A Nek7 é uma quinase multifuncional que atua sobre diferentes processos biológicos e em concerto com a sinalização da divisão celular = Nek7 is a multifunctional kinase that acts on different biological processes and in concert with the cell division sign

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Souza, Edmarcia Elisa,

So89n SouA Nek7 é uma quinase multifuncional que atua sobre diferentes processos biológicos e em concerto com a sinalização da divisão celular / Edmarcia Elisa de Souza. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.

SouOrientador: Jörg Kobarg.

SouTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

Sou1. Proteína Nek7 humana. 2. Interatoma. 3. Proteína RGS2 humana. 4. Ciclo celular - Regulação. 5. Mitose. 6. Cancer. I. Kobarg, Jörg. II. Universidade

Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Nek7 is a multifunctional kinase that acts on different biological processes and in concert with the cell division signaling

Palavras-chave em inglês: Nek7 protein, human

Interactome

RGS2 protein, human Cell cycle - Regulation Mitose

Cancer

Área de concentração: Bioquímica

Titulação: Doutora em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora:

Jorg Kobarg [Orientador] Celso Eduardo Benedetti Adriana Franco Paes Leme Glaucia Maria Machado Santelli Marcio Chaim Bajgelman Data de defesa: 20-08-2014

Programa de Pós-Graduação: Biologia Funcional e Molecular

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RESUMO

As proteínas Neks (NIMA-related kinases) representam uma família de 11 quinases humanas nomeadas Nek1 a 11 que compartilham 40 a 45% de identidade de sequência com o regulador mitótico NIMA identificado em Aspergillus nidulans. O sinergismo entre os mecanismos que dirigem a mitose é essencial para a adequada divisão celular e sua desregulação é correlacionada ao aparecimento de cânceres humanos. As Neks são essenciais para progressão do ciclo celular e por isso têm recebido especial atenção como alvos para terapia do câncer. A Nek7 humana, por sua vez, contribui para formação do fuso mitótico e biogênese dos centrossomos. Neste trabalho, nós revelamos um amplo espectro de proteínas de interações com a Nek7 humana, sobretudo, envolvidas com a divisão celular. Alguns novos parceiros de interação também são seus potencias substratos

e, ainda, localizam com a Nek7 em estruturas essenciais para a mitose e citocinese. Nós

evidenciamos ainda, que através de mecanismos distintos, os domínios N- e C-terminal de Nek6 e Nek7 podem contribuir diferencialmente para a regulação e catálise e podem proporcionar a base estrutural para a independência funcional dessas quinases na sinalização celular. Além disso, usando estudos baseados microscopia confocal e RNAi (RNA interference), nós mostramos que o interactor de Nek7, a proteína RGS2, é necessária para organização e orientação do fuso mitótico. Células em metáfase suprimidas de RGS2 apresentaram fenótipos tais como: prisão na mitose; defeitos na tensão dos cinetocóros e alinhamento dos cromossomos; desorganização do fuso mitótico; perturbação na redistribuição de proteínas do polo do fuso envolvidas em nucleação; mal-orientação do fuso mitótico; e redução de microtúbulos dos ásteres e de dinâmica. Além disso, tanto a supressão quanto a superexpressão das formas selvagem e quinase dead de Nek7 prejudicaram o recutamento de γ-tubulina para o polo do fuso. Esses achados introduz a participação de RGS2 na mitose e indicam que esta pode atuar cooperativamente com Nek7 para a precisa organização e formação do fuso mitótico. Por fim, empregando biologia de sistemas, nós mostramos um compreensivo interactoma das Neks, destacando para um possível crosstalking de todos os membros da família nos processos de regulação de centríolos e mitose; função ciliar e ciliopatias; e resposta a dano de DNA.

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ABSTRACT

The Neks (NIMA-related kinases) proteins represent a human kinases family named Nek1 to 11 that share 40 to 45% of sequence identity with the established NIMA mitotic regulator, identified in Aspergillus nidulans. The synergism of the mechanisms that drive mitosis is essential for proper cell division and its dysregulation is correlated with the occurrence of human cancers. The Neks are essential for cell cycle progression and therefore have received attention as targets for cancer therapy and other diseases. Human Nek7 contributes to mitotic spindle formation and centrosome biogenesis. Herein, we reveal Nek7 as a multifunctional kinase. Our proteomic studies have demonstrated a broad spectrum of interaction proteins of human Nek7 classified into multiple functional categories, especially, cell division. Some new interaction partners are also potential Nek7 substrates and localize in key structure during mitosis and cytokinesis. We also evidenced that, through different mechanisms, the N- and C- terminal domains of Nek7 and Nek6 can differentially contribute to the regulation and catalysis and provide the basis for a functional independence of Nek6 and Nek7 in cell signaling. Furthermore, using studies based in confocal microscopy and RNAi we showed the Nek7 interactor, RGS2 protein, is required for organization and orientation of the mitotic spindle. Metaphase cells RGS2-depleted showed phenotypes such as: arrest in mitosis; defects in tension kinetochores and alignment chromosomes; disruption of the mitotic spindle; disturbance in the proteins redistribution of the spindle pole involved in nucleation and microtubule dynamics; mitotic spindle misorientation; and astral microtubules reduction. Furthermore, the suppression or both overexpression of Nek7 wild type or kinase dead impaired the recruitment of γ-tubulin to the spindle pole. These findings introduce the involvement of RGS2 in mitosis and indicate that it may act cooperatively with Nek7 for proper mitotic spindle organization and formation. Finally, employing systems biology, we showed a comprehensive Neks interactome, highlighting for a possible crosstalking of all family members in centrioles and mitosis regulation; ciliary and ciliopathies function; and response to DNA damage.

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SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 1

1.Introdução 1

1. As proteínas NIMA-related kinases – Neks humanas, um histórico 1

2. A divisão celular, as Neks e uma abordagem para terapia do câncer 4

3. Como as Neks 1-11 podem dirigir os eventos da divisão celular e do câncer 6

CAPÍTULO 2 17

1. Objetivos 17

CAPÍTULO 3 19

Artigo I: “Stop Ne(c)king around”: How interactomics contributes to functional characterize Nek family kinases 20

CAPÍTULO 4 43

Artigo II: Characterization of the Human NEK7 Interactome Suggests Catalytic and Regulatory Properties Distinct from Those of NEK6 44

CAPÍTULO 5 63

Artigo III: Human Nek7-interactor RGS2 is required for mitotic spindle orientation and organization 64

CAPÍTULO 6 95

1. Resultados Complementares 95

1.1. Estudos de interactoma e localização celular das Neks através do ciclo celular 95

1.2. Implicação funcional de Nek7 e seus parceiros de interação 100

CAPÍTULO 7 107

1. Considerações Finais 107

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Aos meus amados pais José e Erotilde, e aos meus irmãos Márcio e Kathiani, pelo amor incondicional e por acreditarem que, independentemente das difilculdades, poderia conquistar os meus sonhos. Eu amo vocês!

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AGRADECIMENTOS

A Deus por me permitir chegar a esse momento.

Ao professor Jörg pela oportunidade, por permitir a liberdade de minhas decisões e por acreditar em meu potencial como pesquisadora. Suas palavras sempre motivadoras incentivaram ainda mais o meu entusiasmo pela pesquisa. Obrigada por ter sido um excelente orientador, amigo e um ótimo parceiro de forró durante esses anos!

Aos meus queridos pais José e Erotilde, pelo amor incondicional, pelo apoio aos meus planos, e por entenderem que a minha ausência seria necessária para que pudesse concretizá-los.

Aos meus irmãos Márcio e Kathiani pela admiração e por se motivarem em minha trajetória.

Às minhas queridas amigas Gabriela, Kaliandra, Juliana e Kainara, por compartilharmos momentos tão divertidos durante esses 4 anos.

Agradeço à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, pelo apoio financeiro.

Ao LNBio e ao CNPEM, por proporcionarem uma excelente infraestrutura para realização do trabalho.

Um agradecimento especial à Gabriela pelo valioso apoio nos ensaios de clonagens, duplo-híbrido em levedura, na construção das redes de interação; e à Juliana Smetana pela colaboração nos ensaios para localização celular usando o sistema Operetta. Em conjunto, o nosso trabalho foi bastante entusiástico e produtivo! Obrigada.

À Bárbara Biatriz Godoy, minha aluna de iniciação científica, pelo seu excelente trabalho, esforço e dedicação. Você é uma inspiração para o meu trabalho.

Agradeço à Arina pela valiosa colaboração nos ensaios de pull down, dentre outros. Ao Jorge, pelo apoio às questões de informática e formatação da tese.

Um agradecimento especial ao professor Stephen Doxsey e ao seu grupo da University of Massachusetts Medical School, USA, por me proporcionarem uma excelente infraestrutura e especialidade na realização dos ensaios baseados em microscopia confocal e time-lapse image.Thanks for your receptivity and support!

Meus sinceros agradecimentos ao Stephen Whelan da Boston University School of Medicine, USA, por sua importante colaboração nos ensaios de espectrometria de massas.

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Um agradecimento a todos os meus colaboradores Gabriela Vaz Meirelles, Bárbara Biatriz Godoy, Arina Marina Perez, Juliana Helena Costa Smetana, Stephen J. Doxsey, Heidi Hehnly, Stephen A. Whelan, Catherine E. Costello e Mark E. MacComb, por usa importante e valiosa contribuição para com este trabalho.

Agradeço à Secretaria de Pós-graduacão, em especial à Andréia, pela disposição e apoio às questões burocráticas.

À Maria Eugênia, por seu bom trabalho como técnica do laboratório.

Ao Grupo LMA pela contribuição direta ou indireta com o trabalho: Angela Saito; Bruno Aquino; Bianca Gomes Pereira; Vanessa Bonfim Cardoso; Aline Monticelli Cardoso; Talita Diniz Melo; Fernanda Luisa Basei; Fernanda Cristina Costa; Priscila Ferreira Papa; Leandro Henrique de Paula Assis e Maria Eugenia Ribeiro de Camargo.

Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a vitória é o desejo de vencer. Mahatma Gandhi.

CAPÍTULO 1

1. Introdução

1. As proteínas NIMA-related kinases – Neks humanas, um histórico

Em 1975, Ron Morris realizou um screening genético para mutantes sensíveis à temperatura que falharam para progressão do ciclo celular no fungo filamentoso

Aspergillus nidulans. O screening levou à identificação de mutantes classificados como bim

(blocked in mitosis) para aqueles que foram aprisionados em mitose, e nim (never in

mitosis) para aqueles bloqueados em interfase e incapazes de entrar em mitose sob o efeito

de temperatura restritiva. O primeiro mutante nim caracterizado, nimA, foi capaz de rapidamente completar a formação do fuso mitótico e a condensação dos cromossomos quando submetido a uma mudança de temperatura, indicando um preciso controle sobre o início da mitose (Oakley & Morris, 1983; Osmani et al., 1987). Subsequentes estudos revelaram que o gene nimA codifica para uma serina/treonina quinase, essencial para progressão do ciclo celular em Aspergillus que foi denominada NIMA (Never In Mitosis,

gene A) (Osmani et al., 1988, Osmani et al., 1991).

Em meados dos anos de 1990s, estudos independentes dos grupos de Nurse e Hunter mostraram que a superexpressão de NIMA em células humanas HeLa resultou na indução de eventos relacionados à mitose prematura tais como condensação da cromatina, envelope nuclear quebrado (O'Connell et al., 1994) e prisão em G2 (Lu & Hunter, 1995). Esses resultados foram as primeiras evidências de que quinases homólogas à NIMA conservadas durante a evolução, poderiam ser importantes reguladores da progressão do ciclo celular de eucariotos superiores.

As primeiras quinases de mamíferos relacionadas à NIMA, NIMA-related kinases- Neks, foram identificadas pelos grupos de Pawson e Nigg no início de 1990s (Letwin et al., 1992; Schultz & Nigg, 1993). Posteriormente, o sequenciamento do genôma humano revelou a presença de 11 genes que codificam para diferentes subtipos de Neks, nomeadas de Nek1 a 11 (Manning et al., 2002; Forrest et al., 2003), as quais constituem aproximadamente 2% do quinoma humano (O'Regan et al, 2007).

As Neks humanas compartilham cerca de 40 a 45% de identidade de sequência no seu domínio N-terminal com NIMA, enquanto a região C-terminal é altamente divergente

(O'Connel et al., 2003; O’Regan et al., 2007; Moniz et al., 2011; Fry et al., 2012) sugerindo propriedades bioquímicas similares à NIMA e funções distintas para cada quinase.

Dentre os membros das Neks humanas melhores caracterizados, a Nek1 e a Nek8 têm sido relacionadas à funcão ciliar (Upadhya et al., 2000) e à resposta a dano no DNA (Polci et al., 2004; Liu et al., 2013); a Nek2 tem sido implicada na regulação do centrossomo (Rellos et al., 2007); e as Neks 6, 7 e 9 têm sido associadas à regulação mitótica (Belham et al., 2003).

A expansão da família das Neks ao longo da evolução tem sido acompanhada por seu amplo envolvimento em doenças como ciliopatias e o câncer (Upadhya et al., 2000; Moniz et al., 2011). Entretanto, a compreensão da biologia das Neks e o seu papel em doenças humanas ainda são escassos. Como pode ser observado na Tabela 1, nem todos os membros das Neks possuem função bem caracterizada no contexto celular como um todo, o que dificulta o entendimento do papel das Neks ao nível das doenças humanas, incluindo o câncer.

Tabela 1. Funcões atribuídas para as Neks humanas.

Processos Biológicos (GO)1 Funções propostas2 Referências Desordens associadas ao gene3 Nek1

Resposta celular a danos no DNA; montagem dos cílios; mitose; resposta à radiação ionizante Regula a apoptose via abertura e fechamento de VDAC mitocondrial; regulação do ciclo celular; redistribuição de coesinas em espermatócitos murinos Chen et al., 2010; Holloway et al., 2011; Patil et al., 2013

Câncer de mama; câncer de bexiga; síndrome de costela curta e polidactilia; distrofia torácica asfixiante (síndrome de Jeune) Nek2 Transição G2/M do ciclo celular mitótico; desenvolvimento embrionário; separação centrosome; segregação cromossômica; divisão nuclear meiótica; segregação das cromátides irmãs em mitose; regulação Modula o alinhamento de cromossomos e a sinalização do checkpoint do fuso mitotico (SAC); regulação da mitose transição metáfase/anáfase; splicing factor Wei et al., 2011; Sedgwick et al., 2013; Naro et al., 2014

Câncer de mama; retinite pigmentosa; neurofibroma plexiforme; câncer

hepatobiliar; câncer de fígado; câncer de estômago; câncer coloretal; câncer de cervix; câncer de ovário; mieloma múltiplo; tumor maligno da bainha de nervo periférico

negativa de ligação à DNA; regulamentação de microtúbulos do fuso para os cinetocóros; regulação da separação centrosome mitótico; formação do fuso mitótico

Nek3 Mitose; divisão celular

Organização de citoesqueleto; regulação de microtúbulos neuronais; tráfego de membranas? Miller., 2007; Chang et al., 2009 Não encontrada

Nek4 Mitose; transdução de sinal por fosforilação

Regulação de microtúbulos; efeito na sinalização dos cílios; regulação de senescência replicativa e resposta a dano no DNA Noguchi et al., 2002; Coene et al., 2011; Nguyen et al., 2012 Desordem bipolar

Nek5 Não descrito

Regulação da diferenciação muscular via regulação da atividade da caspase 3 Shimizu et al., 2013 Não encontrada Nek6 Checkpoint do dano de DNA de G2; processo apoptótico segregação cromossômica; citocinese; mitose; desmontagem envelope nuclear mitótico; regulação positiva da quinase I-kappaB e sinalização de NF-kappaB; regulação da senescência celular; regulação do ciclo celular mitótico; regulação da mitose transição metáfase/anáfase; formação do fuso mitótico

Medeia hipertrofia

cardíaca Bian., 2014

Esofagite; câncer de fígado ; adenocarcinoma esofágico; câncer de rim

Nek7

Citocinese; regulação do ciclo celular mitótico; formação do fuso mitótico

Biogênese de centrossomo; regulação da dinâmica de microtúbulos Kim., 2011; Cohen et al., 2013

Distúrbio do sistema nervoso periférico; retardação do desenvolvimento; catarata congênita

Nek8 Morfogênese de órgãos; regulação da sinalização hipotalámo Regulação de citoesqueleto; função ciliar; dano no DNA

Liu et al., 2002; Young et al., 2013; Choi et al., 2013

Nefronoftise, displasia infântil; câncer de mama; desordem genética do sistema urinário e renal; nefrite

Nek9

Mitose; ciclo celular mitótico; desmontagem do envelope nuclear mitótico Formação do fuso mitótico; biogênese de centrossomo; regulação do fuso mitótico e progressão do ciclo celular; indução de mitose catastrófica O'Regan et a., 2009; Kim., 2011; Yang et al., 2012; Kaneta 1t al., 2013

Câncer de estômago; glioma; Limfoma non-Hodgkin's (Burkitt)

Nek10 Não descrito

Manutenção do checkpoint G2/M em resposta a dano no DNA Moniz & Stambolic., 2010 Câncer de mama Nek11 Checkpoint do dano de DNA em na fase G2; checkpoint do dano de DNA na fase S Funções no nucleólo junto de Nek2 Noguchi et al., 2004 Não encontrada 1

Os processos biológicos foram baseado no banco de dados Gene Ontology (GO): http://www.geneontology.org/

2_{As funções propostas foram curados manualmente a partir da literatura}

3_{As desordens descritas foram baseadas no banco de dados Integrity: http://thomsonreuters.com/integrity/}

2. A divisão celular, as Neks e uma abordagem para terapia do câncer

O ciclo celular é um complexo e bem orquestrado processo que culmina quando conjuntos de cromossomos duplicados são igualmente particionados (segregados) entre duas células filhas (O’Connell & Khodjakov et al. 2007). A segregação dos cromossomos é mediada pela ligação dos cinetocóros ao fuso mitótico, uma rede de microtúbulos altamente dinâmica dependentemente nucleada a partir dos centrossomos em células eucarióticas (Goshima et al., 2007; Uehara et al., 2009; Dumont & Mitchison, 2012). Os centrossomos, como centro organizador de microtúbulos, fornecem um adicional papel estrutural para divisão celular por assegurar a forma correta do fuso e, por conseguinte, possibilitar que o material genético seja distribuído igualmente entre as filha células. Além disso, se vistos como scaffolds estruturais, os centrossomos recrutam proteínas específicas

tais como motores moleculares e uma série de proteínas quinases que participam de uma rede complexa de sinalização para a divisão celular (Mazzorana et al., 2011). O sinergismo entre os eventos que dirigem a biogênese do centrossomo e a formação do aparato do fuso é fundamental para completar a adequada divisão celular (Doxsey, 2005; Silkworth & Cimini., 2012; Hayward et al., 2014), e sua desregulação resulta em aneuploidia e instabilidade genômica, características estabelecidas de cânceres humanos (Hanahan & Weinberg 2011; Bakhoum et al., 2014). Por exemplo, células tumorais apresentam múltiplos centrossomos organizados em fusos multipolares os quais mal segregam os cromossomos e, subsequentemente, contribuem para instabilidade genômica (Pihan et al., 2003). Por outro lado, células de câncer parecem ter desenvolvido mecanismos que limitam defeitos do fuso para estágios transientes e assim evitam a morte celular (Silkworth & Cimini., 2012).

A fidelidade do ciclo celular é mantida, em parte, por proteínas reguladoras tais como quinases. Proteínas quinases regulam e disparam os principais eventos que coordenam a divisão celular tais como manutenção de pontos de checagem (checkpoints), biogênese do centrossomo, nucleação e dinâmica de microtúbulos e ligação dos cinetocóros aos microtúbulos, os quais resultam na correta formação do fuso mitótico e segregação cromossômica (Malumbres, 2011; Ma & Poon, 2011; Bayliss et al., 2012).

As principais quinases humanas reguladoras da divisão celular são as Cyclin

dependent kinases (CDKs), membros da família de Polo-like kinases (PLKs), Aurora

quinases e as Neks (Fry et al., 1998; O’Regan et al., 2007; Moniz et al., 2011; Dodson et al., 2013). A desregulação destas quinases afetam diretamente os eventos da divisão celular e tem sido fortemente correlacionada com transformações neoplásicas desempenhando um papel central na iniciação e progressão do câncer (Nigg, 2001).

Até a presente data, aproximadamente 518 proteínas quinases compõem o quinoma humano (Chartier et al., 2013), dentre as quais aquelas descritas por atuarem na progressão mitótica têm sido consideradas promissores alvos terapêuticos anti-câncer, uma vez que podem exibir menos efeitos secundários quando comparados à drogas baseadas na ligação à microtúbulos (Manchado et al., 2012). Assim, o estudo direcionado das quinases mitóticas representam uma oportunidade terapêutica valiosa para contrastar o desenvolvimento do câncer.

Dentre as diversas famílias de quinases humanas envolvidas na regulação da divisão celular, os membros da família das Neks representam os menos caracterizados e compreendidos funcionalmente. Embora não existam evidências bem estabelecidas de que todas as Neks humanas são essenciais para progressão do ciclo celular, alguns membros possuem importantes papéis no controle da divisão celular e, portanto, têm recebido especial atenção como alvos potencialmente importantes para terapia do câncer.

Em particular, as Nek2, Nek6, Nek7 e Nek9 cooperam para diferentes processos da progressão mitótica tais como: separação do centrossomo, condensação da cromatina, desmontagem do complexo do poro nuclear, quebra do envelope nuclear, estabelecimento do fuso mitótico, checkpoint do fuso e citocinese. Por outro lado, as Nek1, 4, 10 e 11 têm sido envolvidas na resposta à danos de DNA especialmente na transição G2/M (Fry et al., 2012; Nguyen et al., 2012).

De modo geral, mutações e níveis de expressão elevados das Neks têm sido encontrados em vários tipos de tumores (Fry et al., 2012). Além disso, estudos de sequenciamento do genoma do câncer têm identificado mutações em vários membros das Neks diretamente envolvidas com transformação celular e tumorigênese (Moniz et al, 2011). Desta forma, o entendimento das funções das Neks na regulação de eventos da divisão celular é crítico para o desenvolvimento de novas e eficazes terapias para o câncer.

3. Como as Neks 1-11 podem dirigir os eventos da divisão celular e do câncer 3.1. Nek1

A proteína Nek1, o primeiro membro da família a ser descrito, foi inicialmente relacionada à etiologia da doença renal policística progressiva (PKD) (Wilson et al 2004) e ao aparecimento de efeitos pleiotrópicos incluindo dimorfismo facial, nanismo, esterilidade masculina, anemia e formação de cistos no plexo coróide em camundongos mutantes (Upadhya et al., 2000). Recentes estudos mostraram que mutações no gene de Nek1 levam a SRPS (short-rib polydactyl syndrome), uma ciliopatia familiar autossomal recessiva implicada em um amplo espectro de fenótipos associados a transdução de sinal e coordenação do ciclo celular (Thiel et al., 2011; Chen et al., 2012). Esses e outros estudos têm indicado um papel para a Nek1 no controle do ciclo celular, particularmente, na resposta a danos no DNA. Por exemplo, células deficientes em Nek1, quando submetidas à

radiação ionizante, não controlam devidamente a ativação das quinases Chk1 e Chk2, mediadoras de chekpoints na mitose (Chen et al., 2008; Polci et al., 2004) bem como diminuem a capacidade de eliminar os danos no DNA causados por agentes genotóxicos (Pelegrini et al., 2010). Importantemente, a proteína SMC3 (structural maintenance of

chromosomes protein 3), um componente do complexo de coesinas, foi recentemente

encontrada interagindo com Nek1 sugerindo sua possível participação em eventos mitóticos tais como segregação de cromossomos e formação do fuso mitótico (Holloway et al., 2011).

3.2. Nek2

Nek2, o membro mais estudado da família das Neks, possue expressão diferencial através do ciclo celular sendo o pico de expressão alcançado entre a fase S e G2 durante a qual encontra-se localizada predominantemente no centrossomo (Fry et al., 1998, Noguchi

et al., 2004). Durante a mitose a Nek2 é um componente do MTOC (Microtubule organization center) onde regula a coesão centriolar através da fosforilação de

componentes-chave tais como C-Nap1 e Rootletin, o que permite a separação dos centrossomos e sua migração para os pólos celular (Yang et al., 2006). Além disso, Nek2 tem sido importantemente descrita no contexto funcional de SAC (Spindle Assemble

Checkpoint) onde através de sua interação com as principais proteínas do cinetocóro Mad1

e Mad2 (Lou et al., 2004) e a fosforilação de Hec1 (Chen et al., 2002), pode monitorar o alinhamento das cromátides irmãs e a fiel segregação cromossômica durante a mitose (Wei et al., 2011). As anormalidades centrossomais em combinação com defeitos em SAC esta frequentemente associada à instabilidade cromossomal e aneuploidia e têm sido encontrados em muitas formas de câncer (Bettencourt-Dias & Glover 2007). Esses achados evidenciam a Nek2 como um alvo potencialmente interessante para desenho de drogas anti-câncer.

3.3. Nek3

A Nek3 humana foi mapeada na região 13q14 do cromossomo 13, cujo polimorfismo mutacional está frequentemente associado a vários tipos de câncer (Shaughnessy et al., 2000). Sua localização é nuclear e citoplasmática (Miller et al., 2007) e sua expressão é alta em testículos, próstata, ovário e cérebro mas moderada ou baixa em

pulmão e fígado (Kimura & Okano, 2001); entretanto, seu papel nesses sítios celulares e tecidos ainda é pouco compreendido. A Nek3 humana compartilha alta similaridade de sequência com a Nek3 de camundongo, a qual foi identificada em um screening baseado em transcriptoma de genes relacionados ao ciclo celular (Forrest et al., 2003).

Análises da região codificadora de Nek3 mostraram um polimorfismo de deleção/inserção no alelo A8 (cujo produto de expressão é a proteína na sua forma completa) que apresenta uma maior frequência estatística em câncer de próstata (Hernandez & Almeida 2006). Além disso, a Nek3 parece apresentar um importante papel na sinalização do receptor de prolactina e na organização do citoesquelo via proteínas Vav2 e prolactina, cuja ativação por Nek3 contribui para a invasão e motilidade do câncer de mama (Miller et al., 2005; Miller et al., 2007). De fato, McHale e colaboradores (2008), mostraram que a expressão de Nek3 é altamente regulada em epitélio de câncer de mama o que a sugere como alvo para modulação do crescimento e diferenciação do câncer de mama mediado pelo receptor de prolactina. Mais recentemente, a Nek3 tem sido correlacionada com a regulação de microtúbulos neuronais. A expressão exógena de mutantes inativos ou de versões truncadas de Nek3 levou a uma distorção da morfologia neuronal com polaridade perturbada (Chang et al., 2009). Além disso a deacetilação de alfa-tubulina, via a deacetilase HDAC6, em células HeLa quiescentes também foi observada (Chang et al., 2009), indicando uma possível função de Nek3 na dinâmica de microtúbulos e em doenças onde a degeneração axonal é um componente importante. Embora para o presente momento não existam evidências estabelecidas da atuação de Nek3 na progressão do ciclo celular, esses achados levantam a possibilidade de uma provável função de Nek3 na dinâmica de microtúbulos de células em divisão. A precisa instabilidade dinâmica de microtúbulo é crítica para a correta modelagem do fuso mitótico e formação dos cílios (Mitchison & Kirschner, 1984; Miyoshi et al., 2011) e o aumento da sua dinamicidade esta associada à tumorigênese (Honore et a., 2005), portanto indicando a Nek3 como um potencial alvo de estudos visando o desenvolvimento de drogas em câncer.

3.4. Nek4

A proteína Nek4 foi inicialmente encontrada em um screening genético em carcinoma de câncer de cabeça (Cance et al., 1993). Recentemente, a Nek4 assim como as

Nek1 e Nek8, tem sido proeminentemente observada em associação com estruturas ciliares que são essenciais para estabilidade ciliar em tecidos que são afetados por ciliopatias (fotoreceptores, rim e cérebro, por exemplo) (Coene et al., 2011). Um provável papel de Nek4 na regulação no ciclo celular pode ser atribuído, uma vez que esta participa da formação do cílios primários (Coene et al., 2011), de resposta a danos de DNA (Nguyen et al., 2012) e da estabilização de microtúbulos (Doles et al., 2010).

Muitos cânceres de pulmão carregam deleções no braço curto do cromossomo 3, que inclue o locus genômico de Nek4. De fato, a superexpressão de Nek4 promove resistência à vincristina e sensibilidade para múltiplos taxanos em células de câncer de pulmão, indicando que os níveis de Nek4 podem impactar a sensibilidade a essas drogas de microtúbulos em câncer de pulmão (Doles et al., 2010) e, concebivelmente, em outros tipos de câncer. Adicionalmente, células suprimidas de Nek4 apresentaram uma prisão em G2/M após tratamento com taxol, bem como uma redução dos ásteres, sugerindo um papel para Nek4 na formação do fuso mitótico, regulação de microtúbulos e dinâmica diante da interface de drogas (Doles et al., 2010). Portanto, o fato de que os níveis de Nek4 confere sensibilidade a desestabilizadores de microtúbulos e interferem com a progressão G2/M, sugerem a Nek4 como um alvo para as terapias anti-câncer existentes.

3.5. Nek5

Dentre todos os membros das Neks humanas, a proteína Nek5 é a menos estudada. Estruturalmente, a Nek5 possue o domínio de quinase na região canônica N-terminal (O'Connell et al., 2003) ao passo que a porção C-terminal é composta de um domínio adicional único dead box-helicase like (Mahjoub et al., 2005), o qual é tipicamente envolvido em pré-processamento de mRNA, rearranjo de ribonucleoproteínas e expressão gênica (Young et al., 2013).

A proteína Nek5 foi recentemente identificada como novo substrato de caspase-3 (Shimizu & Sawasaki, 2013) uma protease com papel central na execução da apoptose e diferenciação celular (Larsen et al., 2009). Quando superexpressa, a Nek5 promove a formação de miotubos (Shimizu & Sawasaki, 2013). Reciprocamente, em células suprimidas de Nek5, a formação de miotubos bem como a atividade de caspase-3 é inibida

sugerindo que Nek5 pode promover a diferenciação miogênica através da regulação positiva da atividade de caspase-3 (Shimizu & Sawasaki, 2013).

Em Arabidopsis thaliana a proteína Nek5 homodimeriza ou heterodimeriza com Nek4 e Nek6 para desestabilizar microtúbulos, possivelmente através da interação e fosforilação direta de beta-tubulinas (Motose et al., 2011). Ainda em Arabidopsis

thaliana, estudos adicionais mostraram que mutantes de Nek5 foram hipersensíveis à

drogas de microtúbulos tais como propizamida e taxol, sugerindo que Nek5 juntamente com Nek4 e Nek6, coordenam a morfogênese e divisão celular bem com a expansão do crescimento através da regulação da organização de microtúbulos em planta (Motose et al., 2011). Portanto, pode ser especulado em um primeiro nível, que a Nek5 humana pode interferir com microtúbulos ou pode atuar junto as Nek4 e Nek6 para sinalização de microtúbulos do fuso mitótico, como a exemplo para a já bem estabelecida cascata de sinalização mitótica das Neks 6,7 e 9. Crucialmente, os mecanismos moleculares para a proposição de um modelo completo devem ser descobertos.

3.6. Neks 6, 7 e 9

A Nek6, juntamente com Nek7 e Nek9, constitui um módulo de sinalização na mitose, onde Nek6 e Nek7 assumem a posição de substratos de Nek9, cuja ativação combinada é importante para a progressão mitótica (Belham et al., 2003; Roig et al., 2005). De fato, a Plk1 (Polo-like kinase 1) e a Cdk1 (Cyclin dependent kinase 1) controlam a separação do centrossomo através da fosforilação e ativação de Nek9 o que leva a uma fosforilação sequencial da quinesina Eg5 de maneira dependente de Nek6 e Nek7, um evento chave para separação do centrossomo e formação do fuso durante a mitose (Bertran

et al., 2011). Consistente com esses achados foi demonstrado que a ligação de Nek9 para

DYNLL/LC8, originalmente descrita como uma subunidade da cadeia leve de dineína citplasmática, é crucial para o controle da transdução de sinal entre o módulo Nek9, Nek6 e Nek7 (Regué et al., 2011; Gallego et al., 2013). Apesar da importância comprovada do módulo de sinalização Nek9, Nek6 e Nek7 para a progressão adequada da mitose, uma descrição precisa do seu papel molecular na sinalização da divisão celular está atualmente em falta.

As Nek6 e Nek7 são os menores membros das Neks cuja composição estrutural é uma excessão, compreendendo apenas um domínio catalítico na região C-terminal que compartilham ~86% de identidade entre si (Belham et al., 2003; Kandli et al., 2000; O’Regan et al., 2007), imediatamente seguido de um curto e altamente desordenado domínio regulatório na região N-terminal que é apenas ~20% idêntico entre cada Nek6 e Nek7 (Richards et al., 2009; e Figura 1).

Apesar da similaridade estrutural, estudos indicam que Nek6 e Nek7 podem possuir diferentes papéis e funções biológicas (Feige & Motro, 2002; Minoguchi et al., 2003), que são provavelmente fornecidos pelos seus distintos domínios N-terminais (Meirelles et al., 2011). De fato, é possível que Nek6 não possa compensar a perda de Nek7 no organismo. Isto pode ser explicado em parte pela distribuição diferencial nos tecidos (Feige & Motro 2002) e controle enzimático (Minoguchi et al., 2003) bem como pela distinta localização subcelular de Nek6 e Nek7 (O’Regan & Fry, 2009). Além disso, Nek6 e Nek7 apresentam padrões de expressão espaço-temporais distintos. Por exemplo, comparativo padrão de expressão gênica revelou que a Nek6 é altamente expressa em trofoblástos durante o desenvolvimento embrionário inicial, enquanto que a Nek7 é expressa no local de reação decidual. Além disso, Nek6 é encontrada em regiões ventriculares e sub-ventriculares, enquanto Nek7 é altamente expressa no tálamodorsal (Feige & Motro 2002). É importante ressaltar que a proteína Nek7 tem um aumento do nível de expressão em componentes específicos durante o ciclo celular, ao passo que há indícios de que Nek7 apresenta uma expressão constante ao logo desses componentes. Com efeito, a proteína Nek6 foi localizada no microtúbulo em metáfase e anáfase, ao passo que a Nek7 foi localizada no centrossomo durante todos os estágios da divisão celular (Kim et al., 2007; O’Regan et al., 2007; O’Regan & Fry, 2009). Finalmente, a baixa atividade de Nek7 em células de mamíferos, ao contrário da alta atividade de Nek6 enzimático (Minoguchi et al., 2003), reforçam a informação que Nek6 e Nek7 desempenham diferentes papéis na sinalização celular.

A

Figura 1. Predição de estrutura e alinhamento de sequência das Nek6 e Nek7 humanas. A. alinhamento

da seqüência primária entre Nek6 humana (NP_055212.2) e Nek7 (NP_598001.1) utilizando Clustal W2. O variável domínio regulatório N-terminal esta destacado em amarelo. B. Predição da estrutura secundária de consenso das proteínas hNek6 (NP_055212.2) e hNek7 (PDB: 2WQM). Está representado: hélices-α (ondas em vermelho), as folhas-ß (setas amarelas) e coiled-coil (linhas pretas) geradas de 5 predições e o score de consenso para cada aminoácido (1-5) é mostrado (score 1-2 representa predições ambíguas). O consenso da região de desordem predita foi gerada a partir de 9 predições e está representado por barras azuis quando o score de consenso (0-9) é de 5-9. O domínio regulatório N-terminal e o domínio de quinase C-terminal estão descritos e a assinatura-chave no domínio de quinase está em caixa colorida como segue: região de ligação a ATP (verde); sítio de ativação de Ser/Thr quinase (laranja). A seqüência conservada rica em glicina, motivos HRD e DLG estão em roxo, e os resíduos conservados K74 (folhas β3) e E93 (hélice αC ) estão em vermelho. Os resíduos de fosforilação pela Nek9 Thr195 (Nek7) e Ser206(Nek6), foi predito pelo software NetPhosK 1.0 e estão indicados. Também está descrito na seqüência de aminoácidos: a região de sinal para exportação nuclear LGDLGL, o domínio WW de ligação a motivos PY e pSP e o motivo PPLP (linhas pontilhadas). (Retirado de Meirelles et al., 2011).

A proteína Nek7, assim como as Nek 1, 2, 6 e 9 possuem as mais bem estabelecidas funções através do ciclo celular. Especialmente, a Nek7 foi originalmente descrita como um regulador de p70 ribossomal S6 quinase (Belham et al, 2001) e participando de importantes eventos da progressão mitótica (Lizcano et al, 2002;. Belham et al, 2003). De fato, a redução de Nek7 via RNAi e mutantes inativos interrompeu o recrutamento de gama-tubulina para os centrossomos de células em intérfase e causaram uma prisão na prometáfase associada a formação de um fuso mitótico frágil (Quarmby & Mahjoub, 2005; Yissachar et al., 2006; Kim et al., 2007; O’Regan et al., 2007; O’Regan & Fry, 2009) ao passo que sua superexpressão resultou em células multinucleadas e alta proporção de células apoptóticas (Yissachar et al., 2006). Sobretudo, a deficiência de Nek7 em camundongos levou à letalidade na embriogênese e à retardação do crescimento bem como para fenótipos ao nível celular tais como instabilidade cromossomal, aumento do número de centrossomos, binucleação, formação de micronúcleos e falhas na citocinese (Salem et al., 2010). Além disso, Kim e colaboradores (2011) mostraram que proteínas do material pericentriolar (PCM) não acumulam no centrossomo em células suprimidas de Nek7 tanto na transição G1/S quando G2/M. Isto indica que Nek7 pode participar da biogênese de centrossomo via o recrutamento de PCMs, que é necessário para duplicação dos centríolos e maturação do centrossomo (Bettencourt- Dias & Glover, 2007).

A Nek7, assim como Nek6, encontra-se super expressa em cânceres de colo-retal e mama, também encontrando-se a superexpressão de Nek7 em cânceres de laringe pulmão e em linfoma não-Hodgkin (Capra et al., 2006). Subsequentes estudos têm mostrado que células suprimidas de Nek7 apresentaram consequentes aumentos na instabilidade

dinâmica de microtúbulo (Cohen et al., 2013). Coletivamente, esses achados revelam a Nek6, Nek7 e Nek9 como componentes essenciais para divisão celular e as colocam como potenciais alvos para terapia do câncer. Especificamente, no caso de Nek7 é importante determinar suas vias de atuação em câncer, de maneira independente de Nek6, bem como seus alvos downstream na sinalização mitótica.

3.7. Nek8

Em humanos a Nek8 é superexpressa em tumor de mama e em tumores primários de cabeça (Bowers & Boylan., 2004). A Nek8, assim como a Nek1, apresenta funções relacionadas aos cílios e ao ciclo celular (Quarmby & Mahjoub, 2005). A superexpressão de formas mutantes de Nek8 leva a formação de células multinucleadas e com reduzidos números de fibras de actina sugerindo que o papel celular de Nek8 pode estar relacionado a regulação do citoesqueleto (Liu et al., 2002). Mais recentemente, Choi e colaboradores (2013), mostraram que a anormal interação entre Nek8 e o complexo de policistina pode dar origem a modelos da doença policística do rim provavelmente através de distúrbios na dinâmica dos microtúbulos, de SAC e do citoesqueleto. Além disso, mutações em Nek8 que estão associadas à ciliopatias afetam suas funções de estabilidade genômica bem como causam acúmulo de danos no DNA apontando Nek8 como um componente crítico de resposta a dano de DNA associados a distúrbios renais císticos (Valkova et al, 2005).

3.8. Nek10

A Nek10 é, estruturalmente, a maior e a mais complexa das Neks, cuja as funções têm sido pouco estudadas. A Nek10 é a única dentre as Neks composta de um domínio de quinase localizado centralmente e um motivo adicional de quatro repetições de armadillo na região regulatória N-terminal (Moniz et al., 2011; Fry et al., 2012) que pode servir para mediar as interações proteína-proteína (Huber et al., 1997). A Nek10 foi inicialmente mapeada em um loci de suscetibilidade ao câncer de mama junto à região cromossômica 3p24 (Ahmed et al., 2009) indicando uma potencial associação de Nek10 com o câncer. Interessantemente, este locus de suscetibilidade esta associado a um risco aumentado de câncer de mama pelo supressor tumoral BRCA (Breast Cancer Susceptibility Gene product

al., 2014) indicando que NEK10 pode estar sujeito à mutações em câncer. De fato, em estudos de sequenciamento de genôma do câncer, mutações somáticas não-sinônimas foram encontradas junto à sequência codificadora de Nek10 sendo treze mutações não-sinônimas, catalogadas em seis diferentes tipos de câncer. Importantemente, mutações em NEK10 foram encontradas tanto em tumores primários de ovário, pulmão e cérebro quanto em linhagens celulares de pele, pulmão, pâncreas e estômago (Greenman et al., 2007).

Em resposta a dano de DNA induzido por radiação ultravioleta a Nek10 forma um complexo ternário com as proteínas quinases ativadas por mitógeno MEK1

(Mitogen-activated protein kinase) e RAF1 (V-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1). A

proteína RAF1 funciona como um scaffold para formação do complexo o que permite a fosforilação e auto-ativação de MEK1 mediada por Nek10 e a fosforilação/ativação das quinases reguladoras de sinal extracelular ERK1/2 (Extracellular signal-regulated protein

kinases 1 and 2), culminando subsequentemente numa prisão em G2/M. Consistente com

esses resultados, a supressão de Nek10 por RNAi prejudicou a ativação de MEK1/2 e/ou ERK1/2 em resposta ao tratamento com ultravioleta (Moniz & Stambolic, 2011) indicando que Nek10 pode participar da manutenção do checkpoint G2/M bem como da proliferação celular via sinalização de MEK/ERK. Adicionalmente, a supressão de Nek10 levou a uma diminuição do número de células mitóticas sob condições não irradiadas, indicando que Nek10 pode ter um papel adicional no controle e progressão do ciclo celular (Moniz & Stambolic, 2011). Em conjunto, esses estudos levantam a possibilidade de que a desregulação da função de Nek10 pode contribuir para a oncogênese. Entretanto, o papel detalhado da Nek10 no chekpoint de G2/M e progressão do ciclo celular ainda não foi esclarecido. Além disso, embora mutações ao nível gênico tenham sido identificadas, as funções protéicas de Nek10 na tumorigênese é atualmente desconhecida.

3.9. Nek11

A Nek11 foi originalmente descrita como uma quinase responsiva a danos de replicação no DNA, sendo implicada em checkpoint do dano no DNA (Noguchi et al., 2002).

Os checkpoints do dano no DNA são de grande importância na regulação do ciclo celular e na manutenção da integridade do genoma (Bartek et al., 2007). É consenso que

perturbações de sensores, transdutores e efetores do checkpoint podem levar à instabilidade genômica, que suportam a iniciação e progressão do câncer (Fletcher & Muschel, 2006; Goto et al., 2012). Dentre os membros da família das Neks, a contribuição de Nek11 para o controle do checkpoint do ciclo celular tem sido a melhor caracterizada. A Nek11 é ativada através de fosforilação por Chk1 (checkpoint kinase 1), em resposta a danos no DNA induzidos por radiação ionizante (Melixetian et al., 2009). A Nek11 e Chk1 diretamente fosforilam Cdc25A (cyclin-dependent kinases 25 A) num resíduo cuja a fosforilação é necessária para poliubiquinação mediada por β‑TrCP (β-transducin repeat-containing

protein) e degração de Cdc25A (Melixetian et al., 2009). Esses mecanismos culminam na

ubiquinação e degradação de ciclinas, portanto, impactando a regulação do ciclo celular. Consistente com esses resultados, a redução de Nek11 eleva os níveis da proteína Cdc25A (Meliexetian et al., 2009), cuja superexpressão pode ser observada, por exemplo, em tumor de mama (Ray 2007). Essas observações apontam para um provável envolvimento de Nek11 em tumorigênese. De fato, análises de imunohistoquímica mostraram que a Nek11 é altamente expressa em adenomas e carcinomas de cólon (Sørensen et al., 2010). Importantemente, mutações em Nek11 têm sido observadas em tumores de ovário, pulmão e cérebro e em cultura de células de câncer de pele (Moniz et al., 2011). Portanto, a desregulação de Nek11 pode certamente contribuir para o desenvolvimento de eventos relacionados à tumorigênese, em especial, da resposta à danos no DNA exibidas por certos tipos de câncer.

Em suma, esses achados sugerem que as Neks podem se constituir importantes biomarcadores prognósticos do câncer, cuja interferência tem o potencial para seletivamente intervir com a proliferação celular e a tumorigênese. Entretanto, até a presente data, o potencial das Neks como alvos anti-câncer tem sido relativamente inexplorado e apenas estudos limitados envolvendo desenhos de drogas foram realizados para alguns membros da família. Desta forma, o entendimento do papel biológico das Neks num contexto celular, sobretudo na regulação da divisão celular, tem a primária relevância de que a correção das anormalidades induzidas pelas Neks poderá contribuir grandemente para futuras opções terapêuticas no tratamento do câncer e doenças associadas. Sendo assim, nós propomos para este trabalho, os objetivos que se seguem no próximo capítulo.

CAPÍTULO 2

2.1. OBJETIVOS

Este trabalho teve como objetivo geral investigar o papel funcional e molecular da proteína reguladora Nek7 humana.

Para a caracterização do contexto funcional e molecular desta proteína os objetivos específicos foram:

2.1.1. Identificar as proteínas e/ou substratos que interagem intracelularmente com a Nek7 humana e caracterizar sua interação/fosforilação.

2.1.2. Analisar o perfil de localização celular da Nek7 e suas proteínas parceiras de interação.

2.1.3. Comparar o interactoma de Nek7 com o de Nek6, a fim de fornecer pistas da independência funcional das duas quinases.

2.1.4. Analisar o papel do N e C-terminal de Nek7 na interação e fosforilação.

2.1.5. Caracterizar o envolvimento funcional e molecular de Nek7 com seus potenciais interactores e substratos, com enfoque nos eventos da regulação da divisão celular.

As proteínas quinases são os principais transmissores de sinal em células eucarióticas que desencadeiam, especialmente, os eventos envolvidos no ciclo celular. As proteínas Neks têm emergido como importantes quinases reguladoras da divisão celular, junto aos clássicos reguladores do ciclo celular tais como as CDKs, as ciclinas e PLKs. Os principais caminhos de atuação das Neks no controle do ciclo celular incluem a sinalização do checkpoint do fuso mitótico, a formação do fuso mitótico, e importantemente, a biogênese do centrossomo, a estrutura que une todos os eventos do complexo processo do ciclo celular. Além disso, muitas Neks têm sido associadas a outros diferentes processos tais como transcrição e respiração. Este projeto visa portanto, uma melhor compreensão deste cenário uma vez que o quadro geral do entendimento da biologia das Neks e do mecanismo detalhado de suas funções, permanece bastante desconectado na literatura.

No Capítulo 3 é apresentada uma completa revisão da literatura que aborda os diversos papéis biológicos de todos os membros das Neks, e empregando biologia de sistemas, discute sua associação entre três principais vias essenciais: regulação de centríolos e mitose, função ciliar e ciliopatias, e resposta a dano de DNA.

CAPÍTULO 3

Artigo I

“Stop Ne(c)king around”: How interactomics

contributes to functionally characterize Nek family

kinases

GABRIELA VAZ MEIRELLES, ARINA MARINA PEREZ, EDMÁRCIA ELISA DE SOUZA, FERNANDA LUISA BASEI, PRISCILA FERREIRA PAPA, TALITA DINIZ MELO HANCHUK, VANESSA BOMFIM CARDOSO AND JÖRG KOBARG

WORLD JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 5(2):141-60, 2014 (doi: 10.4331/wjbc.v5.i2.141)

in mitosis-gene A (NIMA)-related kinases (Neks). The founding member of this family is the sole member NIMA of Aspergillus nidulans, which is crucial for the initiation of mitosis in that organism. All 11 human Neks have been functionally assigned to one of the three core functions established for this family in mammals: (1) centrioles/mitosis; (2) primary ciliary function/ciliop-athies; and (3) DNA damage response (DDR). Recent findings, especially on Nek 1 and 8, showed however, that several Neks participate in parallel in at least two of these contexts: primary ciliary function and DDR. In the core section of this in-depth review, we report the current detailed functional knowledge on each of the 11 Neks. In the discussion, we return to the cross-con-nections among Neks and point out how our and other groups’ functional and interactomics studies revealed that most Neks interact with protein partners associ-ated with two if not all three of the functional contexts. We then raise the hypothesis that Neks may be the connecting regulatory elements that allow the cell to fine tune and synchronize the cellular events associated with these three core functions. The new and exciting findings on the Nek family open new perspectives and should allow the Neks to finally claim the attention they deserve in the field of kinases and cell cycle biology. © 2014 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.

Key words: Cell cycle; Mitosis; DNA damage response; Protein interactions; Kinases

Core tip: Never in mitosis-gene A (NIMA)-related ki-nases (Neks) are a family of 11 human kiki-nases involved in cell cycle regulation. This article represents an in-depth review of the current knowledge on the function of each of the 11 human Nek kinases. Furthermore, we present arguments in the discussion of how systems bi-ology, especially interactomics, helped to uncover that the majority of Neks are involved in more than one of

Gabriela Vaz Meirelles, Arina Marina Perez, Edmárcia Elisa de Souza, Fernanda Luisa Basei, Priscila Ferreira Papa, Talita Diniz Melo Hanchuk, Vanessa Bomfim Cardoso, Jörg Kobarg

“Stop Ne(c)king around”: How interactomics contributes

to functionally characterize Nek family kinases

REVIEW

Gabriela Vaz Meirelles, Arina Marina Perez, Edmárcia Elisa de Souza, Fernanda Luisa Basei, Priscila Ferreira Papa, Talita Diniz Melo Hanchuk, Vanessa Bomfim Cardoso, Jörg Kobarg, Laboratório Nacional de Biociências, Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais, Campinas, SP 13084-971, Brazil

Edmárcia Elisa de Souza, Fernanda Luisa Basei, Talita Diniz Melo Hanchuk, Vanessa Bomfim Cardoso, Jörg Kobarg, De-partamento de Bioquímica-Programa de Pós-graduação em Bio-logia Funcional e Molecular, Instituto de BioBio-logia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP 13084-971, Brasil

Priscila Ferreira Papa, Jörg Kobarg, Departamento de Gené-tica, Evolução e Bioagentes-Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de Biologia, Universi-dade Estadual de Campinas, Campinas, SP 13084-971, Brasil Author contributions: Meirelles GV, Perez AM, de Souza EE, Basei FL, Papa PF, Melo Hanchuk TD, Cardoso VB, Kobarg J performed the literature search, analysis and interpretation of the data, and contributed specific parts of the manuscript; Mei-relles GV and Kobarg J elaborated the figures; Kobarg J, Meire-lles GV and Perez AM conceived the overall idea of the review, elaborated the final version of the text together, and supervised the project; all the authors read, revised and approved the final version.

Supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado São Paulo (FAPESP, Grant No.2010/51730-0), Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), and Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM)

Correspondence to: Jörg Kobarg, PhD, Laboratório Nacional de Biociências, Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Mate-riais, Rua Giuseppe Máximo Scolfaro 10.000, C.P. 6192, Campi-nas, SP 13084-971, Brasil. [email protected] Telephone: +55-19-35121125 Fax: +55-19-35121006 Received: November 23, 2013 Revised: January 7, 2014 Accepted: February 16, 2014

Published online: May 26, 2014

Abstract

Aside from Polo and Aurora, a third but less studied kinase family involved in mitosis regulation is the never

World J Biol Chem 2014 May 26; 5(2): 141-160 ISSN 1949-8454 (online)

© 2014 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.

World Journal of

Biological Chemistry

W J B C

Meirelles GV et al. Nek family kinase interactomes and functions

and to include all recent novelty on the least studied Neks as well as our own group’s published and unpublished findings, with a special emphasis on the characterization of the functional context based on the identification of interacting proteins (interactomics). A point we would like to stress here is that most Neks interact with proteins of several of the classical functional contexts reported initially for a subset of specific Neks. In other words, we may characterize the following three areas as the main functional contexts of Neks: (1) centriolar function and mitosis regulation (Nek2, 6, 7 and 9); (2) primary cili-ary function, ciliopathies and microtubule dynamics in general (Nek1, 4 and 8); and more recently (3) DDR and G2/M checkpoint (Nek1, 4, 6, 8, 10 and 11)[8,9].

However, published interactome data (Figure 2), as well as our group’s efforts to identify new interacting proteins for all Neks, showed some surprising cross-connections and novelties, which we would like to point out here. Most of the above mentioned Neks seem to interact with proteins that are functionally linked to two or even all three of the above mentioned areas, thereby raising the possibility that these are somehow connected on a higher regulatory level and that the Neks may be key elements to understand how the regulation of these functional contexts is performed. A typical recently published example is the role of Nek8 in both primary ciliary function and DNA repair mechanisms[10]. Our own studies revealed that Nek6, a kinase primarily as-sociated with mitotic regulatory events[11,12], also interacts with proteins involved in the DNA damage response, such as putative DNA repair and recombination protein RAD26-like (RAD26L) and PHD finger protein 1 (PHF1) (Figure 2)[3]. In fact, for the majority of Neks we found interacting partners of the DDR or effector proteins of different DNA repair pathways, which clearly suggests a larger than initially imagined involvement of Neks in these biological processes. Other insights came from the identification of interacting proteins from the apoptosis regulatory pathways with several Neks (e.g., Nek 1[13] and 5). This suggests that, aside the well established mitotic context, we must be open minded about additional new roles for Neks (Table 1). Before we go into details of new cross-connections and suggested additional functional contexts in the final discussion, we will present each of the 11 human Neks in detail in the following section of this review.

NEK1

Although Nek1 is only the third most studied Nek family member after Nek2 and aside from Nek6, it is in many ways a representative member of this family of protein kinases. Along this line, Nek1 started to draw the atten-tion of the kinase and signaling research communities, not only to itself but to the Nek family after the publica-tion of the seminal article of Upadhya et al in 2000[14]. It reported that deletion mutations in the Nek1 gene in mice caused polycystic kidney disease (PKD) among oth-er pleiotropic effects, ranging from facial dysmorphism,

the three Neks core functions: (1) centrioles/mitosis; (2) primary ciliary function/ciliopathies; and (3) the DNA damage response. Possibly, the Neks act on a higher regulatory level which may control the core functions.

Meirelles GV, Perez AM, de Souza EE, Basei FL, Papa PF, Melo Hanchuk TD, Cardoso VB, Kobarg J. “Stop Ne(c)king around”: How interactomics contributes to functionally characterize Nek family kinases. World J Biol Chem 2014; 5(2): 141-160 Available from: URL: http://www.wjgnet.com/1949-8454/full/v5/i2/141. htm DOI: http://dx.doi.org/10.4331/wjbc.v5.i2.141

INTRODUCTION

The never in mitosis-gene A (NIMA)-related kinases (Neks) represent, aside from the Polo and Aurora kinase families, a third family of mitotic kinases, but remain the least studied to date and hence least understood family of kinases involved in the regulation of the cell cycle. The founding member of this family of kinases is the

Asper-gillus nidulans NIMA, which exists as a single member in this fungus, is functionally involved in the initiation of mitosis and promotes the chromosome condensation by phosphorylation of histone H3[1]. Humans have 11 mem-bers of the Nek family which show highly conserved kinase domains but differ significantly in the composition and length of their N- and especially C-terminal regula-tory and docking domains (Figure 1).

Although some protein interaction partners have been described for the majority of the human Neks (Figure 2), the domain of interaction at the side of Neks has been mapped only for a smaller subset of interacting proteins (Figure 1). As we can see, most interactors are assigned to specific regions in the regulatory domains, which rep-resent in most cases classical protein-protein interaction modules, such as coiled coil regions. Identification of in-teraction with the kinases domains have been scarce due to the transient and weak nature of these interactions and therefore the discovery and characterization of true bona

fide in vivo substrates of Nek kinases remain one of the main challenges in the field. Among the interacting pro-teins identified by our[2,3] and other groups, through both yeast two-hybrid screens and mass spectrometry analyses, there were hopefully not only those that regulate the Neks but maybe also candidate substrate proteins. The binding of these substrate proteins possibly contributes to “opening up” the Neks or to the activation of these kinases and then, as a consequence, these proteins may be phosphorylated by the Neks.

There has been a series of very good and concise reviews on NIMA and Neks in the past years[4-8]. How-ever, due to scarce or absent knowledge on several family members, including Nek5, 10 and 11 for instance, most reviews opted to focus on a subset of Neks or grouped them according to phylogenetic or functional relatedness. Here, we try to discuss all 11 human Neks in some depth

dwarfing, male sterility, anemia and cystic choroid plexus. The pleiotropic nature of these phenotypes suggested a role of Nek1 early on in basic cellular functions, possibly involved in signaling pathways associated with polycys-tin-1 and 2, whose mutations also cause PKD and signal-ing initiates at the renal epithelial cell’s primary cilia[15].

Recently, another set of insertion, non-sense and splice site mutations in the Nek1 gene were reported in Majewski type short-rib polydactyl syndrome (SRPS), an autosomal-recessive familiar ciliopathy[16,17]

. Ciliopathies have been associated with a series of defects of proteins involved in intra-flagellar transport (IFT), as well as cilia, basal body and centrosome maintenance, and in the case of Nek1, SRPS also presents a broad phenotypic spectrum, including reduced cilia number and cell cycle associated cilia morphogenesis. This results ultimately in severe or lethal embryonic malformations and especially osteochondrodysplasia, shortened ribs and tibias,

poly-syndactyly, fused kidneys, heart defects and mouth clefts, among others[17].

In terms of molecular functions, a first breakthrough came from a protein interactome study that shed light on the involvement of Nek1 in several pathways related to the above diseases, but also opened new avenues in the context of cell cycle regulation and DNA damage re-sponses[2]. These findings were later not only confirmed by functional studies but also extended to other Nek family members, including Nek4, 6, 10 and 11[3,8,9,18]. The interactome study was a yeast two-hybrid assay using Nek1 as bait and a human fetal brain cDNA library as prey. Nek1 is a rather large, 1258 amino acids containing protein and interacts with these proteins mainly through the two N-terminals of its four coiled coil regions, which are located at the C-terminal of its kinase domain (Fig-ure 1). Among the Nek1 interacting proteins were the kinesin-like protein KIF3A, tuberin and alpha-catulin, mutation in all three of these genes also have been re-ported to cause PKD. This suggests the existence of a multicomponent signaling or regulatory pathway, which regulates the kidney cell’s proliferation and when affected by mutations may lead to PKD[19-21]. Evidence in support for a major role of Nek1 in primary ciliary function also came from other model organisms, including

Chlamydomo-nas[22].

Surprising at that time was the discovery of interac-tions with several cell cycle regulatory proteins, 14-3-3 protein η (eta, YWHAH), tumor suppressor p53-binding protein 1 (TP53BP1), serine/threonine-protein phosphatase 2A 56 kDa regulatory subunit alpha/delta isoform (PPP2R5A/D) and especially with proteins involved in the DNA damage response, such as the double-strand break repair protein MRE11A (MRE11A) and the transcriptional regulator ATRX (ATRX)[2]. Soon, additional experiments with the irradiation of wild-type and Nek1-/- cells revealed that Nek1 is over-expressed and activated in response to ionizing radia-tion (IR) and co-localizes to γ-H2AX positive DNA repair foci in the nucleus[23]. Cells without Nek1 died in response to sub-lethal doses of IR and knockdown of Nek1 also diminished their capacity to clear DNA dam-age caused by chemical genotoxic dam-agents, such as cispla-tin and methyl-metanesulfonate (MMS)[24]. This line of experiments culminated recently in a paper where the authors showed that Nek1 kinase is not only physically associated with ATR-ATRIP, but also required for ATR priming to allow an efficient DNA damage signaling[25]

. Furthermore, Nek1 has been indicated to act in apop-tosis signaling, especially by phosphorylation of key mitochondrial proteins such as the voltage-dependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1)[13]. This is a pore complex that functions both as a voltage depen-dent anion channel and permeability pore that regulates cytochrome c leakage to the cytoplasm, which upon exit initiates apoptotic events[13]

. Nek1’s activity to maintain cells in homeostasis is mediated through phosphoryla-tion of a specific external VDAC1 Ser residue. Upon apoptotic stimuli, Nek1 is degraded and the lack of

Meirelles GV et al. Nek family kinase interactomes and functions

NEK1 NEK2 NEK3 NEK4 NEK5 NEK6 NEK7 NEK8 NEK9 NEK10 NEK11 Catalytic domain Coiled coils RCC1 Armadillo repeats

Degradation motifs (PEST Seq.) Short unfolded interaction segments Dead box helicase-like domain

645 aa 1125 aa 979 aa NEK6/7 703 aa 302 aa 313 aa

NEK9, TRIP4, CDC42, RAD26L, SNX26, PRDX3, ANKRA2, RBBP6 708 aa 841 aa 560 459 aa 445 aa NEK2, NEK11, PPP1R2 TACP1, TRF1, MAPK1 1258 aa RPGRIP1 VDAC1, ATR/ATRIP ZBRK1 ATRX, MRE11A, TP53BP1 FEZ1/2, KIF3A, PPP2R5A/D, YWHAH, CTNNAL1, TSC2

Figure 1 Representation of the domain organization of the eleven human Neks depicting the domain regions for selected protein interactions. The gene symbols corresponding to interacting proteins are shown above the Neks primary structure regions with which they have been found to interact. The list of interactors is not intended to be complete but is necessarily shorter than the list of all proteins known in the literature to interact with Neks (e.g., see Figure 2), since, for the majority of interactors, the location of interaction in the Neks has not been reported. Different repeated domains have been indicated by the color code at the bottom of the figure. The lengths of the full proteins are indi-cated by number of amino acids (aa) at the C-terminal of the proteins. At least two isoforms of Nek1, 2, 3 and three of Nek4 and 11, all generated by alterna-tive splicing, have been reported and known functional distinctions have been briefly discussed in the text, where feasible. References for the proteins and their mapped interactors: Nek1[2,13,25]

; Nek2[116,121-124]

; Nek4[53]

; Nek6[3]

; Nek9[66]

. Nek: Never in mitosis-gene A-related kinases.

VDAC1 phosphorylation causes opening of the chan-nel, loss of the membrane potential and leakage of cy-tochrome c to the cytoplasm.

Finally, Nek1 has been implicated in gametogenesis due to its high expression levels in meiotic tissues[26]. In another interactome study, this time using a testicular tis-sue cDNA library, the protein Nurit was found to be an interactor of Nek1[27]. Nurit is expressed in the late phase of spermatogenesis, has structural resemblance with leu-cin zippers and contains additional super helix domains, possibly involved in its homo-multimerization. Further-more, the structural maintenance of chromosomes pro-tein 3 (SMC3) was found to interact with Nek1, further implying important functions in meiotic events such as spindle assembly checkpoints[28]

.

In summary, Nek1 has been functionally implied in three major functional contexts and their sub-functions: cil-iogenesis (PKD, SRPS), DNA damage response in a wider sense, also including cell cycle checkpoints and centrosome functions and, finally, gametogenesis. Unpublished recent mass spectrometry studies of the Nek1 interactome after challenging cells with genotoxic drugs identified a number of nuclear proteins, the majority of which were associated with DNA repair, replication and transcription regulation. This, together with a very recent article which reports on Nek1 interaction with NHEJ (Non homologous end join-ing) repair protein Ku80, clearly establishes Nek1 as a key player in DDR signaling[29].

NEK2

Nek2 is the most studied and most well understood of the human Neks. In fact, it will be difficult to cover all of its aspects in the context of this review. Therefore, we focused on the most important features of Nek2 and would like to apologize to the many researchers whose work could not be covered here due to space restrictions. Nek2 shares the highest sequence similarity with NIMA in its kinase domain and many biochemical, structural and functional features. This has led many re-searchers to believe that it may be the prototype NIMA among all vertebrate Neks and that Nek2 may maintain the primordial functions of NIMA in mitosis progres-sion. For this reason, Nek2 became the most studied Nek family member in mammals[6]. However, care must be taken with such an interpretation since Nek2 cannot res-cue NIMA defective mutants and Nek1 also shares many NIMA characteristics[30].

Nek2 expression varies during the cell cycle, being maximal between the S and G2 phase, during which it

localizes predominantly to the centrosome[31,32]. Nek2 is a component of the MTOC (microtubule organization center) at mitosis entry and a core component of the centrosome, where it phosphorylates the centrosomal key components C-Nap1 and rootletin, which form the intercentriolar linker that holds the pair of centrioles physically together. This event in turn promotes

centro-Meirelles GV et al. Nek family kinase interactomes and functions

Figure 2 Global interactome of Nek1-11, involving their published interactors. The proteins color code refers to their main biological function given by the top

enriched Gene Ontology[125]

biological processes (P İ 0.05). Common interactors establish crosslinks between Neks, thereby emphasizing their common functional contexts. The protein sizes are depicted proportional to their connectivity degree. The protein-protein interaction network was built for the first neighbors of Neks using the Integrated Interactome System (IIS) platform, developed at National Laboratory of Biosciences, Brazil (http://www.lge.ibi.unicamp.br/lnbio/IIS/) and visualized us-ing the Cytoscape software[126]. Nek: Never in mitosis-gene A-related kinases.

Node color Axon guidance Protein transport Apoptotic process Transcription, DNA-dependent Metabolic process Cell division Autophagy Signal transduction Cell cycle DNA repair