P. Faraco - Quantificação de polimorfonucleares no glomérulo
Infiltrado neutrofílico em capilares glomerulares - Método de
quantificação
serem observados por amostra de tecido. Fre-quentemente, o observador decide arbitrariamente quanto ao número de glomérulos que considera representativo para avaliar a infiltração de PMN e realizar comparações.
Este trabalho teve como objetivo definir um critério de contagem que pudesse ser estendido a qualquer investigação que viesse a utilizar este índice como indicador de atividade inflamatória glomerular. A questão fundamental a ser respondida é se os PMN encontrados nos capilares glome-rulares seguem alguma distribuição estatística conhecida ou se isto ocorre aleatoriamente. Sendo assim, testou-se a hipótese de que os PMN en-contrados nos capilares glomerulares seguem a distribuição de Poisson.
M a t e r i a l e M é t o d o s
Foram utilizados 19 coelhos New Zealand White, pesando entre 1900g e 2400g, regularmente alimentados com ração, líquido à vontade e mantidos à temperatura constante de 21ºC. Nove animais que
Paulo Faraco
O número de polimorfonucleares (PMN) encontrados nos capilares glomerulares serve como indicador de atividade inflamatória, particularmente em modelos experimentais de glomerulonefrites. Este indicador pode ser expresso como um índice através da média de PMN por glomérulo. Porém, não há um consenso na literatura de como a contagem dos PMN deve ser realizada para que as médias obtidas sejam estatisticamente representativas e sirvam adequadamente para comparações. Analisando-se cortes histológicos de rins de dezenove coelhos, observamos que em dezoito amostras os PMN seguiram a distribuição de Poisson nos capilares glomerulares. Utilizando-se das propriedades desta distribuição estatistica o autor sugere regras que devem ser observadas para a determinação do referido índice.
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Hospital Universitário Pedro Ernesto - Rio de Janeiro, RJ Disciplina de Nefrologia
Endereço para correspondência: Hospital Universitário Pedro Ernesto Av. 28 de setembro 87
CEP 20551-030 - Rio de Janeiro, RJ
Tel: (021) 2646222 Ramal 6227 Fax: (021) 5679012
I n t r o d u ç ã o
O número de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) no interior dos capilares glomerulares é usado como índice de atividade inflamatória nas glomerulopatias. Em estudos com animais de experimentação, este índice é normalmente considerado como sendo a média do número de PMN por glomérulo. Esta média é obtida sem que haja critério quanto ao número de glomérulos a
Polimorfonucleares, Distribuição estatística, Glomérulo Polymorphonuclear cells, Statistic distribution, Glomerulus
P. Faraco - Quantificação de polimorfonucleares no glomérulo
formaram o grupo controle foram infundidos, sem anestesia, com solução apirogênica de NaCl 0.9% através da veia marginal da orelha, durante 5 horas à taxa de 1 ml por hora, com auxílio de uma bomba infusora. Ao final da infusão, foram sacrificados com pentobarbital e os rins removidos, fracionados, fixados em formalina mercurial, processados como de rotina para a obtenção de cortes de 2 um de espessura e corados com hematoxilina e eosina. Dez animais, que formaram o grupo de teste, foram infundidos durante 5 horas à taxa de 1 ml por hora com uma solução contendo endotoxina, preparada através da diluição de lipopolissacarídeo de E. coli 0111:B4 (Sigma Co, Mo, USA) em solução de NaCl 0.9% . Obteve-se, assim, a administração de 40 ug de endotoxina por kilo por hora. Estes animais foram sacrificados e o tecido renal processado como os do grupo controle.
As lâminas foram examinadas com aumento de 1000X usando óleo de imersão. Somente os PMN intactos, com citoplasma granular de cor rosa e núcleo típico foram contados no interior dos capilares glomerulares. As lâminas foram examinadas iniciando-se iniciando-sempre da área externa em direção à área interna da córtex renal e voltando um campo visual acima ou abaixo em um movimento de zig-zag. Glomérulos de todos os tamanhos foram estudados. Apro-ximadamente 100 glomérulos foram examinados por lâmina. Todas as lâminas foram examinadas pelo mesmo observador.
Os cálculos foram realizados através de uma planilha eletrônica (Excel 5.0, Microsoft, WA, USA). O número de glomérulos contendo 0, 1, 2, 3, ...n PMN por lâmina foi utilizado para derivar a frequência esperada de glomérulos, baseado na fórmula de Poisson para probabilidades individuais. Simulta-neamente, a média de PMN por glomérulo, a va-riância da distribuição e a razão entre vava-riância e média foram calculados (Tabela 1). Os limites superiores e inferiores daquelas razões para intervalos de confiança a 95% foram obtidos através de tabelas estatísticas. 1 O teste de ajuste adequado foi aplicado
para as distribuições observadas e esperadas de cada lâmina e o valor de p calculado a partir do chi-quadrado.
R e s u l t a d o s
A tabela 2 mostra o número médio de PMN por lâmina e os intervalos de confiança a 95% para a
razão entre variância e média. Os intervalos de confiança variaram de acordo com o número de glomérulos observados. Os limites foram obtidos das tabelas estatísticas de chi-quadrado. Limites superiores e inferiores foram derivados de valores de p=0.025 e p=0.975 divididos pelo respectivo grau de liberdade. Os valores de s2/x obtidos de cada lâmina se
encontraram dentro dos limites superiores e inferiores do intervalo de confiança, exceto o valor da lâmina de número 16.
A tabela 3 mostra os valores do chi-quadrado para o teste de ajuste adequado entre o observado e
Tabela 1
Exemplo de tabela utilizada na planilha para introdução dos dados e resultados obtidos
Número de PMN por glomérulo
0 1 2 3 4 5 6 7 Observado 52 36 10 2 0 0 0 0 Esperado 53.79 33.35 10.33 2.13 .33 .04 0 0 Total de glomérulos = 100 Total de PMN = 62 Média (x) = 0.62 Chi-quadrado = 0.327 Graus de liberdade= 2 p = 0.849 Variância (s2) = 0.561 s2/x = 0.905 Tabela 2
Número médio de PMN por lâmina com os respectivos intervalos de confiança a 95% para a razão entre variância e média
Lâmina Média Variância s2/x IC 95%
1 0,62 0,5212 0,9051 0,741-1,297 2 0,61 0,7394 1,2045 0,742-1,295 3 0,36 0,3135 0,8709 0,741-1,297 4 0,65 0,7348 1,1305 0,741-1,297 5 0,44 0,5083 1,1668 0,742-1,295 6 0,60 0,6215 1,0291 0,742-1,295 7 0,47 0,4277 0,9178 0,745-1,293 8 0,52 0,5044 0,9715 0,746-1,291 9 0,42 0,4278 1,0187 0,741-1,297 10 0,87 0,8129 0,9353 0,749-1,287 11 0,82 0,8002 0,9717 0,743-1,294 12 2,35 2,1903 0,9323 0,745-1,293 13 2,50 2,1755 0,8685 0,747-1,290 14 2,43 2,5669 1,0582 0,742-1,295 15 2,28 2,8194 1,2342 0,743-1,294 16 2,30 3,4040 1,480* 0,741-1,297 17 1,13 1,1901 1,0458 0,724-1,320 18 1,44 1,7286 1,1980 0,695-1,360 19 1,44 1,6244 1,1254 0,737-1,302
apresentam áreas diferentes e que, portanto, a distribuição dos PMN não pode ser avaliada através da distribuição de Poisson. Porém, os valores encontrados mostram claramente que esta limitação pode ser ultrapassada através do exame de um elevado número de glomérulos em uma mesma amostra. Desta forma, trabalha-se com a área média dos glomérulos e o mesmo princípio que se aplica ao hemocitômetro serve para um corte histológico de rim.
Esta observação de que os PMN, tanto no glomérulo normal como no glomérulo inflamado, seguem uma distribuição estatística específica, no caso a distribuição de Poisson, permite definir com precisão um critério de contagem destas células para ser utilizado como índice de inflamação glomerular. Da mesma forma como foi demonstrado para as células em um hemocitômetro, o coeficiente de variação da contagem dependerá do número de PMNs contados, e não do número de glomérulos analisados. 3 Frequentemente encontramos referências
a comparações realizadas entre médias de PMN por glomérulo em que se determinou que um mesmo número x de glomérulos teria sido observado em grupos diferentes de animais. 4 O correto é que se
conte aproximadamente o mesmo número de PMN em cada corte histológico para que o coeficiente de variação das médias seja o mesmo. Desta forma também evitamos a observação desnecessária de um grande número de glomérulos quando a amostra está muito infiltrada. Neste caso o número de glomérulos a ser analisado por amostra de tecido fica na dependência do número de PMN encontrados.
Baseado na fórmula que define o coeficiente de variação para a distribuição no hemocitômetro: CV(%) = 100/xT, onde T é o número total de células contadas, para se ter um coeficiente de variação em torno de 5%, é necessário que se conte no mínimo 400 PMN por amostra de tecido.
S u m m a r y
The author investigated the distribution of polymorphonuclear leukocytes (PMN) in the glomeruli of rabbits. Glomerular PMN infiltrate is accepted as an index of inflammatory activity, particularly in experimental models of glomerulonephritis. Rabbits infused with sub-thrombotic doses of endotoxin have an increase in the mean number of glomerular PMN compared to animals infused with saline. Using
Tabela 3
Valores de chi-quadrado para o teste de ajuste adequado entre o observado e obtido para cada lâmina.
Lâmina Média x2 p 1 0,62 0,327 0,8491 2 0,61 0,940 0,6250 3 0,36 0,148 0,7004 4 0,65 1,197 0,5496 5 0,44 0,219 0,8960 6 0,60 0,090 0,9559 7 0,47 0,505 0,7768 8 0,52 0,220 0,8958 9 0,42 0,028 0,9860 10 0,87 0,368 0,9467 11 0,82 0,570 0,9032 12 2,35 1,013 0,9615 13 2,50 0,821 0,9756 14 2,43 2,696 0,7467 15 2,28 4,229 0,6457 16 2,30 8,487 0,131* 17 1,13 0,015 0,9995 18 1,44 1,881 0,7576 19 1,44 1,768 0,7783
obtido para cada lâmina. Apenas a lâmina de número 16 não se ajustou à distribuição teórica de Poisson.
D i s c u s s ã o
A infusão de endotoxina em coelhos promove a infiltração de PMN nos glomérulos. Este é um modelo de glomerulonetrite que serve para estudar microangiopatia trombótica. 2 É sabido que a
migração de PMN para os capilares glomerulares ocorre antes do aparecimento do depósito de fibrina. Desta forma, os trombos de fibrina que se encontram dentro das alças capilares não afetam a distribuição dos PMN. Isto ficou demonstrado, já que tanto nos animais do grupo controle como nos animais que receberam endotoxina, os PMN seguiram a mesma distribuição. Ao mesmo tempo, esta observação estatística confirma os achados de estudos morfológicos de que os polimorfonucleares precedem ao desenvolvimento dos trombos nesta forma de microangiopatia.
É possível extrapolar que a detecção de PMN no glomérulo representa eventos isolados em um continuum de volume. Isto é exatamente o que ocorre com as células em suspensão colocadas em uma câmara de contagem. Neste modelo, os quadrados da câmara de contagem são os glomérulos. Porém, pode-se argumentar que em um preparo histológico desta natureza os glomérulos
P. Faraco - Quantificação de polimorfonucleares no glomérulo
proper statistical analysis, it was shown that the glomerular PMN distribution followed a Poisson distribution in the glomeruli of eighteen out of nineteen animals studied. Increase in cell infiltration and presence of fibrin did not interfere with the distribution. In conclusion, since the PMNs follow a specific statistical distribution in the glomeruli, a rule to count these cells can be determined precisely, making possible to compare results from different experiments.
R e f e r ê n c i a s :
1. Diem K, Seldrva J. Geigy Scientific Tables Vol. 2. Basle, Ciba-Geigy, 1982
2. Faraco P, Hewitson T, Kincaid-Smith P. An animal model for the study of the microangiopathic form of cyclosporine toxicity. Transplantation. 1991; 51: 1129-1131
3. Gadeholt H. Counting cells in urine. The variability of haemocytometer counts. Acta Med Scand. 1968; 183: 9-16 4. Tomosugi NI, Cashman SJ, Hay H, Pusey CD, Evans DJ,
Shaw A, Rees AJ. Modulation of antibody-mediated glomerular injury in vivo by bacterial lipopolysaccharide, tumor necrosis factor and IL-1. J Immunol. 1989; 142: 3083-3090
Ar tigo recebido em 15 de agosto de 1995 e aceito para publicação em 23 de agosto de 1996.
