SELEÇÃO DE INIBIDORES DE α-amilases ESPECÍFICOS PARA Anthonomus grandis (*)

SELEÇÃO DE INIBIDORES DE α-AMILASES ESPECÍFICOS PARA Anthonomus grandis (*) Rafael Perseghini Del Sarto (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia; UnB / rafaelpds@pop.com.br), Maria Cristina Mattar da Silva (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Cleiton Carlos Macedo da Cruz (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Edson Luiz Zangrando Figueira (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Fabíola Rodrigues Teixeira (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Andréia Queiroz Maranhão (UnB), Marcelo Macedo Brígido (UnB), Márcia Fernandes da Costa (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Marise Ventura Coutinho (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Izabel Cristina Bezerra (Embrapa Hortaliças), Maria Fátima Grossi-de-Sá (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia)

RESUMO – O bicudo do algodoeiro, Anthonomus grandis, provoca grandes perdas para a agricultura

devido aos danos causados as maçãs e botões florais do algodoeiro. A utilização biotecnológica de proteínas envolvidas na defesa vegetal, como inibidores de α-amilases (αAIs), são poderosas ferramentas para o controle de insetos-praga. Nesse contexto, αAIs variantes foram selecionados a partir de uma biblioteca de αAIs utilizando a metodologia de Phage Display. A biblioteca foi construída utilizando recombinação homóloga (DNA shuffling) dos genes de αAI1 e αAI2, isolados de sementes de Phaseolus vulgaris, resultando em 107 moléculas recombinantes. As variantes de αAIs foram

selecionadas contra as α-amilases de A. grandis. Para garantir o dobramento adequado para atividade inibitória de α-amilases, os genes para as variantes foram sub-clonados em vetor específico para expressão em plantas de Arabidopsis thaliana. Os extratos vegetais foram utilizados em ensaios in vitro e in vivo para selecionar inibidores de α-amilases potentes e específicos contra a larva do bicudo do algodoeiro. Os resultados confirmam que a biblioteca combinatória é uma excelente ferramenta para gerar grande número de moléculas variantes com atividade e especificidade melhorada para insetos-praga.

Palavras-chave: Bicudo do algodoeiro, DNA shuffling, Phage Display

SCREENING OF SPECIFIC α-AMYLASE INHIBITORS TO THE COTTON BOLL WEEVIL CONTROL

ABSTRACT - The cotton boll weevil Anthonomus grandis cause severe losses to agriculture due to

their damage in cotton floral buds. Biotechnological approaches employing proteins involved in plant defense, such as the α-amylase inhibitors (αAIs), are powerful tools for the control of insect pests. In this context, αAI variants from a previously generated shuffled αAI library have been screened using phage display methodology. The library was produced by homologous gene recombination (DNA shuffling) of αAI1 and αAI2 genes, isolated from Phaseolus vulgaris seeds, resulting in 107 _recombined

molecules. The genes for the αAI variants were selected against A. grandis α-amylases. To guarantee the correct folding needed for amylase inhibitory activity the variant genes were sub-cloned into plant expression vectors to be expressed in Arabidopsis thaliana plants. The plant extracts were used in the assays, both in vitro and in vivo, to select specific and potent α-amylase inhibitors against boll weevil larvae. Our data confirm that the combinatorial library is a great tool to generate large numbers of variant molecules with improved activities and specificities towards insect pests.

INTRODUÇÃO

O bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis) ataca as estruturas reprodutivas das plantas de algodão danificando as maçãs e os botões florais onde se alimenta e se desenvolve. A identificação de grânulos de amido nestes órgãos e a detecção de altos níveis de α-amilases no intestino de larvas do inseto sugerem o envolvimento dessas enzimas na digestão de amido durante sua dieta (OLIVEIRA NETO et al. 2003) potencializando a utilização de inibidores de α-amilases (α-AIs) como estratégia de controle da praga.

Os inibidores de α-amilases são bem caracterizados em sementes de leguminosas e cereais. A semente do feijão comum (Phaseolus vulgaris) possui um inibidor de α -amilase do tipo lectina (α-AI1) com atividade inibitória para a α-amilase pancreática de porco (PPA) e dos insetos Callosobruchus maculatus (CMA) e C. chinenses (CCA), mas não apresenta atividade para as α-amilases dos bruquídeos Acanthoscelides obtectus (AOA) e Zabrotes subfasciatus (ZSA), importantes pragas de feijões armazenados. No entanto, o feijão comum selvagem possui uma isoforma, denominada α-AI2 que possui atividade para ZSA e não para as α-amilases de mamíferos (FRANCO et al., 2002).

A tecnologia de Phage Display combinada às técnicas de recombinação gênica (ex. DNA shuffling, mutagênese sitio dirigida, e outras) tem sido amplamente utilizada na evolução molecular in vitro de moléculas para obtenção de características desejadas. Assim, variantes de inibidores enzimáticos podem ser gerados e selecionados contra insetos-praga, com elevada especificidade e atividade (BEEKWILDER, et al., 1999; EL ZOEIBY et al., 2003; HUANG et al., 2003; CECI et al., 2003; CAMPOS et al., 2004) podem ser gerados e selecionados contra insetos específicos. Neste contexto, o trabalho teve como objetivo selecionar αAIs específicos contra o bicudo do algodoeiro partindo de uma biblioteca combinatória de αAIs, construída com o produto de DNA Shuffling dos genes α-AI1 e α-AI2 do feijão comum. Foram selecionados 22 genes mutantes mostrando afinidade contra α-amilase de A. grandis (AGA) semi-purificada. Estes genes foram subclonados em vetor de expressão em planta para transformação de Arabidopsis thaliana. As formas variantes de α-AIs selecionadas foram utilizadas em experimentos de atividade iniibitória in vitro e bioensaios. Os dados indicaram genes para variantes de α-AIs com atividade elevada, os quais serão utilizados na transformação de plantas de algodão, via engenharia genética, visando à resistência ao bicudo do algodoeiro.

MATERIAL E MÉTODOS

Extração de α-amilase de bicudo do algodoeiro

Larvas do terceiro instar foram maceradas em 500 µL de solução de extração (10 mM E-64 e pepstatina A 5 µg/mL), centrifugadas a 10.000 g, 4ºC, 30 min. O sobrenadante coletado foi filtrado e o extrato total foi quantificado segundo o método descrito por Bradford (1976).

Purificação parcial de α-amilase de bicudo do algodoeiro em cromatografia hidrofóbica

Para purificar a α-amilase de bicudo do algodoeiro (AGA), 14,3mg do extrato total de larvas foi aplicado em coluna hidrofóbica Phenyl Sepharose CL 4B ® Amersham como descrito em Silva et al., 2001. As proteínas adsorvidas à resina foram eluídas com um gradiente linear decrescente de 1M a 0 M de sulfato de amônio. Frações de 1 mL foram coletadas em fluxo de 1 mL/min. A eluição de

proteínas foi monitorada pela absorbância a 280 nm em cada fração. Os ensaios iodométricos de atividade amilolítica e de degradação de amido em gel semi-desnaturante foram realizados conforme Campos et al. (1989) a fim de identificar as frações ativas.

Seleção de genes mutantes de αAIs com afinidade para as α-amilase de A. grandis.

A seleção de variantes de αAIS foi realizada de acordo com o protocolo estabelecido por Barbas et al., (2001) utilizando 50 µg/poço de AGA semi-purificada. Os fagos específicos foram eluídos com tampão ácido (0,1 M glicine-HCl pH 2,2) e imediatamente neutralizados com soluçãoTris-base 2 M, pH 8,0. O enriquecimento de fagos específicos foi monitorado através de titulação de unidades formadoras de colônias de bactérias infectadas durante cada ciclo de seleção.

Expressão das mutantes de αAIs em E. coli e análises de seqüências

O precipitado de bactéria do ciclo de seleção escolhido foi utilizado para preparação de DNA plasmidial e transformação de E. coli TOP10 F´. As colônias isoladas foram analisadas por PCR e a expressão de 96 clones aleatórios foi induzida com 1 mM de IPTG. Os sobrenadantes dos cultivos de expressão foram avaliados em imunodots usando anticorpo anti-hemaglutinina para identificar clones expressando os αAIs recombinantes. Esses clones foram seqüenciados , cujas seqüências foram alinhadas com os genes parentais, utilizando-se o algorítmo ClustalW, para identificação das mutações.

Inserção dos genes mutantes de αAIs em vetor para expressão em planta

Os oligonucleotídeos inciadores XmaIPSAI e SacIAI1 contendo o peptídeo sinal do α-AI1 foram usados para amplificação dos genes selecionados e subclonagem no vetor de expressão em planta pCambia2300 sob controle do promotor 35S duplicado do vírus do mosaico da couve-flor (35sdCaMV). Os transformantes positivos foram confirmados por PCR, digestão e seqüenciamento. Estas construções (pC35sdCaMV/a-AImutAGA) foram usadas para transformar A. thaliana ecotipo Columbia usando o método de imersão do botão floral descrito por Clough e Bent (1998).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com o objetivo de selecionar variantes de αAIs contra α-amilases do bicudo do algodoeiro, extrato total de larvas do inseto foi purificado em cromatografia hidrofóbica (Fig. 1a). As frações de 78-99 com atividade amilolítica foram eluídas na concentração de 0,22 M a 0 M de (NH4)2SO4. O pico

com atividade foi analisado em géis SDS-PAGE (Fig. 1b) e a atividade foi confirmada em ensaio de atividade em gel semi-desnaturante (banda entre 43 e 29 kDa) (Fig. 1c).

Uma biblioteca combinatória de αAIs contendo

3,7 x 107 _{variantes, gerada pela}

recombinação dos genes α-AI1 e

α-AI2, através de DNA shuffling foi utilizada na seleção de α-AIs variantes contra as enzimas digestivas do bicudo do algodoeiro. Seguindo Barbas et

al. (2000) a seleção foi realizada usando 50 µg de AGA para imobilizar poços de placa de ELISA. No segundo ciclo de seleção a população de fagos estabilizou-se e se manteve durante os três ciclos subseqüentes, indicando que o enriquecimento dos variantes com afinidade para AGA ocorreu nesse ciclo.

Figura 1: (a) Purificação de extrato de larva de A. grandis em Phenyl

Sepharose CL-4B. A cromatografia foi feita com um gradiente linear decrescente de 1 M a 0 M de (NH4)2SO4 (---). A proteína eluída foi monitorada a 280 nm (______{). As frações ativas (}

*****) foram reunidas e dialisadas. (b) SDS-PAGE da semi-purificação de AGA. Marc- Marcador de massa molecular de proteína, 1 - extrato total, 2 - pico ativo. (c) ensaio em gel de atividade amilolítica. 1-extrato total, 2- pico ativo. (massa molecular aproximada do marcador de proteína. O pico ativo, foi utilizado nos experimentos de seleção. 0 0,15 0,3 1 21 41 61 81 101 121 Frações ABS 280 nm 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 [(NH 4₎ 2_SO 4_] 200 kDa 97,4 kDa 68 kDa 43 kDa 29 kDa 18,4 kDa 14,6 kDa Marc 1 2 200 kDa 97,4 kDa 68 kDa 43 kDa 29 kDa 18,4 kDa 14,6 kDa 1 2 (a) (b) (c) , C11 F8 A3 A4 H5 B2 H10 G8 G4 A5 D9 E11 E8 B1 E7 A11 D10 E12 D12 H7 G9 H7 , C11 F8 A3 A4 H5 B2 H10 G8 G4 A5 D9 E11 E8 B1 E7 A11 D10 E12 D12 H7 G9 H7 A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 2: (a) Imunodot, usando anticorpo anti-HA, dos clones que apresentaram afinidade para AGA. Posições H9 e H12 representam controles negativos e positivos, respectivamente. (b) Ilustração demonstrando o perfil de recombinação de 22 mutantes obtidos da seleção contra AGA. Em azul representação de seqüências do α-AI-1 e em vermelho referem-se à sequências do α-AI-2.

O DNA plasmidial do segundo ciclo de seleção foi utilizado na transformação de células bacterianas. As variantes de αAIs selecionadas foram expressadas em fagos e 31 clones foram detectados no imunodot (Fig. 2a). Desses clones, 27 foram seqüenciados e as análises de seqüências indicaram 22 formas variantes apresentando, cada uma delas, diferente padrão de recombinação (Fig. 2b). Os ensaios in vitro e bioensaios utilizando as plantas modelo de Arabadopsis expressando os 22 variantes para αAIs mostraram variado espectro de atividade contra as α-amilases alvo. Estes ensaios estão sendo repetidos para validação estatística dos resultados.

CONCLUSÃO

A estratégia utilizada permitiu selecionar variantes de inibidores de enzimas hidrolíticas com variado espectro de atividade contra as α-amilases de A. grandis. Após validação por meio de bioensaios, os genes para variantes de α-AIs, com especificidade e alta atividade serão disponibilizados para utilização em programas de melhoramento genético de algodão, via engenharia genética, visando a obtenção de plantas de algodão geneticamente modificadas com resistência ao bicudo do algodoeiro. Em adição, análises estruturais in silico serão realizadas para elucidar as interações envolvidas com a atividade específica dos inibidores, contribuindo para o desenho de moléculas efetivas no desempenho da atividade biológica.

(*)Trabalho financiado por: Embrapa, Facual, Fialgo e CNPq

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