UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇAO DA CAPACIDADE IMUNOGÊNICA DA ENOLASE DE Conidiobolus lamprauges
Juçara Tinasi de Oliveira
Cuiabá / MT Julho - 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇAO DA CAPACIDADE IMUNOGÊNICA DA ENOLASE DE Conidiobolus lamprauges
Autor: Juçara Tinasi de Oliveira Orientadora: Profª. Drª. Valéria Dutra. Co-Orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal de Mato Grosso – Tese: Doutorado em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Sanidade Animal.
Cuiabá / MT Julho - 2016
TESE
Discente: Juçara Tinasi de Oliveira
Título: CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇAO DA CAPACIDADE IMUNOGÊNICA DO GENE ENOLASE DE Conidiobolus lamprauges
Banca Examinadora:
Profª. Drª. Valéria Dutra (Orientadora) Universidade Federal de Mato Grosso
Profª. Drª. Caroline Argenta Pescador (Membro Interno) Universidade Federal de Mato Grosso
Prof. Dr. Richard Campos Pacheco (Membro Interno) Universidade Federal de Mato Grosso
Profa. Drª. Sonia de Avilla Botton (Membro Externo)
Unversidade Federal de Santa Maria
Profa. Drª. Maria Cristina da Silva (Membro Externo)
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso Campus Barra do Garças
Prof. Dr. Daniel Moura Aguiar Universidade Federal de Mato Grosso
Dedico esta conquista aos que me deram tranquilidade para seguir em frente com os meus objetivos e ânimo a não desistir: meus pais, José Acir e Regina; minha filha Ana Luiza, minha irmã Gerusa e meu marido Paulo.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por mais essa vitória alcançada.
Aos meus pais, José Acir e Regina, à minha irmã e cunhado, Gerusa e Jonas e ao Paulo por estarem sempre presentes, apoiando e aconselhando a trilhar meu caminho acadêmico e pessoal.
À minha filha Ana Luiza e aos meus sobrinhos Laura e Victor pelo carinho e amor incondicional que sempre me inspiraram nos momentos difíceis.
Aos meus orientadores Profa. Dra. Valéria Dutra e Prof. Dr. Luciano Nakazato
por mais uma vez confiaram em mim, com eles amadureci muito como profissional, me ensinaram e ensinam muito do que é ser pesquisadora.
Aos meus colegas de trabalho do IFMT – Campus Cáceres Prof. Olegário Baldo, os quais foram motivadores para a realização desta conquista. Em especial, ao meu grande amigo Olegário por tudo o que me ensinou em vida.
Aos meus colegas da pós-graduação pelo convívio e troca de experiências. Aos meus amigos de trabalho do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular Veterinário da UFMT que me acolheram e muito me ajudaram para a realização desta tese, cada um sabe o quanto foram significantes na minha trajetória.
Aos familiares que acreditaram em mim.
Agradeço pelo apoio financeiro a Fundação de Amparo à Pesquisa de Mato Grosso - FAPEMAT e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - MCTI/CNPq/FNDCT/PRO-CENTRO-OESTE 19.
“A persistência é o caminho do êxito” Charlie Chaplin
RESUMO
OLIVEIRA, J.T. Caracterização e avaliação da capacidade imunogênica da enolase de Conidiobolus lamprauges. 2016. 32f. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias), Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, Brasil.
Enolase, uma importante enzima glicolítica, com expressão aumentada a 37°C em
Conidiobolus (C.) lamprauges, exerce diferentes funções em outros
micro-organismos, dentre elas, a adesão e invasão em hospedeiros. Desta forma, a identificação da enolase como proteína imunorreativa pode contribuir para a compreensão da doença, auxiliar na padronização de testes sorológicos e também o desenvolvimento de vacinas, consequentemente, tratamentos mais eficientes e redução na morte dos animais. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar o gene enolase (eno) de C. lamprauges e avaliar sua capacidade imunogênica frente a soros de ovinos naturalmente infectados. A amplificação de eno do isolado de C.
lamprauges, através dos oligonucleotídeos sintetizados com base na sequência do
gene de C. lamprauges, resultou em fragmento de 1305pb. A sequência deduzida de aminoácidos foi de 434 resíduos sendo a massa molecular estimada de 47,2KDa. Na análise da sequência, identificou-se a assinatura do gene enolase (LLLKVNQIGTVSES) correspondentes às posições 342 a 345. Na análise “in silico” foram detectadas regiões prováveis para epítopos para linfócitos T e B. A sequência foi clonada no plasmídeo pFN6K (HQ) Flexi® Vector (Promega®) e a proteína
expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS com indução por IPTG. No SDS-PAGE e no Western blot, a eno recombinante foi detectada com peso molecular estimado em 47kDa. Detectou-se IgG recombinante anti enolase em todos os animais com conidiobolomicose, através da técnica de Western blot, demonstrando a imunogenicidade. No soro de ovino saudável, utilizado como controle negativo, e no soro de ovino com pitiose, utilizado para avaliar reatividade cruzada, não foram detectadas bandas, demonstrando que a enolase recombinante de C. lamprauges, é imunogênica contra soros de ovinos naturalmente infectados com conidiobolomicose. A detecção de anticorpos anti-enolase específicos nos animais evidenciam que a proteína é um antígeno candidato bastante promissor para o desenvolvimento de vacinas.
ABSTRACT
OLIVEIRA, J.T. Characterization and evaluation of immunogenicity of Conidiobolus lamprauges enolase. 2016. 32f. Thesis (Doctorate in Veterinary Science), Veterinary Science Postgraduate, Faculty of Veterinary, Federal University of Mato Grosso, Cuiabá, Brazil.
Enolase, an important glycolytic enzyme with increased expression at 37°C in
Conidiobolus (C.) lamprauges, performs different functions in other organisms,
among them, adhesion and invasion of hosts. Thus, the identification of enolase as an immunoreactive protein may contribute to the understanding of these diseases; provide the standardization of serological tests and also develop vaccines, thus bringing more effective treatments and reducing the death of animals. The objectives of this study were to characterize the enolase gene (eno) C. lamprauges and evaluate its immunogenic capacity towards naturally infected sheep. Eno gene amplification isolated from C. lamprauges by the oligonucleotides synthesized based on the sequence of the gene C. lamprauges resulted in a 1305pb fragment. The deduced aminoacid sequence comprised 434 residues with a predicted molecular weight of 47,2KDa. In the sequence analysis, we identified the signing of the enolase gene (LLLKVNQIGTVSES) corresponding to positions 342-345. In the analysis "in silico" probable regions were detected for epitopes to T and B lymphocytes. The sequence was cloned into the plasmid pFN6K (HQ) Flexi® Vector (Promega®) and the protein expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS cells with IPTG induction. In SDS-PAGE and Western blot, the recombinant eno was detected with estimated molecular weight of 47kDa. Recombinant IgG anti-enolase was found is in all animals with conidiobolomycosis by means of the Western blot technique, demonstrating immunogenicity. In healthy sheep serum, used as a negative control, and serum from sheep with pythiosis used to evaluate cross-reactivity, bands were not detected. Therefore, this study demonstrated that recombinant enolase C.
lamprauges is immunogenic against serum of naturally infected sheep with
conidiobolomycosis. The detection of specific anti-enolase antibodies in animals shows that the protein is a promising candidate antigen for the development of effective vaccine against this disease.
LISTA DE FIGURAS
Páginas Figura 1: SDS – PAGE (A) and serological response in Western Blot (B) 31 Figura 2: Antibody levels (IgG) in natural infected sheep 32
SUMÁRIO Páginas 1. Introdução 10 2. Objetivos 15 2.1 Objetivo geral 15 2.2 Objetivos específicos 15 3 Material e Métodos 15 4 Resultados 19 5 Discussão e conclusão 20 6 Referências Bibliográficas 22
7 Artigo aceito no periódico Small Ruminant Research - Characterization
1 Introdução
A ovinocultura está presente em praticamente todos os continentes e a ampla difusão da espécie se deve principalmente a seu poder de adaptação a diferentes climas, relevos e vegetações (VIANA, 2008).
A criação de ovinos no Brasil se apresenta como importante alternativa para produção de alimentos e aumento na lucratividade de propriedades rurais (CARVALHO, 2014). No entanto, a ovinocultura ainda é explorada como uma atividade secundária, os animais, na maioria das propriedades, são criados com pouca tecnologia e junto aos bovinos (OLIVEIRA et al., 2014).
Conforme dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) (2014), o rebanho de ovinos no Brasil foi estimado em 17,61 milhões de cabeças, sendo que Mato Grosso possui aproximadamente 307,95 mil cabeças. Apesar do expressivo rebanho no estado brasileiro, práticas inadequadas de manejo, más condições sanitárias e nutricionais acarretam em aumento no risco de doenças, provocando queda na produção e na produtividade dos animais, além de mortalidade.
Dentre os problemas sanitários que afetam o setor, a conidiobolomicose tem grande importância. A enfermidade causa grandes perdas econômicas aos produtores rurais, pois acarreta em aumento do custo com medicamentos para tratamentos dos ovinos e perdas dos animais por diagnóstico tardio (PORTELA et al., 2010; AGUIAR et al., 2014).
O gênero Conidiobolus é um fungo oportunista e saprófito, pertencente a classe dos zigomicetos, ordem Entomophthoraceae, causador da conidiobolomicose em humanos (TADANO et al., 2005; KIMURA et al., 2011; PORNPANICH et al., 2011; BACHELET et al., 2014; RAVEENTHIRAN et al., 2014; SOUZA et al., 2014; TWIZEYIMANA et al., 2014) e animais (SILVA et al., 2007; PEDROSO et al., 2009; SILVEIRA et al., 2013; TONDOLO et al., 2013; UBIALI et al., 2013; AGUIAR et al., 2014; MUSTAFA, 2014; MACKEY et al., 2015) e está associado com rinite granulomatosa crônica, podendo adquirir caráter invasivo e disseminado.
O zigomiceto é termofílico, cresce bem em meios como Ágar Sabouraud Dextrose (SDA) e Ágar Batata Dextrose (BDA), a temperatura de 22 a 37°C (RIBES et. al., 2000). Em SDA, as colônias apresentam-se com aspecto rugoso, brancas ou
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pigmentadas e com formação de colônias satélites (DE PAULA et. al., 2010). Microscopicamente, os fungos caracterizam-se pela presença de inúmeras hifas, com poucos septos, ramificações irregulares, conídios arredondados a ovóides com diâmetro de 14-22μm, paredes finas e papilas proeminentes (MORRIS et al., 2001).
Normalmente, as zigomicoses humanas causam infecções granulomatosas cutâneas e subcutâneas crônicas em indivíduos imunocompetentes, enquanto disseminada e invasiva em hospedeiros imunocomprometidos (CHOON et al., 2012; RHAVEENTHIRAN et al., 2014; KHATAMI et al., 2015).
As espécies Conidiobolus (C) coronatus, C. incongruus e C. lamprauges já foram identificadas como causadoras da enfermidade em humanos e ovinos (CARRIGAN et al., 1992; MORRIS et al., 2001; TADANO et. al., 2005; SILVA et al., 2007; DE PAULA et al., 2010; RAVEENTHIRAN et al., 2014; TWIZEYIMANA et al., 2014; WEIBLEN et al., 2016).
Casos de conidiobolomicose têm sido descritos em humanos residentes, principalmente, em áreas tropicais de regiões da África, Ásia e América do Sul, embora haja relatos no Reino Unido, Índia e Estados Unidos (RIBES et al., 2000; BENTO et al., 2010; KIMURA et al., 2011; PORNPANICH et al., 2011; BACHELET et al., 2014; SOUZA et al., 2014; JOHN et al., 2016; MONCADA et al., 2016).No Brasil, o primeiro relato da doença em humanos foi descrito no Estado da Bahia, por Andrade et al. (1967). Há também descrições de casos nos Estados do Maranhão (VALLE et al., 2001; COSTA et al., 2004), Pará (MORAES et al., 1994; MORAES et al., 1997; SOUZA et al., 2014), São Paulo (CASTRO E SOUZA FILHO et al., 1992), Bahia (BITTENCOURT et al., 2006) e no Mato Grosso (TADANO et al., 2005). O último relato no Brasil foi em 2014, onde uma criança de nove anos de Belém (PA) foi diagnosticada com Conidiobolus spp. e obteve cura após 5 meses de tratamento com Anfotericina B (SOUZA et al., 2014).
Relatos de rinite micótica em ovinos causada por C. lamprauges tem sido frequentes em estados da região Sul (FURLAN et al., 2010), Nordeste (RIET-CORREA et al., 2008; PORTELA et al., 2010; VILELA et al., 2010) e Centro-Oeste do Brasil (DE PAULA et al., 2010; UBIALI et al., 2013; SILVEIRA et al., 2013; MUSTAFA, 2014).
A incidência da doença é maior em áreas úmidas, onde o animal se alimenta ou bebe água, próximas a açudes, com presença de matéria vegetal, tanto no período seco quanto no chuvoso (BOABAID et. al., 2008; RIET-CORREA et. al.,
2008; PEDROSO et. al., 2009; FURLAN et. al., 2010; PORTELA et. al., 2010; AGUIAR et al., 2014; MUSTAFA, 2014) e atinge animais de todas as idades (MORRIS et al., 2001; CÂMARA et al., 2011).
O modo de transmissão da conidiobolomicose não é bem estabelecido, mas é provável que se dê através da inalação de esporos do fungo, que se implantariam na mucosa nasal ou através de pequenos traumas, como picadas de insetos (CARRIGAN et al., 1992; KIMURA et. al., 2011).
O curso clínico da doença varia de uma a cinco semanas, no entanto, os sinais clínicos aparecem algum tempo após o início da infecção, sendo associados, principalmente, com alterações obstrutivas nas vias nasais superiores (BOABAID et al., 2008; RIET-CORREA et al., 2008).
Os sinais clínicos da conidiobolomicose variam de acordo com a localização da lesão, podendo ocorrer na região nasofacial ou rinofaríngea. Nesta, afeta a região faríngea, cornetos, seios nasais, órbita, ossos adjacentes e na região rinofacial acomete a região nasal frontal. Geralmente, o agente etiológico relacionado à forma rinofaríngea é o C. lamprauges (FURLAN et al., 2007; De PAULA et al., 2010; VILELA et al., 2010). De modo geral, os animais apresentam aumento de volume da porção posterior da cavidade nasal, dificuldade respiratória, emagrecimento, corrimento nasal e exoftalmia (MORRIS et al., 2001; SILVA et al., 2007; BOABAID et al., 2008, RIET-CORREA et al., 2008).
Os animais também apresentam sinais clínicos inespecíficos como anorexia, febre, apatia, depressão e inapetência. Adicionalmente podem ocorrer sinais neurológicos, incluindo depressão, cabeça baixa, pressão da cabeça contra objetos e incoordenação motora (CARRIGAN et al., 1992; MORRIS et al., 2001; SILVA et al., 2007; BOABAID et al., 2008; RIET-CORREA et al., 2008; PEDROSO et al., 2009) e ainda acometer pulmão, cérebro e trato gastrointestinal (BOABAID et. al., 2008; PEDROSO et. al., 2009; PORTELA et. al., 2010; CÂMARA et. al., 2011; AGUIAR et. al., 2014;).
A letalidade é de 100% e pode estar associada ao diagnóstico tardio em consequência da ineficiência do tratamento, tendo em vista que, os sinais clínicos só são observados quando há grande comprometimento da cavidade nasal (SILVA et al., 2007; BOABAID et al., 2008; RIET-CORREA et al., 2008; PEDROSO et al., 2009; PORTELA et al., 2010; FURLAN et al., 2010; CÂMARA et al., 2011; MENDONÇA et al., 2012; AGUIAR et al., 2014).
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Não há relatos de sucesso no tratamento terapêutico contra conidiobolomicose ovina. O iodeto de potássio já foi utilizado no tratamento da forma rinofaríngea da doença, porém sem melhoras no quadro clínico (BOABAID et al., 2008). Portanto, a eutanásia tem sido indicada, pois o tratamento não é eficaz (PORTELA et. al. 2010).
O padrão ouro para o diagnóstico de conidiobolomicose ainda é o isolamento e identificação do agente etiológico através de tecido lesionado e histopatologia (KAUFMAN et al., 1990), entretanto, esses métodos requerem tempo e, apresentam baixa sensibilidade e/ou especificidade (IMHOF et al., 2003).
De Paula e colaboradores (2010) propuseram diagnóstico definitivo através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), porém, as técnicas moleculares têm sido mais utilizadas como forma de diagnóstico após necropsia ou biopsia de tecidos, isoladamente de animais e não em rebanhos.
Deve-se considerar como diagnóstico diferencial a pitiose, causada pelo
Pythium (P.) insidiosum (UBIALI et al. 2013) e tumor etmoidal enzoótico (SILVA et al.
2010), pois apresentam sinais clínicos semelhantes. Ubiali e colaboradores (2013) preconizaram a técnica de imunohistoquímica como ferramenta para diagnóstico diferencial de rinite em ovinos, uma vez que a técnica é capaz de distinguir antígenos específicos de C. lamprauges e P. insidiosum.
Os testes sorológicos são técnicas de fácil execução e possibilitam a detecção de infecções precoces e subclínicas, principalmente em rebanhos, contudo, não há nenhuma rotina destes testes para infecções causadas por
Conidiobolus spp.. Kaufman e colaboradores (1990) desenvolveram um teste de
imunodifusão utilizando soro humano e de equinos para detectar anticorpos contra
C. coronatus e Basidiobolus ranarun, o ensaio mostrou-se totalmente específico e
sensível, mostrando-se útil para o monitoramento da infecção causada por essas espécies.
Através do estudo de proteínas é possível compreender a patogenia da enfermidade e a virulência do fungo, bem como auxiliar em novos diagnósticos, tratamentos e vacinas (ROSA E SILVA et al., 2008). Godoy e colaboradores (2014) analisaram o perfil de proteínas de C. lamprauges, cultivados em diferentes temperaturas, e encontraram spots diferencialmente expressos à 37°C, concluindo que o micro-organismo deve ser capaz de expressar genes relacionados à termorregulação, o que permite a adaptação ao hospedeiro.
A enolase (glicerato), que catalisa a desidratação de 2-fosfo-D-glicerato (2-PG) à fosfoenolpiruvato (PEP) na segunda metade da via glicolítica (JI et al., 2016), é uma das enzimas citoplasmáticas mais abundantemente expressas em muitos micro-organismos (PANCHOLLI, 2001). Além da atividade glicolítica, a proteína desempenha diferentes funções, denominando-a de “moonlighting”. A proteína multifuncional possui várias ações biológicas e fisiopatológicas como proteína de choque térmico, proteína de estresse hipóxico e como antígeno auto-imune (HERNANDEZ-PÉREZ et al., 2011).
Além dessas funções, a enolase possui capacidade de interação patógeno-hospedeiro, uma vez que é capaz de promover a adesão e invasão do fungo às células, consequentemente, disseminação da infecção (DONOFRIO et al., 2009; SILVA et al., 2012; MARCOS et al., 2014; MACÍAS-SANCHEZ et al., 2015; ZHANG et al., 2015, FUNK et al., 2016). Isso demonstra que a enzima possui potencial em constituir uma vacina contra diferentes doenças (GAN et al., 2010; LI et al., 2010; CARABARIN-LIMA et al., 2014).
Em C. lamprauges, a enolase foi detectada com nível de expressão diferencial a 37°C, por meio da técnica de RDA e confirmada pela análise de qPCR (SILVA et al., 2012). Os autores concluíram que a proteína localiza-se, predominantemente, no citoplasma com potencial envolvimento na virulência do fungo. No fungo dimórfico Paracoccidiodes brasiliensis, a enolase foi diferencialmente expressa na condição de adesão ao colágeno e à fibronectina, e identificada na superfície de células leveduriformes. Esta espécie seria capaz de adquirir atividade proteolítica após a ligação da enolase ao plasminogênio e a sua conversão à plasmina, facilitando a invasão tecidual no hospedeiro, contribuindo para patogenicidade do fungo (NOGUEIRA, et. al. 2010).
A utilização da enolase como proteína imunogênica abrange estudos em vários micro-organismos como Streptococcus pneumoniae, Trypanossoma cruzi,
Candida albicans, Mycoplasma mycoides, Chaetomium globosum, Rhodotorula mucilaginosa e Aspergillus fumigatus (LAI et al., 2002; CHANG et al., 2002; ADRIAN
et al., 2004; LI et al., 2011; CORONA et al., 2013; CARABARIN-LIMA et al., 2014; GREEN et al., 2014; SILVA et al., 2014) . Além disso, tem sido amplamente discutida na área humana como biomarcador em casos tumorais (CHANG et al., 2014, SONG et al. 2014) e sendo detectada em doenças autoimunes (TERRIER et al. 2007).
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Desse modo, a caracterização e identificação da enolase como proteína imunogênica de C. lamprauges contribuirá para o desenvolvimento de técnicas sorológicas que, além de facilitar o entendimento da patogenia da doença, poderá auxiliar em um tratamento mais eficiente, e, consequentemente, redução da morte dos animais. Ainda não existem vacinas para conidiobolomicose, tanto para humanos como animais, e a identificação de proteínas imunogênicas permitirá novas possibilidades para prevenção ou tratamento da mesma.
2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Caracterizar molecularmente o gene enolase (eno) de C. lamprauges e avaliar sua capacidade imunogênica frente a soros de ovinos naturalmente infectados através da utilização da proteína recombinante.
2.2 Objetivos específicos
Sequenciar o gene completo da enolase de C. lamprauges;
Analisar a estrutura e perfil antigênico da enolase de C. lamprauges; Expressar a proteína recombinante enolase de C. lamprauges;
Verificar a imunogenicidade da proteína em ovinos naturalmente infectados.
3 Material e Métodos
3.1 Isolado e condições de cultivo:
Foi utilizado o isolado clínico de C. lamprauges M290/07 (FIOCRUZ INCQS 40316), identificado e classificado previamente por De Paula et al., 2010. O cultivo foi realizado em meio Ágar Sabouraud Dextrose (SDA) 2%, incubado a 37°C durante quatro dias.
O RNA total foi extraído de acordo com Sokolovsky et al. (1990) e o cDNA sintetizado utilizando o sistema SMARTer TM PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech) a
partir de 1µg de RNA total. Uma alíquota de 5µL da primeira fita foi utilizada como molde para a síntese da segunda fita.
3.3 Amplificação e sequenciamento de eno de C. lamprauges:
Para reações de amplificação do gene, foram sintetizados oligonucleotídeos, tendo como base um fragmento de eno de C. lamprauges (foward 5`-
AACTGTTTAAACTTGAGGATGACGGAAATGTTCAC – 3` e reverse: 5`-
TACGGCGATCGCCATGTCTATTAGCAAAGTTCACG -3`) . A PCR foi realizada em
um volume final de 25μl (10ng DNA, 50mM MgSO4, 10X Taq Buffer com 50mM KCl,
1mM dNTP, 1,25pmol de cada oligonucleotideo e 1U de TaqDNA polimerase HiFi). A PCR foi realizada em 40 ciclos em termociclador (Techne, Analítica), com desnaturação inicial por 3 minutos à 94°C, 30 segundos para desnaturação à 94°C, 15 segundos de anelamento à 50°C e 1,5 minutos de extensão à 72°C, seguidos por um ciclo de extensão final por 5 minutos à 72°C. Os produtos de amplificação foram analisados em eletroforese em gel de agarose 1,0%, corados com Gel Red™ (Biotium®), à 100V por cm e observados em ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad), utilizando
o software ImageLab™. Os produtos de PCR foram purificados em GFX PCR DNA & Gel Band Purification kit e sequenciados em sequenciador ABI 3500 Genetic Analyser (Applied Biosystems®), utilizando os oligonucleotideos correspondentes. As
sequências obtidas foram analisadas no banco de dados do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) através do programa tBLASTx.
3.4 Análise computacional e pesquisa de homologia:
O gene da enolase de C. lamprauges e a sequência deduzida de aminoácidos foram analisadas e comparadas ao banco de dados do GenBank. Para os alinhamentos de sequências, foi utilizado o programa ClustalW no programa DNASTAR LASEGENE. Os parâmetros da sequencia deduzida de aminoácidos foram calculados utilizando o programa ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/). Os softwares Gene Runner
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(http://www.generunner.net/) e Protean (DNASTAR Lasergene) foram utilizados para detectar péptidos imunogénicos e de superfície.
3.5 Clonagem, expressão e purificação da proteína enolase (ENO):
O amplicon foi clonado em vetor pFN6K (HQ) Flexi® Vector (Promega®),
conforme instruções do fabricante, e transformados em Escherichia coli BL21 (DE3)
pLysS por choque térmico (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). Os clones foram
selecionados e transferidos para meio líquido Luria Bertani (LB), incubados a 37°C por 12 horas, após, foi realizada a extração do DNA plasmidial, de acordo com Sambrook & Russel (2001). As amostras extraídas foram sequenciadas novamente para confirmação de eno inserido no plasmídeo. Para a expressão de ENO, os clones transformantes foram cultivados em 3mL de meio LB, contendo 100µg/mL de Kanamicina, sob agitação de 250rpm a 37°C, overnight. Após, 2% do volume foi transferido para 200mL de meio LB contendo kanamicina na mesma concentração anterior, sendo incubado a 37ºC sob agitação de 200rpm até atingir DO600nm de 0,5.
A expressão da proteína foi induzida pela adição de IPTG (isopropil ß-D-1-tiogalactopiranosídeo) na concentração final de 0,2mM e incubada por mais 4 horas a 37ºC, sob agitação de 200 rpm. Em seguida, foi realizada a purificação de ENO através do Kit His Link™ Spin Protein Purification System (Promega®) e sua
concentração foi medida pelo detector de fluorescência Quibit® (Invitrogen).
3.6 Western blot:
Para realização da eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), foi utilizado10µg da proteína purificada, segundo metodologia de Laemmli (1970). Resumidamente, a proteína foi precipitada com TCA a -20°C por 30 minutos, seguida de centrifugação 12.600g por 20 minutos. Foi ressuspendida em 100µL de tampão de amostra desnaturante (Tris-HCl 0,5M ph 6,8; glicerol 10%; 2-mercaptoetanol 4%; SDS 2%; azul de bromofenol 0,01%), e, novamente incubada a 100°C por 5 minutos. Foi utilizado o marcador de massa molecular BenchMark ™ Unstained Protein Ladder Protocol (Invitrogen). A corrida eletroforética foi realizada a 70V, por 4 horas. O gel foi corado com Comassie Brilliant Blue, e as imagens dos géis foram capturadas e processadas em sistema de fotodocumentação
ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad), utilizando o software ImageLab™. Após, foi realizada transferência para membrana de PVDF (fluoreto de polivinilideno - Hybond, Ge
Healthcare), conforme instruções do fabricante. O blot foi incubado, sob agitação
lenta, em tampão de bloqueio PBS-Tb (tampão fosfato salino, pH 7.4 + 0,1% Tween-20 + 5% leite desnatado) por 1h e lavado duas vezes com PBS-T (tampão fosfato salino, pH 7.4 + 0,1% Tween-20), em temperatura ambiente por 5 minutos. Após a lavagem, incubou-se, sob agitação lenta, por 1 hora a membrana com o soro M614/09 de ovino infectado por C. lamprauges, diluído em PBS-T na proporção 1:1600. Foram realizadas 3 lavagens com PBS-T por 10 minutos cada, seguida da incubação com o anticorpo secundário anti-IgG de ovino marcado com peroxidase (Sigma) diluído em PBS-T na proporção 1:2000, por 1 hora, sob agitação lenta, em temperatura ambiente. Após incubação, foram realizadas 4 lavagens com PBS-T por 10 minutos cada e a proteína reativa foi evidenciada com a solução cromógena TMB (3,3`, 5,5`- Tetramethylbenzidine Liquid Substrate System for Membranes – Sigma). Em seguida, a membrana foi lavada com água destilada e seca em papel filtro. A marcação foi fotodocumentada usando o ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad), utilizando o
software ImageLab™.
3.7 Ensaio imunoenzimático:
Amostras de soros: foram utilizadas cinco amostras de soros de ovinos com diagnóstico confirmado de conidiobolomicose através de PCR e imunohistoquímica (DE PAULA et al., 2010; UBIALI et al., 2013), nove amostras de soros de ovinos saudáveis e uma amostra de soro de ovino com pitiose. Todas as amostras são provenientes de rebanhos do Estado de Mato Grosso.
Antígeno: utilizou-se a proteína recombinante de enolase de C. lamprauges purificada na concentração de 10 µg/mL, que correspondeu a 1 µg/poço da placa.
Execução do teste: O teste de ELISA foi realizado segundo descrições de Santurio et al. (2006). Testou-se cinco diluições de cada soro em triplicata (1:100, 1:200, 1:400, 1:800 e 1:1600) frente a diluição do conjugado anti-ovino IgG Peroxidase (1:2000). O ensaio foi realizado a 37°C, usando 100µl de cada componente da reação. O antígeno foi diluído em tampão carbonato-bicarbonato (0,02M Na2CO3; 0,03M NaHCO3; pH 9,6) e o soro e o conjugado em PBS-T (pH 7,4).
19
poço da placa de poliestireno de 96 cavidades (BD-Biosciences) com a proteína diluída e incubou-se “overnight” a 4 °C em câmara úmida. Após bloqueio com PBS-T por 1 h, os soros diluídos foram distribuídos em triplicata e incubados por 1 h. Em seguida, adicionou-se o anticorpo secundário anti-IgG de ovino na diluição de 1:2000 e incubou-se por 1 h. A reação foi revelada pela adição de 100 µL/poço de solução cromógena TMB (3,3`, 5,5`- Tetramethylbenzidine Liquid Substrate System for ELISA – Sigma). Após 15 minutos à temperatura ambiente, sem exposição da luz, a reação foi interrompida com adição de 10 µL de solução de H2SO4 (4N). A
leitura foi realizada no comprimento de onda de 450nm em espectrofotômetro Epoch (Biotek). Para estabelecer o ponto de corte da reação foi considerada a média dos valores da densidade óptica (DO450nm) das amostras negativas acrescidas de duas
vezes o desvio padrão.
4 Resultados
A amplificação através dos oligonucleotídeos sintetizados com base na sequência do gene de C. lamprauges resultou em fragmento de 1305pb. A sequência deduzida de aminoácidos foi de 434 resíduos sendo a massa molecular estimada de 47,2kDa (Figura 1). Na análise da sequência, identificou-se a assinatura de eno (LLLKVNQIGTVSES) correspondentes às posições 342 a 345.
Na comparação com as sequências de enolase de outros fungos, observou-se uma identidade com a observou-sequência de Conidiobolus coronatus (83%) e a menor com Candida albicans (70%). As relações filogenéticas baseadas na comparação com outras sequências de enolases de fungo estão demonstradas na Figura 2.
A análise da estrutura e perfil antigênico da enolase de C. lamprauges apresentou epítopos preditivos para anticorpos e células T. As regiões de hidrofilia foram maiores do que as de hidrofobicidade pela análise de Kyte-Doolittle. A presença de regiões flexíveis (Karplus) também foi observada, assim como regiões de superfície celular pelo índice de Emini. O index de Jameson-Wolf indica as regiões antigênicas potenciais. Regiões com perfil de epítopos para células T e MHCII pelos índices de Sette, Amphi e Rothbard-Taylor (Figura 3).
O cDNA foi clonado em vetor de expressão pFN6K (HQ) Flexi® Vector (Promega®) e a proteína expressa foi purificada e quantificada, obtendo
concentração de 2,52µg/µL. No SDS-PAGE, a enolase foi detectada com peso molecular estimado em 47kDa.
A imunogenicidade da enolase recombinante foi testada através do ELISA e
Western blot. Na técnica de ELISA, observaram-se nas leituras de animais
sabidamente positivos títulos variando de 1: 100 a 1:1600, com DO variando de 0,424 a 1,988. Nos animais sadios observou-se uma DO variando de 0,383 a 0,783, sempre menor quando comparado com animais doentes. Baseado nos títulos de animais negativos, considerou-se como “cut-off” a média acrescido de dois desvios padrões no titulo de 1:400 como uma leitura de DO igual ou superior a 0,691.
Baseado nisto, quatro (4/5) amostras de soros de ovinos doentes foi considerada positiva, o que corresponde a 80% de sensibilidade. Sete (7/9) soros de ovinos sadios foram negativos representando 77,77% de especificidade. O soro de ovino com infecção por Pythium insidiosum não reagiu com enolase de C.
lamprauges.
A detecção de IgG recombinate anti enolase foi detectada em todos os animais através da técnica de Western blot com a massa molecular predita demonstrando a imunogenicidade e os soros de ovino saudável e com pitiose, utilizados como controle negativo, não apresentaram presença de bandas detectáveis.
5 Discussão e conclusão
O estudo da enolase de C. lamprauges é relevante, pois, além de sua atividade glicolítica, estudos revelam, em diversos micro-organismos, sua capacidade de interação patógeno-hospedeiro, uma vez que é capaz de promover a adesão e invasão do fungo às células, consequentemente, disseminação da infecção (MARCOS et al., 2014).
Através das análises, constatou-se que C. lamprauges apresenta sequência de nucleotídeos (1.305pb) e aminoácidos (47kDa) similares com outros fungos, como Candida albicans (1323pb e 46kDa) (SUNDSTROM & ALIAGA, 1992; LI et al., 2011) e Paracoccidioides brasiliensis (1684pb e 54kDa) (NOGUEIRA et al., 2010; DONOFRIO et al., 2009). Pancholi (2001) analisou através do programa computacional Lasergene-MagAlign, 39 sequências de aminoácidos de enolase de diferentes espécies e concluiu que, apesar das diferenças entre sequências, a
21
enolase é altamente conservada, assim como a maioria das enzimas glicolíticas. A análise filogenética baseada na sequência de aminoácidos demonstra similaridade com enolases de outros zygomicetos como observado na figura 2.
O gene eno de C. lamprauges apresenta, em análises “in silico”, presença de regiões imunogênicas tanto para linfócitos T e B. Diversos estudos baseados em análise “in silico” foram confirmados posteriormente sobre a capacidade imunogênica da enolase como Candida albicans (CHAFFIN et al., 1998; MARTÌNEZ et al., 1998), Cladosporium herbarum and Alternaria alternata (SIMON-NOBBE et al., 2000) e Cryptococcus gatti (MARTINS et al., 2013).
Por meio da técnica de Western blot, a enolase foi reconhecida por anticorpos presentes no soro de ovinos infectados com C. lamprauges, portanto, a proteína foi capaz de induzir resposta imunológica ao hospedeiro, sugerindo ser candidata a marcador imunológico da doença. Estudo prévio realizado com perfil protéico de extrato miceliano de C. lamprauges através da mesma técnica mostrou proteínas imunorreativas, com peso molecular variando entre 198 a 6kDa (SILVA et al., 2015) e, possivelmente, a enolase tenha sido evidenciada, em razão de possuir 47kDa.
Neste trabalho, foram detectados anticorpos anti-enolase em 80% dos ovinos com conidiobolomicose pela técnica de ELISA sem reações cruzadas com ovinos infectados com P. insidiosum. Esses resultados reforçam os encontrados por Silva et al. (2015) que concluíram que não houve reatividade cruzada de extrato proteíco de
C. lamprauges com soro de ovino com pitiose.
Portanto, a detecção de anticorpos anti-enolase específicos nos animais evidenciam que a proteína é um antígeno candidato bastante promissor para o desenvolvimento de vacina eficaz contra a enfermidade. Recomenda-se a incorporação do teste de ELISA no estudo da doença, desde que, os dados clínicos e epidemiológicos sejam avaliados concomitantemente.
Figure 1: Sequência de nucleotideos de cDNA e sequência deduzida de aminoácidos da enolase de C. lamprauges (INCQS 40316). O retângulo representa a assinatura do gene da enolase. * = Stop codon
ATGTCTATTAGCAAAGTTCACGCTCGTCAAATTTTCGATTCCCGTGGTAACCCTACTATTGAAGTTGAAGTTACTACTGAAAAAGGAACCTTTCGTGCTGCTGTACCCAGTGGAGCTTCTACCGGTATTCATGAAGCTTT 5' M S I S K V H A R Q I F D S R G N P T I E V E V T T E K G T F R A A V P S G A S T G I H E A L 1 140 AGAACTTCGTGATAATGATAAATCCAATTATCTCGGTAAAGGTGTACTAAAAGCTGTTCAGAATGTTAAAGACATCATTGCTCCTAAACTAATTGAAGCTAAATTGGACTTGAAAGATCAAAAAGCTGTTGATGACTTTT 5' E L R D N D K S N Y L G K G V L K A V Q N V K D I I A P K L I E A K L D L K D Q K A V D D F 1 280 TATTAAACTTAGATGGTACTAAGAATAAATCTAAACTTGGTGCTAATGCTATCCTCGGGGTTTCGCTCGCTATAGCTAAAGCTGGGGCTGCTGAGAAGGGCATTCCACTTTATAAACATATTTCTGAGCTTGCTGGAGCT 5' L L N L D G T K N K S K L G A N A I L G V S L A I A K A G A A E K G I P L Y K H I S E L A G A 1 420 AAAACCCCTTATGTATTACCCGTTCCTGCTTTTAATGTCATTAATGGTGGTTCTCATGCTGGCAATAAATTAGCTATGCAGGAATTCATGATCTTACCTACTGGTGCTCAATCTTTTACTGAGGCTATGAAGATTGGTTC 5' K T P Y V L P V P A F N V I N G G S H A G N K L A M Q E F M I L P T G A Q S F T E A M K I G S 1 560 TGAAGTATATCATACTTTGAAGAAAGTTATTAAAGAGAAGTATGGTCAAGATGCTACCAATGTTGGTGATGAAGGTGGTTTCGCTCCTAATATTCAAGATAATAAAGAAGGTCTTGAATTATTAAAAGTTTCTATTGAGA 5' E V Y H T L K K V I K E K Y G Q D A T N V G D E G G F A P N I Q D N K E G L E L L K V S I E 1 700 AGGCTGGCTATACTGGCAAAGTTAAAATTGCCATGGATGTTGCTGCTTCAGAATTCTATAAGAATGGTAAATATGACCTTGATTTTAAGAACCCTAACTCCGATCCTTCTAAGTGGTTAACTGGTGCTGAGCTTTCCCAG 5' K A G Y T G K V K I A M D V A A S E F Y K N G K Y D L D F K N P N S D P S K W L T G A E L S Q 1 840 CTCTATTTAGATTATGCCAAAGAATATCCAATTGTATCAATTGAAGATCCATTTGACCAAGATGATTGGGAATCTTGGACTCATATAAGAAATTCTACTGATATCCAAATCGTTGGTGATGATCTTACTGTAACCAATCC 5' L Y L D Y A K E Y P I V S I E D P F D Q D D W E S W T H I R N S T D I Q I V G D D L T V T N P 1 980 AGAGCGTATTCAAACTGCTATTCAAAAGAAATCATGCTCTGGTTTGCTTCTTAAAGTAAATCAGATTGGTACTGTTTCTGAATCTATTGCTGCTGCTAAATTATCTCAATCTGATGGATGGGGTGTCATGGTTTCTCATC 5' E R I Q T A I Q K K S C S G L L L K V N Q I G T V S E S I A A A K L S Q S D G W G V M V S H 1 1120 GTTCTGGTGAAACTGAAGATTCATTTATTGCTGATTTAGTAGTTGGTTTACGCACTGGGCAGATTAAAACCGGTGCTCCTTGTCGTTCTGAACGTTTAGCTAAATATAATCAATTACTACGTATTGAAGAGGAACTCGGT 5' R S G E T E D S F I A D L V V G L R T G Q I K T G A P C R S E R L A K Y N Q L L R I E E E L G 1 1260 GCTCATGCTGTTTATGCTGGTGAACATTTCCGTCATCCTCAATAA 5' A H A V Y A G E H F R H P Q . 1 *
11
Figure 3: Análise da estrutura e perfil antigênicodos epitopos preditivos para o anticorpos e células T da enolase de C. lamprauges.
A B C D E F
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4 Artigo aceito ao periódico Small Ruminant Research - Characterization and evaluation of immunogenicity of Conidiobolus lamprauges enolase
Title: Characterization and evaluation of immunogenicity of Conidiobolus lamprauges enolase
Authors: Juçara Tinasi Oliveiraa, Isabela de Godoya, Luiz Henrique Rego De Oliveira Santosa;
Icaro Sergio Magalhães Rochaa, Fernanda Harumi Maruyamaa, Luciano Nakazatoa, b, Valeria
Dutraa
aLaboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Hospital Veterinário da Universidade
Federal de Mato Grosso (HOVET-UFMT), 78060900, Cuiabá, MT, Brazil,
b Corresponding author e-mail: lucnak@ufmt.br
Abstract: Conidiobolomycosis is a fungal disease that affects the upper respiratory tract of
animal mainly sheep in tropical region. There are no vaccines or efficient treatments for this pathology and identifying immunoreactive proteins could create new opportunities for preventing or diagnosing this disease. The objectives of this study were to characterize the C.
lamprauges enolase-gene (eno) and evaluate its immunogenic capacity in naturally infected
sheep serum. Gene amplification of eno gene from C. lamprauges resulted in a 1305 bp amplicon and 434 residues of deduced amino acid with a predicted molecular weight of 47.2 kDa and it had a signature enolase sequence. Anti-recombinant enolase IgG showed 80% of sensibility and 81.8% of specifity, with no cross-reactivity detected in sheep with pythiosis. Therefore, this study demonstrated that recombinant ENO from C. lamprauges is immunogenic against the sera of sheep that were naturally infected with conidiobolomycosis. The detection of specific anti-enolase antibodies in animals shows that the protein is a promising candidate antigen for the development of effective vaccines against the disease or diagnostic tests.
Abstract: Conidiobolomycosis is a fungal disease that affects the upper respiratory tract of animal mainly sheep in tropical region. There are no vaccines or efficient treatments for this pathology and identifying immunoreactive proteins could create new opportunities for preventing or diagnosing this disease. The objectives of this study were to characterize the C. lamprauges enolase-gene (eno) and evaluate its immunogenic capacity in naturally infected sheep serum. Gene amplification of eno gene from C. lamprauges resulted in a 1305 bp amplicon and 434 residues of deduced amino acid with a predicted molecular weight of 47.2 kDa and it had a signature enolase sequence. Anti-recombinant enolase IgG showed 80% of sensibility and 81.8% of specifity, with no cross-reactivity detected in sheep with pythiosis . Therefore, this study demonstrated that recombinant ENO from C. lamprauges is immunogenic against the sera of sheep that were naturally infected with conidiobolomycosis. The detection of specific anti-enolase antibodies in animals shows that the protein is a promising candidate antigen for the development of effective vaccines against the disease or diagnostic tests
Keywords: Enolase, ovine, Conidiobolus lamprauges, IgG, sheep
Introduction
Conidiobolomycosis is a fungal disease that affects the upper respiratory tract of humans and animals (Ribes et al., 2000; Vilela et al., 2010).Reports of mycotic rhinitis in sheep caused by Conidiobolus (C.) lamprauges have been frequent in Brazil (Silva et al., 2007). This disease can cause serious damage that results in the death of the animals, especially due to the difficulty in diagnosis coupled with treatment failures (Silveira et al., 2013; Tondolo et al., 2013).
Enolase is a cytoplasmic enzyme expressed in a variety of microorganisms (Pancholi, 2001), and previous study has detected the differential expression of enolase at 37°C in a
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clinical isolate of C. lamprauges (Silva et al., 2012). This enzyme in Candida (C.) albicans elicited specific antibodies in patients with invasive candidiasis, serving as a marker in the diagnosis of this disease (Angiolella et al., 1996).
This study aimed to molecularly characterize C. lamprauges enolase-gene (eno) and evaluate its immunogenic capacity in the sera of naturally infected sheep using recombinant protein.
Materials and methods
The cultivation of C. lamprauges (FIOCRUZ INCQS 40316) was performed in Sabouraud dextrose agar medium and incubated at 37°C for four days. Total RNA was extractedand the cDNA was synthesized from 1μg of total RNA.
Primers were synthesized based on a fragment from C. lamprauges full eno gene
(5`ATGACGGAAATGTTCAC -3` and 5`-ATTAGCAAAGTTCACG -3`) for amplification
reaction in volume of 25 μl with10 ng cDNA. After an initial step for 3 min at 94°C, 40 cycles were performed of 30 sec at 94°C, 15 sec at 50°C, and a 1.5 min at 72°C, followed by a final extension cycle for 5 min at 72°C. The PCR products were cloned into the pFN6K (HQ)
plasmid according to the manufacturer's instructions and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cell.Then, plasmid DNA was extracted and sequenced to confirm that the eno gene was inserted in the plasmid. Nucleotides and deduced protein sequences were analyzed and compared with those in the GenBank database and with ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/).
For expressing ENO, transformant clones were grown in 200 mL of LB medium containing kanamycin at 37°C, and protein expression was induced by adding IPTG (0.2 mM). The ENO protein was purified using a His Link Kit™ Spin Protein Purification System and its concentration was measured using a Quibit®.
Polyacrylamide gel electrophoresis was used to separate 10 μg of the purified protein [10] and then transferred onto a PVDF membrane. The blot was incubated, after blocking, with serum (1:1600 PBS-T) from sheep infected with C. lamprauges. Three washes were performed with PBS-T, followed by incubation with anti-sheep IgG secondary antibody labeled with peroxidase (1:2000 PBS-T) and detected with TMB chromogen.
Five serum samples were used from sheep with conidiobolomycosis, which were confirmed by PCR and immunohistochemistry (Ubiali et al., 2013), nine samples from healthy sheep serum and two serum sample from sheep with pythiosis. ELISA was performed according to the method described (Santurio et al., 2006)with 1 µg/well of ENO protein.
Dilutions of serum samples (1:100, 1:200, 1:400, 1:800 and 1:1600) were tested in triplicate for each serum against a dilution of anti-sheep IgG peroxidase conjugate (1:2000). The reaction was catalyzed by the addition of 100 µL/well of TMB and then was stopped by 10 µL of H2SO4. The absorbance (OD450nm) was measured in spectrophotometer and cutoff
value for seropositivity was an OD450nm greater than the mean plus two SD of that for the
controls. Results
The amplification by the primers synthesized based on the sequence of C. lamprauges gene resulted in 1305 bp fragment. The deduced amino acid sequence had 434 residues and a predicted molecular weight of 47.2 kDa with a signature of eno genes (LLLKVNQIGTVSES) corresponding to positions 342-345.
The immunogenicity of the recombinant enolase was tested by ELISA and Western blotting. Anti-recombinant enolase IgG was detected with the predicted molecular mass in all of the animals by a Western blotting, demonstrating immunogenicity, and sera from healthy sheep and sheep with pythiosis, used as negative controls, showed no detectable bands (Figure 1).
