RESULTADOS E DISCUSSÃO (hTRα 1 LBD)

Após o uso de todos os Kits mencionados na metodologia. Observou-se que em algumas condições com o receptor no estado holo, existia o aparecimento de sinais claros de um indício do início do processo de cristalização. Resultados tais como esferulitas, mudanças de fase (figura-18) além de que em muitas condições observou-se o surgimento de micro-cristais. As condições onde houve o surgimento de micro-cristais não foram estudadas, pois como em muitos casos existe o aparecimento de micro-cristais de sal e por inspeção visual é impossível distingui-los (dado ao reduzido tamanho por difração de raios- X, não há possibilidade de testá-los) optou-se por explorar condições mais promissoras.

Figura-18. Primeiros resultados obtidos após realização dos ensaios de cristalização. Em A foto de esferulitas e em B foto de uma mudança de fase.

Normalmente, quando num primeiro momento não se possui nenhuma informação prévia da literatura de alguma proteína correlata cristalizada e quando num primeiro teste de cristalização não se obtém um cristal difratável (fenômeno raro em cristalização de proteínas) opta-se, pelo desenvolvimento de condições onde as mudanças de fases são visíveis como na figura-18, (onde num experimento de cristalização de proteínas seguramente tal fenômeno só ocorre com proteínas, pois os sais não reproduzem o mesmo fenômeno) o que não foi o caso do presente estudo para o hTRα1LBD. Pois já se conhecia uma condição extraída da literatura31 onde cristais haviam sido obtidos, para receptores holo com alto grau de identidade.

Vale a pena destacar que: diversas tentativas foram realizadas com a proteína oriunda da coluna de gel filtração sem prévia troca do tampão. Só foi possível obter sucesso na cristalização do hTRα1LBD holo quando o tampão em que a proteína se encontrava (gel filtração) foi sucessivamente mudado e principalmente quando foi adicionado 600mM de NaCl, demonstrando que neste receptor o fenômeno de “salting-out” possui marcada importância na sua cristalização.

De um modo geral cada caixinha de cristalização onde o resultado era positivo, possuía uma quantidade altíssima de cristais. Algumas gotas possuíam mais de 30 cristais viáveis.

Figura-19. Figura dos cristais coletados do hTRα1LBD complexado com T3

em A(grupo espacial C2), T3 em B(grupo espacial P212121 ), TRIAC em C

(grupo espacial P212121)e GC-1 em D (grupo espacial P212121).

O tamanho dos cristais variava imensamente, normalmente possuíam 0.5 x 0.4 x 0.3 mm a 18oC e a 4oC eles possuíam sua maior dimensão variando em torno de 0.6-0.8mm (figura-19). Os cristais obtidos do receptor no estado holo possuíam um tamanho maior e melhor conformação quando crescidos a 4oC, salienta-se ainda que a quantidade de cristais a 4oC era reduzida. No caso da primeira cristalização com T3 à 4oC obtiveram-se poucos cristais por gota na maioria dos poços. O que fica obvio quando se pensa em consumo de

D

C

B

A

sempre era o mesmo P212121, o que evidencia a importância da temperatura na condução da cristalização. A 18oC Encontrava-se mais de um grupo cristalino, o grupo C2, que foi verificado tanto para os ligante T3 como GC-1.

O tempo de crescimento dos cristais do hTRα1LBD holo era em torno de 12-24 horas sendo que quando a temperatura de cristalização era de 18oC, em torno de 5minutos podia-se observar nitidamente a formação dos primeiros núcleos cristalinos crescendo no microscópio. Tal fato permitiu um amplo estudo dos melhores volumes de precipitante versus volume de solução de proteína a serem utilizados em cada ensaio. Determinou-se que quando a cristalização era realizada com T3, a melhor relação entre volume de proteína(10mg/mL) e agente precipitante era de 1/1µL respectivamente; no caso do TRIAC 1/0,5 µL; quando o ligante era GC-1 a melhor proporção foi de: 1/0,25 µL; quando tentou- se cristalizar com T4 1/1 µL. Como o T4 sofre foto decomposição, um grande problema era observado pois uma parte do T4 se convertia a T3, como o T3 possuí maior afinidade pelo sítio de ligação que o T4 o resultado obtido era sempre T3 ligado. Existia também um aspecto negativo: embora os cristais crescessem rapidamente em todas as temperaturas estudadas, os mesmos também morriam muito rapidamente. Cerca de 4 dias após a maturação do cristal, este começava a se deteriorar e no quinto ou sexto dia, pós cristalização, este estava completamente inválido para difração, muitas vezes se tornavam uma película no fundo da lamínula. Por conta deste problema assim que se completava 24h pós-ensaio de cristalização, ou se congelava e estocavam-se os cristais em nitrogênio liquido ou estes estariam imprestáveis aos estudos cristalográficos(figura-20).

Em relação à seletividade dos ligantes. O T3 não possui seletividade entre as isoformas α e β dos receptores de hormônio tireoidiano. O TRIAC possui maior afinidade pelos receptores tireoidianos que o T3. O TRIAC também possui um menor tempo de residência nos receptores nucleares que o T3 e uma menor meia vida plasmática. Sabe-se que o TRIAC possui uma certa beta seletividade (se liga duas vezes mais fortemente ao TRβ1 do que ao TRα1). O GC-1 é um ligante sabidamente desenvolvido para ser β seletivo31,32.

No caso dos ensaios de cristalização do hTRα1LBD apo. Diversas tentativas foram realizadas com todos os kits disponíveis e na totalidade dos experimentos realizadas a maioria dos resultados observados era proteína precipitada (figura-21 A). O melhor resultado obtido com o receptor apo foi apresentado na condição 9 : 0,2M de acetato de amônio, 0,1M de citrato de sódio e 30% de peg 4000 do Cristal Screen I, o material observado na foto era semelhante a um gel que estava aderido na lamínula, as tentativas de

Figura-20. Representação do estados dos cristais (morte dos cristais) a partir do quarto dia após ensaio de cristalização.

resultados obtidos levam a uma clara observação, que a proteína no estado apo se encontra instável. O que demonstra que antes da cristalização demandam esforços no sentido de estabilização da proteína em solução, o que fica evidenciado em diversas etapas do processo de purificação com obtenção de menor rendimento por conta de precipitação da proteína em solução, além de altas quantidades de proteína que sempre ficam retidas na membrana do concentrador no processo de concentração da proteína, o que não é verificado para o receptor no estado holo.

Figura-21. Resultados obtidos nos ensaios de cristalização do hTRα1LBD

apo. Em A foto da proteína precipitada, em B foto de uma espécie de gel formado que ficava aderida à lamínula, a foto B está em preto e branco para melhorar o contraste do objeto mostrado.

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CAPÍTULO - DIFRAÇÃO DE RAIOS-X