UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO
GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA HABILITAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS
ANA CLARA SILVEIRA MARQUES
ESPECTROMETRIA DE MASSAS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
Time-of-Flight (MALDI-TOF) APLICADA NA IDENTIFICAÇÃO DOS
MICRORGANISMOS PRESENTES EM FERIDAS CRÔNICAS
Niterói, RJ 2016
ANA CLARA SILVEIRA MARQUES
ESPECTROMETRIA DE MASSAS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
Time-of-Flight (MALDI-TOF) APLICADA NA IDENTIFICAÇÃO DOS
MICRORGANISMOS PRESENTES EM FERIDAS CRÔNICAS
Orientadora: Profª Dra. Beatriz Guitton Renaud Baptista de Oliveira
Co-orientadora: Profª Dra. Márcia Soares Pinheiro
Niterói, RJ 2016
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Graduação em Biomedicina da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção de Título de Bacharel em Biomedicina - Habilitação em Análises Clínicas com Ênfase em Microbiologia.
M357 Marques, Ana Clara Silveira
Espectrometria de massas Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) aplicada na identificação dos microrganismos presentes em feridas crônicas/ Ana Clara Silveira Marques.- Niterói: [ s.n.], 2016.
60 f. : il.
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação em Biomedicina) - Universidade Federal Fluminense, 2016.
1.Staphylococcus aureus. 2.Pseudomonas aeruginosa. I. Título.
CDD 616.014
CDD 616.014
1.Staphylococcus aureus. 2.Pseudomonas aeruginosa. I. Título.
CDD 616.014
ANA CLARA SILVEIRA MARQUES
ESPECTROMETRIA DE MASSAS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
Time-of-Flight (MALDI-TOF) APLICADA NA IDENTIFICAÇÃO DOS
MICRORGANISMOS PRESENTES EM FERIDAS CRÔNICAS
Aprovada em 29 de março de 2016.
BANCA EXAMINADORA
--- Profª. Drª. Beatriz Guitton Renaud Baptista de Oliveira – UFF
Orientadora
--- Profª. Drª. Márcia Soares Pinheiro – UFF
Co-orientadora
--- MSc. Bruna Maiara Ferreira Barreto – UFF
--- MSc. Fernanda Pessanha de Oliveira - UFF (Suplente)
Niterói, RJ 2016
A Deus, pois sem ele nada seria possível.
À minha família, meu bem maior.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus pela vida, por guiar meus passos, me dar
forças através da fé, principalmente nos momentos que me achei incapaz, achando que nada seria possível.
A minha querida orientadora Drª Beatriz, primeiramente pela oportunidade, por me permitir fazer parte de um projeto pelo qual me apaixonei e me dediquei. Aos seus ensinamentos e a todo carinho que sempre teve comigo. Minha gratidão por tudo que fez por mim.
A minha querida professora Drª Márcia, que me ajudou tanto nos momentos que precisei a minha imensa gratidão e admiração pela pessoa que é.
Ao meu pai José Paulo, que está ao lado de Deus em um caminho muito mais bonito, obrigada por ser o grande incentivador dos meus estudos. A minha mãe Sandra, por me dar a vida e ser totalmente responsável por tudo que sou hoje. Aos meus irmãos Barbara e Paulo Victor e meu padrasto Renato por ser a minha família e meu bem mais precioso.
As minhas amigas Fernanda e Bruna, não só do laboratório e da pesquisa, mas amigas do coração com certeza as grandes responsáveis por tudo que aprendi. Obrigada por tudo que me ensinaram, pelo privilégio de conviver diariamente com pessoas de coração e caráter excepcional, palavras nunca serão suficientes para expressar minha eterna gratidão.
A minha terapeuta, Clarissa, por me fazer acreditar que somos capazes quando temos certeza que não, que um sonho e uma vontade são mais fortes que tudo.
Ao meu namorado, Yan por ser o grande responsável pela minha felicidade e alegria diária.
Ao meu primo Hugo, por toda ajuda durante a faculdade, sempre solícito, minha eterna gratidão.
Agradeço a todos que sempre estiveram ao meu lado e de alguma forma incentivaram e torceram pelo meu sucesso.
RESUMO
As feridas crônicas vêm se constituindo como um grave problema em saúde pública em todo mundo principalmente devido ao ônus relacionado ao tratamento gerado aos sistemas de saúde. No Brasil, representam a segunda maior causa de afastamento do trabalho e interferem diretamente na qualidade de vida do paciente, limitando atividades físicas e gerando impactos na auto-estima e no bem-estar. Neste estudo, objetivou-se caracterizar a população sociodemográfica do estudo, caracterizar a microbiota de feridas crônicas tratadas com espuma de poliuretano e identificar cepas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa presentes nestas feridas. Para tanto, realizamos um estudo descritivo, cuja coleta de dados foi realizada na Policlínica Comunitária da Engenhoca (Niterói, RJ), entre os meses de outubro de 2014 e fevereiro de 2015. A coleta do espécime clínico deu-se por meio de swabs mediante técnica de Levine, seguido por cultura em meios seletivos e posterior classificação e identificação pela espectrometria de massas MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight). A aplicação da espectrometria de massa MALDI-TOF para identificação microbiana é revolucionária para a microbiologia clínica, fornecendo uma identificação rápida com mínimo de preparação da amostra a uma potencial economia de custos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Antônio Pedro (UFF). Participaram do estudo 8 pacientes com feridas crônicas, dos quais (50%) eram mulheres e (50%) homens, a média de 68 anos. Os voluntários apresentaram como comorbidades insuficiência venosa crônica (100%) e hipertensão arterial sistêmica (75%). As feridas avaliadas apresentaram características clínicas de infecção. Foi observada alta prevalência de S. aureus (100%) e P. aeruginosa (78,6%) entre as amostras analisadas. A microbiota apresentou grande variabilidade e diversidade, destacando-se as enterobactérias (100%). O presente estudo corrobora a importância de estudos de identificação microbiológica em feridas crônicas utilizando a técnica de espectrometria de massas MALDI-TOF tendo em vista a rapidez na identificação de microrganismos e suas implicações no diagnóstico preciso e imediato de microrganismos.
Palavras-chave: Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; microbiota;
espectrometria de massas; cicatrização de ferimentos.
ABSTRACT
The chronic wounds have established themselves as a serious problem in public health throughout the world mainly due to related burden to treatment generated to health systems. In Brazil, this represents the second most cause of work leave and interfere directly with the patient life quality limiting physical activities and creating impacts on self esteem and wellbeing. In this study, it was intended to characterize the sociodemographic study population, characterize the microbiota of chronic wounds treated with polyurethane foam and identify strains of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa in those wounds. For this purpose, it was executed a descriptive study which data collection was executed at Engenhoca Public Polyclinic, Niterói, RJ, between the months October, 2014 and February, 2015. The collection of the clinical specimen was given via swab through the technique of Levine, followed by culture in selective means and posterior classification and identification by MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight). The Application of MALDI-TOF mass spectrometry for microbial identification is revolutionary for clinical microbiology, providing quick identification with minimal sample preparation for a potential cost savings. This study was approved by the ethics committee in research the Antonio Pedro university hospital (HUAP /UFF). Eight patients with chronical wounds participated in the study, of which (50%) were women and (50%) were men, the average 68 years. The volunteers presented as comorbidities chronic venous insufficiency (100%), and hypertension (75%). The evaluated wounds presented clinical characteristics of infection. It was observed high predominance of S. aureus (100%) and P. aeruginosa (78,6%) among the isolated samples. The microbiota presented great variance and variety, standing out the enterobacteria (100%). This study corroborates the importance of microbiological identification studies in chronic wounds using the technique of MALDI-TOF mass spectrometry in order to rapidly identifying microorganisms and its implications in the precise and immediate diagnostic of the microorganisms.
Key-words: Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; microbiota; mass
spectrometry; wound healing.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Crescimento típico de Pseudomonas aeruginosa em Ágar Cetrimide ...43
Figura 2- Crescimento típico de Staphylococcus aureus em Ágar Manitol Salgado...45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuição dos pacientes segundo características sociodemográficas, Niterói/RJ, 2015...34
Tabela 2- Distribuição dos pacientes segundo características de saúde, Niterói/RJ, 2015...35
Tabela 3- Distribuição dos sinais e sintomas clássicos de infecção em feridas crônicas, referentes à coleta do 1º swab (n=8) e 2º swab (n=6) de pacientes, Niterói/RJ, 2015...37
Tabela 4- Avaliação da microbiota das feridas por MALDI-TOF - 1ª coleta e 2ª coleta, Niterói/RJ, 2015...39
Tabela 5- Identificação de Pseudomonas aeruginosa por MALDI-TOF- 1º coleta e 2º coleta, Niterói/RJ, 2015...44
Tabela 6- Identificação de Staphylococcus aureus por MALDI-TOF - 1º coleta e 2º coleta, Niterói/RJ, 2015...46
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1- Frequência de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos- 1ª coleta ... 40
Gráfico 2- Frequência de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos- 2ª coleta ... 40
LISTA DE ANEXOS E APÊNDICES
Anexo I- Aprovação CEP- Plataforma Brasil ... 59
LISTA DE ABREVIATURAS
DM Diabetes mellitus
DNA Ácido Desoxirribonucleico
EPS Substância polimérica extracelular HAS Hipertensão arterial sistêmica HCCA Ácido alfa-ciano 4-hidroxicinâmico IL-8 Interleucina 8
IVC Insuficiência venosa crônica LPS Lipolissacarídeo
MALDI- TOF Espectrometria de massa por ionização/dessorção a lazer
auxiliada por matriz-tempo de voo
MBL Metalobetalactamase
MRSA Staphylococcus aureus resistentes à meticilina pH Potencial hidrogeniônico ou potencial de hidrogênio RJ Rio de Janeiro
TSA Ágar Triptona de Soja TSB Caldo Triptona de Soja
UFF Universidade Federal Fluminense UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...16
1.1. Feridas crônicas...16
1.1.1. Fisiologia da cicatrização...16
1.1.2.Tecnologias utilizadas no tratamento de feridas...17
1.1.3. Coleta de espécime clínico...18
1.1.4.Feridas infectadas...19
1.2. Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa...19
1.3. Enterobactérias...24
1.4.Espectrometria de massas (MALDI-TOF) na identificação de microrganismos...25 2. OBJETIVOS...28 2.1. Objetivo geral...28 2.2. Objetivos específicos...28 3. METODOLOGIA....29 3.1.Tipo de estudo.. ...29 3.2. Aspectos éticos ...29 3.3. Amostra...29 3.4. Coleta...30 3.5. Análise Laboratorial...31 3.5.1. Cultura...31
3.5.2. Espectrometria de massas por ionização\dessorção a laser auxiliada por matriz- tempo de voo (MALDI-TOF)...31
3.5.2.1.Colônias Gram-positivas...32
3.5.2.2. Colônias Gram-negativas...32
3.5.2.3. Geração dos Espectros...33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...34
4.1.1. Dados sociodemográficos...34
4.1.2. Dados clínicos...35
4.2. Avaliação das feridas crônicas...36
4.3. Análise laboratorial...38
4.3.1. Microbiota presente nas feridas...38
4.3.2. Isolamento e identificação de P. aeruginosa...43
4.3.3. Isolamento e identificação de S. aureus...45
4.4. A importância da espectrometria de massas (MALDI-TOF) como método de identificação...48
5. CONCLUSÃO...49
REFERÊNCIAS...50
ANEXOS...59
1. INTRODUÇÃO
1.1. Feridas crônicas
As feridas crônicas são definidas como aquelas que demoram mais de seis semanas para cicatrizar (LUND; CURTIN, 2014). Deve-se levar em consideração, que são refratárias a diversos tipos de tratamento e decorrem de condições predisponentes que impossibilitam a cicatrização fisiológica (CANDIDO, 2001). Compõem um grave problema de abrangência mundial, responsáveis por significativos índices de morbidade e mortalidade, com considerável impacto econômico (MARTINS et al, 2010; ZHAO, 2010), em torno de 25 milhões de dólares por ano (HAN et al, 2011).
Ressalta-se que estas feridas caracterizam um cenário problemático, pois contribuem drasticamente para o sofrimento dos pacientes interferindo na saúde mental e no bem-estar do indivíduo, além de limitar suas atividades cotidianas, devido à dificuldade de cicatrização, levando ao absenteísmo, desemprego e aposentadorias precoces, bem como, impactos sobre a imagem corporal e o aumento da suscetibilidade a infecções (WAIDMAN, 2011).
1.1.1. Fisiologia da cicatrização
Quando a integridade da pele é alterada, inicia-se o processo de cicatrização, que consiste em uma série de eventos coordenados que resultam na reparação tecidual. Este pode ser organizado em três fases distintas, mas temporalmente superpostas.
A fase inflamatória ou exsudativa tem início imediatamente após o aparecimento da lesão. Ocorre a liberação de substâncias vasoconstritoras e estímulos a cascata de coagulação, com formação da rede de fibrina. Também ocorre a migração de neutrófilos, gradativamente substituídos por macrófagos, que contribuem na angiogênese, fibroplasia e síntese da matriz extracelular (CAMPOS et al, 2007).
A fase proliferativa inicia-se próximo ao quarto dia após a lesão e se estende até o término da segunda semana. É constituída por quatro etapas: epitelização,
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angiogênese, formação do tecido de granulação e deposição de colágeno (CAMPOS et al, 2007).
Na fase de remodelação ocorre a substituição do colágeno tipo III para o tipo I (CAMPOS et al, 2007), que caracteriza a maturidade dos tecidos neoformados.
O conhecimento das fases do processo fisiológico cicatricial é fundamental para o tratamento adequado das feridas. Pois, para a correta reparação das feridas, todas as fases desse processo devem ocorrer em sequência correta, dentro de um período de tempo determinado e numa intensidade ideal, para que as lesões não entrem em estados de cronicidade (SANTOS et al, 2012).
Vê-se, com isso, que o processo de cicatrização é multifatorial, isto é, pode ser influenciado por diversas variáveis locais ou sistêmicas. Entre as variáveis locais destaca-se a infecção, visto que, quando a pele é lesionada, microrganismos geralmente encontrados na superfície obtêm acesso aos tecidos subjacentes.
A fase inflamatória do processo de reparo tecidual é essencial para a remoção desses microrganismos das feridas. Na ausência de uma descontaminação eficiente, essa fase pode se tornar prolongada, com a liberação de citocinas pró-inflamatórias que levam a ferida ao estado de cronicidade (GUO; DIPIETRO, 2010).
O oxigênio também atua como fator crucial no processo de cicatrização, protegendo as feridas de infecções, induzindo a angiogênese, aumentando a diferenciação dos queratinócitos e a síntese de colágeno, além de promover a contração da ferida. Em pacientes diabéticos, sabe-se que a oxigenação tecidual é limitada, em decorrência de prejuízos no fluxo vascular, gerando hipóxia tecidual (GUO; DIPIETRO, 2010).
Entre as variáveis sistêmicas, o aumento da idade representa um fator de risco para o atraso no tempo de cicatrização. O stress também compromete o processo cicatricial, uma vez que sua fisiopatologia leva a desregulação do sistema imune. (GUO; DIPIETRO,2010).
1.1.2. Tecnologias utilizadas no tratamento de feridas
O uso adequado de curativos pode ajudar a manter a umidade do leito da ferida, permitindo, retenção de fatores de crescimento, angiogênese, desbridamento autolítico e manutenção de gradientes elétricos (POWERS et al, 2013). Curativos
primários são aqueles que permanecem em contato direto com a lesão. Já os secundários, ficam sobre a cobertura primária.
Diversas tecnologias são utilizadas para tratamento de feridas crônicas, como hidrogel, alginato, papaína, hidrocolóide,dentre outros. Destaca-se, neste estudo a espuma de poliuretano, usada como curativo primário. Permite proteção mecânica da lesão, absorve exsudato, mantêm o meio úmido e filtra o odor, favorecendo o processo de cicatrização (FRANCO; GONÇALVES, 2008).
1.1.3. Coleta de espécime clínico
A coleta, cultura e análise microbiológica em lesões quando há a suspeita de infecção pode contribuir para um cuidado específico e direto ao paciente (FERREIRA; SANTOS, 2004). Com a avaliação dos microrganismos que prevalecem nas feridas os profissionais da saúde têm subsídios para melhor contribuir na assistência e realização dos curativos, acelerando o processo cicatricial (VICENTIM et al, 2009).
Portanto, a identificação correta de patógenos é imprescindível para iniciar a terapia antimicrobiana adequada, quando necessário, e em alguns casos garantir a sobrevida do paciente, diminuindo o tempo de hospitalização e consequentemente o custo de internação.
Dentre as técnicas de coleta de espécimes clínicos de feridas destacam-se a aspiração, a biópsia e o swab. A aspiração e a biópsia são procedimentos mais invasivos, que causam dor ao paciente (LEVINE et al, 1976; FERREIRA; ANDRADE, 2006). Por outro lado, o swab tem sido mais utilizado para monitorar feridas, por ser um procedimento simples, de baixo custo e não invasivo (LEVINE et al, 1976; FERNANDES et al, 2007). As culturas de swab têm alta sensibilidade, variando de 87 a 100%, alta especificidade de 85 a 94% e excelente precisão de 90 a 99%, quando comparados com estas outras técnicas, exceto em úlceras por pressão (LEVINE et al, 1976).
O método do swab permite isolar microrganismos nas lesões, mas não determina o diagnóstico de infecção na ferida. Isto porque, como dito anteriormente, grande parte das feridas crônicas apresentam microrganismos, o que, não necessariamente, prejudica a cicatrização. Isto é, sabe-se que feridas com quantidades menores de microrganismos podem cicatrizar. Quando ocorre um
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desequilíbrio, levando a um aumento da carga microbiana presente nas lesões, inicia-se a infecção, como aparecimento de sinais e sintomas característicos nas feridas (FERREIRA et al, 2004).
1.1.4. Feridas infectadas
Sabe-se que as feridas crônicas são colonizadas por microrganismos. Nesse sentido, a função do sistema imunológico é de diminuir esta carga microbiana durante o processo cicatricial. No entanto, se o sistema estiver comprometido, a proliferação de microrganismos sobrecarrega a resposta imunológica, podendo levar a infecção (PEDRO; SARAIVA, 2013).
Os indicadores locais de uma lesão com infecção são dor, eritema, edema, calor e exsudato purulento. Enquanto que os sinais e sintomas adicionais podem ser cicatrização sem evolução, descoloração do leito da ferida, granulação friável, odor fétido, túnel para os tecidos moles, rompimento da ferida, exsudato sanguinolento e exsudato seroso aumentado (FERREIRA; SANTOS, 2004; MARTINS et al, 2010).
Lipsky et al (2012) afirmam que as feridas infectadas são aquelas que apresentam exsudato purulento ou dois ou mais sinais clássicos de infecção.
A presença de infecção nas lesões leva a um prolongamento da fase inflamatória, retardando a síntese de colágeno e a epitelização (RONDAS et al, 2013). Assim, a ocorrência de infecções em feridas propicia um aumento do custo de tratamento, exigindo uma série de cuidados que devem ser tomados, tanto pela equipe de saúde quanto pelo paciente em seu domicílio. Dentre os quais, pode-se destacar a necessidade do uso de antimicrobianos e alterações psicológicas e econômicas. Destaca-se também o risco de sepse e outras consequências graves, que podem ser incompatíveis com a vida (BORGES et al, 2008).
1.2. Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa
Estudos destacam que os microrganismos mais prevalentes em feridas crônicas são P. aeruginosa, Escherichia coli e S. aureus (BASU et al, 2009). No entanto, há estudos que destacam outros gêneros também frequentes em feridas como: Proteus sp, Klebsiella sp, Bacteroides spp, Staphylococcus sp e
Streptococcus sp (HAN et al, 2011).
O gênero Staphylococcus pertence à família Micrococcaee. Foi descrito pela primeira vez em 1880, em pus de abscessos cirúrgicos, pelo cirurgião escocês Alexandre Ogston. S. aureus é a espécie mais importante deste gênero, são cocos Gram-positivos com diâmetro de 0,5 µm a 1,5 µm, imóveis, não esporogênicos, produtores das enzimas catalase, coagulase e DNase, com metabolismo anaeróbio facultativo e temperatura ótima de crescimento entre 35ºC e 40ºC, em pH 6,6 a 7,0. São relativamente resistentes ao calor, a dessecação, as elevadas concentrações de cloreto de sódio (até 10%) e as variações de pH (BANNERMAN, 1995; SANTOS et al, 2007).
Apresentam-se amplamente distribuídos na natureza, estando adaptado à sobrevivência em diversos sítios do corpo humano, como as narinas, a pele, a orofaringe, os cabelos e os tratos digestivo e geniturinário (SANTOS et al, 2007).
Está associado a infecções que variam desde as superficiais como: abcessos, celulite e furunculose, até as enfermidades mais graves como: artrite séptica, meningite, osteomelite, endocardite, pneumonia e sepse. Cepas produtoras de exotoxinas podem estar associadas a quadros de toxemias, como as síndromes do choque tóxico e da pele escaldada e a intoxicação alimentar (KLOOS; BANNERMAN, 1995).
A patogenicidade vem sendo relacionada a diversos fatores de virulência, que desempenham papel importante na patogenia das mesmas, tais como: as enzimas extracelulares coagulase, catalase, estafiloquinase, hialuronidase, nucleases e - lactamase a toxina esfoliativa, e as enterotoxinas, além de estruturas de superfície (SANTOS et al, 2007).
A coagulase é a enzima que coagula o plasma, formando uma malha protetora ao redor do microrganismo. A catalase tem como função transformar o peróxido de hidrogênio (H2O2) que pode acumular-se durante o metabolismo
bacteriano e após a fagocitose, em água e oxigênio. A hialuronidase é responsável por hidrolisar ácidos hialurônicos presentes na matriz celular. As lipases são essenciais na hidrólise de lipídios. As nucleases hidrolisam as ligações internucleotidícas, permitindo assim, a invasão do microrganismo aos tecidos. Já a - lactamase é a enzima que quebra o anel -lactâmico, inativando a droga,
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produzida por 90% das cepas hospitalares e 50% das comunitárias de S. aureus (BROOKS et al, 2014).
Dentre as toxinas, destacam-se: hemolisina, que prejudica a resposta quimiotática dos leucócitos através da formação de poros em sua membrana; e leucocidina, que implica em resistência a fagocitose (BROOKS et al, 2014).
Já entre as estruturas de superfície, podem ser citadas: as adesinas, que promovem a adesão bacteriana a células ou à matriz extracelular; a cápsula polissacarídica, que inibe a opsonização e fagocitose; e a proteína A, que tem ação anti-complementar e anti-fagocitária, podendo induzir a ocorrência de reações anafiláticas locais ou sistêmicas (BROOKS et al, 2014).
Dentre os meios seletivos empregados para o isolamento e identificação presuntiva do microrganismo destaca-se o ágar manitol salgado. S. aureus fermenta o manitol produzindo ácido lático, formando colônias arredondadas, lisas e brilhantes, com diâmetro maior ou igual a 1,0 mm, amareladas e/ou com halo amarelo circundante (SANTOS et al, 2007).
Staphylococcus aureus tem se apresentado como um dos agentes mais comuns de infecção comunitária e hospitalar, e sua capacidade em adquirir resistência aos antimicrobianos fazem deste microrganismo, uma das principais causas de mortalidade, principalmente entre pacientes hospitalizados e crianças (CDC, 1997; LIMA et al, 2015).
A antibioticoterapia foi introduzida em 1930 e no início da década de 1940 ocorria a introdução da penicilina. Anos depois já havia relatos de cepas de S. aureus resistentes a penicilina. O S. aureus passou a desenvolver resistência a esse -lactâmico pela produção da enzima -lactamase, (penicilinase), capaz de hidrolisar o anel -lactâmico, da penicilina, tornando-a inativa. Em 1959, foi introduzido o uso das penicilinas semi-sintéticas, resistentes as -lactamases como alternativa para o tratamento de infecções estafilocócicas por estirpes resistentes á penicilina, oxacilina e meticilina, porém em 1961 surgiram as primeiras cepas resistentes a estes antimicrobianos. Inicialmente os S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) estavam restritos a centros de saúde e hospitais de referência, mas rapidamente se associaram a infecções adquiridas na comunidade. A vancomicina tornou-se o antimicrobiano de escolha para o tratamento de infecções severas por S. aureus (MIMICA; MENDES, 2007). Em 1996, o primeiro caso de infecção associada a S.
aureus com reduzida sensibilidade á vancomicina foi documentada no Japão (CDC, 1997).
Uma característica de atual importância é a emergência de resistência plena a vancomicina, a qual foi identificada em estudos realizados na Pensilvânia (CDC, 2002) e em Michigan (CHANG et al, 2003).
O segundo microrganismo mais frequente em feridas crônicas é P. aeruginosa. Foi descrita pela primeira vez em 1862 por Luke após observação de secreção de cor azul esverdeada em infecções purulentas. O fato ocorre devido à produção dos pigmentos piocianina (na cor azul) e pioverdina (na cor verde fluorescente), característicos desta espécie (FERREIRA; LALA, 2010).
Da família Pseudomonadaceae, este microrganismo apresenta-se na forma de bastonete de 0,5 a 0,8 µm de largura por 1,5 a 3,0 µm de comprimento. Trata-se de um bacilo Gram-negativo, aeróbio, não esporulado, não fermentador, que possui flagelo polar e que pode ser observado de forma isolada, aos pares ou em cadeias curtas (FERREIRA, 2005).
Pseudomonas aeruginosa pode ser encontrado em diversos ambientes, tais como: solo, água ou associados a plantas e animais. É um microrganismo não pertencente a microbiota humana, que se adapta facilmente às condições ambientais, o que facilita sua disseminação. Em humanos tem predileção por áreas úmidas tais como: axilas, períneo, mucosa nasal, trato gastrointestinal e orofaringe (FERREIRA; LALA, 2010).
Este microrganismo causa infecções em pacientes imunocomprometidos, determinando diversas infecções relacionadas à assistência à saúde. O fato ocorre, devido a capacidade de colonizar pele e mucosas de pacientes internados, contaminar aparelhos respiratórios, utensílios e equipamentos hospitalares, além de apresentar resistência a muitos antibióticos (FERREIRA; LALA, 2010).
As cepas de P. aeruginosa crescem em meios de cultura como ágar sangue ou meios para o crescimento de bacilos gram-negativos entéricos. O meio seletivo para esta espécie é o Ágar Cetrimide (MURRAY, et al 2007). Podem ser incubados a temperatura 37ºC - 42ºC, e o crescimento a temperatura de 42ºC permite diferenciá-la de outras espécies do gênero Pseudomonas spp (MARTINS, 2003).
A morfologia colonial pode ser variada, podendo ser puntiforme, gelatinosa, rugosa ou mucosa, com odor característico e produção de pigmentos visíveis em meios de cultura, como piocianina (pigmento azulado) pioverdina (pigmento amarelo
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esverdeado), piorrubina (pigmento avermelhado) ou piomelanina (pigmento preto) (FERREIRA; LALA, 2010).
Este microrganismo apresenta resistência natural ou adquirida a muitos antibióticos. São resistentes aos carbapenêmicos por uma série de fatores, dentre os quais se destacam a perda de porinas (canais de difusão responsáveis pela expulsão e penetração de compostos), superexpressão de bombas de efluxo (canais de difusão responsáveis pela expulsão de compostos tóxicos). A estas amostras a antibioticoterapia fica restrita as polimixinas, que, apesar de tóxica, tem sido utilizada (NEVES et al, 2011; FERREIRA; LALA, 2010).
Em 2002, começaram a ser descritos no Brasil, isolados produtores de metalobetalactamases (MBL), enzimas responsáveis por degradar todos os betalactâmicos, a exceção do aztreonam. Por meio de mutações genômicas também foi descrita resistência as quinolonas (NEVES et al, 2011; FERREIRA; LALA, 2010).
As cepas de P. aeruginosa são consideradas as mais virulentas dentre o grupo dos bastonetes Gram-negativos não fermentadores (FERREIRA, 2005).
Segundo Ferreira (2005) e Murray et al (2014), dentre os fatores de virulência destacam-se:
as fimbrias, que se estendem a partir da superfície celular e promovem ligação as células epiteliais do hospedeiro;
o flagelo, que confere mobilidade, favorecendo a disseminação do patógeno a partir do sítio primário de infecção;
o alginato, que, por sua vez, forma uma cápsula, protegendo o microrganismo da ação de antibióticos e da fagocitose;
a fosfolipase C, responsável pela hidrólise da lecitina e pelo rompimento de lipídios, culminando na destruição tecidual;
a hemolisina, que promove morte celular pela destruição das células de defesa; a exotoxina A, que inibe a síntese proteica e leva a necrose dos tecidos do
hospedeiro; o lipopolissacarídeo (LPS), que estimula a resposta imune;
a protease alcalina e a elastase, que degradam elastina, colágeno e laminina, destruindo tecidos;
os pigmentos fenazídicos, como a piocianina (que, acelera a produção de formas tóxicas de oxigênio e estimula liberação de citocinas pró-inflamatórias) e a pioverdina, que se liga ao ferro.
1.3. Enterobactérias
Diversos estudos vêm destacando a alta prevalência de enterobactérias em feridas crônicas (CARVALHO et al, 2004; MARTINS et al, 2010).
A família Enterobacteriaceae é constituída por microrganismos pertencentes à microbiota intestinal de seres humanos e animais. São bacilos Gram-negativos, não esporulados, móveis ou imóveis, que possuem exigências nutricionais simples, são catalase-positivas, oxidases-negativas e fermentadores da glicose (ALVES, 2011).
Algumas espécies desta família estão associadas á patogenias como abcessos, sepses, meningite, pneumonia, infecções do trato urinário, infecções gastrintestinais, colonização de cateteres e infecções em feridas operatórias (KONEMAN et al, 2008).
As enterobactérias representam os microrganismos mais frequentemente isolados de amostras clínicas e podem causar infecções intestinais e extraintestinais (TRABULSI; CAMPOS, 2002). A maioria das infecções são causadas por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, Proteus spp, Providencia spp, Citrobacter spp e Serratia marcescens (ASENSIO et al, 2011).
Esta família de microrganismos vem apresentando um perfil de elevada resistência aos antimicrobianos, devido a produção de enzimas β-lactamases. Os microrganismos produtores desta enzima apresentam resistência aos betalactâmicos de amplo espectro como as cefalosporinas de terceira geração, isto é, ceftazidima, cefotaxima e ceftriaxona (ASENSIO et al, 2011). A emergência e disseminação de resistência às cefalosporinas de terceira geração é motivo de grande preocupação, pois em geral, elas representam a primeira escolha terapêutica no tratamento de infecções por enterobactérias (ASENSIO et al, 2011).
Dentre a família Enterobacteriaceae, o gênero Proteus, tem sido descrito como um dos mais frequentes na colonização de feridas crônicas (HAN et al, 2011). O principal microrganismo deste gênero, Proteus mirablis é uma espécie pertencente a microbiota intestinal e da região perianal, responsável por causar uma variedade de infecções nosocomiais oportunistas, incluindo o trato respiratório e urinário e infecções de pele e mucosas, especialmente em casos de queimaduras (JACOBSEN et al, 2008).
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A capacidade de P. mirablis em causar doenças está diretamente relacionada aos diversos fatores de virulência, onde se destacam as fímbrias que permitem ligação as células do hospedeiro, permitindo a adesão do microrganismo. A produção da enzima urease associada a píli e a motilidade, podem gerar infecções no trato urinário. Além da hemolisina, que é um fator citotóxico que facilita a invasão renal por esta espécie (CASELLAS, 2008).
Este microrganismo apresenta a capacidade de induzir a apoptose em células epiteliais e a descamação (CASELLAS, 2008).
1.4. Espectrometria de massas (MALDI-TOF) na identificação de microrganismos
Os métodos tradicionais de identificação microbiológica se baseiam em análises fenotípicas que dependem diretamente do isolamento e crescimento do microrganismo em meios de cultura (seletivos e não seletivos), coloração de GRAM e uma série de provas bioquímicas que exigem maior tempo e dependem de processos metabólicos do microrganismo.
Estes métodos podem levar dias para obtenção de um resultado, que, ao final, pode ser inconclusivo. Esses testes fenotípicos são passíveis de erros, são mais trabalhosos e demandam maior tempo para liberação de um resultado. Em alguns casos, como na bacteremia, a identificação e o tratamento são extremamente críticos, por esses motivos, torna-se cada vez mais necessária à adoção de métodos diagnósticos rápidos que não dependa diretamente do crescimento do microrganismo (PASTERNAK, 2012).
O atraso na liberação do laudo pode levar a prescrição de antibióticos empíricos, que são, por vezes, inadequados. Bem como, à automedicação, podendo gerar prejuízos graves ao paciente e atrasos na evolução clínica, aumentando a suscetibilidade a novas infecções.
Alguns laboratórios de pesquisa e principalmente de microbiologia clínica, na tentativa de fornecer resultados mais precisos, adotaram alguns sistemas automatizados, mais eficientes, porém ainda apresentam limitações, podendo ser demorados, levando períodos de horas ou até dias, para liberação do resultado, no caso de microrganismos mais exigentes (SANTOS et al, 2013; MIMICA et al, 2013).
O princípio da espectrometria de massas surgiu em 1906. Nos anos 80, técnicas como o MALDI-TOF, espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz-tempo de voo (MALDI-TOF), permitiram análises de moléculas de alto peso molecular como proteínas e ácidos nucléicos (ASISS et al, 2011). Em 2002 o pesquisador japonês Koichi Tanaka, recebeu o prêmio Nobel de química, ao desenvolver o método MALDI-TOF para análises de espectrometria de massa em macromoléculas biológicas (GOULART; RESENDE, 2013). O MALDI-TOF é uma técnica de espectrometria, que detecta moléculas de massa maior, como as proteínas (GOULART; RESENDE, 2013).
De acordo com Pasternak (2012, p. 118)
Para execução da técnica o material é colocado em uma placa com matriz e bombardeado com um laser que o evapora; um sistema ioniza e aspira o material volatilizado, que chega a detectores, os quais registram o tempo em que a substância chega ao detector e sua quantidade. Cada patógeno tem um espectro característico que é analisado por um software.
O MALDI-TOF é uma técnica recente, rápida, confiável, facilmente interpretada e de fácil execução, pois necessita de pequenas quantidades de material biológico e pode ser aplicada em larga escala e por isso é indicada para o diagnóstico microbiológico (PAULETTE et al, 2013). Além disso, permite diagnósticos mais complexos e identificações mais detalhadas, especialmente de patógenos que não podem ser prontamente identificados por cultura e análise bioquímica (STINGU et al, 2008; MIMICA et al, 2013).
O MALDI-TOF vem sendo utilizado com muito sucesso na microbiologia clínica e adotado por muitos laboratórios ao redor do mundo, por ser uma tecnologia automatizada e de alto rendimento. Apesar do investimento inicial ser alto, o gasto para cada identificação é baixo. Esta metodologia constitui alto desempenho analítico e requer o mínimo de preparo da amostra, diminuindo o tempo para liberação do resultado e consequentemente a evolução mais rápida do tratamento (PATEL, 2015). Assis et al (2011) afirmam que o tempo de análise das amostras, utilizando o MALDI-TOF, chegam a 30 segundos, enquanto no método convencional pode chegar a dias.
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Apesar da técnica ser indiscutivelmente benéfica e revolucionária, ainda apresenta algumas limitações no que diz respeito à identificação de microrganismos de parede espessa como fungos filamentosos e micobactérias. Outra desvantagem é que ainda não é possível obter o perfil de resistência dos microrganismos, sendo indispensável à realização do antibiograma por métodos convencionais, além do elevado custo de implantação desta tecnologia (ASSIS et al, 2011).
Muitos estudos vêm demonstrando que a técnica MALDI-TOF alberga uma série de propósitos além da identificação e tipagem de isolados microbianos, como estudos epidemiológicos, detecção de agentes patogênicos em água de origem alimentar, entre outros aspectos no ramo da microbiologia (SINGHAL et al, 2015).
Existem poucos estudos acerca da identificação de microrganismos de feridas crônicas pela técnica do MALDI-TOF o que aponta a relevância deste trabalho como uma importante ferramenta para a caracterização precisa de espécies bacterianas relacionadas a infecções crônicas de feridas.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Analisar os microrganismos presentes em feridas crônicas de pacientes tratados com espuma de poliuretano.
2.2. Objetivos específicos
Caracterizar os pacientes incluídos no estudo de acordo com dados sociodemográficos e clínicos;
Descrever, a partir da coleta de amostras biológicas por meio de swab, os microrganismos cultiváveis presentes nas feridas, com destaque para as cepas de S. aureus e P. aeruginosa;
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3. METODOLOGIA
3.1. Tipo de estudo
Trata-se de um estudo descritivo, utilizando swab para coleta do espécime clínico de lesões crônicas que utilizem a espuma de poliuretano para tratamento.
3.2. Aspectos éticos
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina/UFF e do Hospital Universitário Antônio Pedro com CAAE 33740214.2.0000.5243 e número de parecer de aprovação 815.353 de 03 de outubro de 2014. Com o intuito de atender a Resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde foi apresentado ao paciente ou responsável o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. É conveniente relatar que não houve incentivo financeiro à participação dos pacientes. A não autorização por parte do paciente em participar do estudo, não trouxe prejuízo algum em seu atendimento.
3.3. Amostra
A amostra foi determinada por conveniência. Foram incluídos na pesquisa pacientes atendidos na Policlínica Comunitária da Engenhoca, localizada na cidade de Niterói-RJ, entre os meses de outubro de 2014 e fevereiro de 2015 e que atenderam aos critérios de inclusão: idade acima de 18 anos; apresentar uma ou mais feridas crônicas; usar espuma de poliuretano no tratamento da úlcera. Foram consideradas feridas crônicas aquelas cujo tempo de processo de reparo tecidual fora maior que seis semanas para ser concluído (SCOTTON et al, 2014).
Foram critérios de exclusão: presença somente de necrose no leito da úlcera (CUZZELL, 1993); gravidez suspeita ou confirmada e uso de medicamentos imunossupressores.
3.4. Coleta de dados
Foram coletadas 2 amostras clínicas de cada paciente. As coletas de material biológico foram realizadas por enfermeiros experientes, em duas consultas com cada paciente, com intervalos quinzenais entre as coletas.
Na primeira consulta, foram coletados os dados clínicos dos pacientes: identificação, história clínica e características da lesão, sendo registrados em protocolo próprio. Em seguida, foram realizadas as coletas de material biológico das feridas através do swab.
Procedia-se, a antissepsia das mãos, limpeza da ferida com soro fisiológico a 0,9% perfurado com a agulha 40x12 e o desbridamento de tecidos inviáveis (MARTINS; MENEGHIM, 2012). A seguir, determinava-se a área de coleta mais adequada, optando-se por um local da ferida onde houvesse tecido aparentemente limpo e viável (tecido de granulação), pois, ao contrário do que se imagina é onde a infecção ocorre (CUZZELL, 1993). A seguir, umedecia-se a ponta do swab com soro fisiológico a 0,9%, e então a pressionava, rodando-a por 1cm² em seu próprio eixo por 5 segundos, para que ocorresse expressão do fluido do tecido (LEVINE et al, 1976).
Na segunda consulta, realizada cerca de quinze dias após a primeira, eram atualizadas as informações sobre as características da ferida, incluindo mensuração da área por planimetra através de decalque (OLIVEIRA et al, 2013) e fotografia, e realizada a coleta do segundo swab.
Após a coleta dos materiais biológicos, os curativos foram realizados de acordo com a necessidade do paciente. As amostras foram devidamente identificadas, com os dados do paciente e a data da respectiva coleta e encaminhadas à análise microbiológica em meio de transporte Stuart, para a preservação das bactérias possivelmente presentes (FERREIRA; SANTOS, 2004).
As informações obtidas foram tabuladas em planilhas de Excel e divididas em categorias: dados clínicos do paciente, descrição das feridas e dados laboratoriais.
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3.5. Análise laboratorial
3.5.1. Cultura
No Laboratório de Controle Microbiológico (LCM) da Faculdade de Farmácia (UFF), os swabs coletados eram introduzidos em 2ml de salina estéril (0,9% p/v), processados em vórtex e cerca de 1 mL da suspensão obtida era adicionado em 2 mL de caldo triptona de soja (TSB), meio altamente nutritivo para fins gerais, sendo em seguida, incubado a 37ºC por 24 horas.
Uma alçada da suspensão bacteriana proveniente de TSB com crescimento microbiano positivo foi semeada em Ágar Manitol Salgado (DIFCO), para detecção de S. aureus e em Ágar Cetrimide (DIFCO), para detecção de P. aeruginosa (MURRAY et al. 2007), os quais foram incubados por 24-48h a temperatura de 37ºC.
Com objetivo de avaliar e caracterizar a microbiota das feridas dos pacientes tratados com espuma de poliuretano, uma alçada do crescimento obtido em TSB foi semeada em ágar triptona de soja - TSA (DIFCO), incubado por 24-48h a temperatura de 37ºC. Após a observação das diferentes características coloniais obtidas no ágar TSA, foram realizados esfregaços em lâminas para análise morfotintorial pelo método de coloração de Gram. Após identificação, todos os isolados foram mantidos a -70ºC em meio crioprotetor (TSB com glicerol 50% v/v).
3.5.2. Espectrometria de massas por ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz-tempo de voo (MALDI-TOF)
As amostras foram identificadas pela técnica de espectrometria de massas MALDI-TOF com base em protocolos específicos para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Esta etapa foi realizada no Instituto de Microbiologia Paulo de Góes localizado na Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ.
A partir das amostras congeladas em meio crioprotetor, foi retirada uma alçada, a qual foi inoculada em TSB e incubada a 37°C. Após verificação da turvação do meio de cultura, foi realizada a semeadura em ágar TSA, seguida por incubação em estufa por 24h à 48h à temperatura de 37ºC.
As placas de TSA foram analisadas e posteriormente, todas as colônias bacterianas com características morfotintoriais distintas na placa foram selecionadas para identificação pela técnica de MALDI-TOF.
3.5.2.1. Colônias Gram-positivas
Devido à composição espessa da parede celular de bactérias Gram-positivas, como S. aureus, ocorreu uma etapa de extração das amostras. As colônias selecionadas foram diluídas em água destilada estéril para padronização da turvação correspondente a escala 1,0 de McFarland. Em seguida, 300µl dessa suspensão foram retirados para um microtubo de 1,5mL e adicionados 900µl de etanol absoluto para inativação das células.
Após mistura, foi realizada centrifugação a 15.000 rpm, por 2 minutos com eliminação do sobrenadante. O sedimento foi ressuspenso em 50 µl de ácido fórmico a 70%, para que ocorresse o rompimento da parede celular, e em seguida foi adicionado 50 µl de acetonitrila.
Após homogeneização com vórtex, nova centrifugação a 15.000 rpm por 2 minutos foi realizada e o sobrenadante com o extrato proteico do microrganismo pesquisado foi transferido para um novo microtubo mantido a -20ºC, para posteriormente ser aplicado no MALDI-TOF Microflex LT (BrukerDaltonics, Leipzig, Alemanha). No momento da análise, os extratos proteicos obtidos foram aplicados em uma placa de metal (1µl) e submetidos a secagem à temperatura ambiente.
3.5.2.2. Colônias Gram-negativas
Devido à composição não tão espessa da parede celular de bactérias Gram-negativas, como P. aeruginosa, utilizavam-se células retiradas diretamente do meio sólido (TSA), com o auxílio de alça bacteriológica, depositadas sobre a placa de metal utilizada no MALDI-TOF. Posteriormente, sobre a amostra, era adicionado 1µL de ácido fórmico 70%, submetidos a secagem a temperatura ambiente.
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3.5.2.3. Geração dos espectros
Para geração dos espectros, sob o extrato seco (das colônias gram-positivas) e sob as colônias gram-negativas retiradas diretamente das placas, foi aplicado 1 µl de uma matriz composta pelo ácido alfa-ciano 4-hidroxicinâmico (HCCA) preparado em 50% de acetonitrila e 2,5% de ácido trifluoroacético, de forma a cobrir as amostras anteriormente aplicadas na placa. Essa matriz foi responsável por uma ionização mais eficiente, e compartimentalização dos polipeptídeos, de forma que os mesmos se dissociassem sem que houvesse alteração das suas características de massa molecular e carga. Após secagem a temperatura ambiente, a placa foi submetida ao espectrômetro de massa MALDI-TOF Microflex LT equipado com um laser de 337 nm de nitrogênio, com frequência de 60Hz, em modo linear.
Em etapa posterior foram emitidos pulsos do laser sobre a amostra, que sofreu assim, uma ionização, a qual fez com que a mesma realizasse uma espécie de “aceleração” em um campo magnético, atingindo o detector (esse evento é chamado “Voo”). Como os peptídeos menores atingem mais rapidamente o detector, em relação aos maiores, foi possível assim, que o software Biotyper 3.1 formasse um espectro que relaciona a carga e massa dessas moléculas, pela intensidade das mesmas. Esse software comparou o espectro obtido com os espectros contidos em seu banco de dados: através de um algoritmo baseado nas similaridades entre os picos do espectro da amostra testada e os picos dos espectros das amostras contidas no banco de dados, o software calculava um score, e fornecia a identificação da espécie de acordo com o score mais alto.
“Scores” entre 3,0 e 2,3 foram considerados com alta credibilidade a nível de espécie; “scores” entre 2,299 e 2,0 foram considerados para identificação à nível de espécie; scores obtidos entre 1,999 e 1,7 foram considerados para identificação a nível de gênero; scores menores que 1,7 não foram considerados confiáveis para identificação.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Caracterização dos pacientes com feridas crônicas
4.1.1. Dados sociodemográficos
Os dados sociodemográficos dos pacientes foram listados na tabela 1.
Tabela 1- Distribuição dos pacientes segundo características
sociodemográficas, Niterói/RJ, 2015. Paciente Sexo Idade Escolaridade Ocupação
1 2 3 4 5 6 7 8 M M F M F M F F 61 78 65 63 85 73 64 55 Fundamental Fundamental Fundamental Fundamental Analfabeto Fundamental Médio Médio Manutenção Aposentado Dona de casa Aposentado Pensionista Aposentado Aposentado Dona de casa
Observou-se que a amostra estudada se distribuiu de forma equilibrada entre os sexos, pois, do total de 8 pacientes, 4 (50%) eram do sexo masculino e 4 (50%), do sexo feminino. O estudo realizado por Ramos (2014) no Brasil, na avaliação de feridas crônicas, corroboram estes achados.
Segundo dados da literatura, as feridas crônicas são consideradas um problema que afeta principalmente o gênero feminino por estar correlacionada a fatores hormonais (OLIVEIRA et al, 2012; RAMOS, 2014). Entretanto algumas pesquisas apontam que o gênero masculino tem se mostrado preponderante (TUTTLE, 2011; MARTINS, 2008).
A idade variou de 55 a 85 anos, sendo a média 68 anos e desvio padrão
±9,23. A maioria dos pacientes (87,5%) eram idosos com idade igual ou superior a 60 anos, conforme a Lei No 10741 (2003), que dispõe sobre o Estatuto do Idoso (BRASIL, 2003). A prevalência de feridas crônicas é maior na idade avançada devido ao envelhecimento biológico e por ser marcada por um perfil de condições crônicas degenerativas. Como confirma Silva (2009), os idosos apresentam vascularização comprometida, diminuição da elasticidade da pele, além da presença de comorbidades. Em estudos realizados por Chavaglia (2015); Gomes (2011)
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também pode ser observado a prevalência de feridas crônicas em pacientes com idade superior a 60 anos.
Os dados referentes a escolaridade mostram que 62,5% tinham ensino fundamental, 25% ensino médio completo e 12,5% eram analfabetos. Nenhum paciente possuía ensino superior. Estes achados corroboram com outras pesquisas realizadas no Brasil (OLIVEIRA et al, 2012; QUEGE, 2008). A baixa escolaridade pode gerar dificuldade na compreensão de orientações dadas pelos profissionais de saúde e na prática do autocuidado.
Em relação à ocupação, 50% eram aposentados, 25% dona de casa, 12,5% pensionista e 12,5% trabalhava em serviços de manutenção. Ressalta-se que 62,5% dos pacientes eram aposentados e pensionistas, situação que pode ser influenciada pela cronificação das feridas, que pode levar a incapacidade física e ao impacto psíquico, afetando a saúde mental do indivíduo. Em concordância com os dados relacionados, Hopkins (2001) afirma que muitos pacientes com feridas crônicas não conseguem retornar a trabalhos anteriores e executar tarefas diárias.
4.1.2. Dados clínicos
A tabela 2 apresenta os resultados referentes a distribuição dos 8 pacientes segundo características de saúde.
Tabela 2- Distribuição dos pacientes segundo características de saúde,
Niterói/RJ, 2015. Variáveis de saúde N % Doença de base DM 0 0 HAS 0 0 IVC 2 25,0 HAS+ IVC 6 75,0 Variáveis Etilismo 1 12,5 Tabagismo 2 25,0
Tempo da lesão Até 10 anos 7 87,5 > 10 anos 1 12,5
O valor 0 (zero): significa que nenhum paciente apresentou tal característica. HAS: hipertensão arterial sistêmica; IVC: insuficiência venosa crônica; DM: diabetes mellitus; n= número de pacientes;
Em relação ao perfil clínico dos pacientes, destaca-se que 75% dos participantes possuíam hipertensão arterial sistêmica e insuficiência venosa crônica, concomitantemente. O estudo realizado por Gomes (2011) relata resultados semelhantes aos encontrados neste estudo.
Em relação às varáveis etilismo e tabagismo, 12,5% dos pacientes faziam uso de bebidas alcoólicas e 25% eram fumantes. Esses fatores estão em destaque por estarem associados ao processo cicatricial das feridas. O fumo pode levar à disfunção pulmonar reduzindo a chegada de oxigênio às células (RUFINO; SILVA, 2006) enquanto o consumo de bebidas alcoólicas pode comprometer o sistema imunológico, prejudicando a cura (JUNKES, 2009).
Em relação ao tempo da lesão, 87,5% relataram o aparecimento da primeira úlcera em até 10 anos e 12,5% há mais de 10 anos.
4.2. Avaliação das feridas crônicas
Quanto a classificação das feridas, todos os pacientes (100%) possuíam feridas de etiologia venosa. Segundo dados da literatura os principais tipos de feridas de perna são de etiologia venosa, como confirma o estudo realizado por Thomas (2013). Em relação à localização, 62,5% dos pacientes tiveram suas feridas localizadas na região do maléolo, seguida pela região anterior ou posterior da perna (25%) e dorso do pé (12,5%).
Quanto aos resultados referentes a 1ª consulta, observamos que 87,5% das feridas eram superficiais e 12,5% parciais. Enquanto que, na 2ª consulta, observou-se que 100% das lesões eram superficiais.
Um dos principais indicativos de que uma ferida possa estar infectada é a diminuição do tecido de granulação, diante disso, na 1ª consulta, observamos que 4 pacientes apresentavam 1-25% de tecido de granulação no leito da lesão, 3 pacientes apresentavam 26-50% e 1 paciente, 51-75%.
Em relação a 2ª consulta, cabe ressaltar, que ocorreram perdas de seguimento, tendo em vista que dois pacientes não compareceram ao agendamento. Em relação ao tecido de granulação, 1 paciente apresentou 1-25% de tecido de granulação no leito da lesão, 3 pacientes, 26-50%, 1 paciente, 51-75% e 1 paciente, 76-100%.
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Pesquisamos os sinais clássicos de infecção e os resultados foram listados na tabela 3.
Tabela 3- Distribuição dos sinais e sintomas clássicos de infecção em feridas
crônicas, referentes à coleta do 1º swab (n=8) e 2º swab (n=6) de pacientes, Niterói/RJ, 2015.
Sinal ou Sintoma 1ª Coleta 2ª Coleta
N % N % Clássicos Dor 5 62,5 3 50,0 Eritema 1 12,5 3 50,0 Edema 5 62,5 2 33,3 Calor 1 12,5 0 0,0 Exsudato purulento 3 37,5 2 33,3 Sinais adicionais
Cicatrização sem evolução 8 100,0 8 100,0
Descoloração do leito 0 0,0 0 0,0
Granulação friável 1 12,5 0 0,0
Odor fétido 2 25,0 1 16,7
Túnel para tecidos 0 0,0 0 0,0
Exsudato piosanguinolento 2 25,0 0 0,0
Exsudato seroso 3 37,5 4 66,6
O valor 0 (zero) significa que nenhum paciente apresentou o sinal ou sintoma; N= número de pacientes; %= percentual de pacientes.
A ferida é dita como infectada quando apresenta exsudato purulento ou dois ou mais sinais clássicos de infecção (LIPSKY et al, 2012). Em relação aos resultados referentes à 1ª consulta, o sinal clássico mais frequente foi aumento da dor, com frequência acima de 60%. Esse mesmo sinal apresentou frequência menor na 2ª consulta, igual ou abaixo de 50%.
Os sinais calor e granulação friável ocorreram em baixa frequência na 1ª consulta (12,5%) e não foram observados na 2ª consulta.
Em relação ao sinal clássico eritema, que se apresentava em baixa frequência na 1ª consulta (12,5%), aumentou consideravelmente na 2ª consulta (50%).
O odor fétido foi notado em 25% na 1ª consulta e 16,7% na 2ª consulta. Em relação à avaliação do exsudato, 37,5% dos pacientes drenavam exsudato purulento, 37,5%, exsudato seroso e 25%, exsudato piosanguinolento-
resultados referentes a 1º consulta. Entretanto na 2º consulta, 66,6% apresentavam exsudato seroso e 33,3% purulento.
O exsudato seroso, caracterizado por uma extensa liberação de líquido, está associado a lesões limpas, já o exsudato purulento está geralmente associado a processos infecciosos, enquanto o exsudato sanguinolento relaciona-se a lesões vasculares (VIANA, 2011). Desta forma, ao comparar as duas consultas, podemos perceber o aumento na frequência do exsudato seroso e ausência do exsudato piosanguinolento.
Podemos perceber pelos critérios clínicos, clássicos e adicionais que as feridas crônicas deste estudo eram feridas com sinais de infecção.
4.3. Análise laboratorial
4.3.1. Microrganismos presentes nas feridas
Em todas as amostras biológicas coletadas foi observado crescimento microbiano, evidenciado por turvação em TSB. No meio TSA, todas as amostras apresentaram crescimento e após observar as diferentes características coloniais, realizamos a coloração de Gram das colônias com diferentes características morfológicas observadas a olho nu nas placas. Os resultados referentes à coloração de Gram e a identificação por MALDI-TOF foram listados na tabela 6.
39
Tabela 4- Avaliação da microbiota das feridas por MALDI-TOF - 1ª coleta e 2ª
coleta, Niterói/RJ, 2015.
Paciente 1ª Coleta MALDI-TOF 2ª Coleta MALDI-TOF
Espécies Encontradas GRAM Espécies Encontradas GRAM
1 Escherichia coli
Kerstersia gyiorum
negativa
negativa Proteus mirabilis negativa
2 Staphylococcus aureus Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Serratia marscences positiva negativa negativa negativa Proteus mirabilis Alcaligenes faecalis negativa negativa 3 Staphylococcus aureus Proteus mirabilis positiva negativa Acinetobacter pitti Proteus mirabilis negativa negativa 4 Proteus mirabilis Morganella morganii Pseudomonas aeruginosa Kerstersia gyiorum negativa negativa negativa negativa Proteus mirabilis Providencia stuartii negativa negativa 5 Proteus mirabilis Providencia stuartii Pseudomonas aeruginosa negativa negativa negativa Proteus mirabilis Kerstersia gyiorum Enterococcus faecalis negativa negativa positiva 6 Staphylococcus aureus Proteus mirabilis Providencia stuartii Kerstersia gyiorum positiva negativa negativa negativa Perda Perda 7 Staphylococcus warneri Proteus mirabilis Providencia stuartii Morganella morganii positiva negativa negativa negativa Perda Perda 8 Proteus mirabilis Alcaligenes faecalis negativa
negativa Proteus mirabilis negativa Perda: não foi coletado o 2º swab, por motivos diversos um paciente se internou para tratamento de câncer e o outro paciente se mudou para outro estado. Sendo assim, na avaliação após 30 dias, há apenas 6 pacientes.
Foram identificadas através do MALDI-TOF 25 colônias de microrganismos referentes a 1ª coleta, dentre os quais os gêneros isolados com maior frequência foram: Proteus (7), Staphylococcus (4), Pseudomonas (3), Kertesia (3) e Providencia (3).
Em 50% das feridas foram isoladas quatro colônias, em 37,5%, duas e em 12,5%, três colônias de microrganismos distintos, evidenciando a característica polimicrobiana das feridas em estudo. A elevada variabilidade e diversidade da microbiota prejudicam a cicatrização das feridas (WOLCOTT, 2015).
Em relação à 2ª coleta, foram identificadas 11 colônias, dentre as quais o gênero mais frequente foi Proteus (6). Em 50% das feridas foram isoladas duas colônias, em 33,3%, uma colônia e, em 16,7%, três colônias.
Ao comparar as duas coletas, percebemos a diminuição no número de colônias de microrganismos isolados por ferida. Os gráficos 1 e 2 ilustram a frequência de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos encontrados nas duas coletas ás condições cultiváveis para o crescimento dos mesmos.
Gráfico 1- Frequência de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos –
1ª coleta
84%
16%
Gram-negativo Gram-positivo
Gráfico 2- Frequência de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos –
2ª coleta
91%
9%
Gram-negativo Gram-positivo
Em relação a 1ª coleta, das 25 colônias isoladas, 21 (84%) foram caracterizadas como Gram-negativas e 4 (16%) como Gram-positivas.
41
Na 2ª coleta, observamos que das 11 colônias isoladas somente uma (9,1%) foi caracterizada como Gram-positiva, todas as outras 10 (90,9%) foram caracterizadas como Gram-negativos.
A existência de múltiplas espécies colonizando a mesma lesão pode indicar a presença de biofilme no leito da ferida, que tem um papel importante na patogênese, como responsável pelo atraso no processo cicatricial e contribuinte para cronicidade das feridas (BOWLER, 2003; MENOITA, 2012).
Tem sido proposto que a causa de infecções de feridas crônicas pode não ser reduzido a uma única espécie de bactérias, mas sim a comunidade polimicrobiana do biofilme como afirma Rhoads e colaboradores (2012).
Em lesões crônicas há uma microbiota diversificada e transitória, na 1ª coleta, a associação mais frequente ocorreu entre espécies de P. mirabilis e S. aureus e P. mirabilis e P. aeruginosa.
Dentre os gêneros Gram-negativos as espécies encontradas em maior frequência foram: P. mirabilis, P. stuartii, P. aeruginosa e K. gyiorum.
P.mirabilis esta associado a infecções do trato urinário e pertence a microbiota intestinal e da região perianal (BALDO; ROCHA, 2014). P. stuartii é um patógeno que também está presente na microbiota intestinal (BROOKS, 2014). O que pode indicar possível contaminação das feridas por material fecal, diretamente relacionada ao déficit do autocuidado.
P. aeruginosa, é um patógeno oportunista, isolado principalmente de plantas, solos, água e tecidos animais, nos humanos tem predileção por áreas úmidas, sendo o trato gastroinstestinal sua principal área de colonização (FERREIRA; LALA, 2010). K. gyiorum, é um membro da família Alcaligenaceae, é um patógeno oportunista infrequentemente associado a infecções humanas (PENCE, 2013).
Foram encontradas em menor freqüência, as espécies E. coli, M. morganii, A. faecalis e S. marscences.
Quanto aos pátogenos Gram-positivos, foram encontrados S. warneri e S. aureus, espécies pertencentes a microbiota da pele (OTTO, 2010).
Segundo dados da literatura, as infecções podem ser provocadas por bactérias que não são necessariamente virulentas e que geralmente compreendem parte da microbiota humana simbiótica e comensal, no entanto, principalmente em hospedeiros imunocomprometidos, estes organismos passam a estar presentes no leito das feridas, por apresentar um ambiente favorável, onde as estratégias de
sobrevivência permitem torná-lo um agente patogênico. As interações entre estes microrganismos irão influenciar diretamente a patogênese e a cicatrização das feridas. (RHOADS, 2012; BOWLER et al, 2001).
Em relação a 2º coleta, a espécie P. mirabilis foi encontrada em todas as feridas e não foram identificadas associações frequentes com outras espécies. Foram encontradas, em baixa freqüência as espécies A. faecalis, K. gyiorum, E. faecalis, A. pitti, e P. stuartii.
Comparando as duas coletas, observamos que houve modificação da microbiota em todas as feridas, com exceção da espécie P. mirabilis.
Há relatos na literatura que o uso de curativos, como a espuma de poliuretano, pode alterar qualitativamente a microbiota (BROOKS, 2014).
Em síntese, podemos observar à alta frequência de microrganismos Gram-negativos, na 1º coleta 84% e na 2º coleta 90,9%. Em ambas as coletas houve predomínio da família Enterobacteriaceae (100%), neste estudo delimitado pelas espécies: P. mirabiliis (92,9%), E. coli (7,1%), M. morganii (14,3%), S. marscences (7,1%) e P. stuartii (28,6%). Estes microrganismos são residentes da microbiota intestinal, são anaeróbios facultativos e contribuem em infecções hospitalares e associadas à comunidade. O estudo realizado no Ceará, por Carvalho e colaboradores (2004), reitera os achados desta pesquisa e relata à alta frequência, 83,7% de enterobactérias isoladas de úlceras de pé diabético.
Ao compararmos somente o grupo dos microrganismos Gram-negativos 86,1% com outros estudos, estes achados estão em consonância com estudos realizados no Brasil, por Fernandes e colaboradores (2007) que observaram a freqüência de 70,66% de bastonetes Gram-negativos nas lesões, com predomínio de enterobactérias. No estudo de Martins e colaboradores (2010), realizado em Goiânia, dentre o grupo dos microrganismos Gram-negativos, foi observada a frequência de 81%, com predomínio de enterobactérias. Tais dados corroboram este estudo e evidenciam a alta frequência de enterobactérias dentre o grupo dos microrganismos Gram-negativos isolados de feridas crônicas.
Com predomínio de enterobactérias, consequentemente observou-se microrganismos anaeróbios facultativos e uma pequena população de microrganismos aeróbios estritos. Um estudo realizado nos EUA analisou a microbiota em úlceras por pressão e ao avaliar a população de microrganismos
