Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Geral
Pós-graduação em Ecologia, Conservação e Manejo de Vida Silvestre
O potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi como
organismo-teste em estudos ecotoxicológicos: uma comparação
congênere
Marcela Martins Ribeiro
Belo Horizonte 2011
O potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi como
organismo-teste em estudos ecotoxicológicos: uma comparação
congênere
Orientadora: Profa Dra Arnola Cecília Rietzler
Belo Horizonte 2011
Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ecologia, Conservação e Manejo de Vida Silvestre.
iii
Agradecimentos
À Profa.Dra. Arnola Rietzler pela oportunidade de trabalhar com a ecotoxicologia e orientação neste trabalho, me passando segurança e me permitindo aprender. Deixo meus agradecimentos e minha admiração pela profissional e pessoa que é.
Ao Prof.Dr. Eduardo Silva, Universidade Federal da Bahia, por nos fornecer os organismos de Ceriodaphnia cornuta, nossa ferramenta de trabalho.
À Prof.Dra. Alessandra Giani e ao Prof.Dr. Cléber Figueredo e aos alunos do Laboratório de Ficologia, departamento de Botânica, Universidade Federal de Minas Gerais pelas coletas de água e Prof.Dr. Cléber Figueredo pelos dados do fitoplâncton da lagoa da Pampulha.
À Dra. Clarice Botta, Universidade de São Paulo, pelas valiosas sugestões e ajuda e pelos dados de reprodução de C. dubia;
À Dra. Ana Lúcia Fonseca, Universidade Federal de Itajubá, também pelas valiosas sugestões dadas ao trabalho;
À Dra. Clarice Botta e Profa. Dra. Ana Lúcia Fonseca pela participação na banca e pelas críticas e correções ao trabalho.
Ao Prof.Dr. Rubén Dario Sinisterra Milan, do Laboratório de Inorgânica, Departamento de Química da UFMG, por disponibilizar a balança analítica e a química Alinne Martins por me atender e auxiliar na utilização da balança.
Ao Prof.Dr. Francisco Barbosa, Laboratório de Limnologia da UFMG por disponibilizar o laboratório e ao biólogo Marcelo Costa, por nos atender.
Ao técnico da biologia geral Daniel e aos motoristas do ICB-UFMG pelas buscas de água da fonte.
Aos técnicos e aos e responsáveis pelo laboratório central da Parasitologia por disponibilizar água destilada ao laboratório.
Ao professor Fabrício Santos, laboratório de Biodiversidade e evolução da UFMG, pela disponibilização de água Milli-Q para o laboratório.
Aos professores da pós-graduação, Dr. Jóse Bezerra, Dra. Paulina Maia-Barbosa e Dr. Francisco Barbosa pelas críticas ao projeto durante os seminários de andamento de teses e dissertações.
Às meninas do laboratório de Ecotoxicologia: Juliana e Cíntia pela grandiosa ajuda com os testes. À Suellen por ter sido grande amiga, pelas discussões de artigo e pelas ajudas nos programas estatísticos.
Ao Leonardo pela paciência em me ajudar com o programa Sigma Plot.
A Virginia por me apresentar ao professor Rubén, por me auxiliar com o programa Origen e me tirar todas as dúvidas de química.
Ao Héder, Mirian, Maíra, William, Ângelo e Júlio César pelos abstracts, deste trabalho e dos seminários de andamento de teses e dissertações.
Ao Diego Pujoni pela ajuda com a estatística.
Aos secretários da pós-graduação, Fred e Cris, por cuidarem da gente e pela paciência. À CAPES pelo bolsa de pesquisa;
Às amigas de curso:
Cristina Apolônia por ter sido companheira de disciplinas, agradeço a parceria. Eugênia, irmã da Kelly, por não me deixar ouvir as vozes sozinha!
Maíra e Fernanda, por entenderem tudo que se passava... as luzes que se acendiam e aquela porta que mudou de lugar!
Nadja, pela companhia no final da caminhada, duas mortas se apoiando! Ao Pr. José Eugênio por me trazer uma nova visão da ecologia.
Virna e Héder pela amizade e companhia em todos os momentos, pelo apoio e boas risadas.
Aos meus irmãos, Mirian e Átila, por serem meus companheiros.
Aos meus pais, Fátima e Jacob, pelo aconchego do “nosso ninho” que tanto me protege.
A todos vocês que contribuíram com este trabalho, rezo para que Deus abençoe cada um.
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Índice
Índice de Figuras ...vii
Índice de Tabelas ...viii
Resumo ...x
Abstract...xi
Introdução Geral ...1
Objetivos...5
Hipóteses de trabalho...5
Capítulo 1: Avaliação do potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi como organismo-teste em estudos ecotoxicológicos, utilizando parâmetros biológicos: uma comparação congênere. ...5
1- Introdução...7
2- Material e Métodos...9
2.1- Água de cultivo ... 9
2.2- Manutenção dos Cultivos... 9
2.3- Estudo do ciclo de vida de Ceriodaphnia spp... 10
2.4- Crescimento Populacional... 11
3- Resultados ...13
3.1- Experimento individual para obtenção dos dados do ciclo de vida de Ceriodaphnia spp ... 13
3.2- Crescimento Populacional de Ceriodaphnia spp ... 19
4- Discussão...21
4-1 Análises dos Ciclos de vida para Ceriodaphnia spp... 21
4.2- Crescimento Populacional de Ceriodaphnia spp ... 26
5- Conclusões ...29
Capítulo 2: Avaliação do potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi como organismo-teste em testes de toxicidade aguda e crônica: comparação congênere ...30
1- Introdução...31
2- Material e Métodos...34
2.1- Manutenção dos cultivos... 34
2.2- Água de cultivo ... 34
2.3- Alimentação ... 34
2.4- Monitoramento... 34
2.5- Preparo das soluções-estoque de cloreto de sódio e dodecil sulfato de sódio... 35
2.6- Teste de Toxicidade Aguda... 36
2.7- Testes de Toxicidade Crônica ... 37
3- Resultados ...37
3.1- Testes de Toxicidade Aguda utilizando cloreto de sódio... 37
3.2- Testes de toxicidade aguda utilizando dodecil sulfato de sódio... 41
3.3- Testes de toxicidade crônica utilizando as substâncias cloreto de sódio e dodecil sulfato de sódio... 44
4.1- Teste de Toxicidade Aguda... 47
4.2- Teste de Toxicidade Crônica... 52
5- Conclusões ...55
Capítulo 3: Avaliação do potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi como organismo-teste em estudos ecotoxicológicos na Represa da Pampulha, Minas Gerais...57
1- Introdução...58
2- Material e Métodos...60
2.1- Manutenção dos cultivos... 60
2.2- Água de cultivo ... 60
2.3- Alimentação ... 60
2.4- Monitoramento... 60
2.5- Área de estudo e amostragem ... 61
2.6- Ensaios de Toxicidade aguda e crônica... 62
2.7- Análise estatística dos dados ... 62
3- Resultados ...63
3.1- Ensaios de toxicidade aguda e crônica... 63
4- Discussão...65
5- Conclusões ...68
Considerações Finais ...69
Referências Bibliográficas...71
Anexo 1: Experimentos Individuais e Populacionais ...80
Anexo 2: Testes de Toxicidade Aguda e Crônica ...86
vii
Índice de Figuras
Capítulo 1
Figura 1- Foto de C. cornuta [A], C. silvestrii [B], C. dubia [C]. (aumento 40x) (Foto:
Ribeiro, 2 011)... 7
Figura 2- Experimento individual para Ceriodaphnia spp... 11
Figura 3- Experimento populacional ... 12
durante a primeira semana... 12
Figura 4- Experimento populacional mantido em cubas na segunda semana...12
Figura 5- Média de neonatas produzidas durante o ciclo de vida por [A1] C. cornuta, [B1] C. silvestrii e [C1] C. dubia e média de neonatas por ninhada durante todo o experimento para [A2] C. cornuta, [B2] C. silvestrii e [C2] C. dubia... 15
Figura 6: Sobrevivência de C. cornuta [A], C. silvestrii [B] e C. dubia [C]... 16
Figura 7: Média acumulada de produção de neonatas para [A] C. cornuta, [B] C. silvestrii e [C] C. dubia. ... 17
Figura 8- Curvas de Crescimento populacional de Ceriodaphnia cornuta, C. silvestrii e C. dubia no período de 15 dias... 20
Capítulo 2 Figura 1- Cartas-controle de C. cornuta [A1]; C. silvestrii [B1] e C. dubia [C1] para CE50;24h e de C. cornuta [A2]; C. silvestrii [B2] e C. dubia [C2] para CE50;48h utilizando cloreto de sódio como substância de referência. ... 40
Figura 2- Cartas-controle de C. cornuta [A1]; C. silvestrii [B1] e C. dubia [C1] para CE50;24h e de C. cornuta [A2]; C. silvestrii [B2] e C. dubia [C2] para CE50;48h utilizando dodecil sulfato de sódio como substância de referência... 43
Figura 3- Total de neonatas nos testes de toxicidade crônica para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia,utilizando o dodecil sulfato de sódio (mg L-1). Teste 1 [A]; Teste 2 [B]; Teste 3 [C]... 45
Figura 4- Total de neonatas nos testes de toxicidade crônica para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, utilizando cloreto de sódio (mg L-1). Teste 1 [A]; Teste 2 [B]; Teste 3 [C]... 46
Figura 3- Valores médios de CE50;24 h e CE50;48h (g L-1) para C. cornuta e C. silvestrii, utilizando cloreto de sódio, nos experimentos normais iniciais e contaminados com íons ferroso e férrico (Fe+2 e Fe+3)... 50
Figura 5- Valores médios de CE50;24 h e CE50;48h (g L-1) para C. cornuta e C. silvestrii, utilizando sulfato de sódio, nos experimentos iniciais e contaminados com íons ferroso e férrico (Fe+2 e Fe+3)... 50
Figura 6- Valores médios de CE50;24 h e CE50;48h (mg L-1) para C. cornuta e C. silvestrii, utilizando dodecil sulfato de sódio, nos experimentos iniciais e contaminados com íons ferroso e férrico (Fe+2 e Fe+3)... 51
Capítulo 3 Figura 1- Localização do reservatório da Pampulha, Minas Gerais, incluindo o ponto de coleta. Extraído de Araújo e Pinto-Coelho (1998). ... 61
Figura 2- Total de neonatas nos ensaios de toxicidade crônica realizados com amostras de água da Lagoa da Pampulha, em outubro de 2010 [A] , novembro de 2010 [B] e dezembro de 2010 [C] . ... 64
Anexo 2 Figura 1- Média de neonatas nos testes de toxicidade crônica para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia,utilizando o dodecil sulfato de sódio (mg L-1). Teste 1 [A]; Teste 2 [B]; Teste 3 [C]... 96
Figura 2- Média de neonatas nos testes de toxicidade crônica para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, utilizando cloreto de sódio (mg L-1). Teste 1 [A]; Teste 2 [B]; Teste 3 [C]. ... 97
Índice de Tabelas
Introdução geral
Tabela 1- Registro da ocorrência de Ceriodaphnia cornuta no mundo, extraído de Villalobos e González (2006)... 4 Capítulo 1
Tabela 1: Parâmetros do ciclo de vida de Ceriodaphnia spp. ... 18 Tabela 2: Dados da literatura relacionados à reprodução e longevidade de cladóceros, sob diferentes condições de cultivo... 23 Capítulo 2
Tabela 1- Dados de CE50;24 h e CE50;48h para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia utilizando cloreto de sódio (NaCl - g L-1). ... 39 Tabela 2- Dados de CE50;24 h e CE50;48h para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia utilizando dodecil sulfato de sódio (C12H25SO4Na - mg L-1). ... 42 Anexos
Tabela 1- Medidas físicas e químicas da água de manutenção do laboratório... 81 Tabela 2- Medidas físicas e químicas iniciais e finais do experimento individual. ... 82 Tabela 3- Medidas físicas e químicas iniciais e finais do experimento populacional.... 83 Tabela 4- Parâmetros do ciclo de vida de Ceriodaphnia cornuta: idade e número de neonatas da primípara à 5ª reprodução, tempo de reprodução, longevidade, número de neonatas por ninhada, número de ninhadas e total de neonatas produzidas em testes com contaminação de ferro (Fe+2, Fe+3). ... 84 Tabela 5- Parâmetros de vida para C. silvestrii. :idade e número de neonatas da
primípara à 5ª reprodução, tempo de reprodução, longevidade, número de neonatas por ninhada, número de ninhadas e total de neonatas produzidas em testes com
contaminação de ferro (Fe+2, Fe+3). Idem legenda anterior. ... 84 Tabela 6- Parâmetros de vida para C. dubia. idade e número de neonatas da primípara à 5ª reprodução, tempo de reprodução, longevidade, número de neonatas por ninhada, número de ninhadas e total de neonatas produzidas em testes com contaminação de ferro (Fe+2, Fe+3).. ... 85 Tabela 7- Dados de CE50;24 h e CE50;48h, para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, utilizando dodecil sulfato de sódio, nos experimentos de toxicidade aguda,
contaminados com íons ferrosos (Fe+2 e Fe+3). ... 87 Tabela 8- Dados de CE50;24 h e CE50;48h, para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, utilizando cloreto de sódio, nos experimentos de toxicidade aguda, contaminados com íons ferrosos (Fe+2 e Fe+3)... 87 Tabela 9- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e condutividade elétrica para o primeiro teste definitivo de toxicidade aguda de NaCl... 88 Tabela 10- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o segundo teste definitivo de toxicidade aguda de NaCl. .. 88 Tabela 11- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o terceiro teste definitivo de toxicidade aguda de NaCl... 89 Tabela 12- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
ix Tabela 13- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o quinto teste definitivo de toxicidade aguda de NaCl... 90 Tabela 14- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o primeiro teste definitivo de toxicidade aguda de DSS. ... 90 Tabela 15- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o segundo teste definitivo de toxicidade aguda de DSS... 91 Tabela 16- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o terceiro teste definitivo de toxicidade aguda de DSS... 91 Tabela 17- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o quarto teste definitivo de toxicidade aguda de DSS... 92 Tabela 18- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o quinto teste definitivo de toxicidade aguda de DSS... 92 Tabela 19- Dados de porcentagem de imobilização, pH, OD, temperatura e
condutividade elétrica para o sexto teste definitivo de toxicidade aguda de DSS. ... 93 Tabela 20- Dados físicos e químicos dos testes definitivos de toxicidade crônica para DSS... 94 Tabela 21- Dados físicos e químicos dos testes definitivos de toxicidade crônica para NaCl... 95 Tabela 22- Parâmetros físicos e químicos dos testes de toxicidade crônica da água da Pampulha nos meses outubro, novembro e dezembro de 2010... 99 Tabela 23- Média da produção de neonatas dos ensaios de toxicidade crôncia do
Resumo
O objetivo deste trabalho foi testar a sensibilidade em relação a duas substâncias de referência, cloreto de sódio (NaCl) e dodecil sulfato de sódio- DSS - (C12H25SO4Na) e de amostras de água do reservatório da Pampulha, à Ceriodaphnia cornuta para verificar seu potencial como organismo-teste em estudos ecotoxicológicos. Além disso, foram obtidas informações quanto à reprodução e longevidade desta espécie no contexto individual e populacional. Paralelamente foram conduzidos experimentos utilizando Ceriodaphnia silvestrii e Ceriodaphnia dubia, já padronizadas, visando comparar suas respostas às de C. cornuta. A metodologia utilizada para os testes de toxicidade aguda (letais) e crônica (sub-letais) foi a descrita pela ABNT (2003a, 2003b), respectivamente. Nos experimentos individuais, 8 a 10 fêmeas foram mantidas em 20mL de água de cultivo e monitoradas ao longo do ciclo de vida. Para determinação do crescimento populacional, 30 fêmeas foram colocadas em recipientes de 2L com água de cultivo, sendo realizada a contagem de organismos em dias alternados, durante 15 dias. Os experimentos foram alimentados com Pseudokirchneriella subcapitata (2x105cél mL-1) e 0,02 mL de um composto de ração de peixe e levedura (RL). Dentre os dados do ciclo de vida, não foram verificadas diferenças estatisticamente significativas para as primíparas. Os tempos médios corresponderam a 3,8; 4,0; 4,1 dias para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, respectivamente. Também não houve diferenças em relação ao número de neonatas produzidas por estas primíparas, com médias correspondentes de 3,5; 2,6 e 2,6 neonatas/fêmea. C. cornuta, a espécie menor, em média, apresentou menor longevidade, 20,6 dias, enquanto C. silvestrii e C. dubia, 33,8 e 34,5 dias, respectivamente. Ao longo do ciclo de vida, C. cornuta produziu em média 34,0 neonatas/fêmea, distribuídas em 6,8 ninhadas com 4,6 neonatas/ninhada/fêmea. C. silvestrii produziu 111,2 neonatas/fêmea, 16,5 ninhadas e 6,4 neonatas/ninhada/fêmea. Para C. dubia, houve uma produção média de 100,0 neonatas/fêmea, 15,8 ninhadas e 6,1 neonatas/ninhada/fêmea. As taxas intrínsecas de crescimento populacional foram 0,37; 0,31 e 0,30 para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, respectivamente, as quais corresponderam a densidades populacionais de 9080, 4338 e 2885 indivíduos, mostrando diferenças de C. cornuta em relação às outras duas espécies. Os resultados dos testes de toxicidade aguda, tanto para o cloreto de sódio quanto para dodecil sulfato de sódio, não mostraram diferenças estatisticamente significativas de sensibilidade entre as espécies em 24h e 48h. Para NaCl, os respectivos valores médios de CE50;24h e CE50;48h para C.cornuta foram 1,67g L-1 e 1,04g L-1 ; para C. silvestrii 1,97g L-1 e 1,28g L-1 e para C. dubia 1,60g L-1 e 1,02g L-1 . Para DSS, os valores médios de CE50;24h e CE50;48h corresponderam a 4,28mg L-1 e 2,09mg L-1 para C.cornuta; 4,96mg L-1 e 3,35mg L-1 para C.silvestrii; e 4,19mg L-1 e 2,71mg L-1 para C.dubia. Quanto aos testes de toxicidade crônica, também não foram verificadas diferenças entre as espécies em relação ao cloreto de sódio, com médias de CI25 de 0,32; 0,37 e 0,30 g L-1 para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, respectivamente. Porém, houve diferenças significativas em relação ao dodecil sulfato de sódio, com médias de CI25 de 1,31; 2,32 e 2,09 mg L-1, respectivamente. Os resultados dos ensaios de toxicidade crônica com amostras de água do reservatório da Pampulha utilizando C. cornuta como organismo-teste mostraram que ela foi tão sensível quanto C.silvestrii e C.dubia. Os resultados do trabalho mostraram a viabilidade do cultivo de C. cornuta e seu potencial para ser utilizada como organismo-teste em estudos ecotoxicológicos.
xi
Abstract
The aim of this study was to essay sensivity in relation to two reference substances, sodium chloride (NaCl) and sodium dodecyl sulfate-SDS-(C12H25SO4Na) and water samples from Pampulha reservoir to Ceriodaphnia cornuta in order to evaluate its potential as test organisms in ecotoxicological studies. In addition, information on the reproduction and longevity of those species in the individual and population context was obtained. Parallel experiments were conducted using Ceriodaphnia dubia and Ceriodaphnia silvestrii, already standardized, in order to compare their responses to those of C. cornuta. The methodology used for acute toxicity essays (lethal) and chronic toxicity essays (sublethal) was described by ABNT (2003a, 2003b) respectively. In individual experiments, 8 to 10 females were kept in 20 mL of water for cultivation and monitored throughout the life cycle. In order to determine population growth, 30 females were placed in containers with 2L water, the counting of organism being carried out every other day during 15 days. The experiments were fed with Pseudokirchneriella subcapitata (2x105cel mL-1) and a 0.02 mL fish meal and yeast (RL) compound. No statistically significant differences for primipara were found among lifespan data. The average times corresponded to 3.8, 4.0, 4.1 days for C. cornuta, C. silvestrii and C. dubia, respectively. Furthermore, there were no differences compared to the number of neonates produced by primipara, with corresponding averages of 3.5, 2.6 and 2.6 neonates per female. C. cornuta, the smallest specie, presented lower average longevity, 20.6 days, while C. silvestrii and C. dubia presented 33.8 and 34.5 days, respectively. C. cornuta reproduced 34.0 neonates per female on average distributed in 6.8 litters with 4.6 neonates/brood/female throughout the lifecycle. The C. silvestrii has reproduced 111.2 neonates per female, 16.5 litters, 6.4 neonates / brood / female. For C. dubia, the average reproduction was of 100.0 neonates/female, 15.8 litters, 6.1 neonates/brood/female. The intrinsic rates of increase were 0.37, 0.31 and 0.30 for C. cornuta, C. silvestrii and C. dubia, respectively, which corresponded to densities of 9080, 4338 and 2885 individuals respectively, showing differences in C. cornuta compared to other species. The results of acute toxicity tests for both sodium chloride and for sodium dodecyl sulfate do not show statistically significant differences of sensitivity between the species in 24h and 48h. For NaCl, the respectives mean values of EC50;24h and EC50;48h for C. cornuta were 1.67 g L-1 and 1.04 g L-1; for C. silvestrii 1.97 g L-1 and 1.28 g L-1 and C. dubia 1.60 g L-1 and 1.02 g L-1. For SDS, the mean values of EC50;24h and EC50;48h correspond to 4.28 mg L-1 and 2.09 mg L-1 for C. cornuta 4.96 mg L-1 and 3.35 mg L-1, for C. silvestrii and 4.19 mg L-1 and 2.71 mg L
-1 for C. dubia. Regarding chronic toxicity tests, no differences were found between species in relation to sodium chloride with CI25 averages of 0.32, 0.37 and 0.30 g L-1 for C. cornuta, C. silvestrii and C. dubia, respectively. However, there were significant differences in relation to sodium dodecyl sulfate, with CI25 averages of 1.31, 2.32 and 2.09 mg L-1, respectively. The results of chronic toxicity tests with samples of water from the reservoir using C. cornuta as test organisms showed that it was as sensitive as C. silvestrii and C. dubia. The results of the study showed the feasibility of cultivation of C. cornuta and its potential to be used as test organisms in ecotoxicological studies. Keywords: Ceriodaphnia cornuta, test organism, lifecycle, sensitivity.
Introdução Geral
A ecotoxicologia é uma ciência que permite avaliar a ação de poluentes sobre a biota, e tem como finalidade proteger as comunidades biológicas. O foco da ciência é um organismo vivo, o qual precisa atender alguns critérios biológicos e ecológicos para ser considerado um organismo-teste.
Em relação aos aspectos biológicos, é necessário que a espécie seja sensível a uma gama de substâncias químicas, e que esta sensibilidade seja constante, possibilitando a repetibilidade e reprodutibilidade dos testes. Além disso, o conhecimento prévio dos aspectos reprodutivos, longevidade, hábitos alimentares e comportamento, é importante para a constatação de sua viabilidade em cultivo, sendo que, espécies com curto ciclo de vida e alta fecundidade são interessantes como organismos-teste. Por fim, a espécie deve possuir uma estabilidade genética para que sejam obtidos lotes homogêneos de organismos, de forma a diminuir interferências nos estudos (Domingues e Bertoletti, 2008).
Já em relação aos aspectos ecológicos, as espécies abundantes e disponíveis ao longo do ano são preferenciais na utilização como organismos-teste, considerando que os testes de laboratório devem ser contínuos e necessitam de grande quantidade de organismos para sua realização (Domingues e Bertoletti, op. cit.). Além disso, deve possuir grande relevância na transferência energética nos ecossistemas.
Para a avaliação da toxicidade de substâncias em relação a organismos vivos devem ser considerados os fatores de interferência, que podem ser classificados como internos e externos.
Para os internos, a resposta tóxica varia entre espécies e pode ser explicada por divergências nos processos de biotransformação de um xenobiótico nas diferentes vias metabólicas, já que um tóxico pode degradar em substâncias com menor, igual ou maior toxicidade dependendo das biotransformações que ocorrem nas diferentes espécies (Nascimento, 2008). Além disso, o fator tamanho influencia, uma vez que organismos menores são geralmente mais sensíveis, em função de uma maior área de superfície, levando a uma maior probabilidade de contato com as substâncias tóxicas do meio.
2 Os fatores abióticos podem influenciar na biodisponibilidade de certas substâncias à biota aquática, variando os efeitos de toxicidade dos poluentes. Como exemplo, as formas dissociadas e não dissociadas de uma substância variam o efeito tóxico e a prevalência de uma em relação à outra depende do pH do meio. A temperatura influencia na toxicidade por aumentar a solubilidade de muitas substâncias e alterar suas estruturas químicas. A dureza age alterando a toxicidade, principalmente de metais, sendo eles menos tóxicos em águas duras, pela reação com os íons cálcio, precipitação e indisponibilização aos organismos (Aragão e Araújo, 2008).
A sensibilidade de organismos varia entre grupos, até mesmo entre espécies (Knie e Lopes, 2004). O filo Arthropoda tem se mostrado sensível em relação a outros invertebrados (Mollusca, Annelida), em destaque a ordem Cladocera (por exemplo, para substâncias metálicas e orgânicas, Wogram e Liess, 2001 em uma compilação de dados). Tais descobertas justificam estudos de investigação de sensibilidade para diferentes espécies, principalmente dentro da ordem Cladocera, já que eles são recomendados como organismos-teste, sendo inclusive alguns gêneros como Daphnia e Ceriodaphnia já estabelecidos para estudos ecotoxicológicos (ABNT, 2003a, 2003b). Nos anos 50 e 60, vários países europeus, Estados Unidos e Canadá começaram a selecionar organismos representantes da biocenose para serem utilizados como organismo-teste e naturalmente, deram preferência às espécies nativas destas regiões. A experiência destes países foi disseminada para todo o mundo e algumas das espécies se tornaram conhecidas e utilizadas internacionalmente (Environmental Canada, 1990, 2000 e 2007; USEPA, 2002).
Porém, partindo do princípio que somente as espécies representativas da região podem detectar, de forma plausível, problemas nos ecossistemas a que pertencem, deu força à ideia de investimentos em espécies nativas como organismo-teste. Por este motivo, algumas espécies foram estudadas no Brasil (C. silvestrii e D. laevis, Fonseca, 1991), e em outras regiões tropicais (C. rigaudii, Hong et al., 2004; Mohammed e Agard, 2006 e 2007; Mohammed, 2009).
Desta forma, devido à importância que C. cornuta exerce na estrutura e funcionamento dos ecossistemas tropicais, somado a recomendação do gênero como organismos-teste, bem como as impossibilidades em se comparar estatisticamente com dados da literatura
por causa de fatores de interferências e os registros de sensibilidade de espécies tropicais superiores a de exóticas; a proposta deste trabalho é estudar o potencial desta espécie como organismo-teste, comparando sua sensibilidade e características biológicas às de duas espécies já padronizadas, nacionalmente (Ceriodaphnia silvestrii) e internacionalmente (Ceriodaphnia dubia).
Ceriodaphnia silvestrii Daday, 1902 é um microcrustáceo zooplanctônico, com 0,8mm a 0,9mm de comprimento (ABNT, 2003b), podendo alcançar 1mm (Fonseca e Rocha, 2004), sendo considerada pequena em relação a outros organismos da ordem Cladocera (Fonseca e Rocha, 2004). A importância ecológica da espécie é sua atuação como consumidor primário na cadeia trófica aquática e por consumir material orgânico particulado. Assim como Daphnia laevis, C. silvestrii foi estudada e testada em estudos ecotoxicológicos, de forma que pudesse substituir as de regiões temperadas, por mostrar ser igual ou mais sensível (Fonseca, 1991).
Ceriodaphnia dubia Richard, 1894 é um outro microcrustáceo zooplanctônico, que apresenta 0,8mm a 0,9mm de comprimento (ABNT, 2003b). Também se caracteriza como consumidor primário em águas doces. Assim como Daphnia similis e Daphnia magna, C. dubia é uma das espécies padronizadas internacionalmente como organismo-teste para estudos ecotoxicológicos (Environmental Canada, 2007).
Ceriodaphnia cornuta apresenta o corpo arredondado e pequeno, com tamanho compreendido entre 0,35mm e 0,60mm (Villalobos e Gonzáles, 2006). Juntamente com Moina micrura e Diaphanosoma excisum, é um dos três cladóceros mais abundantes e de ampla distribuição em águas doces tropicais (Fernando, 1980); com uma marcada alternância de dominância entre elas nos corpos d’água tropicais (Margalef, 1983). Dessas espécies, somente C. cornuta é representante da família Daphnidae.
A espécie é bem distribuída em toda região tropical, entre as latitudes 23°S a 23°N do globo, com registros nos cinco continentes, incluindo Brasil (Tabela 1). Além disso, há ocorrências em latitudes maiores, abaixo de 35°S (Fernando, 1980). Junto com Bosminopsis deitersi, e algumas espécies de Daphnia, C. cornuta é considerada um típico zooplâncton brasileiro (Arcifa, 1984).
4 Tabela 1- Registro da ocorrência de Ceriodaphnia cornuta no mundo, extraído de Villalobos e González (2006).
Com base no exposto acima, foram considerados os objetivos e hipóteses para este estudo, descritos a seguir.
Objetivos
Os objetivos deste trabalho foram testar a sensibilidade de C. cornuta ao cloreto de sódio (NaCl), dodecil sulfato de sódio (C12H25SO4Na) e amostras de água do reservatório da Pampulha, para verificar seu potencial como organismo-teste em estudos ecotoxicológicos. Além disso, procurou-se obter informações quanto a aspectos reprodutivos e longevidade desta espécie no contexto individual e populacional, comparando-a a Ceriodaphnia silvestrii e Ceriodaphnia dubia, já padronizadas.
Hipóteses de trabalho
Ho= não existem diferenças entre sensibilidade, reprodução e longevidade de C. cornuta em relação à C. silvestrii e C. dubia.
Ha= existem diferenças entre sensibilidade, reprodução e longevidade de C. cornuta em relação à C. silvestrii e C. dubia.
O estudo realizado gerou três capítulos considerados a seguir:
Capítulo 1: Avaliação do potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi como organismo-teste em estudos ecotoxicológicos, utilizando parâmetros biológicos: uma comparação congênere.
Capítulo 2: Avaliação do potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi como organismo-teste em testes de toxicidade aguda e crônica: comparação congênere. Capítulo 3: Avaliação do potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi como organismo-teste em estudos ecotoxicológicos na Represa da Pampulha, Minas Gerais.
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Capítulo 1
Avaliação do potencial de Ceriodaphnia cornuta Sars (1885) fa rigaudi
como organismo-teste em estudos ecotoxicológicos, utilizando
parâmetros biológicos: uma comparação congênere
1- Introdução
Cladocera contém 11 famílias e aproximadamente 600 espécies, popularmente conhecidas como pulgas d’água. A maioria vive em águas doces, pertencendo ao plâncton ou aos bentos, mas alguns são intersticiais e planctônicas de águas salgadas. Este é um dos taxa de metazoários dominantes do zooplâncton de águas doces, junto com copépodos e rotíferos (Ruppert et al. 2005).
O tamanho do corpo pode compreender entre 0,25 e 18,0 mm (Ruppert et al. 2005). O ciclo de vida pode apresentar formas assexuadas, por partenogênese, ou sexuadas, caracterizadas pelo aparecimento de machos e formação de ovos. O macho aparece em condições adversas: em altas densidades de indivíduos, baixas temperaturas, redução drástica do nível de água e quando o alimento disponível é de baixa qualidade. Os ovos fertilizados são liberados no ambiente, mas no caso de Daphnidae são mantidos em estruturas especializadas, denominados efípios (Stross e Hill, 1965).
Esta ordem representa um grupo chave na transferência de energia por serem grandes consumidores de algas e detritos e servirem de presas para outros invertebrados e peixes (Villalobos e González, 2006).
Ceriodaphnia cornuta (Figura 1A) é comumente encontrada em águas doces tropicais em altas densidades e dominância (Fernando, 1980; Margalef, 1983), representando um grupo de relevância ecológica. Sendo assim, estudos quanto à biologia da espécie são importantes para subsidiar estudos ecossistêmicos, de manejo e ecotoxicológicos.
[I1iii
[Comprimento
Figura 1- Foto de C. cornuta [A], C. silvestrii [B], C. dubia [C]. (aumento 40x) (Foto: Ribeiro, 2 011).
989,0µm
A B C
742,6µm 460,5µm
8 Na década de 80, os estudos sobre ciclo de vida, taxa de crescimento e tamanho de corpo de espécies pertencentes a corpos de água tropicais eram considerados insuficientes para estabelecimento de boas estimativas quanto às interações tróficas do zooplâncton. Neste contexto, algumas espécies, naquela época, foram consideradas prioritárias, dentre elas, C. cornuta (Dumont e Tundisi, 1984), principalmente com foco na comparação com outros dafinídeos (Dehui, 1989). Após isto, alguns estudos foram realizados reportando ciclos de vida de espécies tropicais (C. silvestrii e Daphnia laevis, Fonseca, 1991; Diaphanosoma birgei e C. silvestrii, Rietzler, 1998; Moina micrura e Diaphanosoma birgei, Sipaúba-Tavares e Bachion, 2002; D. laevis e C. silvestrii, Jaconetti, 2005; C. silvestrii, Santos et al., 2006), mas poucos trabalhos deles foram referentes a C. cornuta (Dehui, 1989; López, 2008 e Mohammed, 2009).
Aspectos do ciclo de vida como longevidade e fecundidade, podem servir como subsídios aos estudos de crescimento populacional, pelo fato deles apresentarem as diferentes estratégias utilizadas pelas espécies como forma de garantir sua manutenção no ambiente.
O crescimento de uma população depende de quatro fatores: nascimento, morte, imigração e emigração. Porém sob condições experimentais, são excluídos os movimentos migratórios, e o crescimento populacional decorre basicamente da relação entre natalidade e mortalidade (Gotelli, 2009). Uma forma de mensurar o crescimento populacional é calculando a taxa intrínseca de tamanho populacional, r, o qual mede o crescimento sobre um curto intervalo de tempo por indivíduos, sendo, portanto uma medida per capita. Este valor varia entre espécies (Gotelli, 2009) e pode ser atribuído ao tamanho do corpo (Peters, 1986). Um aspecto importante de uma população que cresce exponencialmente é o tempo de duplicação, relacionado à taxa intrínseca de aumento populacional, que contribui para o entendimento do “turnover” populacional (Gotelli, 2009).
Do ponto de vista ecotoxicológico, estudos desta natureza são imprescindíveis para a análise da viabilidade de certas espécies para uso como organismos-teste, uma vez que precisam atender requisitos biológicos, como, possuir curto ciclo de vida e alta fecundidade (Domingues e Bertoletti, 2008).
O presente capítulo apresenta aspectos do ciclo de vida individual e populacional de Ceriodaphnia cornuta, comparando-os com os de duas espécies de cladóceros já padronizadas para estudos ecotoxicológicos: C. silvestrii (nativa – Figura 1B) e C. dubia (exótica – Figura 1C).
No contexto populacional, foram comparadas as densidades populacionais e o tempo de duplicação das populações.
2- Material e Métodos
2.1- Água de cultivo
A água de manutenção dos cultivos foi captada em uma mina localizada no bairro Horto, em Belo Horizonte e armazenada no laboratório em galões plásticos, para serem utilizadas em até 10 dias. Parâmetros físicos e químicos, incluindo pH, condutividade elétrica, oxigênio dissolvido e dureza foram monitorados no laboratório. Os valores encontrados estiveram na faixa de 6,5; 160-180µS cm-1; 6,0mg L-1 e 32,0-36,0mg CaCO3 L-1 respectivamente (Tabela1/Anexo1).
2.2- Manutenção dos Cultivos
Os cultivos utilizados nos experimentos foram mantidos em béqueres contendo 1 litro de água de cultivo e alimento, sendo armazenados em estufas com temperatura e fotoperíodo controlados. O monitoramento, realizado três vezes por semana, consistiu na retirada de neonatas, troca de aproximadamente 80% do volume de água e reposição de alimento. As espécies tropicais (C. silvestrii e C. cornuta) foram mantidas a 25±1°C, enquanto C.dubia a 23±1°C. Para todas foi considerado o fotoperíodo de 12 horas. Como alimento, utilizou-se a clorofícea Pseudokirchneriella subcapitata à concentração de 2x105cél mL-1 e 1mL L-1 de um composto de ração de peixe e levedura (RL).
10
2.3- Estudo do ciclo de vida de Ceriodaphnia spp
O estudo experimental considerou 10 fêmeas (6-24 horas de vida) de Ceriodaphnia cornuta, Ceriodaphnia silvestrii e 8 fêmeas de Ceriodaphnia dubia, que foram individualizadas em béqueres de 25 mL, organizados em bandejas, mantidas em estufas a uma temperatura de 24±1°C e fotoperíodo de 12 horas (Figura 2). As fêmeas foram cultivadas em 20mL de água de cultivo e alimentadas com Pseudokirchneriella subcapitata (2x105cél mL-1),além de 1mL L-1 do composto de ração de peixe e levedura (RL). O monitoramento dos experimentos, com troca de água e reposição de alimento, foi realizado diariamente até a 5a reprodução, e em dias alternados, na seqüência, até se completar o ciclo de vida.
No contexto individual, consideraram-se as seguintes variáveis para a comparação entre as espécies:
- Tempo de aparecimento da primípara; - Fecundidade média da primípara; - Longevidade;
- Número de ninhadas produzidas durante o ciclo de vida por fêmea; - Número médio de neonatas por ninhada por fêmea;
- Fecundidade média;
- Total de neonatas produzidas pelas fêmeas;
Para isto, foi testada a normalidade, pelo teste Shapiro Wilks. Os dados que apresentaram distribuição normal foram analisados por ANOVA e Teste de Tukey e os de distribuição não-normal por Kruskal-Wallis, todos do programa SAS v8.
Figura 2- Experimento individual para Ceriodaphnia spp.
2.4- Crescimento Populacional
No contexto populacional, foram comparadas as densidades populacionais e o tempo de duplicação das populações. A metodologia utilizada neste experimento foi a mesma adotada por Fonseca (1991), com modificações.
Inicialmente, 30 fêmeas de cada espécie, com idade entre 6 e 24 horas, foram cultivadas em béqueres contendo 1 litro de água de cultivo, em réplicas (Figura 3). A alimentação foi composta pela clorofícea Pseudokirchneriella subcapitata à concentração de 2x105cél mL-1 e pelo composto de ração de peixe e levedura (RL), 1mL L-1. Os recipientes foram mantidos em sala de cultivo à temperatura de 24±1ºC e fotoperíodo de 12 horas.
A duração do experimento foi de 15 dias, sendo que no sétimo dia, houve mudança de recipientes, passando-se de béqueres para recipientes de capacidade de dois litros (Figura 4). O monitoramento foi realizado em dias alternados, sendo realizadas contagens de indivíduos, trocas de aproximadamente 80% do volume de água e reposição de alimento. Até o 5º monitoramento, foi realizada a contagem total. A partir do 6º, a população foi estimada, retirando-se três alíquotas de 100mL para contagem dos organismos. Os coeficientes de variação (CV) entre as alíquotas foram calculados, e ao exceder 10%, mais alíquotas foram retiradas de modo que o CV não ultrapassasse o valor estabelecido.
12 A taxa intrínseca de crescimento populacional (r) foi calculada pelo programa Origen (Microcal Origen 6.0) através do ajuste da curva exponencial, de acordo com a equação descrita em Birch (1948):
Nt= N0 ert Em que: Nt= número de organismos no tempo t. N0= número de organismos no tempo 0.
r= taxa de crescimento. T= tempo.
O tempo de duplicação da população, um parâmetro relacionado ao r, foi calculado de acordo com a equação descrita em Gotelli (2009):
t d= ln (2) r -1
Figura 3- Experimento populacional durante a primeira semana.
Figura 4- Experimento populacional mantido em cubas na segunda semana.
3- Resultados
3.1- Experimento individual para obtenção dos dados do ciclo de vida
de Ceriodaphnia spp
O teste de Kruskal-Wallis não mostrou diferenças entre as espécies em relação ao tempo de aparecimento da primípara (p=0,403), sendo os tempos de 3,8±0,4; 4,0±0; 4,1±0,8dias para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, respectivamente (Tabela 1). O teste Kruskal-Wallis novamente não mostrou diferenças entre as espécies em relação ao número de neonatas das primíparas (p=0,067), sendo a média de 3,5±1,6; 2,6±0,7 e 2,6±0,9neonatas para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, respectivamente (Figura 5 A2 B2, C2).
A longevidade da menor espécie, C. cornuta, foi significativamente menor que as demais (p=0,000) assumindo o valor de 20,6±8,8 em contraposição à C. silvestrii e C. dubia que tiverem longevidade de 33,8±5,3; 34,5±4,5dias, respectivamente (Tabela 1). O tempo mínimo foi de dez dias, com duas mortes, e máximo de quarenta, única sobrevivente, para C. cornuta. Houve uma morte em 22 dias e as quatro últimas em 38, para C. silvestrii e duas em 30 dias e única sobrevivente até 42° dia para C. dubia (Figura 6).
As 10 fêmeas de C. cornuta produziram 340 neonatas em todo ciclo de vida e 68 ninhadas, alcançando uma média de 34,0±14,7 neonatas, 6,8±2,9 ninhadas, com uma média de 4,6±1,7 neonatas por ninhada por fêmea (Tabela 1).
Para C. silvestrii, uma espécie de maior tamanho, a produção total de neonatas, considerando as 10 fêmeas, foi de 1112 e 165 ninhadas. A média de neonatas por fêmea foi de 111,2±22,7 e de ninhadas por fêmea foi 16,5±3,2, de forma que a média de organismo por ninhada por fêmea foi de 6,4±2,4 (Tabela 1).
Para C. dubia, também maior em tamanho comparada à C.cornuta, verificou-se, para as 8 fêmeas, uma produção total de 800 neonatas e 126 ninhadas, sendo as médias de 100,0±29,0 neonatas por fêmea e 15,8±3,5 ninhadas e 6,1±1,7 organismos por ninhada (Tabela 1).
14 As diferenças entre o número de neonatas por fêmea e número de ninhadas de C. cornuta foram estatisticamente diferentes em relação às demais espécies, pelo teste ANOVA (p= 0,000) e Kruskal Wallis (p=0,000).
O tempo de aparecimento da primípara para C. cornuta foi semelhante às demais. Porém, os resultados mostraram que C. cornuta, menor espécie, apresentou menor longevidade, bem como menores produção de neonatas no ciclo de vida, ninhadas e tamanhos de ninhadas.
As diferenças estatísticas de C. cornuta em relação às outras refletem as próprias características biológicas de um organismo pequeno, para o qual se espera menor reprodução e longevidade.
Os dados dos parâmetros físicos e químicos monitorados durante o experimento encontram-se na Tabela 2/Anexo 1.
Figura 5- Média de neonatas produzidas durante o ciclo de vida por [A1] C. cornuta, [B1] C. silvestrii e [C1] C. dubia e média de neonatas por ninhada durante todo o experimento para [A2] C. cornuta, [B2] C. silvestrii e [C2] C. dubia.
Tempo (dias) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 N úm er o de n eo na ta s -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14
A1
Tempo (dias) 0 5 10 15 20 25 30 N úm er o de n eo na ta s 0 2 4 6 8 10 12 14 16 B1 1 2 3 4 5 6 7 8 N eo na ta s 0 2 4 6 8 10 12 14A2
Tempo (dias) 0 5 10 15 20 25 30 35 N úm er o de n eo na ta s -2 0 2 4 6 8 10 12 14C1
Ninhadas 5 10 15 20 N eo na ta s 0 2 4 6 8 10 12C2
5 10 15 20 N eo na ta s 0 2 4 6 8 10 12 14B2
16 Figura 6: Sobrevivência de C. cornuta [A], C. silvestrii [B] e C. dubia [C].
Idade (dias) 0 5 10 15 20 25 30 L n da s ob re vi vê nc ia -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0
A
Idade (dias) 0 10 20 30 40 L n da s ob re vi vê nc ia -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0B
Idade (dias) 0 10 20 30 40 50 L n da s ob re vi vê nc ia -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0C
Figura 7: Média acumulada de produção de neonatas para [A] C. cornuta, [B] C. silvestrii e [C] C. dubia. Ninhadas 1 2 3 4 5 6 7 8 M é d ia a c u m u la d a d e n e o n a ta s 0 10 20 30 40 50 60
A
Ninhadas 0 5 10 15 20 M éd ia a cu m ul ad a de n eo na ta s 0 20 40 60 80 100 120 140 160B
Ninhadas 0 5 10 15 20 M éd ia a cu m ul ad a de n eo na ta s 0 20 40 60 80 100 120 140 160C
A
Tabela 1: Parâmetros do ciclo de vida de Ceriodaphnia spp.
Parâmetros Média Mínimo Máximo Média Mínimo Máximo Média Mínimo Máximo
Idade Primípara-dias 3,8 ±0,4 3 4 4,0±0,0 4 4 4,1±0,8 3 5 Idade da 2ª reprodução-dias 5,5±0,5 5 6 5,5±0,5 5 6 5,9±0,8 5 7 Idade da 3ª reprodução-dias 7,1±0,6 6 8 7,0±0,0 7 7 7,4±1,1 6 9 Idade da 4ª reprodução-dias 9,2±1,1 8 11 9,0±0,0 9 9 9,1±0,8 9 10 Idade da 5ª reprodução-dias 10,1±0,4 10 11 10,0±0,0 10 10 10,6±0,9 10 12 Longevidade-dias 20,6±8,8 10 40 33,8±5,3 22 38 34,5±4,5 30 42
Neonatas Primípara-n° neonatas 3,5±1,6 2 5 2,6±0,7 2 4 2,6±0,9 1 4
Neonatas 2ª reprodução-n° neonatas 7,4±0,8 6 9 6,4±0,8 5 8 5,0±1,9 3 8
Neonatas 3ª reprodução-n° neonatas 7,1±2,2 5 10 9,7±1,6 8 13 7,5±3,1 2 11
Neonatas 4ª reprodução-n° neonatas 6,0±3,5 1 12 5,8±3,2 2 12 7,4±2,6 2 9
Neonatas 5ª reprodução-n° neonatas 6,0±3,3 1 11 11,3±1,5 9 14 7,4±2,3 6 9
Média de Neonatas/ninhada/fêmea 4,6±1,7 2,0 7,0 6,4±2,4 2,2 11,3 6,1±1,7 2,6 8,4 Média de ninhadas/fêmea 6,8±2,9 4 14 16,5±3,2 11 20 15,8±3,5 10 20 Toral de Ninhadas 68,0 - - 165,0 - - 126,0 - -Média de neonatas/fêmea 34,0±14,7 17 66 111,2±22,7 86 144 100,0±29,0 59 135 Total de neonatas 340 - - 1112 - - 800 - -C. dubia C. cornuta C. silvestrii
3.2- Crescimento Populacional de Ceriodaphnia spp
As taxas intrínsecas de crescimento populacional foram calculadas considerando-se a variável t obtida da regressão exponencial (Figura 8). Sendo o valor de r inversamente proporcional ao de t, as taxas calculadas corresponderam a 0,37; 0,31 e 0,30 para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, respectivamente.
Diferenças estatisticamente significativas (ANOVA) foram verificadas quanto ao tamanho populacional após 15 dias, correspondente a 9080, 4338 e 2885 indivíduos para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia respectivamente, (p=0,003). O teste de Tukey mostrou diferença significativa de C. cornuta em relação às outras, não havendo diferenças entre C. silvestrii e C. dubia.
Os tempos de duplicação das populações foram calculados em função de r, obtendo-se 1,8; 2,2 e 2,3 dias para C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia, respectivamente.
Os parâmetros físicos e químicos medidos durante os testes se encontram na Tabelas 3 do Anexo 1.
20 Figura 8- Curvas de Crescimento populacional de Ceriodaphnia cornuta, C. silvestrii e C. dubia no período de 15 dias.
C. silvestrii Modelo: y0+Ae(x/t) R2 = 0.98149 y0 0 ±0 A 77.26606 ±27.25277 t 3.19802 ±0.29382 C. cornuta Modelo: y0+Ae(x/t) R2 = 0.98393 y 0 0 ±0 A 71.5143 ±30.91698 t 2.66881 ±0.24674 C. dubia Modelo: y0+Ae(x/t) R2 = 0.97075 y0 0 ±0 A 63.47225 ±26.25901 t 3.361 ±0.38263
0
2
4
6
8
10
12
14
0
2000
4000
6000
8000
10000
0
2
4
6
8
10
12
14
0
2000
4000
6000
8000
10000
0
2
4
6
8
10
12
14
0
2000
4000
6000
8000
10000
C. dubiaT
a
m
a
n
h
o
P
o
p
u
la
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io
n
a
l
(n
ú
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e
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e
i
n
d
.)
Tempo (dias)
C. cornuta C. silvestrii4- Discussão
4-1 Análises dos Ciclos de vida para Ceriodaphnia spp
Os resultados mostraram uma menor longevidade de C. cornuta em relação às outras espécies e semelhança em relação ao tempo das primíparas. O menor tamanho de corpo de C. cornuta, entre 0,35 e 0,6mm (Villalobos e Gonzáles, 2006) em comparação à C. silvestrii e C. dubia, 0,6 a 0,8mm (ABNT, 2003) pode explicar sua menor longevidade, já que organismos menores tendem a viver menos (Speakman, 2005). Já D. magna, um dafinídeo grande que alcança tamanho de corpo de 5,0 a 6,0mm (EPA, 2002) pode viver de 65 a 120dias, dependendo do alimento utilizado (Pietrzak, 2010). Em relação à reprodução, C. cornuta produziu menos neonatas, ninhadas e número de neonatas por ninhada que C. silvestrii e C. dubia, como reflexo de menores longevidade e tamanho de corpo de C. cornuta. Para organismos menos longevos, espera-se uma menor produção de ninhadas e consequentemente menor número de neonatas em todo ciclo de vida. Uma menor fecundidade também pode ocorrer pela própria limitação do tamanho do corpo, com câmaras incubadoras menores gerando menos indivíduos ou indivíduos menores (Peters, 1986).
Os parâmetros biológicos também são influenciados por fatores bióticos como qualidade e concentração do alimento, os quais podem interferir positivamente ou negativamente no número de ovos produzidos por ninhada (Hong et. al, 2004). Considerando esta relação em uma população natural, tal parâmetro pode estar relacionado com a manutenção dos ciclos populacionais. Neste contexto, Pinto-Coelho e colaboradores (2003) mostraram limitações alimentares como evidências do declínio da população de D. laevis no reservatório da Pampulha, devido a dominância de cianobactérias, conhecidas por baixo valor nutricional. A exposição a baixas concentrações do alimento, afasta o organismo do ótimo das condições ambientais, comprometendo atividades metabólicas relacionadas à reprodução e sobrevivência (Ricklefs, 2001).
No presente estudo, adotou-se Pseudokirchneriella subcapitata como fonte de alimento na concentração de 2x105cél mL-1, considerando-a ideal para as três espécies estudadas. Entretanto, talvez não tenha sido uma fonte ideal para C.cornuta, a menor das três espécies utilizadas, refletindo em uma menor longevidade e principalmente menor fecundidade nos experimentos individuais. Por outro lado, verificou-se que acréscimos
22 nas concentrações do alimento, Chlorella vulgaris, podem surtir efeitos não esperados, como levar a uma queda na reprodução, explicado em razão do aumento do gasto energético despendido pelos cladóceros (Ceriodaphnia cornuta, Moina macrocopa, Pleuroxus aduncus, Simocephalus vetulus) para limpeza de apêndices torácicos entupidos (Nandini e Sarma, 2000). Estes autores, entretanto, não consideraram o ótimo alimentar, sugerindo mais trabalhos a respeito.
De acordo com a Tabela 2, o tempo de primípara e a longevidade de C. cornuta foram semelhantes aos dados encontrados por Dehui (1989) a 25°C, diferindo, entretanto, quanto à reprodução, uma vez que o referido autor verificou ninhadas maiores que resultaram em uma maior produção de neonatas em todo ciclo de vida utilizando ração de peixe, farinha de trigo e milho como fonte de alimento.
O tempo de primípara também foi semelhante ao do estudo realizado por López (2008), para organismos alimentados com P. subcapitata a uma concentração de 1,3x106cél mL -1 a temperatura de 25°C (Tabela 2). Entretanto, foi menor no presente estudo, quando comparado a outras fontes de alimento (C. vulgaris e A. falcatus, respectivamente), com diferenças de 1 e 2 dias. Em relação à longevidade, foi superior apenas a de organismos alimentados com C. vulgaris, a qual foi considerada uma fonte alimentar pouca nutritiva. Neste contexto, outros estudos também mostraram diferenças na reprodução e longevidade de cladóceros em função da fonte de alimento (Rietzler, 1998; Santos et.al., 2006).
Tabela 2: Dados da literatura relacionados à reprodução e longevidade de cladóceros, sob diferentes condições de cultivo.
Espécie Temperatura Alimentação Idade Primípara N° ninhada N° ovos/ninhada Neonatas/fêma Longevidade Autor
C. cornuta 25±1°C Ração 4,26 - 6,21 (10-15) 49,7 19 Dehui (1989)
C. cornuta 22±2°C Pseudokirchneriella subcapitata (diluição 2,1) - - 4±0,7 - - Hong et al. (2004)
C. cornuta 22±2°C Pseudokirchneriella subcapitata (diluição 4,3) - - 3±0,7 - - Hong et al. (2004)
C. cornuta 22±2°C Pseudokirchneriella subcapitata (diluição 6,0) - - 2±0,7 - - Hong et al. (2004)
C. cornuta 20°C Chlorella vulgaris ±10 ±3 3 10 15 López (2008)
C. cornuta 20°C Ankistrodesmus falcatus ±12 ±11 3 35 34,8 López (2008)
C. cornuta 20°C Pseudokirchneriella subcapitata ±11 ±7 3 25 48,2 López (2008)
C. cornuta 25°C Chlorella vulgaris ±5 ±3 6 20 13,5 López (2008)
C. cornuta 25°C Ankistrodesmus falcatus ±6 ±7 5 45 30,7 López (2008)
C. cornuta 25°C Pseudokirchneriella subcapitata ±4 ±6 7 40 26,6 López (2008)
C. silvestrii 20±1°C Alimento natural 5,45±0,44 3 a 8 2,02±0,93/ 5 (máximo) 8,78±3,23 21,00±3,71 Rietzler (1998)
C. silvestrii 25±1°C Alimento natural 4,50±0,53 5 a 11 4,13±2,2/ 11 (máximo) 32,00±17,14 17,22±2,86 Rietzler (1998)
C. silvestrii 25±2°C Pseudokirchneriella subcapitata - - 9 (máxima) 114,55 35 Jaconetti (2005)
C. silvestrii 25±1°C Monoraphidium dybowskii - - 9,46±4,17 - 29,8 Fonseca e Rocha (2004)
C. silvestrii 25±1°C Scenedesmus lijugus 2,63 - 107,07 28,8 Santos et al. (2006)
C. silvestrii 25±1°C Chlorella lacustris 4,21 - 91,83 36,00 Santos et al. (2006)
C. pullchela 20±1°C ASTM - S. capricornutum ±8 - - - ±32 Abrantes e Gonçalves (2003)
C. pullchela 20±1°C Água lagoa (filtro) sem S. capricornutum ±8 - - - ±41 Abrantes e Gonçalves (2003)
C. pullchela 20±1°C Água lagoa (rede) sem S. capricornutum ±5 - - - ±30 Abrantes e Gonçalves (2003)
D. laevis 25±1°C Monoraphidium dybowskii - - 4,7±3,37 - 28,1±2,71 Fonseca (1991)
D. laevis 25±2°C Pseudokirchneriella subcapitata - - 17-19 (máxima) 129,7 21 Jaconetti (2005)
D. birgei 20±1°C Alimento natural 7,19±2,29 1 a 7 1,57±0,50/ 2 (máximo) 6,28±3,35 20,83±3,37 Rietzler (1998)
D. birgei 25±1°C Alimento natural 3,17±0,41 2 a 9 2,39±0,93/ 4 (máximo) 11,83±5,98 10,86±4,91 Rietzler (1998)
D. birgei 25±1°C alga - 6,17 7,16 - 14 Sipaúba-Tavares e Bachion (2002)
D. birgei 25±1°C alga + vitamina - 10,08 8,15 - 16 Sipaúba-Tavares e Bachion (2002)
D. birgei 25±1°C alga + ração - 5,46 6,73 - 13 Sipaúba-Tavares e Bachion (2002)
D. birgei 25±1°C alga+ vitamina+ ração - 7,65 8,66 - 16 Sipaúba-Tavares e Bachion (2002)
M. micrura 25±1°C alga - 2,3 5,37 - 5 Sipaúba-Tavares e Bachion (2002)
M. micrura 25±1°C alga + vitamina - 2,83 8,63 - 5 Sipaúba-Tavares e Bachion (2002)
M. micrura 25±1°C alga + ração - 3,97 5,78 - 6 Sipaúba-Tavares e Bachion (2002)
M. micrura 25±1°C alga+ vitamina+ ração - 3,05 7,1 - 5 Sipaúba-Tavares e Bachion (2002)
C. cornuta 24±1°C Pseudokirchneriella subcapitata + RL 3,8 6,8 4,6 34 20,6 Presente trabalho
C. silvestrii 24±1°C Pseudokirchneriella subcapitata + RL 4 16,5 6,4 111,2 33,8 Presente trabalho
C. dubia 24±1°C Pseudokirchneriella subcapitata + RL 4,1 15,8 6,1 100 34,5 Presente trabalho
S. acutirostratus 28-30°C - - - - 248 44 Murugan e Sivaramakrishnan (1976)
D. carinata king 28-30°C - - - - 142 24 Murugan e Sivaramakrishnan (1976)
S. kingi 28-30°C - - - - 239 20 Murugan e Sivaramakrishnan (1976)
M. micrura 28-30°C - - - - 61 13 Murugan e Sivaramakrishnan (1976)
M. macrocopa 25°C variado - - - 23 14-22 (Kumar e Hwang, 2008).
24 Considerando experimentos sob temperatura controlada e ausência de predadores, as diferenças nos tipos e concentrações de alimento constituem os principais fatores nas divergências quanto a reprodução (incluindo a idade da primípara) e longevidade, como observado por Rietzler (1998), para Ceriodaphnia silvestrii e Diaphanosoma birgei Abrantes e Gonçalves (2003) para Ceriodaphnia pullchela e Santos et al. (2006) para Ceriodaphnia silvestrii.
Em relação a parâmetros biológicos, Ankistrodesmus convolutus, foi recomendada como fonte alimentar para Ceriodaphnia (Cowgill et al., 1985), além de Pseudochirneriella. subcapitata e Chlamydomonas reinhardtii (LaRocca et al. 1994), espécies já recomendadas em estudos ecotoxicológicos por órgãos internacionais (Environmental Canada, 1990).
Considerando-se outros cladóceros cosmopolitas, as espécies Scapholeberis kingi e Daphnia carinata (Murugan e Sivaramakrishnan, 1976) apresentaram longevidade semelhante a C. cornuta e, portanto menor que C. silvestrii e C. dubia, mas apresentaram ninhadas maiores resultando em maior produção total. Segundo o mesmo autor, Moina micrura apresentou menor longevidade e maior produção em relação à C. cornuta e menor longevidade e reprodução que C. silvestrii. Já Simocephalus acutirostratus apresentou maior longevidade e reprodução (Murugan e Sivaramakrishnan, 1976).
Em relação à cladóceros tropicais, Moina macrocopa mostrou longevidade e reprodução próximas a C. cornuta, correspondendo a 20,5dias ou entre 14 e 22 dias dependendo da alimentação e 23,5 neonatas produzidas em média a 20°C (Kumar e Hwang, 2008). Já Pseudosida ramosa, segundo Freitas e Rocha (2006), mostrou longevidade de 37,1dias, tempo de primípara de 8,34 dias e fecundidade média de 38,8, sendo este último dado próximo ao valor encontrado para C. cornuta no presente trabalho. É importante lembrar que P. ramosa é uma espécie maior que as espécies estudadas, e, portanto, seria esperado que ela apresentasse maior longevidade que C. cornuta, C. silvestrii e C. dubia.
De maneira geral, C. cornuta apresentou alguns parâmetros do ciclo de vida (número de ovos por ninhada e ninhadas) semelhantes a outros dados da literatura para outros cladóceros (Sipaúba-Tavares e Bachion, 2002; Rietzler, 1998). Por outro lado, a longevidade de C. cornuta foi menor comparada à C. silvestrii e C. dubia no presente
estudo bem como a outros estudos conduzidos com cladóceros (Fonseca, 1991; Abrantes e Gonçalves, 2003; Fonseca e Rocha, 2004; Jaconetti, 2005; Santos et al. 2006) (Tabela 2). A busca por espécies com curto ciclo de vida, que possam ser utilizadas como organismos-teste, é importante para a Ecotoxicologia, pois esta característica permite estudos completos de todas as fases da vida do organismo, garante rápida reprodução além de possibilitar a manutenção de várias gerações para estudos de bioacumulação, por exemplo.
A baixa qualidade e concentração alimentar, bem como a presença de substâncias tóxicas podem interferir nos parâmetros biológicos. No presente trabalho, dois experimentos individuais com contaminação de íons ferroso e férrico (Fe+2, Fe+3) foram conduzidos para as três espécies. Foram calculadas, para cada espécie, médias de tempo e número de neonatas para a primípara, total de ninhadas e neonatas, média de neonatas por ninhada e longevidade.
A longevidade e os parâmetros reprodutivos (número de ninhadas, número de neonatas) foram menores para as três espécies, tanto do primeiro teste em relação ao segundo, quanto em relação aos não expostos a ferro (Tabela 4, 5 e 6/Anexo1). Gama-Flores e colaboradores (2007) relacionaram a diminuição na longevidade de C. dubia com aumento nas concentrações de cobre e aumento no tempo de exposição deste metal aos organismos. Considerando a reprodução, aumentos no tempo de exposição implicaram em decréscimos na reprodução. E ao contrário, baixas e médias concentrações de cobre e baixos tempos de exposição aumentaram a taxa de reprodução bruta.
Os parâmetros sobrevivência/mortalidade são considerados importantes medidas para entendimento de variáveis da história de vida, como taxa líquida de reprodução, taxa intrínseca de crescimento populacional, que nem sempre são igualmente sensíveis a um dado estresse ambiental. A taxa de reprodução, p.ex., pode representar uma sensível medida de estresse em exposições a cádmio (Nandini et al., 2004). No presente trabalho, tanto a longevidade quanto a produção de neonatas foram aparentemente mais sensíveis que os tempos de reprodução, principalmente considerando-se o primeiro em relação ao segundo teste. Esta diferença possivelmente ocorreu pelo fato dos organismos do segundo teste estarem mais susceptíveis, pois foram produzidos a partir de culturas expostas ao metal por mais tempo que o primeiro teste (exposição crônica).
26 É possível que os íons ferro possam ter agido de duas formas sobre os organismos, uma direta, adsorvido à matéria orgânica presente nas partículas do alimento, ou indireta, através de células de P. subcapitata sob estresse do metal , tornando-se biodisponíveis (Rainbow, 2002) e aumentando o potencial de se acumularem nos organismos.
A exposição ao ferro dissolvido pode causar danos lipídicos e estresse oxidativo a células de P. subcapitata (Aránguiz e Gaete, 2009). Além disso, são conhecidas ações de metais pesados (cobre e cádmio) na toxicidade em microalgas, provocando diminuição nas taxas de crescimento populacional (Pitocchi et. al, 2000) e dentre as causas atribuídas, inclui-se a interferência nas atividades enzimáticas. O zooplâncton, quando se alimenta dessas algas, ingere alimento de baixa qualidade e sofre estresse por fome ou também por absorver o metal presente nas células das algas, acumulando-o no organismo, o que pode justificar as diferenças encontradas na reprodução e longevidade. Outras substâncias químicas, como pesticidas, já foram reportados na literatura como interferentes na reprodução e taxa intrínseca de crescimento populacional. Chen e Stark (2010) mostraram que à medida que se expõem indivíduos de C. dubia em concentrações crescentes de dois pesticidas, observam-se diminuições significativamente nos números de neonatas produzidos por fêmea e nas taxas intrínsecas de crescimento populacional, a qual chega a alcançar valores negativos.
4.2- Crescimento Populacional de Ceriodaphnia spp
Os experimentos controlados de crescimento populacional são realizados de forma que não haja competição por espaço ou alimento, permitindo que a população cresça o que é imprescindível para o estabelecimento da espécie. O r mede a capacidade fisiológica dos organismos em obter uma taxa máxima de crescimento (Birch, 1948).
Nos experimentos realizados, as espécies aproximaram-se de curvas de sobrevivência tipo I (Figura 6 A, B, C), significando alta sobrevivência para idades jovens e idades intermediárias, seguida de alta mortalidade das idades próximas ao máximo, o que pode contribuir para altas densidades populacionais encontradas (Ricklefs, 2001), uma vez que os jovens apresentam grande contribuição para a reprodução, observada pelo
elevado números de neonatas nas cinco primeiras reproduções (Figura 5 A1, B1, C1), durante 12 dias.
Os resultados mostraram alta taxa de crescimento populacional para C. cornuta em relação às outras espécies estudadas, estando de acordo com a lei de Fenchel, em que espécies com pequeno tamanho de corpo assumem maiores taxas de crescimento populacional (Fenchel, 1974). Isso pode ser explicado pela relação taxa metabólica e tamanho de corpo, de forma que, a proporção de energia utilizada para manutenção corporal aumenta com o aumento do corpo levando a uma menor alocação de energia para o crescimento dos organismos.
Analisando os tempos de duplicação (td.), as populações com maiores r apresentaram os menores td. Assim, o tempo de duplicação de 1,8 dias para a população de C. cornuta, implicou em duplicação de sua população mais rapidamente que C. silvestrii (td 2,2) e
C. dubia (td 2,3). Este alto “turnover” gerou elevada densidade de indivíduos no caso de
C. cornuta em relação a C. silvestrii e C. dubia.
O aparecimento de machos pode estar relacionado aos menores valores de r verificados para as populações de C. silvestrii e C.dubia. As elevadas densidades populacionais, principalmente no 11° e 13° dias, pode ter induzido o aparecimento de machos (Rocha e Güntzel, 1999), sendo que o aparecimento da reprodução sexuada na população pode gerar baixos valores de r (Chen e Stark, 2010), em função da formação de ovos de resistência. Embora na análise qualitativa de organismos, retirados ao final do experimento, não tenham sido encontrados efípios, provavelmente eles seriam observados com uma maior duração do experimento.
A literatura apresenta valores de r diferentes do obtido neste trabalho. Para C. cornuta, Dehui (1989) encontrou um valor próximo, 0,40, fornecendo apenas ração em uma concentração três vezes maior que deste trabalho. Já Nandini e Sarma (2000) encontraram valores bem abaixo utilizando a espécie Chlorella vulgaris, como alimento, uma espécie de alga pouco nutritiva. C. vulgaris comprometeu parâmetros reprodutivos de Ceriodaphnia cornuta nos experimentos de López (2008), assim como Abrantes e Gonçalves (2003), que encontraram diferentes valores de r para Ceriodaphnia pulchella, influenciados pela qualidade e quantidade do alimento,
