Estudos estruturais e biofísicos dos receptores nucleares humanos dos hormônios tireoidianos e seus complexos com ligantes isoforma-específicos

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS

Estudos estruturais e biofísicos dos receptores

nucleares humanos dos hormônios

tireoidianos e seus complexos com ligantes

isoforma-específicos

Fábio Macêdo Nunes

Tese apresentada ao Instituto de Física de São Carlos, da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências na área de concentração: Física Aplicada.

Nunes, Fábio Macêdo.

“Estudos estruturais e biofísicos dos receptores nucleares humanos dos hormônios tireoidianos e seus complexos com ligantes isoforma-específicos”

Fábio Macêdo Nunes – São Carlos, 2006.

Tese (Doutorado) – Área de Física Aplicada da Universidade de São Paulo, São Carlos 2006.

2006 - número de paginas: 126 Orientador: Prof. Dr. Igor Polikarpov

1.Receptores Nucleares. 2.Dicroismo circular. 3 Cristalografia.

AGRADECIMENTOS

Ao cientista maior, Pois é dele que provém toda a inspiração e sabedoria para a busca incansável da verdadeira ciência. Longe dos olhos dos assopradores e perto daqueles que podem ver a ciência com olhos e coração de menino. Sem se esquecer que ciência não se restringe a trabalho, resultados, prêmios e reconhecimento, antes tudo deve ser encarada como uma arte e respeitada como tal.

Aos meus pais Fleury Ferreira Nunes e Doralice Macêdo Nunes. Por sempre terem sido um exemplo de Fé, amparo, incentivo, boa vontade, dedicação e tolerância, sem os quais nada do que construí poderia ter sido realizado até hoje!

As minhas duas filhinhas, Rebeca Silva Nunes e Raquel Silva Nunes, que embora ainda tão pequeninas sempre foram compreensivas, mesmo em virtude das dificuldades financeiras, aniversários e tantas outras datas importantes perdidas, enquanto viagens de pesquisa nos afastavam em muitos quilômetros.

Aos meus queridos e grandes mestres inspiradores da ciência: Ricardo Chequer Chemas e Caetano Tourinho que sempre me incentivaram e foram exemplo de conduta e ética na ciência, sem contar com a infinita paciência com um jovem cheio de esperança e inexperiência.

Aos pesquisadores e professores Otavio Henrique Thiemann, Richard Charles Garratt e Glaucius Oliva pela eterna boa vontade e continua atenção, mesmo quando se encontravam em meio a correria, as portas estavam sempre abertas.

Ao Professor Dr. Ralf Ribeiro que infelizmente não se encontra mais entre nós! Tão pouco tempo... Suficiente para o entendimento do notável pesquisador professor e grande ser humano que era e sempre será em minha memória.

Ao Professor Dr. Igor Polikarpov pela orientação, amizade, conduta ética e compreensão dos momentos difíceis, sem as quais este trabalho não poderia ter sido realizado. O meu sincero muito obrigado!

A banca examinadora pelas relevantes contribuições e críticas construtivas.

Aos amigos: Hannes Fisher, Rodrigo Villares Portugal, Sandra Martha, José Ribamar dos Santos Ferreira Júnior, Humberto Pereira, Andrei Leitão, Adriana Lucely Rojas, Glauber Silva Godoi, Daniel Ferreira da Silva e Mario de Oliveira Neto.

Aos colegas de luta e trabalho: Maria Auxiliadora Amorim, Santos, Marcos Calgaro, Ricardo Aparício, André Luis Berteli Ambrosio, João Renato Muniz, Lucas Bleicher, Alessandro Nascimento, Ricardo Nicolucci, Napoleão Fonseca Valadares, Sandra Krauchenco e Ana Carolina Migliorini Figueira.

Ao aluno de Iniciação científica: Marcelo Liberato, Pela constante troca de conhecimentos e apoio ao projeto.

Ao corpo Docente e técnico do IFSC, por todo apoio prestado durante estes anos, por quem sempre fui muito respeitado e bem tratado.

Ao CNPq que sempre financiou minha carreira acadêmica. A FAPESP pela auxilio financeiro (processo 99/03387-4).

SUMÁRIO

1 O CAPÍTULO: INTRODUÇÃO AOS RECEPTORES NUCLEARES 1

1.1RECEPTORESNUCLEARES 1

1.2ESTRUTURACANÔNICADOSRECEPTORESNUCLEARES 3

1.3MODELODELIGAÇÃODOLIGANTEAOSÍTIO,“MODELODARATOEIRA” 8

1.4AIMPORTÂNCIADAMOBILIDADEDAHÉLICE12 10

1.5DIMERIZAÇÃODOSLBDS 11

1.6OBOLSODELIGAÇÃO(LBP-LIGANDBINDINGPOCKET) 11

1.7AÇÃODOSRECEPTORESNUCLEARES 12

1.8POTENCIALFARMACOLÓGICODOSRN 15

1.9OBJETIVOS 19

2 O CAPÍTULO: ESTUDOS DE SUB-CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO 20

2.1METODOLOGIA 20

2.2EXPRESSÃODOShTRα1LBD 20 2.3PURIFICAÇÃOPORAFINIDADE(hTRα1LBD) 21

2.4PURIFICAÇÃODOhTRα1LBDPOREXCLUSÃODETAMANHO(GEL FILTRAÇÃO) 22 2.5RESULTADOSEDISCUSSÃO(hTRα1LBD) 23 2.6EXPRESSÃO 23 2.7PURIFICAÇÃO 24 2.8AFINIDADE 24 2.9GELFILTRAÇÃO 25 2.10SUBCLONAGEMDOhTRα2LBD 26

2.11TRANSFORMAÇÃOEME. COLI (BL21DE3) 26

2.12EXPRESSÃODOhTRα2LBD 27 2.13PURIFICACAODOhTRα2LBD 27 2.14TROCAIÔNICA 28 2.15RE-ENOVELAMENTO 29 2.16RESULTADOSEDISCUSSÃO hTRα2LBD 29 2.17SUBCLONAGEMDOhTRα2LBD. 29 2.18EXPRESSÃODOhTRα2LBD 31 2.19EXTRAÇÃOPROTÉICA 32 2.20TROCAIÔNICA 33 3 O CAPÍTULO: CRISTALIZAÇÃO 34 3.1CRISTAIS 34 3.2SOLUBILIDADE 35 3.3FORÇAIÔNICA 37 3.4 PHEÍONS 38 3.5TEMPERATURA 38

3.8METODOLOGIA 41

3.9CRISTALIZAÇÃODO(hTRα1LBD) 41

3.10RESULTADOSEDISCUSSÃO(hTRα1LBD) 42

4 O CAPÍTULO - DIFRAÇÃO DE RAIOS-X E RESOLUÇÃO ESTRUTURAL 48

4.2CRISTALOGRAFIADERAIOS-X 48

4.3DIFRAÇÃOPORUMCRISTAL 49

4.4ALEIDEBRAGG 50

4.5OPROBLEMADAFASE 51

4.6SUBSTITUIÇÃOMOLECULAR 52

4.7CRIOCRISTALOGRAFIA 52

4.8METODOLOGIA 53

4.9EXPERIMENTODECOLETADEDADOSDEDIFRAÇÃO 53

4.10RESOLUCAOESTRUTURALEREFIAMENTODASESTRUTURAS 54

4.11RESULTADOSEDISCUSSÕES 57

4.12VALIDAÇÃODASESTRUTURAS 57

4.13ANÁLISEDOSSÍTIOSDELIGAÇÃO 59

5 O CAPÍTULO: DICROISMO CIRCULAR(CD) 65

5.1DICROISMOCIRCULAR(CD) 65

5.2DETERMINAÇÃODAESTRUTURASECUNDÁRIADEUMAPROTEÍNAPOR CD 66 5.3ESTABILIDADETÉRMICA 67 5.4METODOLOGIA 68 5.5RESULTADOSEDISCUSSÃO 70 6 o CAPÍTULO: CONCLUSÃO 87 6.1CONCLUSÕES 87

6.2CONSIDERAÇÕESFINAISEPERSPECTIVASFUTURAS 87

LISTA DE TABELAS

Tabela-1. Parâmetros e estatísticas de refinamento das estruturas...56 Tabela-2. Parâmetros dos índices de qualidade das estruturas

(Procheck)...58 Tabela-3. Distâncias das interações de hidrogênio

para os receptores hTRα1 e hTRβ1...59

Tabela 4 – Temperaturas do processo de desenovelamento,

frente ao acréscimo de temperatura com seus respectivos Tms...84 Tabela-5. Temperaturas médias (Tms) e entalpia (∆H)

LISTA DE FIGURAS

Figura-1. Ativação da transcrição dos receptores nucleares via ligação do hormônio (ligante), em alguns casos o ligante sofre algumas alterações até se tornar o hormônio definitivo, sendo neste estágio conhecidos como pró-ligante...2 Figura-2. Representação esquemática da organização estrutural e funcional dos receptores nucleares que foram conservadas evolutivamente. Região amino-terminal (A/B) em cinza, altamente variável entre os membros da família, onde se encontra o domínio de transativação independente de ligante AF-1, em azul(C) encontra-se o domínio de ligação ao DNA (DBD), extremamente conservado, em cinza (D) conectando o DBD ao LBD encontra-se a região dobradiça (hinge), que não é conservada, em verde (E) encontra-se o domínio de ligação ao ligante(LBD), conservado entre os membros da família dos RN, que possui na sua região C-terminal o domínio de transativação dependente do ligante AF-2. Em seguida, em cinza a região (F) que encontra-se, em alguns receptores. A região-F é muito variável e ainda não tem sua função bem conhecida...3

Figura-3. Esquema do domínio de ligação ao DNA dos receptores nucleares, com seus dois característicos dedos de zinco e a extensão de sua região C-terminal (CTE). Nos dedos de zinco observa-se quatro cisteínas conservadas, que são coordenadas para cada dedo de zinco. A hélice 1 contém os resíduos da caixa P, que estão envolvidos na discriminação dos elementos responsivos. Os resíduos no segundo dedo de zinco que constituem a caixa D formam a interface de dimerização. A região C-terminal (CTE) contém as caixas T e a que são responsáveis pela ligação da proteína ao DNA em estado monomérico. Como mostrado acima, observa-se o cruzamento das hélices 1 e 2 num ângulo reto, formando a região de reconhecimento do meio-sítio do elemento responsivo...6

Figura-4. Esquema explicativo da composição do domínio LBD conservado na família dos receptores nucleares. Tal comparação é possível devido a similaridade entre o hRXRαLBD(apo) a esquerda e o hRARγ(holo)a direita...7

Figura-5. Representação esquemática do domínio do domínio de ligação ao ligante(LBD) em receptores nucleares. A esquerda se encontra a representação da estrutura do RXRα-apo e a direita a representação do RARγ-holo. Obs: Esta comparação foi possível porque a estrutura terciária do LBD do receptor RARγ e RXRα são bem similares. Observa-se que quando ocorre à ligação do ligante a estrutura do receptor muda, ficando mais compacta, o que fica claro com a modificação da posição da hélice-12 e do C-terminal...9

Figura-6 Ação dos RNs. O ligante migra via membrana plasmática e interage com o respectivo receptor o que pode não ser diretamente no núcleo, pois há a possibilidade de interação no citoplasma, como por exemplo, com kinases (a). Pode haver uma variação da média da localização dos diferentes receptores e que é afetada pela natureza dos ligantes. A interação dos ligantes controla uma diversidade de fatores. Na ausência do ligante, muitos receptores se encontram ligados a regiões reguladoras de genes alvo como co-repressores ou complexos de histonas desacetilase (HDAC) (b). A desacetilação das histonas é responsável pela condensação da cromatina o que explica o efeito do silenciamento do gene nos receptores apo. A ligação do ligante libera o complexo HDAC (c), o que resulta no recrutamento da histona acetil transferase (HAT) e do complexo de remodelação da cromatina (CRM) que promoverá um estado adequado para a acepção do complexo ativador na região onde se encontra ligado o receptor (d). Para finalizar, o mecanismo a polimerase II aloenzima (enzima pol II, TAF-TATA-binding protein-associated factor) e complexos mediadores são recrutados e aumentam a freqüência da iniciação da transcrição(e)...14

Figura-7. SDS-PAGE da expressão do TRα1 a diferentes temperaturas. (M)

Marcador de peso molecular: BSA (67 kD), Ovalbumina (45 kD), Anidrase Carbônia (30kD), Inibidor de Tripsina de Soja (22,4 kD). Poços (1-6) indução da proteína recombinante com IPTG nas temperaturas 1-2 à 14oC, 3-4 à 20oC, 5-6 à 22oC...23 Figura-8. SDS-PAGE. (A) Purificação por afinidade do TRα1LBDna presença de

ligante (T3); (M) Marcador de peso molecular; (1 e 2) alíquotas da lavagem da resina

Talon; (3 e 4) Diferentes aliquotas da eluição da proteína com 500 mM de imidazol. (B) Purificação por afinidade do TRα1LBD na ausência de ligante; (M) Marcador de peso

molecular; (1-5) Diferentes frações de eluição da proteína recombinante na presença de tampão 2 com 500 mM de imidazol, poço 6 alíquota da resina...24

Figura-9. SDS-PAGE. (A) Purificação por gel filtração do TRα1LBD na presença

de ligante (T3); (M) Marcador de peso molecular; (1-7) diferentes frações de eluição. (B) Purificação por gel filtração do TRα1LBD na ausência de ligante. (M) Marcador de peso

molecular; (1-5) diferentes frações de eluição...25 Figura-10. Géis de 1% agarose. (A) Amplificação por PCR do domínio de ligação ao ligante de hTRα2. (pb) 1 Kb Plus DNA Ladder; Poços (1-5) amostras do produto da

amplificação por PCR do hTRα2LBD, seta mostra amplicon de 1026 pb correspondente

ao LBD de hTRα2. (B) Digestão com enzimas de restrição do hTRα2LBD subclonado em

pGEMT. (pb) 1 Kb Plus DNA Ladder, inserto de 1026pb; A seta mostra um inserto de 786 pb correspondente ao LBD de hTRα1 utilizado como parâmetro de avaliação...30

Figura-11. Gel de 1% agarose da subclonagem do hTRα2LBD. (pb) 1 Kb Plus

DNA Ladder; Poço 1 liberação do inserto do hTRα2LBD do pET 28a(+) após digestão

com enzimas de restrição...30 Figura-12. SDS-PAGE. (A) Expressão de TRα2LBD. (M) Marcador de peso

proteína recombinante de 39 kD. (B) Extrato bruto de diferentes colônias de hTRα2LBD

na busca da que melhor expressa a proteína recombinante de 39 kD; No poço 9 hTRα1LBD purificada para comparação com hTRα2LBD...31

Figura-13. SDS-PAGE. Extração com uréia da hTRα2LBD. (M) Marcador de

peso molecular; no poço 2 amostra da lavagem do sedimento; No poço 3 amostra após ressuspender o sedimento em tampão B contendo uréia; no poço 4 alíquota após 8h de extração com tampão B contendo uréia...32 Figura-14- SDS-PAGE. Purificação de hTRα2LBD através de cromatografia de

troca iônica. (M) marcador de peso molecular; Poços (1-4) diferentes frações contendo hTRα2LBD recombinante de 39 kD, seta preta...33

Figura -15. Distribuição de cargas e regiões hidrofóbicas sobre a superfície de uma proteína...36 Figura-16. Diagrama de fase onde se mostra a solubilidade da proteína (concentração de precipitante x concentração de proteína) onde ocorre a formação de cristais...36

Figura-17. Figura esquemática do sistema utilizado na técnica de hanging drop (gota pendurada)...40

Figura-18. Primeiros resultados obtidos após realização dos ensaios de cristalização. A esquerda uma foto de esferulitas, a direita uma foto de uma mudança de fase...43 Figura-19. Figura dos cristais coletados do hTRα1LBD complexado com T3 em

A(grupo espacial C2), T3 em B(grupo espacial P212121), TRIAC (grupo espacial P212121)

em C e GC-1(Grupo EspacialP212121) em D...44

Figura-20. Representação do estados dos cristais (morte dos cristais) a partir do quarto dia após ensaio de cristalização...46 Figura-21. Resultados obtidos nos ensaios de cristalização do hTRα1LBD apo.

Em A foto da proteína precipitada, em B foto de uma espécie de gel formado que ficava aderida à lamínula, a foto B está em preto e branco para melhorar o contraste do objeto mostrado...47 Figura-22. Fotografia de difração para um cristal real...49 Figura-23. Ramachandran plot do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC: onde

94% dos resíduos estão agrupados em regiões mais favorecidas e 6% em regiões permitidas. (Os ângulos Phi e Psi estão em graus)...57

Figura-24. Ramachandran plot do hTRβ1(LBD) complexado com o TRIAC: onde

92.7% dos resíduos estão agrupados em regiões mais favorecidas e 5.9% em regiões permitidas. (Os ângulos Phi e Psi estão em graus)...58

Figura-25. Sítio de ligação do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC em detalhe

a densidade eletrônica do ligante em azul a 1.5 Sigma...61 Figura-26. Vista esquemática das interações do ligante (TRIAC), no sitio de ligação do hTRα1(LBD), onde pode-se observar com clareza as interações do

ligante...62 Figura-27. Sítio de Ligação do hTRβ1(LBD) complexado com TRIAC em detalhe

a densidade eletrônica do ligante em azul a 1.5 Sigma...63 Figura-28. Vista esquemática das interações do ligante (TRIAC), no sitio de Ligação do hTRβ1(LBD), onde pode-se observar com clareza as Interações do

Ligante...64 Figura 29. Gráfico que apresenta os espectros de CD para hélice a em vermelho, folha β em verde e seqüência aleatória ou randômica em preto para uma cadeia polipeptídica...67 Figura-30. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD). Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual

ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm...71

Figura-31. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T3. Tem-se na ordenada o grau de

desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm...72 Figura-32. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T4. Tem-se na ordenada o grau de

desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm... 73 Figura-33. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com GC-1. Tem-se na ordenada o grau de

desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm...74 Figura-34. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC. Tem-se na ordenada o grau de

Figura-35. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD)-apo. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento

percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC).

Para uma concentração protéica total de

5µm...76 Figura-36. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T3. Tem-se na ordenada o grau de

desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm...77

Figura-37. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T4. Tem-se na ordenada o grau de

desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm...78 Figura-38. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com GC-1. Tem-se na ordenada o grau de

desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm...79 Figura-39. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC. Tem-se na ordenada o grau de

desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperaturaem (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm...80 Figura-40. Espectro da estabilidade térmica realizadas para o hTRα1LBD com e

sem ligante. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e temperatura em (oC), na abscissa. Para uma concentração protéica total de 5µm...81

Figura-41. Espectro da estabilidade térmica realizadas para o hTRβ1LBD com e

sem ligante. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e temperatura em (oC), na abscissa. Para uma concentração protéica total de 5µm...82

Figura-42. Histogramas das entalpias de Van’t Hoff (A e C) e dos Tms (B e D). em E as entalpias para as isoformas alfa e beta estão associadas e em F os Tms para as isoformas se encontram associados. (1, 2 3,4 e 5) equivalem à proteína no estado apo, e ligada a T3, T4, GC-1 e TRIAC sucessivamente...83

LISTA DE ABREVIATURAS

RN – Receptor nuclear

LBD - Domínio de ligação ao ligante DBD - Domínio de ligação ao DNA DNA – Ácido desoxirribonucléico LBP- Bolso de ligação do ligante TR - Receptor de hormônio tireoidiano MR- Substituição molecular

AF-1 - Função de ativação-1 AF-2 - Função de ativação-2

DLS - Espalhamento de luz dinâmico DTT – Ditiotreitol

ER - Receptor de estrogeno RE – Elemento responsivo

ERE - Elemento responsivo a estrogeno HAT - Histona acetil transferase

HDAC - Histona deacetilase

HRE - Elemento responsivo a hormônio

CRM - complexo de remodelação da cromatina TAF-TATA- Fator de ligação associado à proteína CoRNR box - Caixa co-repressora do receptor nuclear APL- Leucemia promielocítica aguda

IPTG - isopropil-beta-D-thiogalactopiranoside LB - Luria broth

PDB - Banco de dados para proteínas

PPAR- Receptor de proliferação e ativação peroxossomal PR- Receptor de progesterona

PXR- Pregnane X Receptor RAR - Receptor do ácido retinóico RXR - Receptor X retinóico

SDS-PAGE - Gel de eletroforese em dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio SMRT- Receptor silenciador e mediador para retinóide e hormônio tireoidiano SRC-1 - Esteróide e coativador-1

TRE - Elemento responsive a TR TIF - Fator transcricional intermediário TRAP - Proteína associada a TR

TSH - Hormônio de estimulação tireoidiano NCoR1- Receptor nuclear correpressor-1 NCoR2- Receptor nuclear correpressor-2

NSAIDs-Drogas não esteroidais e anti-inflamatória. NGFI- Fator indutor de crescimento do nervo.

RESUMO

Os receptores nucleares (RNs) são um conjunto de proteínas e fatores de transcrição que formam uma superfamília que interagem com o DNA. Os receptores de hormônio tireoidiano são parte da família de receptores nucleares e possuem majoritariamente quatro isoformas: TRα1, TRα2, TRβ1 e TRβ2, geradas por splicing

alternativo de RNA de dois genes: um para TRα e outro para TRβ. Neste trabalho realizou-se a sub-clonagem do hTRα2LBD, desenvolveu-se protocolos de expressão,

purificação e re-enovelamento para o hTRα2LBD com produção de proteína solúvel e em

grande quantidade. Desenvolveu-se também os protocolos de expressão purificação e cristalização com diversos ligantes para o hTRα1LBD. A estrutura do receptor

hTRα1LBD complexada com TRIAC(3,5,3’-triiodothyroacetic acid) foi resolvida e um

estudo comparativo do padrão de ligação com a isoforma hTRβ1LBD complexada com o

mesmo ligante foi realizado para determinação da seletividade. Estudos comparativos do desenovelamento por temperatura foram realizados utilizando a técnica de dicroísmo circular (CD) para as isofromas hTRα1LBD e hTRβ1LBD complexadas com diversos

ABSTRACT

The nuclear receptors (NRs) comprise a large set of proteins and factors of transcription which are grouped into the super family of the NRs that interacts with the DNA. The thyroid hormone receptors are members of NRs. The thyroid hormone receptor possesses four isoforms mainly: (TRα1, TRα2, TRβ1 and TRβ2), generated by

splicing alternative of RNA from two genes. In this work hTRα2LBD was sub-cloned,

protocols of expression, purification and re-folding for hTRα2LBD were developed, with

production of soluble protein in great amount. Expression protocols for purification and crystallization with diverse ligands for hTRα1LBD were developed. The structure of the

receptor hTRα1LBD complexed with TRIAC (3,5,3'-triiodothyroacetic acid) had been

solved and a comparative study of the binding mode of the TRIAC for determination of the selectivity was carried out in the hTRα1LBD and hTRβ1LBD isoforms. Comparative

studies between hTRα1LBD and hTRβ1LBD under unfolding testes by temperature were

1

CAPÍTULO: INTRODUÇÃO AOS RECEPTORES NUCLEARES

1.1

Os receptores nucleares são um conjunto de proteínas e fatores de transcrição que foram agrupadas em uma superfamília de receptores as quais interagem com o DNA. Esta família está presente em todo o reino animal e se encontra envolvida em diversos aspectos da vida, de maneira essencial para múltiplas funções fisiológicas como: homeostase, reprodução, crescimento, diferenciação, morfogênese, apoptose e metabolismo1.

A família dos receptores nucleares é constituída por: Receptores de hormônios esteróides, receptores do hormônio tireoidiano, vitamina D, retinóides, ácidos graxos, prostaglandinas, além de um número crescente de receptores órfãos, assim denominados uma vez que seus ligantes não foram ainda identificados. Muitos receptores nucleares tem sido identificados via similaridade seqüencial com receptores conhecidos2,3.

Os receptores nucleares têm, suas funções ativadas pela ligação de uma molécula sinalizadora lipofílica (figura-1). Através da ligação desta molécula sinalizadora é exercido o controle dos processos e respostas transcricionais (1,2,3). Os receptores atuam em conjunto com parceiros em complexos, que são denominados como: complexos co-ativadores, quando em presença de seu ligante natural, participando da ativação da transcrição e co-repressores quando participam da repressão da transcrição na ausência de ligante2. O mecanismo de ação da transcrição de um modo geral se inicia quando um ligante se liga ao sítio ativo do receptor que está ligado ao complexo repressor; após a ligação do ligante ao sítio ativo do receptor uma alteração conformacional é desencadeada provocando a

liberação do receptor do complexo co-repressor, em seguida, o receptor se associa ao complexo ativador seguindo-se da ligação ao DNA, desencadeando o inicio da transcrição4.

Figura-1. Ativação da transcrição dos receptores nucleares via ligação do hormônio (ligante). Em alguns casos o ligante sofre algumas alterações até se tornar o hormônio definitivo, sendo neste estágio conhecidos como pró-ligante.

A família dos receptores nucleares em humanos possui 48 proteínas que regulam a transcrição dos seus respectivos genes alvos5.

A superfamília dos receptores nucleares evoluiu a partir de um receptor ancestral comum3. Tal fato confere a esta família uma organização estrutural bem característica, que será descrita em seções posteriores.

A pesquisa de receptores nucleares hoje em dia apresenta grande influencia no mercado mundial de fármacos, porque constituem alvos extremamente importantes para o desenvolvimento destes, devido ao fato dos receptores estarem envolvidos em mecanismos que possuem influência em diversas doenças que afetam a humanidade como alguns tipos

de câncer, obesidade, osteoporose, diabetes, doenças endócrinas, doenças metabólicas, psoríase, acne, hipercolesteremia, arteriosclerose e desordem lipídica3.

1.2

Os RNs (receptores nucleares) são constituídos de uma única cadeia, que se organizam estruturalmente em módulos ou domínios com funções específicas. Estes domínios são evolutivamente conservados, a saber: região amino-terminal, DBD (DNA binding domain) e LBD (ligand binding domain) 5.

Figura-2. Representação esquemática da organização estrutural e funcional dos receptores nucleares que foram conservadas evolutivamente. Região amino-terminal (A/B) em cinza, altamente variável entre os membros da família, onde se encontra o domínio de transativação independente de ligante AF-1, Em azul(C) encontra-se o domínio de ligação ao DNA (DBD), extremamente conservado, em cinza (D) conectando o DBD ao LBD encontra-se a região dobradiça (hinge), que não é conservada, em verde (E) encontra-se o domínio de ligação ao ligante(LBD), conservado entre os membros da família dos RN, que possui na sua região C-terminal o domínio de transativação dependente do ligante AF-2. Em seguida, em cinza a região(F) que encontra-se, em alguns receptores. A região-F é muito variável e ainda não tem sua função bem conhecida.

¾ Região amino-terminal

Também conhecida como região A/B que contém o domínio de transativação AF-1 (activation function 1) de tamanho e seqüência variados entre os membros das famílias, responsáveis pelo reconhecimento de co-ativadores e outros fatores de transcrição. Esta

região possui atividade celular-específica sugerindo que esta parte da proteína, contribui para a especificidade de ação entre isoformas de um receptor. O domínio modulatório, também é alvo de fosforilação realizada por diferentes caminhos de sinalização, tais modificações via fosforilação podem afetar significativamente a atividade transcricional6

¾ DBD

O DBD é o domínio de ligação ao DNA, sendo o módulo mais conservado entre a superfamília dos receptores nucleares. Ele é composto por dois dedos de zinco e possui normalmente de 60 a 70 aminoácidos. Na sua região C-terminal existem as conhecidas caixas T e A .

O DBD é responsável pelo reconhecimento de seqüências especificas (elementos responsivos) e ativação dos genes, possuindo um motivo de nove cisteínas conservadas ao longo da família dos RNs que é responsável pela alta afinidade do DBD pelo DNA. Em cada dedo de zinco existe um arranjo tetraédrico de cada zinco coordenando quatro cisteínas. Cada íon zinco promove a formação de uma estrutura compacta e interdependente com as cisteínas coordenadas. Alguns aminoácidos específicos estão situados na região próxima aos dedos de zinco e estes são responsáveis pelo reconhecimento de seqüências especificas de DNA ou motivos, na base do primeiro dedo de zinco, este agrupamento específico de aminoácidos é conhecido como Caixa P ou “P Box” enquanto que na região próxima ao segundo dedo de zinco temos a caixa D ou “D Box” que está envolvia no processo de dimerização (figura-3).

liga à cavidade principal do DNA fazendo contatos com bases específicas. A segunda hélice próxima ao C-terminal do segundo dedo de zinco forma um angulo reto com a primeira hélice (hélice de reconhecimento figura-3)7.

Os RNs se ligam via DBD aos elementos responsivos (seqüência especifica de DNA), derivados do motivo AGGTCA. A forma como estes receptores se ligam está vinculada ao seu estado de oligomerização e desta maneira a região de ligação muda com o estado de oligomerização. Normalmente a ligação ocorre de três maneiras:

¾ Monômero, quando se liga a um sítio simples. Ex: alguns receptores órfãos como NGFI-B.

¾ Homodímero, quando se liga a sítio duplicado com palíndromo invertido. Ex: receptores de esteróides.

¾ Heterodimero, quando se liga a sítio duplicado com repetição direta. Ex: heterodimeros com RXR.

Este fenômeno ocorre por que em cada receptor, existe na primeira hélice uma região que é responsável pelo reconhecimento de resíduos expostos, que fazem a discriminação entre os diferentes sítios de ligação, modulando desta forma, o padrão de ligação do receptor nuclear ao respectivo gene para desencadear sua atividade biológica3 .

Figura-3. Esquema do domínio de ligação ao DNA. Com dois característicos dedos de zinco e a extensão C-terminal (CTE). Nos dedos de zinco observam-se quatro cisteínas conservadas, que são coordenadas para cada dedo de zinco. A hélice 1 contém os resíduos da caixa P, que estão envolvidos na discriminação dos elementos responsivos. Os resíduos no segundo dedo de zinco que constituem a caixa D formam a interface de dimerização. O C-terminal(CTE) contém as caixas T e A que são responsáveis pela ligação da proteína ao DNA em estado monomérico. Observa-se o cruzamento das hélices 1 e 2 num ângulo reto, formando a região de reconhecimento do meio-sítio do elemento responsivo

¾ A região hinge

A região hinge (dobradiça) ou domínio D é a porção conectora entre os domínios DBD e LBD, permitindo assim a movimentação de um modulo sobre o outro. O domínio D não é conservado entre a superfamília dos RNs, sendo em muitos casos ligado a sinalização esta região também está envolvida em interações com co-repressores dos RNs pois, alterações nela interferem a nível de cessar completamente interações entre receptores e

co-¾ LBD

O domínio de ligação ao ligante, LBD é um domínio com múltiplas funções; além de atuar como domínio desencadeador do mecanismo de ação dos RNs, ser responsável pela localização nuclear, homo-hetero dimerização, associação com repressores e co-ativadores, proteínas de choque térmico, ele também possui a chamada região de transativação AF-2 ou função de ativação ligante-dependente e é sabido que em muito RNs possui uma fraca atividade de ativação do domínio via AF-2 ou AD.

Figura-4. Esquema explicativo da composição do domínio LBD conservado na família dos receptores nucleares. Tal comparação é possível devido a similaridade entre o hRXRαLBD(apo) a esquerda e o hRARγ(holo) a direita.

O enovelamento do LBD ao longo da família dos RN é bem característico, sendo partilhado pela maioria dos membros da família (figura-4). Este enovelamento é basicamente constituído de 12 hélices-α numeradas de 1-12 e uma folha β (entre as hélices 5 e 6) organizadas em um sandwich“α-helical” (antiparalelo organizado estruturalmente

em três camadas como pode ser visto na figura-5)9,10. No centro de mais duas camadas três hélices se organizam de tal maneira que um “core” é formado na região central do domínio,

os resíduos que constituem este “core” são, em sua maioria, de natureza hidrofóbica. Este core hidrofóbico formado é o sítio ativo do LBD, sendo este alvo dos ligantes. O tamanho da cavidade hidrofóbica formada varia entre os membros da família dos RNs e entre os estados onde o receptor se encontra ligado ao ligante (holo) e na ausência do ligante (apo). A estrutura dos receptores no estado holo são mais compactas o que evidencia claramente uma alteração estrutural significativa. A modificação da estrutura num estado mais compacto(holo) também confere uma maior estabilidade a proteína.

1.3

As estruturas de diversos LBDs já resolvidas sugerem fortemente um mecanismo similar ao de uma armadilha de rato para a entrada do ligante no receptor. Após a ligação do ligante ao sítio de ligação, a região AF-2 torna-se competente para ativar a transcrição causando um re-posicionamento da hélice 11, que agora se torna contínua com a hélice 10, ao mesmo tempo em que a hélice 12 se movimenta provocando um “flip” do “loop-Ω” entre as hélices 2 e 3 para abaixo da hélice 6 carreando o “loop” ao longo da região amino-terminal da hélice H3. O estágio final da movimentação da hélice 12 é um posicionamento estratégico no sentido de selar o LBP (ligand bind pocket), voltando esta hélice que antes apontava para fora no estado apo, agora sobre a parte central da estrutura da proteína, estado holo com a formação de ligações adicionais que promovem uma maior estabilização do receptor, figura-5.

Figura-5. Representação esquemática do domínio de ligação ao ligante(LBD) em receptores nucleares. A esquerda se encontra a representação da estrutura do RXRα-apo e a direita a representação do RARγ-holo. Obs: esta comparação foi possível porque a estrutura terciária do LBD do receptor RARγ e RXRα são similares. Observa-se que quando ocorre à ligação do ligante a estrutura do receptor muda, ficando mais compacta, o que fica claro com a modificação da posição da hélice-12 e do C-terminal.

Outro aspecto importante a salientar é que o equilíbrio entre os estados apo e holo de um dado receptor, pode ser alterado por conta de interações com a hélice 12 como ponte salina que é o caso do receptor RARγ11 ou contatos hidrofóbicos, o que implica que a presença do ligante não é crucial para a ocorrência de tal fenômeno, além de demonstrar que a forma apo não é o estado conformacional de base.

A super expressão de co-ativadores ou mutações nos receptores pode gerar a presença de receptores que não são ligante-dependentes, o que a nível de organismo pode acarretar sérias desordens com conseqüências catastróficas para o indivíduo, como complicações em terapias de câncer endócrino.

1.4

Para os RNs que seguem a regra geral de ligação e composição estrutural do seu LBD, a hélice 12 é um componente estrutural de vital importância no mecanismo da ativação da transcrição, pois a conformação da hélice 12 é induzida pelo ligante. Após a ligação do ligante ocorre uma alteração conformacional da proteína provendo um novo padrão de ligações que proporcionam uma superfície adequada para a ligação dos co-ativadores em seguida a região AF-2 é ativada iniciando a transcrição. Por meio de estudos mutacionais, foi demonstrado a importância da região C-terminal conservada em muitos LBDs dos RNs que contém a região AF-2, antes da resolução estrutural dos LBDs e foi demonstrado que esta porção corresponde a hélice 12 anfipática . Como o movimento da hélice 12 é ligante-induzido tal fato sugere que ela é crucial para controlar as propriedades agonistas e antagonistas dos RNs devido às suas interações com o ligante e com os resíduos que interagem com o ligante. 9,12,13

1.5

Os resultados mostram que o LBD possui uma habilidade natural para a dimerização o que pode ser observado pois as estruturas dos ER, RXR, RAR, PR, e PPARγ foram cristalizadas como dímeros 14.

Dados coletados para a dimerização dos LBDs dos: TR, RXR, RAR, e VDR foram obtidos através de estudos de mutações pontuais e deleções. Tais estudos revelaram que existe uma área comum de 40 aminoácidos situados nas hélices 10 e 11 que são responsáveis pela homodimerização de RXR e TR e heterodimerização entre: RAR-RXR, TR-RXR, e VDR-RXR. Entretanto mutações e deleções podem provocar a perda de folding e interferir na análise dos resultados. Estudos posteriores sugerem que a região de dimerização com parceiros diferentes variam por conta de que as regiões de interação entre diferentes receptores não são sempre as mesmas, o que produz alterações na maneira com que os LBDs interagem e dos resíduos envolvidos no processo15_.

Existe uma possibilidade que quando o ligante se encontra no sítio de ligação, um rearranjo conformacional seja provocado pela presença do ligante, produzindo um rompimento das ligações que preservam o dímero do LBD. Este fenômeno produzido pelo ligante pode provocara um bloqueio na ativação da transcrição14,16_.

1.6

O LBP é constituído por elementos de estrutura secundária das hélices 3,5,11,12 além dos “loops” 6,7,11,12 e os grampos de cabelos tipo β S1 e S213_{. Na maioria das} estruturas cristalográficas disponíveis e em estado holo. O ligante se encontra enterrado no

interior do LBP, sem uma clara entrada ou saída de acesso ao LBP, exceto no caso do PPARγ onde se observa um espaço de acesso entre a hélice H3 e a volta-β que pode ter tamanho suficiente para entrada de pequenos ligantes sem a necessidade de grandes adaptações. Para os outros receptores alterações conformacionais que seguem o modelo da ratoeira previamente descrito são necessárias para permitir o acesso do ligante ao LBP. Pois a movimentação da hélice 12 abre um canal, que promove a remoção da “tampa”, que sela o LBP.

O LBP é basicamente composto de resíduos hidrofóbicos com alguns resíduos carregados na região interna perto da volta-β que serve como pontos de ancoragem para a parte polar dos ligantes, tal fato está ligado também à seletividade dos ligantes. A maioria dos RNs possui uma arginina conservada na hélice 5. Alguns resíduos polares são claramente conservados nas subfamílias dos RNs de acordo com os requerimentos dos ligantes das sub-formas de LBP característico de uma dada sub-família.

Outro aspecto interessante do LBP é a capacidade de adaptação ao ligante que o bolso possui. Esta capacidade de reorganização para receber mais de um tipo de ligante é possível principalmente por conta da flexibilidade das hélices 3,11,12 e do “loop” entre as hélices 11 e 12, que permite uma reorganização dos resíduos para a acepção dos ligantes17.

Uma das grandes subfamílias da superfamília dos receptores nucleares são os receptores de hormônio tireoidiano que particularmente serão abordados nesta tese por conta dos estudos desenvolvidos no domínio de ligação ao ligante LBD das isoformas alfa e beta.

Na ausência de ligantes os receptores nucleares se encontram em geral ligados a um grupo de co-repressores transcricionais como o receptor nuclear co-repressor 1 (NCoR1), ou o silenciador e mediador para retinóide e receptor de hormônio tireoidiano (SMRT), também conhecido como (NCoR2). Tais proteínas recrutam complexos transcricionais que contém desacetilases de histonas (HDACs). Estas desacetilases produzem uma condensação da estrutura da cromatina exatamente sobre os promotores alvos, impedindo assim que os receptores responsáveis pela ativação da transcrição possam encaixar nos elementos responsivos (ER) do DNA produzindo desta maneira então, a repressão do mecanismo de transcrição 18,5figura-6.

Figura-6. Ação dos RNs. O ligante migra via membrana plasmática e interage com o respectivo receptor o que pode não ser diretamente no núcleo, pois há a possibilidade de interação no citoplasma, como por exemplo, com kinases (a). Pode haver uma variação da média da localização dos diferentes receptores e que é afetada pela natureza dos ligantes. A interação dos ligantes controla uma diversidade de fatores. Na ausência do ligante, muitos receptores se encontram ligados a regiões reguladoras de genes alvo como co-repressores ou complexos de histonas desacetilase (HDAC) (b). A desacetilação das histonas é responsável pela condensação da cromatina o que explica o efeito do silenciamento do gene nos receptores apo. A ligação do ligante libera o complexo HDAC (c), o que resulta no recrutamento da histona acetil transferase (HAT) e do complexo de remodelação da cromatina (CRM) que promoverá um estado adequado para a acepção do complexo ativador na região onde se encontra ligado o receptor (d). Para finalizar, o mecanismo a polimeraze II aloenzima (enzima pol II, TAF-TATA-binding protein-associated factor) e complexos mediadores são recrutados e aumentam a freqüência da iniciação da transcrição (e).46

Os co-repressores possuem uma região denominada caixa co-repressora do receptor nuclear “corepressor nuclear-receptor box (CoRNR box)”, que interage com a região hidrofóbica formada pelas hélices 3, 4 e 12 que são parte integrante do LBP (ligand binding pocket). Quando um ligante se liga ao sítio este provoca uma alteração conformacional da hélice 12, produzindo assim uma nova conformação que desestrutura a cavidade hidrofóbica (CoRNR Box) promovendo a dissociação do complexo co-repressor. Essa nova conformação da hélice 12 holo permite a interação desta com motivos co-ativadores com a seqüência básica: LxxLL onde L é leucina e x qualquer aminoácido. O motivo LxxLL está presente na maioria dos co-ativadores envolvidos em interações via LBD. Peptídeos ou proteínas que contém o motivo LxxLL possuem a capacidade de serem reconhecidos pelo sítio formado pelas hélices 3,4 e 12. Esta região é partilhada em interações com co-repressores, este sítio também é reconhecido por co-repressores que possuem um motivo similar mais não idêntico aos motivos dos co-ativadores. O agonista induz a mudança conformacional do LBD que é a manifestação estrutural da função de transativação (AF-1) do receptor nuclear. Observa-se que efeitos alostéricos ligante-induzidos sobre o LBD podem controlar a atividade da região AF-1. O que se observa no caso de crosstalk entre as regiões C e N-termianl5.

1.8

Por conta dos RNs estarem envolvidos em vários processos relacionados aos organismos vivos como: crescimento, morfogênese, metabolismo, procriação, diferenciação celular, proliferação, apoptose e manutenção da homeostase1,2,8, observando-se ainda que cada mecanismo citado acima está ligado à ativação de um determinado ligante que

normalmente é lipofílico os RNs tornam-se facilmente alvos farmacológicos. Deve-se levar em conta ainda que, cada um dos processos citados acima encontram-se estreitamente entrelaçados uns com os outros, o que acarreta numa diversidade de papéis desempenhados pelos RNs como um todo 8.

Segue abaixo alguns exemplos da atuação dos RNs de forma isolada para alguns dos RNs que possuem seus ligantes conhecidos:

O PPAR-γ (receptor γ ativado pela proliferação do peroxisomo) é ativado por muitos agonistas naturais como: prostaglandina-15-deoxi-∆12-14 J2 (15d-PGJ2), alguns ácidos graxos poliinsaturados oxidados, fosfolipídeos, drogas anti-diabéticas, “thiazolidinediones”(reduz nível de glicose no sangue), drogas anti esteroidais e anti-inflamatória (NSAIDs). Diversos agonistas do PPAR-γ inibem muitas funções associadas com ativação de células microgliais, o que sugere que estes compostos, sendo eles naturais ou sintéticos podem estar envolvidos no controle de inflamações do cérebro. Acredita-se que as células microgliais estão ligadas com processos inflamatórios e neurodegenerativos e numa variedade de patologias do cérebro, em desordens crônico degenerativas como mal de Alzheimer. PPAR-γ também se encontra ligado à cicloxigenases (COX), o que também associa este receptor nuclear ao trato gastrintestinal e rins19.

RAR e RXR. Os Retinóides são moléculas de sinalização que atuam através da interação com duas famílias de receptores de retinóides: A do receptor do ácido retinóico (RAR α, β e γ) e a do a do receptor do ácido 9-cis-retinóico( RXR α, β e γ).

Os receptores de retinóides são de estrema importância, pois regulam importantes e complexos eventos, que controlam etapas chaves durante o desenvolvimento, manutenção do controle e homeostase induzindo ou inibindo a proliferação celular, diferenciação e

morte. Ou seja: Os receptores de retinóides demonstram uma grande capacidade de controle da atividade de diferenciação e antiproliferação.

O tratamento de leucemia promielocítica aguda (APL) por retinóides transformou-se no protótipo de terapia de diferenciação e trouxe grandes esperanças não só para a terapia do câncer, mas também para a prevenção desta doença20.

ER (receptor de estrogênio). Terapias de reposição de estrogênio têm mostrado um grande índice de sucesso contra os sintomas da menopausa como atrofia urogenital e picos de temperatura. Além de serem também utilizados para prevenir e controlar efeitos da osteoporose pós-menopausa.

Alguns dados também sugerem que estrógenos possuem efeitos benéficos no sistema nervoso e cardiovascular o que indica que os estrógenos possuem potencial para tratamento de arteriosclerose e mal de Alzheimer. Embora os efeitos positivos do uso de estrógenos sejam conhecidos, existem evidências de que o uso contínuo leva a um aumento reprodutivo de tecido canceroso. Tal problema tem levado a comunidade cientifica a desenvolver grandes esforços no sentido de preservar os efeitos positivos do uso dos estrógenos 21.

PR (receptor de progesterona) - Trata-se de um receptor esteróide que é chave na regulação do crescimento da mama, lactação, ciclo menstrual, gravidez, suporte da gestação e embriogenese. Em humanos a progesterona possui um papel fundamental na manutenção do endométrio e desenvolvimento alveolar lobular durante o ciclo menstrual feminino e gravidez22.

Existem dois receptores de progesterona o receptor A (PRA) e o Receptor B (PRB). Anormalidades reprodutivas e desempenho sexual estão ligadas ao PRA.

Agentes progestacionais têm sido usados como contraceptivos no tratamento da menopausa por terapia de reposição hormonal, tratamento de câncer de mama e hiperplasia endometrial.

Antiprogestinas também tem sido usadas como: contraceptivos, indução do trabalho de parto, tratamento de meningiomas, endometriose e câncer do endométrio. Em câncer de mama os níveis de progesterona são comumente utilizados como guia na terapia hormonal e como marcador na prognose da doença 23.

TR (receptor de hormônio tireoidiano) - Existem predominantemente quatro isoformas do TR (TRα1, TRα2, TRβ1 e TRβ2), que são gerados pelo splicing alternativo de RNA de dois genes um para TRα e outro para TRβ. Em humanos o hipertiroidismo leva a um aumento do metabolismo com redução dos níveis no plasma de colesterol. Tentativas de aumento da taxa metabólica com o uso de tiroxina (T4), que após ser metabolizado é convertido a 3,5,3’-triiodo-L-tironina (T3) levam a sérios problemas cardíacos. Sabe-se que o tecido cardíaco é majoritariamente constituído pelo TRα1 e que o T3 não é seletivo para nenhum dos TRs conhecidos. Parte da comunidade científica que trabalha diretamente com TRs se encontra na busca de ligantes TRβ seletivos que se situam majoritariamente no fígado e quando são ativados iniciam o metabolismo de gorduras e colesterol.

Ao longo dos anos várias estratégias para a redução dos níveis de colesterol vem sendo desenvolvidas com a finalidade de prevenir doenças cardiovasculares.

Testes em roedores e primatas mostraram que derivados sintéticos dos hormônios tireoidianos seletivos para o receptor TRβ tem mostrado uma eficiência maior na redução dos níveis de colesterol LDL no plasma e triglicerídios que as terapias convencionais com redução de peso corporal em 7% em uma semana com grande redução de gordura 17,24-26.

1.9

Expressão heteróloga, purificação, estudos em solução e cristalográficos da porção LBD dos receptor humano dos hormônio tireoidiano isoforma α1 (hTRα1LBD). Cristalização do domínio LBD de hTRα1 com hormônios naturais e com um tiromimético. Estudos comparativos entre os receptores α1 (hTRα1LBD) e β1 (hTRβ1LBD). Expressão heteróloga e purificação da porção LBD do receptor humano de hormônio tireoidiano isoforma α2 (hTRα2LBD).

2O

CAPÍTULO: ESTUDOS DE SUB-CLONAGEM, EXPRESSÃO E

PURIFICAÇÃO

2.1

2.2

O hTRα1LBD é constituído pelos amino ácidos 148-410 (contendo somente o LBD foi inserido em pET28a(+) (Novagem)). O clone utilizado no estudo foi cedido pelo grupo do Dr. John Baxter (Unidade de Pesquisa Metabólica, Centro de Diabetes, Universidade da Califórnia, São Francisco, EUA).

Para determinação das melhores condições de expressão em Eschericia. Coli (B834) diversos experimentos foram realizados no sentido de se obter a otimização da expressão para o hTRα1LBD. Nestes experimentos via varredura sistemática determinou-se as concentrações ideais de IPTG, meio de cultura, tempo de indução, temperatura e volume de pré inoculo. Após o término da varredura das condições de expressão, observou-se que: as melhores condições para expressão do hTRα1LBD seguem descritas abaixo no protocolo de expressão desenvolvido.

Deixou-se crescer um pré-inoculo “overnight” em meio LB (1% Triptona, 0.5% Extrato de levedura e 1% NaCl) a 37 0C com Kanamicina a 50µg/ml. Na manhã seguinte transferiu-se 1,5 mL de pré-inoculo para 1 L de LB contendo Kanamicina e pôs-se para crescer sob agitação à 20 0C até atingir a DO600nm de 1,75. Em seguida induziu-se com IPTG a uma concentração final de 0,5 mM. O tempo de indução total foi de 6 h sob agitação constante à 20 0C e 250 rpm.

Após o término da indução a cultura foi sedimentada por centrifugação a 6.000 rpm (rotor GS 3-Sorvall) 20 min, à 4 0C. Durante todo o procedimento de sedimentação o meio de cultura ainda não sedimentado foi mantido em banho de gelo. Após a sedimentação, o sedimento proveniente de cada litro de cultura foi ressuspendido num volume de 20 mL de solução TST (50 mM Tris-HCl pH- 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 20 mM β-mercaptoetanol). Em seguida, adicionou-se à solução homogeneizada, lisozima (1,4 mg/grama de células). Deixou-se com lisozima por 20-30 min em gelo sob lenta agitação. Após 30 min à 4 0C em agitação constante o extrato foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado à -80 0C.

2.3

Os receptores foram expressos com uma cauda N-terminal contendo 6 histidinas codificadas pelo vetor pET28a (+) (Novagen).

Descongelou-se o extrato e sonicou-se por três ciclos de dez segundos com intervalos de um minuto entre os ciclos. Em seguida centrifugou-se o lisado a 14.000 rpm (rotor SS 34-Sorvall) à 4 0C. Sucedeu-se a retirada do clarificado, por aspiração, este foi incubado com a resina de afinidade Talon Superflow (Clontech) 1 mL/6 g previamente lavada e equilibrada com TST. Adicionou-se em conjunto Imidazol (10 mM) à mistura. A mistura foi agitada lentamente por 1h em câmara fria a 40C. No próximo passo a resina + solução de proteínas foi centrifugada a 500rpm a 40C, o sobrenadante foi aspirado a vácuo e descartado. Lavou-se o “pellet” resultante (resina + proteína ligada) 2 vezes com tampão 1 (50 mM de Na3PO4 pH 8,0; 300 mM de NaCl; 10 % de glicerol e 10 mM de β-mercaptoetanol) contendo 10 mM de imidazol por 5 minutos em agitação, em câmara fria a

4 0_{C e mais duas vezes com tampão 2 ( 50 mM de Na}

3PO4, pH 8,0; 400 mM de KCl; 10 mM de imidazol; 10 % de glicerol e 10 mM de β-mercaptoetanol) por 5 min. Eluiu-se a proteína com 3 mL de tampão 2 adicionado de 500mM de imidazol por gravidade em coluna de plástico Poly-Prep (Bio-Rad) a temperatura de 4 0C. As amostras obtidas foram analisadas em SDS-PAGE 15 % e coradas com Comassie Blue. A proteína no estado apo possuía um grau de pureza em torno de 90 % em quanto que a proteína no estado holo possuía um grau de pureza de aproximadamente 95 % todas as alíquotas obtidas eram checadas via SDS-PAGE 15 %.

Para a produção da proteína com ligante, no momento da incubação da resina com o clarificado, adicionou-se o ligante de interesse em concentração 10x a equimolar e manteve-se o recipiente sob proteção constante contra luz dada a sensibilidade frente à luz dos ligantes (foto-sensíveis).

2.4

FILTRAÇÃO)

Para purificação por filtração em gel, foi utilizada uma coluna Superdex 200 HL 26/60 (Amersham-Bioscience). Aplicou-se 3 ml do eluato da afinidade e procedeu-se a eluição isocrática a 2 mL/min. A solução tampão utilizada foi: 20 mM Hepes-Na pH-8,0; 300 mM NaCl; 10 % de glicerol e 3 mM DTT. As amostras eluídas foram analisadas por SDS-PAGE 15 % e coradas com Comassie Blue. A quantificação foi feita utilizando-se o método colorimétrico de Bradford27. Como algumas alíquotas eram extremamente diluídas, as proteínas foram concentradas através de centrifugação a 1500 x g, 4 0_{C, até atingirem as}

concentrador Amicon Ultra 10 MWCO (Millipore). O grau de pureza das amostras obtidas e checadas via SDS-PAGE eram superior a 98 % tanto para a proteína no estado apo como no estado holo.

2.5

2.6

Após o rastreamento dos outros fatores como concentração de IPTG, tempo de indução e volume de inoculo, restou o ajuste da temperatura. Observou-se que a melhor temperatura se encontrava a 20 o_{C que equivale ao 3}o _{poço da figura-7, após o marcador.} Ainda assim observa-se que o “pellet” 4o poço contém uma grande quantidade de proteína insolúvel, em todas as tentativas realizadas, não houve nenhuma condição em que a proteína se encontrasse em alta porcentagem na fração solúvel. Mesmo assim como será mostrado adiante, obtiveram-se grandes quantidades de proteína solúvel.

M 1 2 3 4 5 6

Figura-7. SDS-PAGE da expressão do TRα1 a

diferentes temperaturas. (M) Marcador de peso molecular: BSA (66 kDa), Ovalbumina (45 kDa), Anidrase Carbônia (29kDa), Inibidor de Tripsina de Soja (22,1 kDa), Lacto albumina bovina(14,2kDa). Poços (1-6) indução da proteína recombinante com IPTG nas temperaturas 1-2 à 14o_{C, 3-4 à 20}o_{C, 5-6 à} 22o_C. 66kDa 45kDa 29kDa 22,1kDa 14,2kDa

2.7

2.8

Seguem os resultados da purificação por afinidade do hTRα1LBD (figura-8) com hormônio (A) e sem hormônio (B). Deve-se observar que em todas as purificações realizadas, o padrão de pureza das proteínas nos estados, apo e holo se repetem, independentemente, do tipo de ligante. Salienta-se ainda que todos os ligantes utilizados eram agonistas e aumentavam a estabilidade da proteína consideravelmente. Faz-se necessário destacar o resultado observado no gel (B) poço 6 corresponde a proteína agregada na resina. No caso da proteína com ligante a quantidade retida na resina de afinidade é muito menor (dado não mostrado).

(A) (B)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6

Figura-8. SDS-PAGE. (A) Purificação por afinidade do TRα1LBDna presença de

ligante (T3); (M) Marcador de peso molecular; (1 e 2) alíquotas da lavagem da

resina Talon; (3 e 4) Diferentes aliquotas da eluição da proteína com 500 mM de imidazol. (B) Purificação por afinidade do TRα1LBDna ausência de ligante; (M)

Marcador de peso molecular; (1-5) Diferentes frações de eluição da proteína recombinante na presença de tampão 2 com 500 mM de imidazol, poço 6 alíquota da resina. 66kDa 45kDa 29kDa 22,1kDa 14,2kDa

2.9

Após a purificação via afinidade. As amostras de proteínas se encontravam relativamente puras para a maioria dos testes preliminares e em quantidades suficientes para a realização dos estudos de interesse. Em contra partida quando se iniciaram os testes de cristalização observou-se que o contaminante de 67 kD observado nos géis de afinidade bem como a heterogeneidade dos estados oligoméricos atrapalhava significativamente a cristalização das proteínas. Logo se constatou que a etapa de purificação em gel filtração seria necessária e esta demonstrou-se uma etapa chave no sucesso da cristalização.

Pode-se observar abaixo os resultados da purificação por gel filtração do hTRα1LBD com hormônio (A) e sem hormônio (B).

(A) (B)

M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5

Figura-9. SDS-PAGE. (A) Purificação por gel filtração do hTRα1LBD na

presença de ligante (T3); (M) Marcador de peso molecular; (1-7) diferentes frações de eluição. (B) Purificação por gel filtração do hTRα1LBD na ausência

de ligante. (M) Marcador de peso molecular; (1-5) diferentes frações de eluição. 22,1kDa

66kDa 45kDa 29kDa

2.10

O clone da proteína completa do hTRα2LBD foi cedido ao grupo pelo Dr. John Baxter (Unidade de Pesquisa Metabólica, Centro de Diabetes, Universidade da Califórnia, São Francisco, EUA). O inserto do hTRα2LBD constituído pelos amino ácidos 148-490 foi inserido em pGEMT-easy vector (Promega contendo somente o LBD) em seguida clivado e inserido em pET 28a(+) (Novagem) nos sítios para Xho I e Nde I. Os clones obtidos foram transformados em (DH5α) para proliferação. Uma fração do material após propagação foi utilizada para mini preparação de plasmídeos, utilizando-se o Kit Qiaprep Spin (Qiagen). Os plasmídeos purificados foram digeridos para verificação da liberação dos insertos, e analisados via eletroforese em gel de agarose e coloração com Brometo de Etídeo para visualização no transluminador. Em seguida os clones foram seqüenciados, (ABI Prism 377 DNA sequencer, Applyed Biosystems).

2.11

Adicionou-se 0,5 µL dos clones à 100 µl de solução de CaCl2 (60 µM de CaCl2, 15 % de Glicerol e 10 µM de MOPS pH7,0) e 100 µL de células competentes. Em seguida a mistura foi mantida no gelo por 30 min, sendo depois a mistura transferida para o banho 42 °C por 1 min e novamente retornou ao gelo por mais 2 min, seguindo-se por mais 2 min a temperatura ambiente. Após o repouso a mistura foi adicionada a um tubo com 1 mL de LB fresco e sem antibiótico, em seguida a mistura foi mantida a 370C em agitação por 1h. Ao fim deste tempo, uma alíquota de 100µL foi retirada e devidamente espalhada em placa de

completa em fluxo laminar as placas foram transferidas e permaneceram em média 16 horas a 37 0C para o crescimento das colônias. Após os testes de expressão uma colônia foi selecionada e propagada em LB para preparação de estoques em glicerol e estocadas a -80 0_C.

2.12

Seguindo a mesma linha da determinação das condições de expressão em E. coli para o hTRα1LBD diversos experimentos foram realizados no sentido de se obter a otimização da expressão para o hTRα2LBD. As melhores condições para expressão do hTRα2LBD seguem descritas abaixo no protocolo de expressão desenvolvido.

Deixou-se crescer um pré inoculo “overnight” em meio LB (1 % triptona; 0,5% extrato de levedura e 1 % NaCl) à 370C com Kanamicina a 50 µg/mL. Na manhã seguinte transferiu-se o 1,5 mL de pré-inoculo para 1 L de meio LB contendo Kanamicina e pôs-se a crescer sob agitação de 250 rpm à 37 0C até atingir a DO600nm de 1,75. Em seguida induziu-se com IPTG a uma concentração final de 1,5 mM. O tempo de indução total foi de 6 h sob agitação constante à 37 0C. Após o término da indução as bactérias foram sedimentadas por centrifugação a 6.000 rpm (rotor GS 3-Sorvall) 20 min, à temperatura ambiente.

2.13

Após a sedimentação, o sedimento proveniente de cada litro de cultura foi ressuspendido num volume de 20 mL de solução TST (50mM Tris-HCl pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,05 % Tween20; 20 mM β-mercaptoetanol). Sonicou-se o material re-suspendido

por três ciclos de trinta segundos, com um intervalo de um minuto entre os ciclos a temperatura ambiente. Em seguida, centrifugou-se a 14.000 rpm (rotor SS 34-Sorvall) à temperatura ambiente. O clarificado foi aspirado e descartado. O sedimento foi novamente re-suspendido (bruscamente) em vortex em tampão A (50 mM Tris-HCl; 2 mM β-mercaptoetanol,pH-8,0), o material foi novamente centrifugado nas mesmas condições e o produto da lavagem foi descartado. Em seguida, o sedimento foi re-suspendido via vortex em tampão B (8 M Uréia; 50 mM Tris-HCl; 10 mM β-mercaptoetanol, pH 8,0), quando o sedimento estava completamente homogêneo este foi submetido a mais 8 h de agitação constante a temperatura ambiente. Após este período o material foi novamente centrifugado sob as mesmas condições descritas acima. Após a centrifugação o sobrenadante foi aspirado e o sedimento restante foi descartado.

2.14

A coluna aniônica (Hiload 16/10 Q-SepharoseTM) foi equilibrada com o tampão B (8 M Uréia, 50 mM Tris-HCl; 10 mM β-mercaptoetanol, pH 8,0). Toda a proteína oriunda da extração da protéica previamente filtrada (50mL) foi injetada em um único passo na coluna e eluída num fluxo contínuo de 1,0 mL/min por gradiente salino que atingiu 100 % em 2 h, com tampão C (8 M Uréia; 50 mM Tris-HCl; 10 mM β-mercaptoetanol; 1 M NaCl; pH 8,0) quando o gradiente atingiu 33 % a proteína foi eluída. As alíquotas com a proteína foram coletadas para o processo de re-enovelamento.

2.15

Iniciou-se então o processo de re-enovelamento. A proteína foi submetida a sucessivas etapas de diálise (em membrana de celulose) para retirada completa da uréia. O Receptor hTRα2LBD foi transferido para um saco de diálise num volume de 10 mL sendo em seguida dialisado contra um volume de 2 L que segue a seguinte regra: a cada duas horas o tampão do Becker, (HEPES 10 mM pH-7,0; 100 mM de NaCl e 3 mM de DTT) foi trocado, num primeiro momento a concentração de uréia era de 8 M na solução da proteína, após 2 h de diálise passava a 4 M, e finalmente a 2 M o que perfazia um total de 4 h. Após esta etapa, um sistema de bomba peristáltica com mangueiras plásticas foi montando num Becker de 200 ml num fluxo contínuo onde 2 L de tampão foi gotejado “overnight” na parte superior do Becker e uma segunda mangueira que foi posicionada no fundo do Becker retirava a solução via bomba peristáltica até retirada completa da uréia. Após o término das diálises, a solução tampão final onde se encontrava a proteína apresentou-se completamente livre de uréia.

2.16

2.17

Abaixo pode-se observar o gel (A) da amplificação por PCR ( polymerization chain

reaction) do hTRα2LBD (figura-10). Após amplificação, obteve-se quantidade de inserto suficiente para inserção no vetor de clonagem pGEMT-easy vector (Promega). Decidiu-se adotar esta estratégia pois ela permitia a transferência do hTRα2LBD de maneira mais

eficaz no vetor de expressão pET28a(+). No gel (B) (figura-10) pode-se observar a liberação dos insertos do hTRα2LBD clonado em pGEMT (poços 1 e 3) e do hTRα1LBD proveniente do vetor pET28a(+) (poço 7). Como pode ser visto, o inserto do hTRα2LBD apresenta o tamanho esperado de 1026 pb enquanto o do hTRα1LBD de 786 pb. Este resultado confirmou a clonagem do hTRα2LBD no pGEMT .

No gel da figura-11 tem-se o resultado positivo da subclonagem do hTRα2LBDem pET28a(+). A confirmação definitiva da clonagem do hTRα2LBD no pET28a(+) só foi obtida após seqüenciamento dos clones e verificação de ausência de qualquer mutação.

(A) (B)

pb 1 2 3 4 5 pb pb 1 2 3 4 5 6 7

Figura-10. Géis de 1% agarose. (A) Amplificação por PCR do domínio de ligação ao ligante de hTRα2. (pb) 1 Kb Plus DNA Ladder; Poços (1-5)

amostras do produto da amplificação por PCR do hTRα2LBD, seta mostra

amplicon de 1026 pb correspondente ao LBD de hTRα2. (B) Digestão com

enzimas de restrição do hTRα2LBD subclonado em pGEMT. Marcador(pb)

1 Kb Plus DNA Ladder, inserto de 1026pb; A seta mostra um inserto de 786 pb correspondente ao LBD de hTRα1 utilizado como parâmetro de

avaliação. 1 pb 1026pb Figura-11. Gel de 1% agarose da subclonagem do hTRα2LBD. Marcador(pb) 1

Kb Plus DNA Ladder; Poço 1 liberação do inserto do hTRα2LBD do pET 28a(+)

após digestão com enzimas de restrição.

2.18

A expressão em fração solúvel do hTRα2 mostrou-se extremamente problemática. Mesmo tentando-se variar todas as condições possíveis como temperatura, concentração de IPTG, inclusive estratégias como adição de detergentes, nenhum resultado positivo significativo foi obtido. Em compensação a quantidade de proteína expressa era bastante significativa, quando comparada com o hTRα1LBD, como pode ser observado no gel A que mostra o extrato bruto de algumas condições testadas (figura-12), na figura (B) observa-se também o extrato bruto resultante de teste de indução para seleção das colônias que apresentaram expressão dentre as colônias bacterianas testadas. No poço 9 tem-se uma amostra pura de hTRα1LBD (33 kD) para fins de comparação com hTRα2LBD expresso (39 kD).

(A) (B)

M 1 2 3 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura-12. SDS-PAGE. (A) Expressão de TRα2LBD. (M) Marcador de peso molecular;

Poços (1-3) extrato bruto do hTRα2LBD expresso a 37 0C, seta mostra a proteína

recombinante de 39 kD. (B) Extrato bruto de diferentes colônias de hTRα2LBD na busca

das colônias que apresentam expressão da proteína recombinante de 39 kD (poços 1 e 2); No poço 9 hTRα1LBD purificada para comparação com hTRα2LBD.

33k 39k _39k 66kDa 45kDa 29kDa 22,1kDa 14,2kDa