taxas, e por isso p od em ser usados com o biom arcadores. A recuperação q ua ntita tiva e análise dos ácidos graxos podem ser usadas para d efin ir os m em bros de um a co m u n id a d e m icrobiana.

Ácidos graxos que co nte nh a m de 9 a 20 carbonos na cadeia têm sido utilizados para caracterizar gêneros e espécies de bactérias, especialm ente aqueles que seriam categorizados co m o o rganism os Gram negativos não-ferm entativos. Com o advento das co lu na s capilares de sílica fundida te m se tornado prático usar crom atografia gasosa e ésteres m etílicos de ácidos graxos de células inteiras para ide ntifica r um a gam a de bactérias.

Um sistem a de s o ftw a re (M icro b ia l ID, Inc., Newark, Dell) e hardware (Hewleh- Packard Co.) c o m b in a d o s e identificados com o Sistema de Identificação M icrobiológica (M IS) te m sido disponível com ercialm ente. 0 MIS é baseado em ácidos graxos que tê m cadeias de 9 a 20 carbonos retas, ram ificadas, saturadas ou insaturadas e que c o nte nh a m grupos hidroxi e ciclopropano. 0 sistema usa crom atografia gasosa de alta-resolução para determ inar a com posição de ácidos graxos de isolados bacterianos de interesse e, então, faz busca contra bibliotecas de c o m p osiçã o conhecida. As bibliotecas incluem aquelas disponíveis do "M ic ro b ia l ID" e ta m b é m aquelas geradas pelo usuário ou outros pesquisadores.

Hoje em dia m ais de 3 0 0 ácidos graxos e com postos relacionados têm sido encontrados em bactérias analisadas pelo MIS.

1 Eng. Agrôn., Doutor, Embrapa Meio Ambiente. Caixa Postal 69, 13820-000 Jaguariúna, SP.

2 Química. Laboratório de Mícrobiologia Ambiental, Embrapa Meio Ambiente, Caixa Postal 69, 13820-000 Jaguariúna, SP

(9)

6 0 - M é to d o s usados no B ioco n tro le de Fito p a tó ge n o s

N o m e n c la tu r a d o s Á c id o s G ra x o s

A seguir será apresentada um a e xem plificaçã o da nom enclatura de um ácido graxo.

A cadeia do á cid o graxo abaixo observada (Figura 1) te m 18 carbonos e seria e scrito 18:0 se ela não tivesse nenhum dos grupos fu n cio n a is apresentados de (a) a (f). Para n om ea r um c o m p osto c o m o sendo 19:0 ISO este deveria co n te r os 18 ca rb on os na cadeia line ar e ainda apresentar um grupo m etílico (a) do se gu nd o ao ú ltim o carbono, enquanto que para ser 19:0 ANTEISO deveria c o n te r o g ru p o m e tílico (b) do te rce iro ao ú ltim o carbono. A ligação dupla (c) te m a m b os h id ro g ê n io s posicion ad os do m esm o lado, e é escrito com o sendo 18:1 cis 11, desde que a única ligação dupla desta cadeia - indicada na n o m e n c la tu ra co m o :J_ - esteja depois do d é c im o p rim e iro carbono. Se os h id ro g ên io s estiverem em lados opostos, o c o m p o sto seria escrito 18:1 trans 11. O c ic lo p ro p a n o c o n tid o entre os carbonos 9 e 10 desta cadeia de 18 carbonos (d) deve ser e scrito c o m o 19:0 CICLO 9-10. O g ru po hidroxila adicionado ao te rc e iro ca rb o n o é d e scrito c o m o 18:0 30H (e), e nquanto o grupo hidroxila no se gu nd o ca rb o n o (f) é d es c rito c o m o 18:0 20H. (a) (b) (d) (e) (f) H c h3 c h3 h h h (c) c h2 h h h h h o h o h

o

I I I I I I / \ I I I I I I I II H - C - C —C - C - C - C - C = C —C - C - C - C - C - C - C —C - C - C - O H I I I I I I I I I I I I I I I I I H H H H H H H H H H H H H H H H H 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Fig. 1. Cadeia de um ácido graxo.

O b je tiv o

Id e n tifica çã o rápida de b actérias aeróbicas por C ro m ato gra fia Gasosa fazendo uso de ácidos graxos de suas m em brana.

(10)

M é to d o s usados no B ioco n tro le de F ito p a tó ge n o s - 61

P ro to c o lo

E tap a I - C u ltiv o d a s B a c té ria s

C ultivar as bactérias pelo m é to d o das estrias cruzadas, em m eio TSBA de m arca BBL (Trypticase Soy Broth A gar) que consiste de 3 0 g de Trypticase Soy Broth BBL e 15 g de Agar BBL em 1 litro de água destilada.

Nota: A m arca BBL é recom endada para uso te n d o em vista que a C rom atografia é uma análise com parativa. As bib lio te cas a dq u irid a s para co m p araçã o possuem certos requisitos o b rig a tó rio s e um deles é o uso de m eios de m arcas específicas. A utilização de m eios de cu ltura de outras m arcas pode não apresentar resultados equivalentes.

As bactérias aeróbicas que não crescerem neste m eio p od em ser in icia lm e n te cultivadas em m eios m ais apropriados para seu crescim en to, m as para a identificação em C rom atografia Gasosa (M IS) é necessário que estas bactérias sejam posteriorm ente repicadas em m eio TSBA.

Nota: Após repicagem os isolados deverão ser in cu ba do s sob a c o n d iç ã o de tem peratura de 28 ± 1°C e p or um te m p o de 24 ± 2 horas para então dar início às etapas de extração.

E tap a II - E x tra ç ã o d o s Á c id o s G ra x o s

1. 4 0 mg de massa de células são tra n sfe rid o s para tu b o s de cu ltura de 13 x 100 mm.

2. Am ostras são, p rim eira m en te, sa ponificadas com 1,0 ± 0,1 m L do reagente de saponificação (45 g de h id ró xido de sódio, 150 m L de m eta no l e 150 m L de água destilada e deionizada), agitadas co m "vo rte x" por 10 segundos, aquecidas a 100°C p or 5 m inutos em banho-m aria, agitadas novam ente por 10 segundos, re-aquecidas a 100 QC p o r m ais 25 m in u to s e, p or ú ltim o, colocadas em banho de água para resfriarem até a tin g ir a te m p e ra tu ra am biente.

3. As amostras passam para o segundo passo, o de m e tila çã o dos ácidos celulares, que é realizado com a adição de 2 ,0 ± 0 , 1 m L do reagente de m etilação (325 m L de HCI 6 .0 N e 275 m L de m etanol), a gita ção p or 10 segundos, aqu ecim en to a 8 0 i 1SC p or 10 ± 1 m in u to s e resfriam en to em banho de água para a tin g ire m a te m p e ra tu ra a m b ie n te . Esta é a etapa m ais im portante no processo de extração dos á cid os graxos e, por isso, deve ser realizada seguindo to da s as orientações apresentadas.

(11)

62 - M é to d o s usados no B ioco n tro le de F ito p a tó ge n o s

Nota: É im p o rta n te dizer que não é recom endado o uso de banho de água gelada, m as sim a te m p e ra tu ra a m biente.

4. Os ácidos graxos m e tila d o s são separados da fase aquosa com adição de 1,25 ± 0 , 1 m L do reagente de extração (10 0 mL de hexano e 100 m L de te rc -b u til m etil é ter) e a g ita d o s lentam ente em rotator clín ico por 10 m inutos. Poderá ser observada a fo rm a ç ã o de duas fases: um a superior (orgânica) e outra in fe rio r (aquosa). C om a ajuda de uma pipeta Pasteur retire a fase aquosa (in fe rio r) e a d esca rte , reservando a fase o rgânica (superior) ainda nos tu b o s.

N ota: Faz-se necessário o uso de um a pipeta Pasteur para cada amostra, a fim de que não o co rra m c o n ta m in a çõ e s.

5. As am ostras são fin a lm e n te lavadas com a adição de 3 ,0 ± 0 , 1 mL de solução de lavagem (10 ,8 g de h id ró x id o de sódio e 9 0 0 m L de água destilada e deionizada) e a gita da s le n ta m e n te em rotator clínico p or 5 m inutos. Uma em ulsão entre as fases o rgânica e aquosa poderá ser fo rm a d a e, neste caso, os tu b o s a m ostrais devem passar por centrifugação a 2 .0 0 0 RPM por 3 m in utos. A fase o rgânica superior, contendo os ésteres m etílicos de ácidos graxos - FAMEs, é então tra n s fe rid a com a utilização de pipeta Pasteur para frascos de v id ro (vials de 2 m L) para análise crom atog rá fica.

Nota: R ecom endam os fin a lm e n te que todos os reagentes utilizados na preparação das soluções necessárias no processo de extração dos ácidos graxos sejam de m arca de renom e, para evitar o risco de uma identificação equivocada. No processo d es c rito pelo MIS há a indicação do uso de reagentes da m arca Fisher.

E ta p a III - In je ç ã o n o C r o m a tó g r a fo G aso so

O C ro m a tó g ra fo Gasoso A g ile n te GC 6 8 5 0 utilizado na id e n tific a ç ã o das bactérias possui um p rogram a de s e q u en cia m en to que perm ite a realização de injeções a u to m á tica s de várias am ostras, o que torna o processo m ais ágil. Assim , basta p ro gram a r o S h erlock S e qu e nce r para dar início às id e ntifica çõe s.

E ta p a IV - O b te n ç ã o d e C ro m a to g ra m a s

O C ro m a tó g ra fo Gasoso A g ile n te GC 6 8 5 0 possui com o acessórios uma coluna ca p ila r U ltra 2 e um D e te c to r de lonização em Chama (FID) que são responsáveis pela id e n tific a ç ã o dos ésteres de ácidos graxos m etilad o s da bactéria. Estes ésteres passam in ic ila m e n te pela coluna capilar e aí são separados.

(12)

Em seguida passam pelo FID, que processa o resu ltad o (te m p o de retenção do ácido graxo na coluna, proporção da á re a /a ltu ra e p orcen ta ge m da área do pico) criando um sinal que é guardado em um program a ch a m a d o C hem S tation. Uma am ostra de bactéria é com posta por vá rios sinais (que são apresentados no g rá fic o na fo rm a de picos). Após to d o s os sinais da am ostra te re m sido depositados no C hem Station, este im p rim e os sinais plo ta do s e integ ra do s, o rig in a n d o um g rá fic o que é cham ado de c rom atog ra m a .

E ta p a V - Id e n tific a ç ã o d e B a c té ria s

Q uando a corrida da am ostra é encerrada e o cro m a to g ra m a é o b tid o , o te m p o de retenção, a proporção da á re a/a ltu ra e a p o rce n ta g e m da área de cada pico são tran sm itid os do C hem S tation para o p rogram a S herlock que prom overá outros processam entos dos dados. Com o já d ito , o c ro m a to g ra m a é um g rá fic o que contém vários picos, sendo que cada pico o bse rva do nele é id e n tific a d o e nom eado.

Q uando é te rm inada a nom eação de to d o s os picos do cro m a to g ra m a , o Sherlock irá com parar os resultados o b tid o s à b ib lio te c a associada ao M é to d o de Identificação de M icroorganism os (MIS). A b ib lio te c a leva em co nsideração ta nto o nom e do pico, quanto a sua p orcen ta ge m o b tid a . A p ó s a procura e com paração com os dados da biblioteca, o c o m p u ta d o r im p rim e o R elatório de Com posição da am ostra, que é o relatório em que aparece a id e n tific a ç ã o da bactéria que se está analisando (Tabela 1).

E ta p a V I - O b te n ç ã o d e D e n d o g ra m a

0 dendogram a é uma técnica de análise em a g ru p a m e n to disposta g ra fica m e n te que apresenta o relacionam ento entre o rg an ism o s.

A distância euclidiana é um m étodo predativo que ajuda a q u a n tific a r a d iversidade por m eio de m edidas de dissim ilaridade. C on side ra nd o estas m ed id a s serão aplicados m étodos aglom erativos, p e rm itin d o o estudo da d ive rsid ad e entre os m ateriais avaliados.

(13)

6 4 - M é to d o s usados no B ioco n tro le de Fito p a tó ge n o s

Tabela 1: Relatório de composição da análise do perfil de ácidos graxos que compõe

uma amostra bacteriana, mostrando os picos de referência obtidos pelo cromatograma que irão identificar quali e quantitativamente tal amostra.

RT Response Ar/Ht RFact ECL Peak Percent Commentl Comment2

1,709 3.617E+8 0.029 — 7,012 SOLVENT — < min rt

1,812 2488 0,008 — 7,218 — < min rt

1,900 1779 0,033 _ _ 7,396 — < min rt

1,981 414 0,033 — 7,557 — < min rt

2,048 468 0,032 — 7,691 — < min rt

2,610 279 0,027 — 8,819 — < min rt

4,440 1599 0,030 1,063 11,609 12:0 ISO 0,92 ECL Reference

4,796 502 0,033 1,043 12,000 12:0 0,28 ECL Reference

5,599 2281 0,034 1,013 12,702 13:0 1,25 ECL Reference

7,302 5090 0,037 0,973 14,000 14:0 2,68 ECL Reference

7,550 451 0,038 — 14,161 —

8,399 8237 0,039 0,958 14,714 15:0 4,27 ECL Reference

8,839 468 0,039 0,953 15,000 15:0 — ECL

9,486 1648 0,041 0,947 15,389 16:1 w7c 0,85 ECL

9,645 5088 0,043 0,946 15,484 Sum In 2,61 ECL 16:1 ISO

10,104 569 0,042 0,943 15,760 16:1 w11c 0,29 ECL

10,267 21244 0,045 0,942 15,857 Sum In 10,83 ECL 15:0 ISO

10,502 9817 0,044 0,940 15,999 16:0 5,00 ECL Reference

10,882 823 0,044 0,938 16,218 15:0 20H 0,42 ECL

11,178 5932 0,051 0,937 16,390 ISSO 17:1 3,01 ECL

11,306 7735 0,051 0,936 16,463 ISSO 17:1 3,92 ECL

11,445 1480 0,045 0,936 16,544 17:1 0,75 ECL

11,757 2096 0,044 0,934 16,724 17:0 1,06 ECL Reference

13,998 581 0,041 0,928 17,999 18:0 0,29 ECL Reference

— 5088 _ — — Summed 2,61 12:0 ALDE unknown

— --- _ _ «T- • ~ 16:1 ISO 14:0

— 21244 — — ---- Summed 10,83 16:1 15:0 ISO

ECL Deviation: 0 ,0 0 2 Reference ECL Shift: 0 .0 0 2 Num ber Reference Peaks: 13 Total Response: 192971 Total Nam ed: 192520

Percent Named: 99,77% Total A m o u n t: 185189

Matches:

Library Sim Index Entry Name

TSBA50 5.00 0,862 BacilIus-cereus-GC subgroup A

0,681 Bacillus-thuringiensis-kurstakii

0,582 Bacillus-thuringiensis-israelensis

0,531 BacilIus-cereus-GC subgroup B

(14)

A distância euclidiana pode ser estim ada to m a nd o -se p or base dados sem repetições, com o é o caso de dados o riu n d o s de banco a tivo de g erm o pla sm a , tornando-se viável a sua aplicação.

Experiências realizadas co m um núm ero g rande de am ostras m icro bian as resultaram nas seguintes diretrizes para a D istância Euclidiana:

- Am ostras com D istância Euclidiana igual ou m e n o r que 10 são consideradas da m esm a espécie;

- Am ostras com D istância Euclidiana igual ou m e n o r que 6 são tip ic a m e n te da m esm a subespécie ou bió tipo ;

- A m ostras com D istância Euclidiana igual ou m e n o r que 2,5 são de duas corridas diferentes da m esm a linhagem .

M as tem-se que to m a r cu id a d o na interpretaçã o de um d e n do gram a , pois se um acoplam ento ocorre num a faixa de 10 ou m ais isto não que r dizer que os dois m icrorganism os são de d iferen te s espécies.

Assim sendo, o den do gram a apresenta in fo rm a ç õ e s sobre am ostras que são agrupadas. Ele ta m b é m pode indicar c o n ta m in a ç ã o ou então a presença de um organism o diferente. O den do gram a pode ser usado para d e te rm in a r um g ru p o de uma determ inada am ostra bem co m o separá-lo co n fia v e lm e n te em dois ou m ais subgrupos.

C o n s id e ra ç õ e s F in a is

A técnica de identificação de bactérias, p or utiliza ção do M IS, te m apresentado grandes vantagens para uso laboratorial. A p rin c ip a l delas é relativa ao te m p o gasto em um processo de extração, que leva no m á x im o três dias para ocorrer, em relação à quantidade de m aterial o b tid o para id e n tific a ç ã o (cerca de 20 a 30 ésteres de ácidos graxos m etila d o s /p ro c e s s o ). Esta é um a té c n ic a recente, porém promissora, e que vem sendo a m p la m e n te d ivu lga da e e m pregada por pesquisadores de to do s os continentes.

L ite ra tu ra C o n s u lta d a

SASSER, M. Id e n tific a tio n o f b a c té ria b y g ás c h r o m a to g r a p h y o f c e lu la r

f a t t y acids. Newark, DE: M IDI, 1990. (Tech. N ote, 101)

MICROBIAL ide ntifica tion system ope ra ting m anual version 4 .0. N ew ark, DE: MIDI, 2001.