Inibição da proliferação de celulas tumorais humanas expostas aos adultos de Baylis-Hillman

(1)

(2)

(3)

(4)

... “Na pesquisa existe uma fina linha entre a

persistência e a teimosia. Se você não viver o

suficiente para provar a sua teoria você é chamado

de teimoso."

(5)

À Deus por criar esse mundo maravilhoso e nos dar a capacidade de poder ajudar a melhorar suas criações.

(6)

Aos meus pais, Valter e Milce, por se dedicarem incondicionalmente a nós e, muitas vezes abdicando de seus sonhos, para que os nossos se tornassem realidade.

À minha irmã, Cristiane, pelo amor e carinho sempre presentes.

(7)

Ao meu marido Denilson O que dizer a quem se Ama?

O que dizer a alguém que esta ao meu lado em cada momento, confortando, ajudando e aconselhando? O que dizer a alguém que traz a certeza de que é possível compartilhar uma vida, juntos, sem perder a individualidade?

O que dizer a alguém que através de um olhar é capaz de olhar dentro de mim?

O que dizer a quem se ama?

Simplesmente, esteja sempre comigo! Te amo!

(8)

Ao Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho, mais que um orientador um amigo, sempre presente nestes longos anos de aprendizado.

Muito obrigado pela oportunidade

concedida e confiança em mim depositada, contribuindo para meu crescimento pessoal e científico.

(9)

A Profa. Dra. Wanda Pereira Almeida, obrigada pela amizade, paciência, dedicação e confiança nos trabalhos que realizamos juntos

(10)

Agradecimentos

Ao CPQBA/UNICAMP, pelo oferecimento de suas instalações para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Departamento de Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia da UNICAMP, pela inserção no programa de pós-graduação.

À Profa. Dra Mary Ann Foglio, pelo apoio e amizade demonstrados em todos esses anos de convivência.

À Sirlene Valerio Tinti, pelo companheirismo, amizade presente em todos esses anos, além da colaboração indispensável na realização deste trabalho.

À Marcia Aparecida Antônio, Ana Possenti, Aparecida Érica Bighetti e Patrícia Corrêa Dias, pelo apoio e amizade sempre presente.

Aos amigos Ângelo, Luzia e Leandro que contribuíram para este trabalho.

Aos amigos Ana Lúcia, Carina, Kalu, Alik, Karin, Juliana, Marina, Mariana, Michele, Cristiana, Claudia e Luciana, que de uma forma ou de outra contribuíram para este trabalho.

À Lilian Panagio, secretária do Curso de Pós-Graduação da Biologia Celular e Estrutural do IB/UNICAMP, pela disposição e atenção constantes em todos os momentos,

A todos os amigos que de alguma forma, colaboraram no desenvolvimento desse trabalho, muito obrigada!

(11)

Lista de Figuras

FIGURA 1: ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO BRUCEÂNICO A COM DESTAQUE PARA O GRUPO CARBONÍLICO CONJUGADO ... 29 FIGURA 2: ESTRUTURA QUÍMICA DOS ADUTOS DO GRUPO I ... 41 FIGURA 3: ESTRUTURA QUÍMICA DOS ADUTOS AROMÁTICOS DO GRUPO II, CONTENDO

GRUPOS RETIRADORES DE ELÉTRONS... 41 FIGURA 4: ESTRUTURA QUÍMICA DOS ADUTOS AROMÁTICOS DO GRUPO III, CONTENDO

GRUPOS DOADORES DE ELÉTRONS... 42 FIGURA 5: ESTRUTURA QUÍMICA DOS ADUTOS HIDROGENADO... 43 FIGURA 6: ESTRUTURA QUÍMICA DOS ADUTOS AROMÁTICOS PROTEGIDOS ... 44 FIGURA 7: FOTOMICROGRAFIA ÓPTICA, EM AUMENTO DE 100X COM FASE DAS

DIFERENTES LINHAGENS CELULARES DO PAINEL DO CPQBA/UNICAMP. BARRA DE ESCALA =100_{µM ... 46} FIGURA 8: CURVA CONCENTRAÇÃO - RESPOSTA DA ATIVIDADE DA DOXORRUBICINA

(DOX) SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS. ... 61 FIGURA 9: ESTRUTURA QUÍMICA E CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE

DO ADUTO 1 SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS. ... 62 FIGURA 10: ESTRUTURA QUÍMICA E CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE

(12)

FIGURA 17: ESTRUTURA QUÍMICA E CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DO ADUTO 9 SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS. ... 67 FIGURA 18: ESTRUTURA QUÍMICA E CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE

DO DERIVADO 14 SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS. ... 71 FIGURA 23: ESTRUTURA QUÍMICA E CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE

ANTIPROLIFERATIVA DO DERIVADO 21 SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS... 75 FIGURA 30: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DA ASSOCIAÇÃO DO

ADUTO 4 E DA DOXORRUBICINA SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS... 77 FIGURA 31: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DA

ASSOCIAÇÃO DO DERIVADO 18 E DA DOXORRUBICINA SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS... 78 FIGURA 32: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DA

ASSOCIAÇÃO ADUTO 10 E DA DOXORRUBICINA SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS... 78

(13)

FIGURA 33: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DA ASSOCIAÇÃO DO DERIVADO 20 E DA DOXORRUBICINA SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS... 79 FIGURA 34: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DO IRINOTECANO SOBRE

A LINHAGEM CELULAR DE CARCINOMA DE OVÁRIO (OVCAR-3)... 81 FIGURA 35: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DO

5-FLUOROURACIL SOBRE A LINHAGEM CELULAR DE CARCINOMA DE OVÁRIO (OVCAR-3)... 81 FIGURA 36: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DA

CISPLATINA SOBRE A LINHAGEM CELULAR DE CARCINOMA DE OVÁRIO (OVCAR-3). ... 82 FIGURA 37: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DA

DOXORRUBICINA SOBRE A LINHAGEM CELULAR DE CARCINOMA DE OVÁRIO (OVCAR-3). ... 82 FIGURA 38: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DO

ADUTO 10 SOBRE A LINHAGEM CELULAR DE CARCINOMA DE OVÁRIO (OVCAR-3). ... 83 FIGURA 39: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DO

ADUTO 4 SOBRE A LINHAGEM CELULAR DE CARCINOMA DE OVÁRIO (OVCAR-3). ... 83 FIGURA 40: CURVA DA PORCENTAGEM DE CRESCIMENTO VERSUS TEMPO DE

EXPOSIÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS NA CONCENTRAÇÃO DE 25 µg/mL SOBRE A

LINHAGEM CELULAR OVCAR-3. ... 84 FIGURA 41: CURVA CONCENTRAÇÃO-RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DO

ADUTO 4 SOBRE AS LINHAGENS CELULARES NORMAIS... 85 FIGURA 42: CURVA CONCENTRAÇÃO - RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA

DO ADUTO 10 SOBRE AS LINHAGENS CELULARES NORMAIS. ... 86 FIGURA 43: CURVA CONCENTRAÇÃO-RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DO

ADUTO 5 SOBRE AS LINHAGENS CELULARES NORMAIS... 86 FIGURA 44: EVOLUÇÃO DO PESO CORPORAL DOS ANIMAIS QUE RECEBERAM 0,5 g/Kg DE

PESO CORPORAL ANIMAL DO ADUTO 4 ADMINISTRADO POR VIA INTRAPERINONEAL, NO INÍCIO E NO FINAL DO TESTE DE TOXICIDADE AGUDA. ... 88 FIGURA 45: EVOLUÇÃO DO PESO CORPORAL DOS ANIMAIS QUE RECEBERAM 1,0 g/Kg DE

PESO CORPORAL ANIMAL DO ADUTO 4 ADMINISTRADO POR VIA INTRAPERINONEAL, NO INÍCIO E NO FINAL DO TESTE DE TOXICIDADE AGUDA. ... 89

(14)

FIGURA 46: EVOLUÇÃO DO PESO CORPORAL DOS ANIMAIS QUE RECEBERAM 1,5 g/Kg DE PESO CORPORAL ANIMAL DO ADUTO 4 ADMINISTRADO POR VIA INTRAPERINONEAL, NO INÍCIO E NO FINAL DO TESTE DE TOXICIDADE AGUDA. ... 90 FIGURA 48: MICROSCOPIA ÓPTICA DA LINHAGEM DE ADENOCARCINOMA OVARIANO

OVCAR-3... 92 FIGURA 49: MICROSCOPIA ÓPTICA DA LINHAGEM DE ADENOCARCINOMA OVARIANO

OVCAR-3, CORADA COM AZUL DE TOLUIDINA (AT)... 93 FIGURA 50: MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DA LINHAGEM DE

ADENOCARCINOMA OVARIANO OVCAR-3... 94 FIGURA 51: CURVA DA PORCENTAGEM DE INTERCALAÇÃO DA DOXORRUBICINA NO

DNA-MG... 95 FIGURA 52: CURVA DA PORCENTAGEM DE INTERCALAÇÃO DO ADUTO 4 NO DNA-MG. ... 95 FIGURA 53: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DO ADUTO 4 SEM

PRÉ-TRATAMENTO SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS... 96 FIGURA 54: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DO ADUTO 4 SOBRE AS

LINHAGENS TRATADAS PREVIAMENTE COM L-NAME SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS... 97 FIGURA 55: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DO ADUTO 4 SOBRE AS

LINHAGENS TRATADAS PREVIAMENTE COM AMG SOBRE AS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS... 97 FIGURA 56: CURVA DA ATIVIDADE TEMPO DEPENDENTE DO ADUTO 4 SOBRE A

LINHAGEM NCI-ADR. ... 98 FIGURA 57: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS DIFERENTES

TRATAMENTOS SOBRE A LINHAGEM NCI-ADR APÓS 6 HORAS DE EXPOSIÇÃO. ... 98 FIGURA 58: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS DIFERENTES

TRATAMENTOS SOBRE A LINHAGEM NCI-ADR APÓS 12 HORAS DE EXPOSIÇÃO. ... 99 FIGURA 59: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DA

LINHAGEM NCI-ADR APÓS 24 HORAS DE EXPOSIÇÃO AOS DIFERENTES TRATAMENTOS. ... 99 FIGURA 60: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS DIFERENTES

TRATAMENTOS SOBRE A LINHAGEM NCI-ADR APÓS 6 HORAS DE EXPOSIÇÃO. ...100 FIGURA 61: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS DIFERENTES

TRATAMENTOS SOBRE A LINHAGEM NCI-ADR APÓS 12 HORAS DE EXPOSIÇÃO. ...100

(15)

FIGURA 62: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS DIFERENTES TRATAMENTOS SOBRE A LINHAGEM NCI-ADR APÓS 24 HORAS DE EXPOSIÇÃO. ...101 FIGURA 63: ATIVIDADE DA NOS VERSUS TEMPOS DE EXPOSIÇÃO DO ADUTO 4 SOBRE A

NCI-ADR...101 FIGURA 64: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS TRATAMENTOS

SOBRE A NCI-ADR ...102 FIGURA 65: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS TRATAMENTOS

SOBRE A MCF-7...103 FIGURA 66: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS TRATAMENTOS

SOBRE A NCI-ADR. ...103 FIGURA 67: CURVA CONCENTRAÇÃO RESPOSTA DA ATIVIDADE DOS TRATAMENTOS

(16)

Lista de Esquemas

ESQUEMA 1: REPRESENTAÇÃO SIMPLIFICADA DA ALQUILAÇÃO DE UMA BASE

NITROGENADA POR UMA MOSTARDA NITROGENADA ... 27

ESQUEMA 2: REAÇÕES DE MICHAEL NOS ADUTOS DE BAYLIS-HILLMAN... 28

ESQUEMA 3: REPRESENTAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DA MITOMICINA C... 29

(17)

Lista de Tabelas

TABELA 1: LINHAGENS CELULARES UTILIZADAS NOS ENSAIOS ANTIPROLIFERATIVOS... 45 TABELA 2: CONCENTRAÇÕES CELULARES UTILIZADAS NA REALIZAÇÃO DA CURVA DE

CRESCIMENTO CELULAR... 49 TABELA 3: CONCENTRAÇÃO DAS DROGAS UTILIZADAS NA CURVA DE DOSE RESPOSTA A

DROGAS DE REFERÊNCIA... 50 TABELA 4: DENSIDADE DE INOCULAÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES DETERMINADAS

PARA OS ENSAIOS DE AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA. ... 60

TABELA 5: VALORES DE IC 50* DOS ADUTOS AVALIADOS EM CULTURA DE CÉLULAS

TUMORAIS HUMANAS E DA DOXORRUBICINA UTILIZADA COMO CONTROLE POSITIVO. ... 76 TABELA 6: EFICIÊNCIA DA ASSOCIAÇÃO DO ADUTO COM A DOXORRUBICINA E DO

CONTROLE POSITIVO DOXORRUBICINA (DOX) CONTRA AS LINHAGENS TUMORAIS HUMANAS*... 80

TABELA 7: VALORES DE IC 50* DO ADUTO 4 E DA DOXORRUBICINA OBTIDOS EM

LINHAGENS DE FIBROBLASTOS... 87 TABELA 8: PESO CORPORAL DOS ANIMAIS QUE RECEBERAM 0,5 G/KG DE PESO

CORPORAL ANIMAL DO ADUTO 4, ADMINISTRADO POR VIA INTRAPERINONEAL, NO INÍCIO E NO FINAL DO TESTE DE TOXICIDADE AGUDA. ... 88 TABELA 9: PESO CORPORAL DOS ANIMAIS QUE RECEBERAM 1,0 G/KG DE PESO

CORPORAL ANIMAL DO ADUTO 4, ADMINISTRADO POR VIA INTRAPERINONEAL, NO INÍCIO E NO FINAL DO TESTE DE TOXICIDADE AGUDA. ... 91 TABELA 12: PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA ENZIMA NOS VERSUS TEMPOS DE

(18)

Lista de Abreviatura

5 FU 5- fluorouracil

786-0 Linhagem celular representativa de renal

AMG Aminoguanidina Ciano Aduto 9 CIS Cisplatina CO2 Gás carbónico CPT - 11 Irinotecano DI Densidade de inoculação DMSO Dimetilsuifóxido

DNA Acido desoxidoribonucléico

DOX Doxorrubicina

HT29 Linhagem celular representativa de adenocarcinoma de cólon

K-562 Linhagem celular representativa de leucemia mielóide crônica

L NAME NG- nitro-L-metil arginina metil éster

MCF-7 Linhagem celular representativa de carcinoma de glândula mamária

NCI National Cancer Institute / USA

NCI-H460 Linhagem celular representativa de pulmão

NCI-ADR Linhagem celular representativa de carcinoma de glândula mamária

que expressa o fenótipo de resistência a múltiplas drgas

NO Óxido nítrico

NOs Óxido nítrico sintase

OTES Trietilsililado

OVCAR-3 Linhagem celular representativa de adenocarcinoma de ovário

PC-03 Linhagem celular representativa de carcinoma de prótasta

RPMI Meio de cultura RPMI 1640

RPMI/SFB Meio de Cultura suplementado de 5% de soro fetal bovino inativado

SFB Soro fetal bovino inativado

SRB Sulforrodamina B

TCA Ácido tricloroacético

(19)

Sumário

RESUMO ... 1 ABSTRACT ... 7 INTRODUÇÃO ... 13 OBJETIVOS... 33 METODOLOGIA ... 37

PARTE A: OBTENÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS TESTE... 39

A.1. ADUTOS DE BAYLLIS HILMAN... 39

A.2. PROCEDIMENTO PARA HIDROGENAÇÃO DOS ADUTOS... 42

A.3. PROCEDIMENTO GERAL PARA PREPARAÇÃO DOS DERIVADOS TRIETILSILILADOS... 43

PARTE B: ENSAIOS FARMACOLÓGICOS... 44

B.1. CÉLULAS... 44 B.1.2. Repiques Celulares... 46 B.1.2.1. Células em Suspensão... 46 B.1.2.2. Células aderidas... 47 B.1.3. Descongelamento celular... 47 B.1.4. Contagem celular ... 47 B.1.5. Congelamento celular... 48

B.1.6. Determinação da densidade de inoculação ... 48

B.2. ATIVIDADE ANTICÂNCER DOS QUIMIOTERÁPICOS... 49

B.3. ENSAIO DA SULFORRODAMINA B (SRB) ... 50

B.4. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DAS SUBSTÂNCIAS TESTES... 51

B.4.1. Diluição das amostras ... 51

B.5. ANÁLISE DOS RESULTADOS... 51

B.6. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DAS SUBSTÂNCIAS EM RELAÇÃO AO TEMPO DE EXPOSIÇÃO... 52

B.7. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DAS SUBSTÂNCIAS EM ASSOCIAÇÃO A DOXORRUBICINA... 52

B.8. AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS EM OVCAR-3 NA PRESENÇA DO ADUTO 4... 52

B.8.1. Análise Morfológica por Microscopia Óptica... 53

B.8.2. Microscopia Eletrônica de Varredura... 53

B.10. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE INTERCALAÇÃO –DNA-METHYL GREEN (DNA-MG) ... 53

B.10. INFLUÊNCIA DOS INIBIDORES DE ÓXIDO NÍTRICO SINTASE (NOS), NG-NITRO-L-ARGININA METIL ÉSTER (L-NAME) E AMINOGUANIDINA (AMG), SOBRE A ATIVIDADE ANTICÂNCER... 54

B.11. INIBIÇÃO DA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE (NOS) DA LINHAGEM NCI-ADR PELO ADUTO 4 E INIBIDORES L-NAME E AMG ... 54

B.12. INFLUÊNCIA DE BLOQUEADOR DE CANAIS DE CÁLCIO (VERAPAMIL) NA ATIVIDADE DO ADUTO EM LINHAGEM COM RESISTÊNCIA A MÚLTIPLAS DROGAS... 56

B.13. DETERMINAÇÃO DA DOSE LETAL 50% (DL50) ... 56

RESULTADOS... 57

(20)

PARTE B: ENSAIOS FARMACOLÓGICOS... 59

B.1. DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE DE INOCULAÇÃO (DI)... 59

B.1.2. ATIVIDADE ANTICÂNCER DOS QUIMIOTERÁPICOS... 60

B.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DAS SUBSTÂNCIAS TESTES... 62

B.2.1. Grupo I ... 62

B.2.2. GRUPO II... 64

B.2.3. GRUPO III ... 68

B.2.4. GRUPO REDUZIDO... 70

B.2.5. GRUPO DOS ADUTOS AROMÁTICOS PROTEGIDOS... 73

B.3. DETERMINAÇÃO DOS VALORES DE IC 50... 75

B.4. CURVA CONCENTRAÇÃO-RESPOSTA DOS ADUTOS NA PRESENÇA DA DOX ... 77

B.5. DETERMINAÇÃO DOS VALORES DE IC50 DOS ADUTOS NA PRESENÇA DA DOXORRUBICINA... 79

B.6. CURVA CONCENTRAÇÃO-RESPOSTA DOS ADUTOS EM RELAÇÃO AO TEMPO DE EXPOSIÇÃO... 80

B.7. CURVA CONCENTRAÇÃO-RESPOSTA DOS ADUTOS NAS CÉLULAS NORMAIS... 85

B.8. DETERMINAÇÃO DA DOSE LETAL 50% ... 87

B.9. ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS PRODUZIDAS PELO ADUTO 4 NAS CÉLULAS DE TUMOR OVARIANO OVCAR-3... 91

B.10. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE INTERCALAÇÃO NA DUPLA FITA DE DNA DO ADUTO 4 OBTIDO POR REAÇÃO DE BAYLIS HILLMAN... 94

B.11. INFLUÊNCIA DOS INIBIDORES DE ÓXIDO NÍTRICO SINTASE (NOS), NG-NITRO-L-ARGININA METIL ÉSTER (L-NAME) E AMINOGUANIDINA (AMG), SOBRE A ATIVIDADE DO ADUTO 4 EM CÉLULAS TUMORAIS. ... 96

B.12. INFLUÊNCIA DOS INIBIDORES DA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE (NOS), NG-NITRO-L-ARGININA METIL ÉSTER (L-NAME) E AMINOGUANIDINA (AMG) NA ATIVIDADE DO ADUTO 4 SOBRE A LINHAGEM CELULAR NCI-ADR EM DIFERENTES TEMPOS DE EXPOSIÇÃO. ... 98

B.13. INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE (NOS) NA LINHAGEM NCI-ADR TRATADA COM O ADUTO 4 E OS INIBIDORES L-NAME E AMG. ...101

B.14. INFLUÊNCIA DE BLOQUEADOR DE CANAIS DE CÁLCIO (VERAPAMIL) NA ATIVIDADE DO ADUTO 4 EM LINHAGEM COM RESISTÊNCIA A MÚLTIPLAS DROGAS. ...102

DISCUSSÃO...105

CONCLUSÃO ...119

(21)

(22)

Resumo

Os adutos de Baylis-Hillman apresentam em sua estrutura grupos funcionais passíveis de interação com biomoléculas, tornando-os potentes protótipos para o desenvolvimento de novas drogas antineoplásicas. O objetivo deste estudo é avaliar a atividade anticâncer de alguns β-hidroxiacrilatos e alguns derivados hidrogenados e protegidos.

As substâncias contendo ligação dupla conjugada a carbonila foram obtidas através da reação de Baylis-Hillman, catalisada por DABCO, entre acrilato de metila e o aldeído correspondente. Os derivados hidrogenados e os protegidos foram obtidos pelo tratamento

do aduto correspondente com hidrogênio (H2, Pd/C) e cloreto de trietilsilila,

respectivamente. Os testes in vitro foram realizados com sete linhagens: UACC-62 (pele tipo melanoma), MCF-7 (mama), NCI-H460 (pulmão), OVCAR-3 (ovário), PC-03 (próstata), 786-0 (rim) e NCI-ADR (mama resistente) em diferentes concentrações (0,25 a 250µg/mL). Os resultados foram obtidos através do ensaio do doseamento protéico pela sulforrodamina B.

(23)

Os adutos aromáticos apresentaram atividade antiproliferativa significativa, enquanto seus derivados hidrogenados não inibiram o crescimento celular. Em relação aos diferentes substituintes do anel aromático, o aduto 9 apresentou maior efeito citocida, porém sem seletividade. Já o aduto 10, com substituinte doador de elétrons, apresenta seletividade para a linhagem de carcinoma ovariano. O aduto 4 com substituinte retirador de elétrons, apresentou o melhor perfil de atividade com potência elevada, concentração-dependente e seletividade. O fato do grupo NO2 ser fortemente retirador de elétrons parece ter sido

decisivo para a atividade, visto que é o único fator diferencial do aduto com substituintes doadores.

O aduto 4 foi selecionado para verificação de sua toxicidade e possível(is) mecanismo(s) de

ação. A dose letal 50 (DL50) em camundongos Swiss foi de 1,3g/Kg de peso corporal

animal, sendo considerado de baixa toxicidade segundo Loomis em “Fundamentos de Toxicologia”. As alterações morfológicas desta substância sobre a linhagem de ovário (OVCAR-3) estão em concordância com o resultado obtido no teste de atividade antiproliferativa, uma vez que manteve uma resposta concentração dependente, com um aumento da citotoxicidade em relação à dose utilizada e a morte celular pelo processo de apoptose.

A possibilidade de o aduto estar inibindo a proliferação celular através de intercalação na dupla fita de DNA foi descartada através do ensaio DNA methyl green no qual o aduto 4 não apresentou atividade quando comparado a doxorrubicina, a qual apresentou intercalação concentração dependente na faixa de 32 a 82%, confirmando assim nossa hipótese que o aduto não intercalaria com a dupla fita de DNA. Quando foi avaliada a interferência do óxido nítrico (NO) na atividade antitumoral pode-se observar claramente a perda de atividade da substância quando a cultura foi pré-tratada com L-NAME para a linhagem NCI-ADR e diminuição do potencial da atividade para as demais linhagens; com o pré-tratamento com AMG só ocorreu a diminuição da atividade.

(24)

A quantificação enzimática permitiu concluir que a atividade do aduto 4 tem correlação com a NOs constitutiva dependente de cálcio (nNOs e eNOs). Os resultados interessantes com os inibidores da NOs sobre a linhagem de mama (NCI-ADR) que expressa o fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR) sugere a hipótese dessa substância ter alguma correlação com o processo de resistência. Dessa forma, tanto o derivado 4 como a doxorrubicina tiveram sua atividade anticâncer avaliada na presença de um bloqueador de

canais de Ca+2, o verapamil. Verificou-se que a atividade da doxorrubicina aumenta

significantemente na presença do verapamil sem alterações na atividade do aduto 4. Esse resultado descarta a hipótese de que esta substância tenha envolvimento com o processo de resistência.

Conclui-se que os adutos de Baylis-Hilman apresentam atividade antiproliferativa “in

vitro” em células tumorais humanas sendo esta dependente o sistema α−β insaturado e anel

aromático presente na estrutura. O padrão toxicológico observado na análise permite dizer que a morte celular ocorre por apoptose e possui baixa atividade em fibroblastos normais. A toxicidade “in vivo” foi avaliada como ligeiramente tóxico.

(25)

(26)

Abstract

Baylis-Hillman adducts present in their structures functional groups capable to interact with biomolecules. This capacity makes them good lead compounds for the design of anti-neoplastic drugs. This study is focusing on anticancer activity evaluating for some β-hydroxyacrylates and their hydrogenated or O-protected derivatives.

Baylis-Hillman adducts of this study were obtained from reaction between an aldehyde and methyl acrylate in the presence of 1,4-diazabicyclo-2,2,2-octane (DABCO). Hydrogenated or O-protected BHAs-derivatives were produced from the hydrogenation (H2, Pd/C) or treatment of correspondent BHA-precursor with triethylsilil chloride and

triethylamine.

In vitro tests were performed against the following human tumor cell lines:

UACC62 (melanoma), MCF-7 (breast), NCI-460 (lung), OVCAR-3 (ovarian), PC-03 (prostate), 786-0 (renal), NCI-ADR (multi-resistant breast). BHAs concentration were

employed in the range of 0.25 - 250 µg/mL and doxorubicin (DOX, at the same

concentration range), as positive control. Cell proliferation was determined by spectrophotometric assay using sulforhodamine B as protein-binding dye. Aromatic adducts

(27)

displayed significant antiproliferative activity while their hydrogenated derivatives were not able to inhibit cell growth. Concerning to different groups attached in the aromatic ring, adduct 9 presented the highest cytotoxic activity, however with no selectivity. On the other hand, adduct 10, which possess an electron-donating group in the aromatic ring, show to be selective for OVCAR-3 (ovarian cancer cell). Electron-withdrawing group (-NO2 in adduct

4) improved both potency and selectivity of Baylis-Hillman adduct. These results showed that the presence of electron-withdrawing groups in the aromatic is very important for determining high activity of this Baylis-Hillman adduct. Based on this, adduct 4 was chosen for verifying of its toxicity on mice swiss as well as the possible mechanism of action of this molecule. Lethal dose (LD50) was shown to be 1.3 g of adduct 4/Kg of

corporeal weight mouse, demonstrating that this compound has low toxicity according to Loomis (Fundamentos de Toxicologia). In addition to this, morphological modifications caused by adduct 4 on OVCAR-3 are in agreement with results obtained in the antiproliferative activity assays where it was observed a concentration-dependent effect of this compound. DNA methyl green assay demonstrated that the adduct 4 is not able to bind DNA as compared to doxorubicin a positive control. Interestingly, pre-treatment of NCI-ADR with Nitric Oxide Synthase (NOS) inhibitor NG_{-Nitro-L-arginine methyl ester}

(L-NAME) abolished the antiproliferative activity of adduct 4. No significant loss of activity for adduct 4 was observed on the other cancer cell lines when they were pre-treated with L-NAME. Only slight decrease of adduct 4 activity studied was observed on all cancer cell lines under pre-treatment with NOS-inducible inhibitor aminoguanidine (AMG) suggesting that the antiproliferative activity of adduct 4 on NCI-ADR is related to the increase of constitutive NOS activity. However, measurement of NOS activity using substrate labeled

with 14C showed decreasing in the activity of constitutive NOS (nNOS and eNOS)

according to the time of NCI-ADR cells exposure to adduct 4. Although these results are not conclusive, it is noteworthy the involvement of NOS enzyme in the antiproliferative activity of adduct 4 on NCI-ADR cells. Since NCI-ADR cells present multiple drugs resistance (MDR) and considering the participation of NOS enzymes it seems that the effect of adduct 4 may be related to the resistance process of these cells. Nevertheless, the antiproliferative activity of adduct 4 on NCI-ADR in the presence of the calcium channels

(28)

blocking verapamil revealed that no alteration on adduct 4 activity was observed suggesting that calcium channels are not involved in the mechanism of action of this adduct.

Overall, these results indicate that Baylis-Hillman adducts present in vitro antiproliferative activity against different human cancer cell lines. This activity is associated to the presence of α,β−unsaturated system and aromatic ring. Among the compounds studied, adduct 4 was the most active and selective compound. Besides this, the high cytotoxic activity of adduct 4 against cancer cells appears to be specific for tumor cells since in vivo assay demonstrated low toxicity of this compound (1.3 g/Kg) on mice as well as low in vitro activity on normal fibroblasts. Cell death caused by adduct 4 presents hallmarks of apoptotic process.

(29)

(30)

Introdução

Um fármaco pode ser amplamente definido como qualquer agente químico que age sobre o protoplasma vivo (Goodmann, 2003), ou ainda como uma substância de estrutura química definida usada para impedir o desenvolvimento ou curar doenças em homens, animais e plantas. Seu efeito farmacológico sobre o indivíduo ocorre por interferência no processo biológico e, por isso, nenhum fármaco é inteiramente seguro (Thomas, 2003). Segundo o postulado de Paracelsus de 1500: “Todas as substâncias são venenosas; a dose correta diferencia o veneno do remédio” (Paoliello e Capetani, 2000).

Desde os tempos antigos o homem já possuía uma ampla coleção de produtos naturais (animais, vegetais e minerais) que eram utilizados para fins medicinais. Porém, muitas destas substâncias eram tóxicas. No final do século XIX, a busca por medicamentos menos tóxicos do que aqueles baseados em fontes naturais resultaram na introdução de substâncias sintéticas. A partir do composto farmacologicamente ativo determina-se a parte da estrutura química que não pode ser modificada ou retirada. Esse grupo é conhecido como

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farmacofórico ou simplesmente farmacóforo, pois qualquer modificação altera a atividade biológica e/ou farmacológica (Thomas, 2003).

A química medicinal em suas inúmeras vertentes engloba o planejamento racional de novas substâncias, envolvendo a síntese ou a modificação molecular destas, seu isolamento a partir de fontes naturais, identificação, elucidação estrutural e a compreensão a nível molecular dos processos bioquímicos, farmacológicos, toxicológicos e farmacocinéticos. E finalmente, a proposição e validação de modelos matemáticos que permitam estudos de relação entre a estrutura química e a atividade farmacológica e ou toxicológica (Amaral e Montanari, 2002).

O processo de descoberta e planejamento de novas drogas que apresentem efeitos farmacológicos desejados com a biodisponibilidade adequada e menor toxicidade é uma área complexa que envolve vários profissionais especializados e milhões de dólares. Este desafio foi vencido há 30 anos pelo planejamento racional da cimetidina. Recentemente, com os avanços científicos e tecnológicos observados em diversas áreas como a biologia estrutural e molecular, o planejamento racional de fármacos tornou-se uma realidade. Vale destacar a contribuição da química computacional e mais recentemente da química combinatória que, acoplada ao contínuo desenvolvimento de computadores, viabilizou bioensaios robotizados de quimiotecas que provavelmente desenharão novos fármacos (Barreiro, 2002, Thurston e Neidle, 2005).

Como salientado anteriormente, até meados do século XX, os medicamentos de origem vegetal constituíam a base da terapia medicamentosa, entretanto com desenvolvimento da síntese química foram rapidamente introduzidos na terapêutica novas drogas sintéticas. Atualmente cerca de 50% dos medicamentos utilizados são de origem sintética e 25% originários de plantas, isolados diretamente ou por semi-síntese a partir de um precursor vegetal. No entanto, nos últimos anos o interesse pelos medicamentos de origem vegetal voltou a crescer, acompanhado de um aumento significativo nos investimentos em pesquisa (Topliss e cols., 2002).

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A química medicinal dedica-se a estudar as razões moleculares da ação dos fármacos, a relação entre a estrutura química e a atividade biológica, além do planejamento racional de novos fármacos (Wermuth, 2001). Diversas estratégias de planejamento molecular são disponíveis, sendo a principal, aquela baseada no mecanismo de ação farmacológica pretendido, também denominada de abordagem fisiológica (Barreiro, 2002).

A segunda metade do século XX presenciou uma explosão da nossa compreensão da química dos estados patológicos, das estruturas biológicas, além de um conhecimento particularizado da fisiologia e bioquímica, tanto de células normais como patológicas, auxiliando na compreensão da doença. A biologia molecular e a genética oferecem valiosas técnicas baseadas no DNA para a codificação das estruturas de todos os organismos atribuindo função a genes desconhecidos, identificando as contribuições hereditárias, as doenças e sintetizando proteínas humanas em cultura de microorganismos ou de células de mamíferos para utilização como agentes terapêuticos (Chabner e cols, 2005).

Dentre as diferentes patologias existentes nos diferentes países, a neoplasia é uma doença encontrada há séculos, com relatos em figuras e/ou documentos de muitas civilizações antigas da Ásia, América do Sul e Egito, e confirmada através de osteosarcomas encontrados em múmias egípcias (Hill, 1992; Coelho, 1998). Atualmente, é um grave problema de saúde pública por ser a terceira maior causa de morte por doenças entre os brasileiros, representando 11,84% do total dos registros de óbitos do país. Muitos fatores têm contribuído para este quadro, tais como o envelhecimento da população e exposição contínua a fatores ambientais carcinogênicos (Ministério da Saúde, 2005). Além disso, esta doença causa preocupação porque provoca redução na qualidade de vida, morte prematura, além de requerer grandes recursos para diagnóstico e tratamento (Verdecchia e cols., 2001). A definição de neoplasia mais aceita foi elaborada pelo patologista inglês Rupert Willis que a define como uma massa tumoral anormal de tecido, cujo crescimento excessivo não está coordenado ao dos tecidos normais e que persiste mesmo cessada a causa que o provocou

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(Cotran e cols., 1999). Desta forma, a célula cancerígena caracteriza-se pela perda de função em conseqüência da ausência de diferenciação, proliferação descontrolada, invasividade dos tecidos adjacentes e metástase (Brentani e cols., 1998 e Simpson e cols., 1998).

A incidência da doença e a mortalidade são de fundamental importância para o conhecimento epidemiológico, para definição dos fatores de risco e estabelecimento de prioridades na prevenção, planejamento e gerenciamento dos serviços de saúde. Tais informações, entretanto, raramente estão disponíveis em nível nacional ou regional, dificultando o estabelecimento de um quadro geral sobre a distribuição dos padrões do câncer para o país e regiões. Dentro deste contexto, o cálculo das estimativas de casos novos oferece uma excelente base para o planejamento e aprimoramento das ações que visam a prevenção e atenção em todos os níveis. A cada ano, segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), surgem nove milhões de novos casos e cinco milhões de pessoas vão a óbito em decorrência do câncer (Ministério da Saúde, 2005). Segundo o INCA a estatística dos diferentes tipo de neoplasias no Brasil sugere: (Ministério da Saúde, 2005).

Câncer de Mama: O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no

mundo, e é o primeiro entre as mulheres (cerca de 1 milhão de casos novos estimados). A incidência apresentou um crescimento contínuo na última década, o que pode ser resultado de mudanças sócio-demográficas e acessibilidade aos serviços de saúde. Seu prognóstico é relativamente bom se diagnosticado nos estádios iniciais. O número de casos novos de câncer de mama esperados para o Brasil em 2005 é de 49.470, com um risco estimado de 53 casos a cada 100 mil mulheres.

Câncer de Pulmão: No mundo, o câncer de pulmão é o que acomete o maior número de

pessoas (cerca de 1,2 milhão de casos novos). O hábito de fumar é responsável por mais de 80% dos casos diagnosticados de câncer de pulmão em homens; e de 45% entre as mulheres. A estimativa de novos casos para o Brasil em 2005 é de 17.110 entre homens e de 8.680 entre as mulheres. Estes valores correspondem a um risco estimado de 19 casos novos a cada 100 mil homens e 9 para cada 100 mil mulheres.

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Câncer de estômago: O câncer de estômago atualmente é o terceiro tumor maligno mais

freqüente no mundo, com aproximadamente 870 mil casos novos por ano. Em homens, a incidência é duas vezes maior do que em mulheres. O número de casos novos estimados para o Brasil em 2005, é de 15.170 entre homens e de 7.975 nas mulheres. Estes valores correspondem a um risco estimado de 17 casos novos a cada 100 mil homens e 9 para cada 100 mil mulheres.

Câncer do colo do útero: Quase 80% dos casos novos ocorrem em países em

desenvolvimento onde, em algumas regiões, é o câncer mais comum entre as mulheres. A mortalidade por câncer de colo de útero é substancialmente menor do que a incidência. Este tipo de câncer é o segundo mais comum entre mulheres no mundo (cerca de 471 mil casos novos). A incidência torna-se evidente na faixa etária de 20 a 29 anos e o risco aumenta rapidamente até atingir seu pico geralmente na faixa etária de 45 a 49 anos. O número de casos novos esperados para o Brasil em 2005 é de 20.690, com um risco estimado de 22 casos a cada 100 mil mulheres.

Câncer de próstata: Mais do que qualquer outro tipo de câncer, este é considerado o

câncer da terceira idade, uma vez que cerca de três quartos dos casos no mundo ocorrem a partir dos 65 anos. O número de casos novos de câncer de próstata estimados para o Brasil em 2005 é de 46.330. Estes valores correspondem a um risco estimado de 51 casos novos a cada 100 mil homens.

Câncer de cólon e reto: O câncer de cólon e reto é o segundo no mundo, com uma

estimativa de 2,4 milhões pacientes nos últimos cinco anos. Nos países desenvolvidos a incidência é maior do que nos países em desenvolvimento. O número de casos novos estimados para o Brasil em 2005 é de 12.410 casos em homens e de 13.640 em mulheres. Estes valores correspondem a um risco estimado de 14 casos novos a cada 100 mil homens e 15 para cada 100 mil mulheres

Câncer de pele: O câncer de pele não melanoma continua sendo o mais incidente em nosso

país em ambos os sexos. Embora de baixa letalidade, em alguns casos pode levar a deformidades físicas e ulcerações graves, conseqüentemente, onerando os serviços de saúde. O número de casos novos estimados para o Brasil em 2005 é de 56.420 casos em

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homens e de 56.600 em mulheres. Estes valores correspondem a um risco estimado de 62 casos novos a cada 100 mil homens e 60 para cada 100 mil mulheres.

Como já salientado, o aumento da incidência de câncer é, principalmente, conseqüência do aumento da expectativa de vida da população, pois o aparecimento dessa patologia é favorecido com o envelhecimento do organismo, entre outros (Cairns, 1981; Bralwey, 2003 e Balducci e Ershler 2005). Além disso, atualmente a população está exposta a vários carcinógenos cuja ação sobre a célula pode resultar em um dano genético (mutação) ou epigenético (alteração no padrão de expressão gênica), com efeito cumulativo durante a vida do indivíduo até a expressão do fenótipo final do tumor. Análises matemáticas sugerem que são necessárias de três a quatro alterações genéticas para ocorrer uma leucemia e de seis a sete para um carcinoma (Momparler, 2003 e Macaluso e cols., 2003). A compreensão da cinética do ciclo celular é essencial para o uso apropriado da geração atual de antineoplásicos. Organismos eucarióticos dependem de um intrincado e evolutivamente conservado ciclo celular, com controle preciso da fase de divisão. O ciclo de eventos que leva a divisão celular é regulado por famílias de proteínas, estando, portanto, sob controle genético (Swanton, 2004). Durante este ciclo celular existem “pontos de restrição”, sendo a proteína codificada pelo gene p53 constitui um destes pontos. Assim, quando uma célula entra na fase S (fase na qual ocorre a síntese das substâncias necessárias para a divisão celular e duplicação do DNA) e apresenta dano no seu DNA, o ciclo é interrompido a fim de permitir o reparo do mesmo. Caso esse dano seja severo ou irreversível e não possa ser corrigido, a célula é encaminhada para o processo de apoptose, ou seja, morte celular programada (Cooper, 2003).

Compreende-se, portanto, que mutações no gene p53 ou em outros genes de mecanismos de reparação do DNA podem alterar o ciclo celular, levando a célula a prosseguir a divisão celular e transmitindo para as células filhas o DNA defeituoso, acarretando anormalidades cromossômicas e conseqüentemente proliferação excessiva e apoptose diminuída, que é basicamente a situação de desenvolvimento de neoplasias. (Pardee, 1974).

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Apoptose, ou morte celular programada é um processo fisiológico que ocorre durante o desenvolvimento embrionário assim como na manutenção da homeostase tecidual. O processo apoptótico é um processo biológico geneticamente regulado. As células apoptóticas são caracterizadas pela perda de volume, condensação nuclear, agregação da cromatina e quebra internucleosomal do DNA. Essas alterações celulares ocorrem após uma cascata de sinalização celular e eventos mediados pelas caspases, que regulam a liberação de proteínas apoptóticas e antiapoptóticas (Jaattela, 2002).

Através de um mecanismo ainda desconhecido, o estímulo apoptótico ativa a expressão de "genes letais" que induzirão a síntese e ativação de uma endonuclease Ca+2 e Mg+2 dependente e de uma transglutaminase. A endonuclease causará a fragmentação internucleossômica do DNA, levando ao clássico "padrão em escada" na eletroforese em gel de agarose. A transglutaminase favorece as ligações cruzadas das proteínas celulares, aumentando a estabilidade da membrana plasmática, limitando assim o vazamento de constituintes citoplasmáticos durante a fragmentação celular em corpos apoptóticos (Willingham, 1999).

A proliferação e morte celular são mantidas em equilíbrio nos tecidos normais. Na hiperplasia há um aumento tecidual, com manutenção da estrutura e função normal, enquanto que na displasia, que representa um estágio inicial de formação tumoral, as células diferem das normais em forma e tamanho do núcleo. Os ciclos de crescimento de algumas dessas células são anormais, com elevado número de figuras de mitose. Já no carcinoma in situ, estas alterações displásicas começam a ser mais pronunciadas, onde as células tumorais apresentam perda da função, proliferação descontrolada, invasividade e metástase. Entretanto estas células, ainda estão situadas na lâmina basal e estão separadas do estroma (Rang e Dale, 2004).

Quando ocorre a invasão dos tecidos circunvizinhos, células metastáticas atravessam a lâmina basal penetrando no tecido conectivo e no estroma e produzindo alterações das funções orgânicas. Para isso as células empregam proteases, que degradam a matriz

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extracelular, podendo invadir os tecidos e alcançar a circulação. A invasão e metástase são processos que lentamente espalham células pelo organismo. Inicialmente, as células destacam-se a partir do sítio primário, digerem a matriz extracelular, podendo penetrar na membrana basal próxima aos vasos sangüíneos. As células livres na circulação podem eventualmente alcançar um capilar sangüíneo e então expressar moléculas de adesão, promovendo sua aderência à parede celular, gerando um tumor secundário (Fidler, 2003; Steeg, 2003; Chambers e cols., 2002).

Com relação as estratégias terapêuticas, podem ser empregadas a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia. De acordo com o tipo e estágio da doença, o sucesso do tratamento geralmente é conseguido com a associação desses três tipos de tratamento. No entanto, a quimioterapia é o tratamento que oferece as menores chances de cura, pois, em conseqüência da baixa seletividade dos antineoplásicos, o aparecimento de efeitos colaterais tóxicos é muito freqüente. Outro problema da quimioterapia é o aparecimento de resistência aos medicamentos, que conduz o tratamento para o uso combinado de drogas, aumentando a probabilidade de efeitos colaterais tóxicos (Calabresi e Chabner, 1996 e Chabner e Roberts, 2005).

A decisão sobre a estratégia de tratamento depende de 3 fatores: o diagnóstico histológico da doença, o estadiamento da doença e a avaliação clínica geral do paciente, incluindo idade e doenças concomitantes. Nesse sentido o conhecimento da farmacologia clínica dos diferentes agentes antineoplásicos permite melhor julgar a relação risco x benefício da terapia para cada paciente específico (Calabresi e Chabner, 1996 e Rang e Dale, 2004). A avaliação da resposta ao tratamento pode ser classificada como completa, quando do desaparecimento de todos os sinais e sintomas por pelo menos um mês; parcial, quando é observada redução de pelo menos 50% das lesões e ausência de progressão da doença ou aparecimento de qualquer nova lesão; estável, quando da ausência de alterações em tamanho tumoral ou sinais e sintomas da doença e progressão tumoral, com aumento de pelo menos 25% do tumor ou surgimento de nova lesão (Katzung, 2003).

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Uma importante descoberta na área de câncer foi o paclitaxel (Taxol), isolado da casca do teixo (Taxus baccata e Taxus brevifolia), em 1971 (Wani e cols., 1971). Estudos clínicos revelaram que essa substância era capaz de regredir o câncer de mama e de ovário, resistentes à terapia tradicional. Como essa substância teria que ser extraída de espécies que levam décadas para o seu crescimento, a introdução dessa droga na terapêutica teve que esperar pelo desenvolvimento da síntese química, de extrema complexidade, e pela descoberta de precursores obtidos de fontes renováveis. Essas dificuldades adiaram a introdução do plaquitaxel e do docetaxel na terapêutica para a década de 90. Além do tratamento do câncer de mama e ovário, essas drogas estão sendo avaliadas no câncer de pulmão, esôfago, cabeça e pescoço (Cragg e Newman, 1999).

No final de 1940 foram isolados dois alcalóides de espécies do gênero Podophyllum, que eram utilizadas pelas populações nativas da América e da Ásia no tratamento do câncer de pele e verrugas. No entanto, os resultados experimentais com esses alcalóides não foram encorajadores. Mais tarde foram obtidos por semi-síntese dois derivados desses alcalóides, a ectoposida e a teniposida, cujos estudos experimentais permitiram a introdução dessas drogas na terapia do câncer (Cragg e Newman, 1999).

As grandes classes de quimioterápicos disponíveis na clínica incluem os agentes alquilantes (clorambucil, ciclofosfamida), antimetabólitos (5-fluorouracila, methotrexato), antibióticos carcinolíticos (bleomicina, dactiomicina, doxorrubicina) e inibidores mitóticos (alcalóides da Vinca, paclitaxel). No entanto, a maioria dos quimioterápicos apresentam baixa seletividade e freqüentemente efeitos colaterais adversos. Além da toxicidade, as células neoplásicas podem desenvolver resistência aos medicamentos, dificultando a cura do paciente (Calabresi e Chabner, 1996).

Um dos mecanismos mais estudados na atualidade é o denominado “resistência múltipla” (“multidrug resistance” ou MDR) (Lum e Gosland, 1995 e Gottesman e cols., 2002). Através deste mecanismo, células tumorais expostas a um único tipo de quimioterápico tornam-se, simultaneamente, resistentes a quimioterápicos de natureza química diversa e

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que apresentam mecanismos de ação completamente distintos. Foi demonstrado que, na maioria dos casos, este fenômeno pode ser explicado pela existência de uma glicoproteína de membrana celular, denominada P-glicoproteína (Pgp) (Marie, 1995; Leighton e Goldstein, 1995 e Kruch, 2003), que atua como uma bomba de efluxo, resultando num decréscimo da concentração intracelular do quimioterápico, assim como de outras substâncias de ocorrência natural (Kane e cols., 1990; Gottesman e cols., 2002 e Attardi e Brown, 2005).

Por estes motivos a metodologia utilizada para descoberta de novas drogas contra o câncer vem sendo aprimorada. Os primeiros programas de pesquisa de novas drogas antitumorias utilizavam exclusivamente leucemias murinas como modelos de triagem laboratorial. Esta metodologia foi selecionada por apresentar alta reprodutibilidade, produtividade, resultados quantitativos e de baixo custo (Johnson, 1990). Um dos importantes centros de pesquisa que adotou este programa de triagem foi o National Cancer Institute (NCI - USA). Nesta ocasião, a leucemia murina L1210 passou a ser empregada como o único modelo padrão para a seleção de novas drogas antitumorais.

Posteriormente, uma nova leucemia murina foi implementada, a P388, por apresentar maior sensibilidade às drogas disponíveis na época (Grindey, 1990). Com isso, houve um grande desenvolvimento teórico, foram definidos importantes conceitos relativos a quimioterapia (Hamburguer, 1991), assim como várias drogas foram descobertas, muitas das quais ainda são úteis na terapêutica antineoplásica atual (Shoemaker, 1986). Entretanto, esta leucemia murina apresentava uma alta sensibilidade às substâncias que interferem com a síntese de DNA e conseqüentemente, ocorreu um repetitivo isolamento de substâncias com o mesmo mecanismo de ação, apesar de apresentarem estruturas químicas distintas (Corbett, 1987). Tal estratégia aparentemente gerou uma seleção tendenciosa (doença-orientada) de compostos ativos, principalmente contra aqueles tumores humanos que foram melhores representados pelos modelos tumorais murinos (linfomas e leucemias), resultando em um

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baixo índice de eficiência e conseqüente estagnação no desenvolvimento de novas drogas antitumorais principalmente em relação aos tumores sólidos (Grindey, 1990).

Na tentativa de aprimorar a triagem antitumoral, foi implementada uma nova estratégia, que consistia em realizar uma pré-seleção com a leucemia murina P388 e testes posteriores com 5 linhagens celulares murinas (melanoma B16, pulmão Lewis, cólon 26, cólon 38 e mama CD8F1) e 3 linhagens humanas (mama MX1, pulmão LX1 e cólon CX1) (Grindey, 1990; Goldin e cols., 1981).

Com o avanço das pesquisas de antibióticos e o aprimoramento das técnicas de cultura de tecidos e de microorganismos, foram desenvolvidos modelos experimentais in vitro, tornando possível à avaliação da quimiossensibilidade de microorganismos, células normais e tumorais (Hambúrguer e Hostettmann, 1991).

Porém, os ensaios in vitro ainda apresentavam, no início da década de 70, vários problemas técnicos; tais como: crescimento celular em cultura inadequado ou ausente (apenas 66% dos espécimes celulares se desenvolviam in vitro), contaminações freqüentes, ausência de padronização do tempo de exposição às drogas, da concentração utilizada e dificuldade na quantificação dos resultados (Hamburguer, 1991).

Através de uma análise de todos os resultados obtidos até a década de 80 foi possível o desenvolvimento de um novo painel de linhagens celulares utilizando modelos experimentais in vitro (Grindey, 1990). Este painel foi formado por 60 linhagens celulares diferentes, buscando a representação de importantes neoplasias, tais como as de pulmão, cólon, ovário, cérebro, medula, pele, mama e próstata, além de linhagens provenientes de tumores do sistema hematopoiético (Holbeck, 2004).

Segundo Grindey (1990), com a utilização dos ensaios in vitro foram identificadas 79 substâncias antineoplásicas, que foram inativas no modelo das leucemias murinas. As

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análises destes dados revelaram que os ensaios in vitro são mais específicos e sensíveis que os que utilizavam somente leucemias (Grindey, 1990).

Atualmente o Laboratório de Cultura de Células do CPQBA/UNICAMP utiliza, em sua triagem de produtos naturais apenas nove linhagens de células tumorais humanas cedidas pelo NCI/USA. Estas células foram selecionadas, por serem os tipos de tumores mais freqüentes no mundo. A metodologia utiliza o corante Sulforrodamina B (SRB), o qual é uma aminoxantina de coloração rosa brilhante que apresenta em sua molécula dois grupos sulfônicos. Por ser um corante aniônico, em meio levemente ácido é capaz de ligar-se a terminações básicas de aminoácidos protéicos de células fixadas com ácido tricoloroacético (TCA), sendo assim um ensaio independente do metabolismo celular (Skehan e cols., 1990; Flores, 1987; Holbeck, 2004). Esta metodologia promove uma quantificação sensível de proteínas de modo linear com o número de células da cultura (Skehan e cols., 1990).

Uma vez determinado o efeito antitumoral potencial faz-se necessário compreender o mecanismo de ação dessa nova molécula. Muitas drogas atuam no DNA através de ligações não covalentes, intercalando-se na dupla fita e impedindo a transcrição, como exemplo, temos a daunorrubicina e a doxorrubicina. Já a cisplatina e a mitomicina C ligam-se covalentemente ao DNA e finalmente existem as que quebram a dupla fita como a bleomicina. Por este motivo pode-se considerar o DNA como receptor macromolecular para drogas anticâncer (Yang e cols., 1999).

Considerando-se a classe dos agentes alquilantes, a característica eletrofílica destas substâncias é responsável pela inativação das bases nitrogenadas que compõem o DNA através de uma reação de substituição nucleofílica. De acordo com Roos (1962), alquilante biológico é uma substância que pode substituir um átomo de hidrogênio por um grupo

alquila sob condições fisiológicas (temperatura de 37°C, pH 7,4, meio aquoso). No

organismo vivo, a reação de substituição nucleofílica ocorre entre o centro eletrofílico do alquilante e os pares de elétrons não ligantes de átomos de nitrogênio, enxofre ou oxigênio presentes em metabólitos endógenos. Para o DNA, por exemplo, os sítios nucleofílicos

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mais reativos são: N-7 da guanina, N-3 e N-1 da adenina e o N-7 da citosina (Lawley e Brookes, 1963 e Drablos e cols., 2004).

O esquema 1 é uma representação simplificada da alquilação de uma base nitrogenada por uma mostarda nitrogenada. Esse agente alquilante (I) pode promover, com uma assistência anquimérica (participação do grupo vizinho), a reação de substituição nucleofílica SN1 ou

SN2, dependendo das velocidades de formação do íon aziridínio (II/IV) e do ataque do

nucleófilo (Nu1/Nu2), que seria então uma base nitrogenada. Em geral, o agente eletrofílico

é um cloreto de alquila ou uma aziridina, mas adições de Michael também ocorrem.

Ι ΙΙ ΙΙΙ ΙV N R Cl Cl R N Cl + íon aziridínio Nu₁ _R _N Nu1 Cl R N Nu1 + íon aziridínio N R Nu1 Nu2 Nu2 V

Esquema 1: Representação simplificada da alquilação de uma base nitrogenada por uma mostarda nitrogenada

Uma das reações mais utilizadas na formação da ligação carbono-carbono é a reação de Michael, convencionalmente caracterizada pela adição de nucleófilos (doadores de Michael) a olefinas ativadas (aceptores de Michael). Embora essa reação tenha sido descoberta por Komnenos em 1883 e Claisen em 1887, foi efetivamente desenvolvida por Michael que a partir de 1887 relatou, em uma série de artigo, a adição de malonatos a enonas, catalisada por base em solventes próticos. A reação de Michael difere de reações de

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alquilação por regenerar a base no meio reacional e, devido a esse fato, apenas uma quantidade catalítica da mesma é necessária (Mattos e Marzorati, 1999).

A existência de reações de Michael in vivo, indica a possibilidade de utilizar adutos de Baylis-Hillman (VI, esquema 2) como eletrófilos em sistemas biológicos. Há alguns anos foram sintetizados estes adutos para utilização como intermediários de síntese de produtos naturais com atividade biológica, explorando-se também a sua reatividade e manipulando diversas condições de reação para que a sua síntese fosse rápida e de baixo custo. Estas substâncias apresentam em sua estrutura um sistema α,β-insaturado, que funciona como aceptor de Michael, sendo conhecidas as adições de aminas, hidretos, cianetos e outros nucleófilos a estes sistemas (Basavaiah e cols., 2003), fornecendo adutos (VII) sintética e biologicamente úteis.

Esquema 2: Reações de Michael nos adutos de Baylis-Hillman

A citotoxicidade de alguns adutos de Baylis-Hillman para Plasmodium falciparum em testes “in vitro” e P. berghei em testes “in vivo" foi demonstrada por Kundu e colaboradores (1999), constituindo-se estes adutos em potenciais agentes antimalários. A citotoxicidade observada pode ser devida a uma interação de biomoléculas com o sistema α,β-insaturado presente nestes adutos. Também é descrita na literatura a atividade antitumoral de alguns produtos naturais que possuem em sua estrutura um sistema carbonílico conjugado como, os quassinóides, representados na figura 1 pelo ácido bruceanico A (Toyota e cols., 1990).

R O R' O O H Nu VI R O R' O OH N u VII Protonação

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O HOOC O O CO2Me O HO OH O O Ácido bruceanico A

Figura 1: Estrutura química do ácido bruceânico A com destaque para o grupo carbonílico conjugado

Dentre as drogas antineoplásicas disponíveis na terapêutica, a mitomicina C atua comprovadamente por interação com o DNA, através da guanina (Beall e cols. 1998). No esquema 3, está representado resumidamente este mecanismo. A mitomicina é ativada “in vivo” por um mecanismo de redução, seguido de eliminação. A espécie ativa formada é um aceptor de Michael que sofre adição nucleofílica pelo DNA, através da guanina (no esquema representado por H2N-DNA).

H2N Me N OH OH NH2 NHDNA CH2 O NH2 O Espécie reativa DNA alquilado O O H2N Me N CH2OCONH2 OMe NH MitomIcina C O H2N Me N OH CH2OCONH2 NH2 H2N DNA H+ biorredução eliminação

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Recentemente, o óxido nítrico (NO) tem sido reportado por apresentar atividade antitumoral e também propriedades pró-tumorais, na dependência da concentração e do tempo de exposição, assim como do tipo de tecido (Wink e cols., 1998). Baixas concentrações de NO podem estimular o crescimento celular e proteger vários tipos celulares do processo apoptótico, enquanto que altas concentrações podem inibir o crescimento celular e induzir à apoptose (Kim e cols., 2001).

Óxido nítrico (NO) é uma molécula sinalizadora em numerosos processos fisiológicos e condições patológicas, sendo produzida quando a enzima óxido nítrico sintase (NOS) catalisa a conversão de L-arginina a L-citrulina. Existem, três isoformas de NOS, sendo duas constitutivamente expressas pelos tecidos endotelial e neuronal e responsáveis pela produção basal de NO, além de serem dependentes de cálcio. Já a terceira isoforma, denominada NOS induzida, é cálcio-independente, não é expressa na maioria dos tecidos sob condições normais, mas pode ser estimulada por lipopolissacarídeos e várias citocinas (Abramson e cols., 2001).

Aparentemente, a morte celular mediada por NO ocorre tanto por necrose como por apoptose (Albina e cols., 1989; Kroncke e cols., 1997). Os efeitos pró-apoptóticos parecem estar mais relacionados às condições patofisiológicas, quando grandes quantidades de NO são produzidas por síntese induzida de NO. Em contraste, a liberação contínua de NO pelo endotélio inibe a apoptose e pode contribuir para a função antiaterosclerótica do NO. O NO pode afetar a expressão e a atividade de proteínas críticas no ciclo celular e, por sua vez, também produzir mutações do DNA celular. A exposição das células aos doadores de NO pode resultar em supra-regulação do gene supressor de tumor, o p53, possivelmente em resposta ao dano do DNA mediado pelo NO (Wink e cols., 1998).

O desenvolvimento tumoral, sua vascularização e seu potencial invasivo estão relacionados a concentrações reduzidas de NO produzidas pelas células tumorais. Em lesões pré-malígnas e em tumores intestinais, a síntese de NO está reduzida ou ausente, ao passo que níveis elevados de NO foram encontrados em tumores ginecológicos (Chhatwal e cols.,

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1996). Correlação inversa entre o potencial metastático de tumores e a produção de NO foi observada por muitos pesquisadores (Hajri e cols., 1998).

Apesar dos grandes avanços na descoberta de novos agentes antineoplásicos, obtidos tanto de origem natural como sintética, que estão sendo amplemente utilizados na clínica para o tratamento de diversas neoplasias, o câncer ainda ocupa a segunda posição de causa de óbtitos em todo o mundo. Assim aumentando o interesse acadêmico e tecnológico no desenvolvimento de novas drogas mais eficientes e com menos toxicidade. Contudo apesar da ampla utilização clínica dos agentes quimioterápicos antineoplásico que controlam o crescimento tumoral e até prolongam a vida dos pacientes em vários anos, os oncologistas afirmam que a melhor ajuda para combater o câncer não é o tratamento antineoplásico, mas o tratamento precoce e, principalmente a sua prevenção (Almeida, e cols. 2005).

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Objetivos

Avaliar a atividade antiproliferativa “in vitro” dos adutos de Baylis-Hillman;

Relacionar a atividade com a estrutura molecular dos adutos de Baylis-Hillman e com o melhor perfil de atividade;

Avaliar possíveis mecanismos de ação do aduto selecionado e, Determinar o padrão toxicológico das amostras ativas.

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Metodologia

PARTE A: Obtenção das Substâncias teste

A síntese dos diversos compostos a partir da reação de Baylis-Hillman foi realizada pela Profa. Dra. Wanda Pereira Almeida e pelos pós-graduandos do Laboratório de Síntese de Produtos Naturais e Fármacos, no Instituto de Química, UNICAMP. Resumidamente, a metodologia utilizada está descrita a seguir.

A.1. Adutos de Bayllis Hilman

Os adutos foram obtidos pela reação de Baylis-Hillman (Basavaiah, Rao e Hyma 2003) entre o aldeído aromático VIII com o substituinte adequado e acrilato de metila IX (Esquema 4). A reação foi catalisada por DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2.]octano) e a técnica de ultra-som foi empregada para diminuir o tempo de reação, que em geral é longo para aldeídos aromáticos (Almeida e Coelho 1998 e Coelho e cols. 2002).

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Reagentes e Condições: CH2Cl2, ultra-som; aduto 1 (R = 3,4-metilenodioxi), 73%;

aduto 2 (R = 4-metoxi), 81%; aduto 3 (R = 4-nitro), 91%.

Esquema 4: Reação de obtenção dos adutos pela reação de Baylis-Hillman

De uma forma geral, a solução contendo a proporção de 1,3 mmol de acrilato de metila e 0,65 mmol de DABCO em 20 mL de diclorometano foi adicionada a 1 mmol do aldeído, e a mistura resultante permaneceu sob agitação magnética, à temperatura ambiente, por dias, dependendo do aldeído. A reação foi monitorizada por cromatografia em camada delgada de sílica gel (acetato de etila/hexano 20%, revelação com UV), e quando não apresentou mais evolução, a mistura reacional foi transferida para um funil de separação e particionada com solução saturada de cloreto de sódio (2 X 50mL). As fases aquosas combinadas foram e reextraídas com diclorometano (2 x 20 mL). As fases orgânicas foram reunidas e, após secagem com sulfato de magnésio anidro, filtração e evaporação do solvente em evaporador rotatório, o resíduo viscoso, levemente amarelado, foi purificado por cromatografia em coluna com gradiente de concentração (sílica gel 70-230 mesh, acetato de

etila-hexano 20 → 50%). Os adutos (1 a 11) foram caracterizados por ressonância

magnética nuclear de 1H, e seus dados espectrais foram compatíveis com os descritos na literatura (Coellho e cols. 2002)

O grupo I (adutos 1-3, Figura 2) foi selecionado para avaliar a importância do anel aromático na atividade antiproliferativa.

O OCH3 C H O R VIII + IX DABC O H O C H3 O R Adutos 1- 11

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GRUPO I

Figura 2: Estrutura química dos Adutos do Grupo I

O grupo II, (adutos 4 – 9, Figura 3), compreende adutos aromáticos apresentando grupos retiradores de elétrons, quer seja por ressonância, ou por indução.

GRUPO II

OCH₃ O

OH

NC 9

Figura 3: Estrutura química dos adutos aromáticos do grupo II, contendo grupos retiradores de elétrons O OCH₃ OH 1 OCH₃ O OH 2

N

OCH

₃

O

OH

OCH3 O OH O2N OCH₃ OH Cl O 4 5 OCH₃ O OH F3CO 7 OCH₃ O OH 3FC 6 O OCH3 o OH S Me O 8 3

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Já grupo III (Figura 4), reúne os adutos aromáticos (10 - 13) contendo grupos doadores de elétrons. A avaliação da atividade poderá confirmar a participação dos grupos doadores de elétrons.

GRUPO III

Figura 4: Estrutura química dos adutos aromáticos do grupo III, contendo grupos doadores de elétrons

A.2. Procedimento para Hidrogenação dos Adutos

A uma suspensão a 5% de Pd/C (10%mol) em acetato de etila (5 mL) foi adicionado, sob atmosfera de nitrogênio, uma solução do aduto (1mmol) em acetato de etila (5 mL). Em seguida, a atmosfera de nitrogênio foi trocada por hidrogênio e a reação foi mantida sob agitação, a temperatura ambiente e pressão atmosférica. Após o período de finalização da reação (30min a 2h) a suspensão foi filtrada através de uma camada de celite e o solvente, removido sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna utilizando acetato de etila-hexano, como eluente (1:3). Os adutos 14 a 17 obtidos nesta reação estão relacionados na Figura 5.

OCH3 OH O O O OCH3 OH H3CO O OCH3 OH HO OCH3 O OCH3 OH H3CO OCH3 H3CO O 10 11 12 13

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O H OCH₃ OH CH₃ OCH₃ OH O O CH₃ O OCH₃ OH Cl CH3 O OCH₃ O OH O2N CH₃ 13 14 15 ₁₆

Figura 5: Estrutura química dos adutos hidrogenado

A.3. Procedimento geral para preparação dos derivados trietilsililados

Uma mistura de 1mmol do aduto, 1,3 mmol de cloreto de trietilsilila , 2,5 mmol de imidazol e 0.3 mL de N,N-dimetilformamida previamente seca sobre hidreto de cálcio e bidestilada, foi agitada a temperatura ambiente e sob atmosfera de nitrogênio por 12-18h. O término da reação foi verificado por cromatografia em camada fina. Em seguida, 10 mL de hexano foram adicionados ao meio reacional e a mistura particionada entre solução saturada de cloreto de sódio (3x5 mL). Após remoção da fase aquosa, o solvente foi removido em evaporador rotatório e o resíduo, seco sobre sulfato de magnésio anidro e filtrado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica, utilizando-se acetato de etila-hexano (1:9) como eluente. Os adutos 18 a 21 obtidos nesta reação estão relacionados na Figura 6.

14 15

16

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OCH3 O OTES OCH₃ O OTES O₂N OCH₃ O O OTES O OCH₃ O OTES H₃CO 17 18 19 20

Figura 6: Estrutura química dos adutos aromáticos protegidos Todas as substâncias foram caracterizadas pelos métodos espectroscópicos.

PARTE B: Ensaios Farmacológicos B.1. Células

As linhagens celulares cedidas pelo NCI e utilizadas na triagem da atividade antiproliferativa estão relacionadas na Tabela 1 e foram cultivadas em RPMI 1640 (Gibco) suplementado 5% de soro fetal bovino inativado (SFB) (Gibco).

Todas as linhagens celulares foram enviadas congeladas para o Laboratório de cultura de células da Divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA/Unicamp. O primeiro passo realizado foi o descongelamento e a propagação das mesmas. Posteriormente, foi realizado o congelamento para a obtenção de um estoque destas linhagens celulares que foram fotografadas para uma avaliação geral de sua morfologia (Figura 7).

As células foram cultivadas em frascos de 25 cm2, com 5 mL de RPMI suplementado com 5% SFB e quando a monocamada celular atingiu cerca de 80% de confluência, estas foram

18 19

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repicadas, sendo mantidos sempre 2 frascos de cultura de 25 cm2 (Nunc) de cada linhagem celular (frascos de manutenção). Estes frascos foram incubados a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 em atmosfera úmida (Incubadora Forma).

Tabela 1: Linhagens celulares utilizadas nos ensaios antiproliferativos.

Tipo celular Nome Tipo / Origem

Humanas Tumorais

Leucemia K-562 Linfoblástica / Mesênquima

Pulmão NCI-H460 Epitelial / Endoderme

Mama MCF-7 Epitelial / Ectoderme

NCI-ADR * _{Epitelial / Ectoderme}

Melanoma UACC-62 Fibroblástica / Ectoderme

Renal 786-0 Epitelial / Mesoderme

Cólon HT-29 Epitelial / Endoderme

Ovário OVCAR-3 Epitelial / Mesoderme

Próstata PC-03 Epitelial / Mesoderme

Animais Normais

Pulmão de Rato 3T3 Fibroblasto

Pulmão de Hamster VT79 Fibroblasto

Rim de Macaco Vero Fibroblasto

Rim de Cachorro MDCK Epitelial

* linhagem celular que expressa o fenótipo de resistência a múltiplas drogas. Todos os procedimentos descritos a seguir foram realizados sob condições estéreis (Fluxo Laminar Veco, Classe IIB2).