Quatro grupos de pesquisadores paulistas. Marcadores da fertilização. tecnologia Pecuária y

Novas técnicas mapeiam a função de

proteínas, carboidratos e lipídeos para obtenção

de embriões bovinos de melhor qualidade

tecnologia

y

marcadores

da fertilização

mico de marcadores moleculares presentes em óvulos e embriões por meio da técnica de espec-trometria de massas, desenvolvido em parceria por pesquisadores da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) e da Universidade de São Paulo (USP), poderá representar um avanço significativo nas biotecnologias da reprodução. “Com o uso dessa ferramenta analítica é possível visualizar partes específicas do embrião bovino, como a zona pelúcida, que reveste todo o embrião e é responsável por sua ligação com o útero”, ex-plica o professor Rodrigo Catharino, coordena-dor das pesquisas e do Laboratório Innovare de Biomarcadores, vinculado à Faculdade de Ciên-cias Farmacêuticas da Unicamp. A presença de biomarcadores como os lipídeos, que funcionam como indicadores de processos biológicos, pode melhorar essa ligação, resultando em prenhez com mais chance de sucesso. Na fertilização in

vitro, os óvulos coletados de uma vaca doadora

são maturados e fecundados no laboratório. Após a fecundação, os possíveis zigotos – células diploi-des formadas pela fusão do óvulo com o esper-matozoide – permanecem em incubadora para se

Q

pau-listas dedicam-se a mapear e a re-lacionar a função de marcadores moleculares como lipídeos, proteí-nas e carboidratos com o auxílio de técnicas de análise não invasivas, que utilizam

lasers e espectrômetros, para selecionar na

fer-tilização in vitro (em laboratório) os melhores embriões bovinos. O objetivo é garantir o sucesso de gestação ao transferi-los para o útero da vaca. Embora o Brasil detenha atualmente o primeiro posto na produção mundial in vitro – com 366.517 embriões bovinos produzidos em 2013, corres-pondentes a 70% do total –, há muito a melho-rar, porque as perdas estão entre 20% e 60%. A variação nessas taxas deve-se, entre outros fa-tores, à qualidade do embrião e à receptividade do endométrio, a membrana que reveste o útero.

O avanço de técnicas rápidas, menos invasivas e a custo factível na análise e seleção de embriões poderá ajudar nos procedimentos biotecnológi-cos da reprodução tanto em animais como em humanos, no futuro. Um método inovador, que une a produção de imagens ao mapeamento

quí-Dinorah ereno foto iN v it r o b r a si l il u st r açã o al e x a N d re te le s

desenvolver por sete dias, quando são congelados ou transferidos para uma va-ca receptora.

As pesquisas resultaram em dois artigos científicos. No primeiro deles, publi-cado na Analytica Chimica

Acta, os autores

descre-vem o uso da espectrome-tria de massas na modali-dade Maldi para visuali-zar as diversas zonas que compõem o embrião bovi-no. Na Maldi, uma matriz – geralmente um ácido or-gânico capaz de absorver a luz – é aplicada sobre a amostra e, em seguida, são feitos disparos de

fei-xes de laser, que resultam na formação de íons (átomos com perda de elétrons). As moléculas ionizadas entram em um tubo submetido a vácuo (analisador) e são levadas até um detector. Os íons com tamanho menor passam mais rapida-mente pelo tubo do que os maiores. Dessa forma, as substâncias das amostras formam espectros, cada um com massa diferente.

“A reunião dos pontos e a informação de qual molécula faz parte do espectro de massas permi-tem saber qual biomarcador é mais prevalente em cada local da amostra”, diz Catharino. “Consegui-mos ver as estruturas separadamente, e não ape-nas o corpo do embrião e do oócito [célula sexual produzida nos ovários dos animais], como se vê pelas técnicas clássicas de análise.” Ele ressalta que a possibilidade de saber a exata localização de um marcador químico configura uma inova-ção. “Muitos marcadores descritos nos trabalhos são inéditos, o que significa que ainda é

preci-so muita pesquisa para descobrir o que eles representam no processo de produção de embriões in vitro.”

O segundo artigo, publicado na revista Reproduction, Fertility and

Development, descreve o uso do

es-pectrômetro Maldi para investigar a evolução de lipídeos biomarcadores em óvulos bovinos e em embriões de até oito células e blastocistos, es-truturas esféricas formadas em um estágio mais avançado do desenvol-vimento embrionário. “Foi possível diferenciar quimicamente os lipídeos em cada fase do embrião porque eles funcionam como assinaturas quími-cas dos estágios de desenvolvimen-to.” Participaram dos desenvolvi-mentos pesquisadores do Innovare, a pesquisadora Roseli Gonçalves e o professor José Visintin, da Faculdade de Medici-na Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da USP, além de Peter Bols, da Universidade da Antuérpia, na Bélgica, Gary Killian, da Universidade Estadual da Pensilvânia, nos Estados Unidos, e o médico veterinário Marcos Achilles, da empresa Achilles Genetics, de Garça, no interior paulista.

Roseli, da USP, que desenvolve um projeto de pesquisa no programa Jovens Pesquisadores em Centros Emergentes da FAPESP, diz que o pro-cesso de fecundação ainda não está totalmente definido, por isso a importância dos resultados obtidos nas pesquisas. Durante o seu doutorado, feito na FMVZ da USP com bolsa da FAPESP, ela estudou no John Almquist Research Center, na Universidade Estadual da Pensilvânia, onde trabalhou com marcadores de fertilidade sob orientação de Gary Killian. Ao terminar o dou-torado, participou de um projeto coordenado por Killian, que resultou no isolamento de uma 1 e 2 embriões bovinos em fase de blastocisto e sistema de avaliação por espectroscopia raman 3 análise de embrião pela técnica Maldi

a possibilidade

de saber a

exata

localização de

cada marcador

químico

configura uma

inovação

com alta fertilidade. “Vimos o efeito dessa pro-teína na produção in vitro de embriões bovinos e no congelamento de sêmen”, diz Roseli, que trabalhou nesse projeto até o fim de 2004.

n

campus de Santo André, na Região

Metro-politana de São Paulo, a professora Marcel-la Pecora MiMarcel-lazzotto está desde 2010 à frente de pesquisas com embriões bovinos em colaboração com Herculano da Silva Martinho, físico de forma-ção. O primeiro projeto teve como objetivo avaliar a interação da luz de um laser de baixa intensida-de com materiais biológicos. “Usamos o laser para estimular espermatozoides, oócitos e embriões bovinos e tivemos resultados interessantes com o gameta feminino [células reprodutoras]”, diz Marcella. “Conseguimos ativar vias importantes de sinalização dentro das células no processo de amadurecimento desse gameta. Percebemos que a luz influencia tanto a produção como a ativação de proteínas presentes nesses oócitos.”

Além desse projeto, o grupo também trabalha com análises por espectroscopia Raman, que uti-liza um feixe de luz para colher informação quí-mica e estrutural de material biológico. Em uma das pesquisas realizadas o objetivo era descobrir o que faltava aos embriões de laboratório para que se assemelhassem aos do campo. Para isso foram feitas comparações. “Usamos as mesmas técnicas utilizadas na reprodução humana, como morfologia embrionária, avaliação da velocidade do embrião em se desenvolver dentro do labo-ratório e análise por espectroscopia Raman dos

copia foram comparados com os de metabolis-mo energético, de gordura e estresse para tentar selecionar os mais viáveis. A descoberta levou a um depósito de patente feito pela universidade.

Na Faculdade de Medicina Veterinária e Zoo-tecnia da Universidade Estadual Paulista (Unesp) de Botucatu, Fernanda da Cruz Landim, do de-partamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, coordena projetos de pesquisa com o intuito de obter informações relacionadas à bio-logia básica dos embriões bovinos para melhorar técnicas importantes destinadas à comercializa-ção do produto, como o aumento da producomercializa-ção embrionária in vitro e a criopreservação, que é o congelamento dos embriões excedentes no pro-cesso de transferência. Em um dos projetos foi feita a comparação da expressão gênica – proces-so em que a informação codificada por um gene é decodificada em uma proteína – entre embriões das raças nelore (Bos taurus indicus) e simental (Bos taurus taurus) produzidos no laboratório e coletados da vaca. “Fizemos um padrão geral da expressão gênica e selecionamos vários genes diferentes envolvidos no metabolismo lipídico”, relata Fernanda.

Para análise das amostras, foi utilizada a es-pectrometria de massas Maldi. “Quando aplica-mos a técnica de Maldi para avaliação do perfil lipídico, com o objetivo de seleção de embriões que poderiam ser mais bem criopreservados, observamos que existe um perfil diferente em relação aos lipídeos da nelore e da simental pro-duzidos in vivo e in vitro.” Os embriões com as melhores qualidades para resistir ao processo de congelamento foram os da simental

produ-zidos no campo. n fo to s 1 e 2 l a b o r a t ó r io d e b io lo g ia d a r eP r o d uçã o a N iM a l/u fa b c 3 l ab o r a t ó ri o iN N o v are i lu st r açã o al e x a N d re te le s 3 Projetos

1. análise do perfil proteico e lipídico de embriões pré-implantacionais

bovinos obtidos por fecundação in vitro, transferência de embriões

e por transferência nuclear de células somáticas pela técnica de espectrometria de massas (nº 2010/01077-9); Modalidade Jovens Pesquisadores em centros emergentes; Pesquisadora responsável roseli fernandes (usP); Investimento r$ 629.986,73 (faPesP).

2. Metabolômica para avaliação não invasiva de embriões bovinos

produzidos in vitro (nº 2012/10351-2); Modalidade auxílio à

Pesqui-sa – regular; PesquiPesqui-sadora responsável Marcella Pecora Milazzotto (ufabc); Investimento r$ 174.631,10 (faPesP).

3. comparação do padrão da expressão gênica global de embriões Bos taurus indicus e Bos taurus taurus produzidos in vitro (nº

2010/09922-0); Modalidade auxílio regular; Pesquisadora responsável fernanda da cruz landim (unesp); Investimento r$ 140.442,19 (faPesP).

artigos científicos

goNçalves, r. f. et al. analysis and characterisation of bovine oocyte

and embryo biomarkers by matrix-assisted desorption ionisation mass spectrometry imaging. reproduction, fertility and Development. 11 jul. 2014 (on-line).

sudaNo, M. J. et al. Phosphatidylcholine and sphingomyelin profiles vary

in Bos taurus indicus and Bos taurus taurus in vitro- and in vivo-produced

1

referência mundial

em produção

investimento em pesquisa e inovação da empresa

in vitro brasil foi responsável por 45% do total

da produção mundial de embriões bovinos em 2013

a

no interior paulista, lidera a produção brasileira de embriões bovinos em labo-ratório – e contribui para o país ser referência mundial nesse campo. Dos 546.628 embriões produzidos em 2013 no mundo, segundo dados da Sociedade Internacional de Tecnologia de Embriões (Iets, na sigla em inglês), a empresa brasileira respondeu por 266 mil deles, ou 45% do total – nessa conta entra a produção dos seus 8 laboratórios próprios e mais 23

afi-liados, em 13 países. “Até 2007, quando terminei o meu dou-torado e comecei a traba-lhar na empresa, a ferti-lização in vitro era ofe-recida principalmente

para animais de elite, doadores de alto

va-lor comercial e ge-nético”, diz Andrea Basso, doutora em reprodução animal pela Universidade

de São Paulo e atualmente chefe de pesquisa da empresa, que no ano passado faturou R$ 15 mi-lhões. Isso ocorria porque era um procedimen-to caro e no Brasil a tecnologia ainda estava em desenvolvimento. “No início, por exemplo, não era possível coletar oócitos e transportá-los por mais de oito horas antes de chegar ao laboratório. Hoje podemos transportá-los por até 24 horas.” Também não era possível congelar embriões pro-duzidos in vitro, e atualmente a empresa congela cerca de 40% da sua produção.

Fundada em 2002, a In Vitro sempre se desta-cou por investir em tecnologia. A partir de 2007, o foco comercial da empresa mudou e a deman-da passou a ser pela multiplicação de animais de produção, principalmente no rebanho lei-teiro. “Fizemos um primeiro projeto comercial de produção de embriões em larga escala, com duração de dois anos”, relata Andrea. “No final, conseguimos produzir 9 mil fêmeas da raça gi-rolanda, resultado do cruzamento entre as raças holandesa, mais produtiva, e gir, mais rústica.” Após o término desse projeto em 2009, a empre-sa desenvolveu outros projetos comerciais de

desenvolvimento 2 Manipulação de embriões no laboratório

Projetos

1. validação de biópsias e amplificação do dNa de embriões de bovinos

produzidos in vitro para análise genômica global (nº

2014/50616-0); Modalidade Pesquisa inovativa em Pequenas empresas (Pipe);

Pesquisadora responsável andrea cristina basso (in vitro brasil);

Investimento r$ 101.052,74 e us$ 4.745,00 (faPesP).

2. Padronização e validação de Pcr em tempo real para certificação

sanitária de embriões bovinos produzidos in vitro (nº

2014/50169-4); Modalidade Pesquisa inovativa em Pequenas empresas (Pipe);

Pesquisadora responsável Juliana Hayashi tannura (in vitro brasil); Investimento r$ 137.675,00 (faPesP).

3. desenvolvimento de ferramentas genômicas para seleção de

vacas com alta fertilidade (nº 2012/51067-5); Modalidade Pipe;

Pesquisadora responsável andrea cristina basso (in vitro brasil); Investimento r$ 229.232,80 (faPesP). foto s iN v it r o b r a si l il u st r açã o al e x a N d re te le s

tilização in vitro, ele consegue antecipar o ganho genético do rebanho por várias gerações, tanto no gado de leite como de corte, o que proporciona crescimento na produtividade.”

a

come-çou a trabalhar com projetos científicos, entre eles um que tinha como objetivo avaliar, por meio da espectrometria de massas, o tempo que era viável manter armazenados na geladeira os meios de cultivo dos embriões. O projeto, que teve apoio da FAPESP por meio do programa Pesquisa Inovativa em Pequenas Em-presas (Pipe), em colaboração com o laborató-rio Thomson de Espectrometria de Massas, da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), mostrou que eles eram mais estáveis do que se imaginava e possibilitou grandes avanços na pro-dução in vitro de embriões bovinos. “Antes do projeto, fazíamos os meios de cultivo uma vez por semana e hoje produzimos uma vez por mês e em grandes quantidades.” Ela ressalta que, quando armazenados em geladeira, o prazo de validade se estende para mais de 60 dias.

Depois desse primeiro projeto, a empresa teve aprovados outros quatro na mesma modalida-de. Um deles, encerrado no ano passado, trata de marcadores moleculares para fertilidade na raça girolanda. “Identificamos algumas regiões de cromossomos bovinos que podem ser candi-datas a marcadores de fertilidade pela medição da taxa de conversão de oócitos em embriões”, descreve Andrea.

Atualmente, três outros projetos estão em an-damento na empresa. Um deles tem como ob-jetivo estabelecer um protocolo de certificação sanitária para os embriões produzidos in vitro no Brasil visando à exportação. “Se conseguirmos provar que os embriões produzidos em labora-tório são livres de patógenos contaminantes, te-remos uma ferramenta de garantia da qualidade que abrirá caminho para a exportação.”

O segundo é sobre o desenvolvimento de um protocolo para coletar uma biópsia de células embrionárias que preserve a viabilidade do em-brião e, ao mesmo tempo, forneça material su-ficiente para se fazer uma análise genômica de suas características. Este projeto é feito em co-laboração com a Universidade Estadual Paulista (Unesp), campus de Araçatuba e de Jaboticabal, e a Agropecuária Jacarezinho. “Estamos desen-volvendo na empresa uma tecnologia em que fazemos uma biópsia dos embriões recém-pro-duzidos no laboratório, antes do congelamento, e uma análise genética para o criador escolher qual embrião quer transferir para a receptora”, diz Andrea. Em um rebanho leiteiro, por

exem-plo, a escolha pode ser para melhorar a taxa de gordura ou proteína do leite.

O terceiro projeto tem como objetivo produzir embriões de animais das raças nelore e holandesa de 2 a 5 meses de idade, que ainda não entraram na puberdade. Os resultados mostraram que as bezerras e as novilhas pré-púberes que receberam determinada estimulação hormonal conseguiram produzir óvulos viáveis e embriões que já foram transferidos para receptoras.

A In Vitro tem ainda dois projetos de cunho social, um deles financiado pelo Sebrae em Ala-goas para melhoramento do rebanho leiteiro. A empresa enviou para produtores de leite embriões da raça girolanda que resultaram em cerca de um mil prenhezes positivas. Com o nascimento das bezerras, o rebanho terá um incremento na produção, podendo atingir desejáveis 20 litros de leite por dia, sendo que antes do melhoramento genético esse número ficava entre 3 e 5 litros. O outro trabalho, também para melhorar a produção de leite, é feito em parceria com a empresa

Zam-bezia Agropecuária de Moçambique, na África. n