AVALIAÇÃO DO TEOR DE ISOFLAVONAS EM SOJA BRASILEIRA

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AVALIAÇÃO DO TEOR DE ISOFLAVONAS EM SOJA BRASILEIRA

Abstract

This work reports the isoflavone contents of soybean (Glycine max. L) cultivars from the Agronomic Institute of Campinas (IAC), Brazil. The effect of the temperature on extraction of soybean isoflavones was also studied. At 25ºC, the IAC Foscarin 31-1 cultivar showed mean content of 1405 mg/g, whereas the IAC 15-1 cultivar showed about 3008 mg/g. Heating at 121ºC for 40 min, the malonyl isoflavone concentration was 17.6 times lower and the glycoside isoflavones was of 2.5 times higher. © 2001 Altaga. all rights reserved.

Key words: Isoflavone, malonyl, glycoside, soybean

Resumen

Se analizaron los contenidos de isoflavonas en cultivares de soja (Glycine max L.) provenientes del Instituto Agronómico de Campinas (IAC), Brasil. El efecto de la temperatura en la extracción de isoflavonas de soja también se estudió. A temperatura ambiente, el cultivar IAC Foscarin 31-1 presentó un contenido medio de isoflavonas de 1405 mg/ g, en cuanto que el cultivar IAC 15-1 presentó cerca de 3008 mg/g. El calentamiento a 121ºC durante 40 min provocó una reducción de hasta 17,6 veces en el contenido de malonil-isoflavonas y un aumento de aproximadamente 2,5 veces en la concentración de glicosil-isoflavonas. © 2001 Altaga. Todos los derechos reservados.

Palabras clave: Isoflavona, malonil, glicosilada, soja

Resumo

Analisou-se os teores de isoflavonas em cultivares de soja (Glycine max L.) provenientes do Instituto Agronômico de Campinas (IAC) e o efeito da temperatura na extração de isoflavonas de soja. À temperatura ambiente, o cultivar IAC Foscarin 31-1 apresentou teor médio de isoflavonas de 1405 mg/g, enquanto que o cultivar IAC 15-1 apresentou cerca de 3008 mg/g. O aquecimento a 121ºC durante 40 min promoveu uma redução de até 17,6 vezes no teor de malonil-isoflavonas e um aumento de aproximadamente 2,5 vezes na concentração de glicosil-isoflavonas. © 2001 Altaga. Todolos dereitos reservados.

Palavras chave: Isoflavona, malonil, glicosilada, soja

SURVEY OF ISOFLAVONE CONTENTS IN BRAZILIAN SOYBEAN

EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE ISOFLAVONAS EN SOJA BRASILEIRA

Park, Y. K.

1*

_{; Aguiar, C. L.}

1

_{; Alencar, S. M.}

1

_{; Mascarenhas, H. A. A.}

2

_{; Scamparini, A.R.P.}

1

Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Laboratório de Bioquímica, Caixa Postal, 6177, CEP. 13083-970, Campinas/SP, Brasil.

2

Instituto Agronômico de Campinas, Centro de Plantas Gramíferas, Caixa Postal, 28, CEP. 13001-970, Campinas/SP, Brasil.

* Autor para la correspondecia. E-mail: ykpark@fea.unicamp.br

Recibido: 27de Diciembre de 2000; recibida versión revisada: 24 de Enero de 2001; aceptado: 9 de Febrero de 2001 Received: 27 December 2000; revised version received: 24 January 2001; accepted: 9 February 2001

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INTRODUÇÃO

O Brasil é o segundo maior exportador de grãos de soja (Glycine max L.) e o principal exportador de farelo de soja, com 32% do mercado mundial, o que representa 75% da produção brasileira (Roessing, 1995). A soja tem sido utilizada há muito tempo como alimento devido ao seu elevado teor protéico. Entretanto, também possui na sua composição química compostos polifenólicos como, por exemplo, os isoflavonóides que exercem importantes propriedades biológicas, tais como atividade antioxidante (Esaki et al., 1999a; Esaki et al., 1998; Shahidi et al., 1992), atividade anti-fúngica (Naim et al. 1974), propriedades estrogênicas (Murphy, 1982) e atividade anti-cancerígena (câncer de mama e próstata) (Coward et

al., 1993; Peterson & Barnes, 1993; Denis et al., 1999).

Países orientais como, Japão e China, já utilizam há muitos anos a soja fermentada na alimentação e, atualmente, tem-se percebido um crescente consumo desta leguminosa e de seus derivados em países europeus e nos Estados Unidos, como alimento funcional. Nos Estados Unidos, para este ano, a produção de alimentos funcionais, como a soja, será de 20 bilhões de dólares, contudo estima-se que haverá um crescimento exponencial e, no ano 2010, atingirá a cifra de quase 60 bilhões de dólares (Henry, 1999).

Glicosil isoflavonas como, genistina e daidzina, possuem menor atividade biológica que suas formas agliconas, genisteína e daidzeína, e são as principais formas encontradas no grão de soja, constituindo de 50 a 90% dos flavonóides em farinha de soja (Eldridge, 1982; Fukutake et al., 1996). Outros compostos derivados destes compostos glicosilados foram identificados e, compreendem a forma malonil-β-glicosil isoflavona, que é transformada à glicosil isoflavona e acetil isoflavona durante o processamento da soja para extração do óleo. Acetil isoflavona também pode ser convertida em glicosil isoflavona, sendo esta convertida por fermentação à forma aglicona.

Atualmente existem muitos produtos comerciais a base de soja, como bolos, chocolates, biscoitos, cápsulas enriquecidas com farinha de soja, que possuem na sua composição isoflavonas glicosiladas (Coward et al., 1993; Wang & Murphy, 1994) ou na forma de acetil e

malonil-β-glicosil isoflavonas (Kudou et al., 1991). Os produtos de soja tradicionalmente usados no Japão, tais como miso,

natto e tempeh são ativos contra a peroxidação lipídica,

pois apresentam atividade antioxidante, além de atividade contra tumores pediátricos (Schweigerer et al., 1992), câncer de próstata (Peterson & Barnes, 1993; Adlercreutz

et al., 2000), câncer de cólon (Steelle et al., 1995) e

inibição de neovascularização, ou angiogênese (Fotsis et

al., 1993).

Os teores de isoflavonas em suas diferentes formas variam de acordo com as condições climáticas e do cultivar analisado. Segundo Carrão-Panizzi et al. (1999), a concentração de isoflavonas em soja é geneticamente determinada e afetada pelos fatores ambientais, pela temperatura local.

Este trabalho teve como objetivo avaliar os teores de isoflavonas e verificar o efeito de duas condições de

temperatura (25 e 121ºC) na extração das isoflavonas de cultivares brasileiros de soja.

MATERIAL E MÉTODOS Materiais

Para a produção dos extratos metanólicos de soja foram utilizados cultivares concedidos pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC), sendo: IAC 15-1, IAC 15-2, IAC-20, IAC-22 e IAC-Foscarin 31-1.

Padrões de isoflavonas foram usados para identificar através do espectro de absorção de cada composto e para quantificar estes compostos em soja. Daidzeína e genisteína foram obtidas da Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA). Daidzina e genistina foram obtidas da Funakoshi Chemical Co. (Tókio, Japão). Glicitina e gliciteína foram avaliadas usando daidzina e daidzeína, porque padrões não são viáveis. Acetil e malonil isoflavonas foram calculadas a partir de seus β -glicosídeos, devido à semelhança dos coeficientes de extinção molecular (Kudou et al., 1991). Padrões para estas formas de isoflavonas são facilmente decompostas, não estando disponível comercialmente (Coward et al., 1998).

Métodos analíticos

As isoflavonas de soja foram extraídas de acordo com método descrito por Fukutake et al. (1996), adaptado para as condições experimentais, como descrito a seguir.

Temperatura ambiente

A massa de grãos de soja, cerca de 5 g, foi triturada e peneirada. Em seguida foi desengordurada com 50 mL de n-hexano por 30 minutos a 25ºC. Após isso, as amostras foram centrifugadas e o resíduo foi seco à temperatura ambiente. Amostras de 1 g de farinha desengordurada de soja, foram submetidas à extração com 10 mL de solução 80% de metanol durante 2 horas a 25ºC. Em seguida, foram centrifugadas a 8000 rpm e o sobrenadante utilizado por CLAE.

Tratamento térmico

Amostras de 1 g de soja desengordurada, foram tratadas a 121ºC por 40 minutos, em solução aquosa (1:5, p/v). O resíduo obtido foi liofilizado e, em seguida foi feita a extração com 10 mL de solução 80% de metanol, durante 2 horas a 25ºC. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 8000 rpm e o sobrenadante utilizado para as análises por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa.

As análises dos extratos metanólicos de soja por CLAE em fase reversa, foram feitas de acordo com Esaki et al. (1999b), adaptado para as condições experimentais desenvolvida, ou seja; vinte microlitros foram injetados em cromatógrafo líquido Shimadzu, equipado com detector de arranjo de fotodiodos (SPD-M10A) e, coluna YMC PACK ODS-A. Um gradiente dos solventes água-ácida (solvente A) e metanol (solvente B) foi usado como fase móvel. O gradiente

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Concentrações de isoflavonas extraídas, µµg/g

Glicosil Isoflavonas Malonil Isoflavonas Isoflavonas Agliconas Cultivar de

soja IAC Daidzina Glicitina Genistina

Sub-total Malonil daidzina Malonil glicitina Maloni gesnistina Sub

-total Daidzeína Gliciteína Genisteína Sub-total Total Foscarin 31-1 25ºC 118,4±18,4 16,1± 4,1 245,0±20,0 379,5 355,4±35,4 43,4±5,4 607,7±37,7 1006,5 5,1±0,2 ND 13,9±3,0 19,0 1405,0 Foscarin 31-1 121ºC 290,7±25,7 32,4±7,4 652,3±52,3 975,4 _25,4_±_3,4 _ND _61,4_±_6,4 86,8 _27,9_±_2,9 _ND _52,4_±_4,6 80,3 _1142,3 15-1 25ºC 265,8±25,8 76,9±6,9 448,5±38,5 791,2 812,1±42,1 153,5±38,5 1235,8±35,8 2201,4 5,4±0,3 ND 9,7±2,3 15,1 3007,7 15-1 121ºC 620,0±40,0 130,4±10,4 1286,2±186,2 2036,6 _69,9_±_4,9 _2,0_±_0,9 _110,4_±_9,4 182,3 _35,7_±_4,7 _ND _60,4_±_6,6 96,1 _2315,0 15-2 25ºC 201,9±11,9 42,2±3,2 334,9±34,9 579,0 731,0±33,0 105,7±5,7 1074,5±54,5 1911,2 8,0±0,9 ND 12,0±1,1 20,0 2510,2 15-2 121ºC 504,1±24,1 79,6±7,6 977,5±67,5 1561,2 _58,3_±_5,3 _ND _50,5_±_4,5 108,8 _34,8_±_2,8 _ND _54,5_±_5,3 89,3 _1759,3 20 25ºC 307,9±27,9 44,6±4,6 270,3±20,3 622,8 789,0±43,7 76,8±6,8 715,2±25,2 1581,0 18,3±0,8 ND 22,2±1,2 40,5 2244,3 20 121ºC 749,4±44,4 81,8±7,8 756,3±46,3 1587,5 _63,0_±_5,3 _ND _56,6_±_6,6 119,6 _57,1_±_8,1 _ND _50,6_±_6,6 107,7 _1814,8 22 25ºC 322,7±28,7 17,9±3,9 321,0±31,0 661,6 451,5±31,5 46,2±3,8 786,6±26,6 1284,3 7,6±0,6 ND 11,0±0,8 18,6 1964,5 22 121ºC 700,8±30,8 35,1±3,1 826,0±56,0 1561,9 57,6±9,2 ND 69,1±7,2 126,7 59,3±6,3 ND 54,8±3,8 114,1 1802,7

começou com 20% de B (0-15 min), avançou até 80% (75-95min) e decresceu até 20% de B (95-105 min) com um fluxo de 0,5 mL/min. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão a partir de três repetições para cada cultivar analisado.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise quantitativa de daidzina, daidzeína, genistina e genisteína foi feita por comparação com padrões conhecidos. Segundo Kudou et al. (1991), os coeficientes de extinção molecular de malonil-daidzeína e malonil-genisteína são aproximadamente iguais aos de daidzina e genistina, respectivamente, sendo possível a análise quantitativa destas formas isoméricas a partir destes conjugados glicosilados. Barnes et al. (1994) e Coward et al. (1998), utilizaram a semelhança dos coeficientes de extinção molecular de malonil isoflavonas aos de seus conjugados glicosilados, para identificar estes compostos. Outros estudos mostram a possibilidade de purificar as formas malonil glicosídeos (Wang & Murphy, 1994; Aussenac

et al., 1998), mas estas são decompostas à

glicosil-isoflavonas após cerca de cinco dias, devido às suas baixas estabilidades. Daidzeína, daidzina, genisteína e genistina foram analisada por comparação com padrões conhecidos, como descrito por Coward et al. (1993) e Coward et al. (1998). As concentrações dos conjugados de malonil-glicosil e acetil-glicosil foram calculadas a partir de curvas padrões de seus β-glicosídeos correspondentes. Gliciteína e seus conjugados foram calculados usando daidzeína e seus conjugados, visto que padrões autênticos para estas não são disponíveis.

De acordo com estudos prévios (Coward et al., 1993), solução 80% de metanol mostrou ser um ótimo solvente para extração de isoflavonas conjugadas e não-conjugadas. Kudou et al. (1991), reporta que malonil-glicosil isoflavonas são os isômeros de isoflavonas em maior quantidade em grãos de soja e são termolábeis, sendo convertidos à suas glicosil-isoflavonas correspondentes. Barnes (1998) reportou que a extração of isoflavonas de produtos de soja com solução 80% de metanol à temperatura ambiente foi eficiente tanto quanto à 60-80ºC e, que a extração à temperaturas elevadas causa alterações na composição de isoflavonas. Portanto, foi utilizado neste trabalho solução 80% de metanol à temperatura ambiente para a extração de isoflavonas.

Foram observados diferentes teores de isoflavonas para cada cultivar analisado, como foi observado anteriormente por Carrão-Panizzi et al. (1999), quando analisou diferentes cultivares de soja. O cultivar IAC-Foscarin 31-1 foi o que apresentou menor teor de isoflavonas totais (1405 µg/g), enquanto que os cultivares IAC 15-1 e IAC 15-2 apresentaram os maiores teores de isoflavonas totais (3007,7 e 2510,2

µg/g), em microgramas de isoflavonas por grama de farinha desengordurada de soja (Tabela 1). A Figura 1 mostra os cromatogramas de dois cultivares analisados, monitorados a 254 nm. Os teores de glicitina foram baixos tanto à temperatura ambiente quanto após aquecimento. Após tratamento térmico, malonil-isoflavonas (malonil-daidzina e malonil-genistina) foram convertidas à glicosil-isoflavonas, sendo que a maior conversão foi percebida no cultivar IAC 15-1 (Figura 1), do qual foi extraído grande concentração das formas glicosiladas.

Tabela 1.- Teores de isoflavonas de farinha desengordurada de soja. Os dados representam a média ± desvio padrão em microgramas de isoflavonas por grama de farinha desengordurada de soja. O tratamento térmico da suspensão aquosa de farinha desengordurada de soja foi feito a 121ºC por 40 minutos. ND = Não Detectado.

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Em todos os cultivares, a extração após aquecimento, teve um aumento nos teores de glicosil-isoflavonas quando comparadas àquelas obtidas de extrações à temperatura ambiente (Tabela 1). Foi observado que os teores de glicosil-isoflavonas aumentaram cerca de 2,5 vezes, em média, após aquecimento. Segundo Coward et al. (1993) na forma de malonil-β-glicosil isoflavonas, os isoflavonóides são instáveis e sensíveis ao aquecimento, decompondo com facilidade à forma glicosilada. A temperatura, tanto da localidade de cultivo quanto da extração, é um fator importante na composição das diferentes formas dos isoflavonóides encontrados em soja.

CONCLUSÕES

O cultivar IAC 15-1 teve maior conteúdo de isoflavonas totais entre os cultivares analisados. A extração após tratamento térmico, promoveu redução média de até 17,6 vezes no teor de malonil-isoflavonas (para IAC 15-2) e, aumento nas concentrações de glicosil isoflavonas (aumento médio de 2,5 vezes).

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