Características polimórficas: marcadores
de variabilidade genética entre indivíduos,
populações, espécies e taxons superiores.
• Marcadores moleculares: características
moleculares polimórficas.
Marcadores
Moleculares
• Proteínas/Enzimas.
• Genes.
• Segmentos de DNA
não codificadores.
Tipos de marcadores
• Técnicas não baseadas em PCR:
• Alozimas;
• RFLP;
Alozimas
• Variantes alélicas de enzimas codificadas por
genes estruturais.
• Aplicações: genética de populações e estudos
de padrão de herança.
• Vantagens: baixo custo e baixa demanda
técnica, alta reprodutibilidade, alelos
codominantes.
• Desvantagens: baixa abundância, baixo nível de
polimorfismo e co-migração de não homólogos.
RFLP – Restriction fragment Length
Polymorphism
• Polimorfismo de tamanho dos fragmentos de
restrição.
• Aplicações: análise sistemática; mapeamento de
genes; genética de populações.
• Vantagens: abundância genômica; alelos
codominantes e alta reprodutibilidade.
• Desvantagens: alta demanda técnica e de
trabalho, grande quantidade de DNA de alto peso
molecular.
Minissatélites (VNTR/LTR)
• Hibridização Southern blot: sondas multilocus.
• Aplicações: DNA fingerprinting (genética forense) • Vantagens: alto nível de polimorfismo e alta
reprodutibilidade
• Desvantagens: altos custos e demanda técnica; sem especificidade de locus ou de alelos.
• Sondas locus específicas: clonagem molecular de fragmentos de restrição.
Técnicas baseadas em PCR:
• RAPD;
• SCAR;
• SSCP;
• PCR-RFLP;
• Microssatélites;
• Sequenciamento de DNA.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
• PCR com primers curtos (10 pb) de sequência randômica. • Um primer forward e reverse amplifica fragmentos em 1–
10 sítios genômicos simultaneamente.
• Fragmentos entre 0,5 – 5 kb: presença e ausência de bandas
• Aplicações: mapeamento de genes; identificação genética de indivíduos e de linhagens e de espécies próximas.
• Vantagens: alta abundânica genômica; alto nível de
polimorfismo; pequena quantidade de DNA; disponibilidade de primers randômicos.
• Desvantagens: baixa reprodutibilidade; locus inespecífico e alelos dominantes.
SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)
• Amplificação com primers específicos (15-30 pb) → a partir das sequências de nucleotídeos de fragmentos de RAPD clonados.
• Polimorfismos de tamanho são detectados por eletroforese. • Aplicações: mapeamento de genes e melhoramento
genético
• Vantagens: rápido e fácil; alta reprodutibilidade; alelos codominantes e pequena quantidade de DNA.
• Desvantagens: ensaio de RAPD prévio e sequência conhecida para desenhar primers específicos.
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
• Fragmentos de DNA (200–500 pb) amplificados por PCR → primers (20-25 pb).
• DNA é desnaturado antes da eletroforese (calor, NaOH e formamida) e o gel não é desnaturante.
• Aplicações: detecção de mutação em regiões de
sequência conhecida (principalmente genes) e estudos de associação.
• Vantagens: alelos codominantes e pequena quantidade de DNA.
• Desvantagens: sequência conhecida; controle das
condições de eletroforese; uso de controles e fragmentos pequenos.
PCR -RFLP (Restriction fragments length polymorphism)
• Fragmentos de DNA amplificados por PCR (300 a 1800 pb) → primers específicos (20-25 pb).
• Digestão dos fragmentos amplificados com enzimas de restrição:polimorfismos de tamanho → variação na
ocorrência de sítios de restrição.
• Aplicações: mapeamento de genes; estudos de associação.
• Vantagens: alelos codominantes; pequena quantidade de DNA e alta reprodutibilidade.
• Desvantagens: sequência conhecida para desenho de primers específicos, baixa abundância genômica.
Criando um sítio de restrição
• ALA
• 539 540 541 545 546
• Sequência normal....5'..GAA GCA GAA TGG...GCA GG...3' • Iniciador (3') GT CGT ACC...CGT CC
• Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG...3'
•
• Fnu4HI ou BsoFI
•
Gel de agarose, mostrando os
3 genótipos
DNA Repetitivo
• Moderadamente repetitivo: 30%
• Altamente repetitivo: 10%
– Repetições em tandem
• Satélite
• Minissatélite
• Microssatélite
– Repetições dispersas
DNA Repetitivo em tandem
• Satélite
(bloco total: 100 Kb até 1Mb)
– Tipo 1 – unidade de repetição: 28-48pb:
heterocromatina centromérica.
– Tipo 2 e 3 - 5pb: em todos cromossomos
– Tipo alfa – 171pb: heterocromatina centromérica
– Tipo beta – 68pb: heterocromatina centromérica
DNA Repetitivo em tandem
• Minissatélite
(bloco: 0,1 até 20 Kb)
– Família telomérica – tamanho da unidade de
6 pb: todos os telômeros
– Família hipervariável – 9 a 24 pb: todos os
cromossomos, em geral na proximidade dos
telômeros
• Microssatélite
(bloco: menor que 150 pb)
– Tamanho da repetição – 1 a 4 pb: todos os
cromossomos
Microssatélites (STR)
• Aplicações: genética de populações, mapeamento de genes, genética forense.
• Vantagens: alta abundânica genômica, alto nível de polimorfismo, pequena quantidade de DNA, alta
reprodutibilidade, alelos codominantes, locus específicos. • Desvantagens: alelos nulos – mutações no sítio de
Alelo 1 – 15 repetições CA Alelo 2 – 17 repetições CA Alelo 3 – 18 repetições CA
Sequenciamento
• Método de Sanger
• NGS
Diferentes características e aplicações
• Abundância genômica.
• Nível de polimorfismo.
• Especificidade de locus.
• Codominância dos alelos.
• Reprodutibilidade.
• Quantidade de DNA.
• Custos.
• Região do DNA associada a uma característica
de interesse (estudos de associação).
• Mapas físicos de cromossomos e de genomas:
marcadores moleculares.
• Estudos de ligação entre alelo do marcador
molecular e característica de interesse.
• Sequenciamento
da
região
do
marcador
molecular e busca por genes candidatos.
Busca por genes candidatos
• Genética forense.
• Ferramentas de manejo: genética da
conservação.
• Auxiliares na análise sistemática: diferenças
e semelhanças evolutivas entre os táxons.
• Complexidade da Arquitetura Genômica: nº de Locos; suas interações e seus efeitos fenotípicos.
• Tamanho da amostra, densidade de marcadores, distribuição de marcadores, número de características quantitativas consideradas.
Projeto 1000 genomas
Projeto 1000 genomas
• O Projeto 1000 Genomas funcionou entre
2008 e 2015, criando o maior catálogo
público de dados de variações e genótipos
humanos.
• O objetivo foi encontrar a maioria das
variantes genéticas com frequências de
Projeto 1000 genomas
Ensembl
• O Ensembl é um navegador de genomas:
genômica comparativa, evolução, variação
de sequências e regulação transcricional.
QTL
• Quantitative trait loci (QTLs) são regiões
do genoma responsáveis pela expressão
de caracteres fenotípicos, que possuem
distribuição contínua
• Ex.: altura e peso de plantas e de animais;
produção de grãos; teor de óleo etc.
• Os marcadores moleculares tornaram
possível mapear regiões cromossômicas
(QTLs) que afetam esses caracteres
quantitativos.
QTL
• Mapear um QTL significa identificar sua
posição no genoma e estimar seus efeitos
genéticos, tais como: o efeito aditivo,
efeito de dominância e outros efeitos
presentes no modelo adotado.
QTL - exemplo
• A velocidade de processamento se refere à
velocidade com que um indivíduo pode
realizar qualquer operação cognitiva.
• A
velocidade
de
processamento
correlaciona-se
fortemente
com
a
capacidade
cognitiva
geral,
diminui
acentuadamente
com
a
idade
e
é
prejudicada
em
vários
distúrbios
neurológicos e psiquiátricos.
QTL - exemplo
• A identificação de genes que influenciam
a
velocidade
de
processamento
provavelmente melhorará a compreensão
da
genética
da
inteligência,
do
envelhecimento biológico e das etiologias
de vários distúrbios.
QTL - exemplo
• Em um estudo foram feitas análises de
associação específica de ligação e QTL.
•
• A amostra incluiu 1291 indivíduos
mexicanos-americanos.
QTL - exemplo
• O desempenho em todos os três fatores
distintos de velocidade de processamento:
• (Velocidade Psicomotora; Sequenciamento
e Deslocamento e Fluência Verbal) eram
moderadamente
e
significativamente
herdáveis.
QTL - exemplo
• Foi encontrado um QTL significativo no
cromossomo 3q23 para a velocidade
psicomotora (LOD = 4,83).
• Dentro desse locus, foi identificado um
gene candidato plausível e interessante
para a velocidade psicomotora.
QTL - exemplo
QTL - exemplo
• O gene RASA2 (RAS p21 Protein
Activator 2) é expresso no cérebro
humano (cerebelo e hipotálamo).
• RASA2 codifica a proteína RAS que
controla diversas vias de sinalização
celular, incluindo crescimento, migração e
adesão.
Referências
• Knowles, E., Mathias, S., Mollon, J., Rodrigue, A., Koenis, M., Dyer, T., . . . Glahn, D. (2018). A QTL on chromosome 3q23 influences processing speed in humans. Genes, Brain, and Behavior, E12530.
• Toledo, E. R., Leandro, R. A., Souza Junior, C. L., SOUZA, A. P. (2008). Mapeamento de QTLS : uma abordagem bayesiana. Rev. Bras. Biom., v.26, n.2, p.107-114.
