Produção de microgéis de goma gelana em dispositivos de microfluídica

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ANA LETICIA RODRIGUES COSTA

PRODUÇÃO DE MICROGÉIS DE GOMA GELANA EM DISPOSITIVOS DE MICROFLUÍDICA

CAMPINAS 2015

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos

ANA LETÍCIA RODRIGUES COSTA

PRODUÇÃO DE MICROGÉIS DE GOMA GELANA EM DISPOSITIVOS DE MICROFLUÍDICA

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Engenharia de Alimentos.

Orientadora: Profª. Dra. Rosiane Lopes da Cunha

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ANA LETICIA RODRIGUES COSTA, E ORIENTADA PELA PROFª. DRA. ROSIANE LOPES DA CUNHA

Profª. Dra. Rosiane Lopes da Cunha

CAMPINAS 2015

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816

Costa, Ana Letícia Rodrigues,

C823p CosProdução de microgéis de goma gelana em dispositivos de microfluídica / Ana Letícia Rodrigues Costa. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.

CosOrientador: Rosiane Lopes da Cunha.

CosDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.

Cos1. Emulsões. 2. Microgéis. 3. Microfluídica. 4. Encapsulação. I. Cunha, Rosiane Lopes da. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Production of gellan gum microgels in microfluidic devices Palavras-chave em inglês:

Emulsions Microgels Microfluidic Encapsulation

Área de concentração: Engenharia de Alimentos Titulação: Mestra em Engenharia de Alimentos Banca examinadora:

Rosiane Lopes da Cunha [Orientador] Lucimara Gaziola de la Torre

Samantha Cristina de Pinho

Data de defesa: 22-04-2015

Programa de Pós-Graduação: Engenharia de Alimentos

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BANCA EXAMINADORA

Profª. Dra. Rosiane Lopes da Cunha

Departamento de Engenharia de Alimentos / FEA / UNICAMP – Orientadora

Profª. Dra. Lucimara Gaziola de la Torre

Departamento de Engenharia Química / FEQ / UNICAMP – Membro titular

Profª Dra. Samantha Cristina de Pinho

Departamento de Engenharia de Alimentos / FZEA / USP – Membro titular

Profª Dra. Lizielle Maria Ricardo Guerreiro

Departamento de Engenharia de Alimentos / DEA/ UFTM – Membro suplente

Profª Dra. Fabiana Perrechil Bonsanto

Resumo

vii RESUMO

A técnica de emulsificação em dispositivos de microfluídica é utilizada para a produção de gotas de diâmetro reduzido e distribuição de tamanho monodispersa. A gelificação da fase dispersa de emulsões água em óleo pode levar à formação de microgéis com elevado potencial para encapsulação de compostos ativos. Do ponto de vista tecnológico, a utilização de partículas de tamanho reduzido permite entrega mais fácil e liberação do bioativo de forma mais eficiente no local alvo. Este trabalho teve como objetivo estudar o processo de formação de microgéis de goma gelana em dispositivos de microfluídica utilizando a técnica de focalização hidrodinâmica. Foram avaliadas as concentrações da goma gelana de 0,5 a 0,7% (m/m) e do agente gelificante acetato de cálcio nas concentrações de 0,5 e 2,0% (m/m) para formação dos microgéis. Na primeira etapa, emulsões simples água em óleo, sendo a fase dispersa constituída de água ou dispersões aquosas de goma gelana e fase contínua constituída por uma mistura composta por óleo de soja e o emulsificante polirricinoleato de poliglicerol (PGPR), foram avaliadas quanto ao regime de formação de gotas em diferentes vazões das fases e razões entre as vazões das fases dispersa e contínua. Também foram determinadas as velocidades reais das fases dentro dos dispositivos de microfluídica e os números adimensionais de Reynolds, Capilar e Weber que descrevem o escoamento dos fluidos no microcanais. Com o controle da condição de processo, vazão de entrada das fases dispersa e contínua, foi possível observar as variações no regime de formação de gotas, que variou desde o gotejamento até o jateamento. Em geral, todas as vazões calculadas (reais) das fases foram menores do que aquelas aplicadas na bomba, sendo este resultado relacionado às limitações das dimensões dos canais e alta viscosidade das fases. Desta forma, os números de Reynolds, Capilar e de Weber calculados a partir das velocidades reais das fases foram menores quando

Resumo

viii

comparados com os valores obtidos usando as velocidades impostas na bomba. Na etapa seguinte, microgéis de goma gelana foram produzidos nos microcanais e caracterizados pela distribuição de tamanho de gotas e microscopia ótica. Os microgéis possuíam formato regular e esférico e distribuição de tamanho altamente monodispersa. O potencial da utilização de microgéis de goma gelana na encapsulação de compostos ativos foi avaliado adicionando o corante hidrofílico Rhodamina B na fase aquosa. As partículas obtidas na saída do dispositivo possuíam coloração vermelha, referente à boa retenção do corante hidrofílico. Desta forma, conclui-se que os microgéis obtidos pela técnica da microfluídica poderão ser utilizados na encapsulação de compostos hidrofílicos, inclusive aqueles sensíveis à temperatura, como as vitaminas e probióticos, na imobilização de proteínas e enzimas, bem como, na entrega de drogas, pois além de apresentarem baixa polidispersidade na distribuição de tamanho das partículas mostraram elevada capacidade de retenção do corante utilizado para simular o composto ativo de interesse.

Abstract

ix ABSTRACT

Emulsification in microfluidic devices is used for the production of droplets with reduced diameter and monodisperse particle size distribution. Gelation of the disperse phase of water in oil emulsions leads to formation of microgels with high potential for the encapsulation of active compounds. Small particle size allows more efficient release of the bioactive at the target site. This work aimed to study the production of gellan microgel using microfluidic devices through flow- focusing technique. Gellan gum concentration of 0.6% (w/w) and calcium acetate (gelling agent) in concentrations of 0.5 and 2.0% (w/w) were used for the formation of microgels. In the first step, it was evaluated of the droplets formation regime at different flow rates of the phases and flow rate ratio of the dispersed and continuous phases of water-in-oil emulsions, composed by dispersed phase of water or gellan aqueous solutions and continuous phase constituted of a mixture composed of soybean oil and the emulsifier polyglycerol polyricinoleate (PGPR). The real velocity of the phases within the microfluidic devices and dimensionless numbers of Reynols, Capilar and Weber that describe the flow of fluids in microchannels were also evaluated. By controlling the process conditions and the input flow rate of dispersed and continuous phases, variations in the drop formation regime were observed which varied from dripping to the jetting regime, such variation exerted strong influence on droplet size. In general, the real flow rate (calculated values) was lower than those applied by pump, which was related with limitations of the size of channels and high viscosity of the phases. Reynolds, Capilar and Weber numbers calculated from the real velocity were smaller compared with the values obtained using the speed imposed by pump. In the next step, gellan microgels were produced the microchannel and characterized by droplet size distribution and optical microscopy. The microgels exhibit uniform and spherical shape and highly monodisperse

Abstract

x

distribution size. Potential use as gellan microgels as encapsulating matriz of active compounds was evaluated by adding the hidrophilic dye, Rhodamine B, in the aqueous phase. Results showed a low polydispersity and high hidrophilic compound retention capacity, indicating that microgels obtained by microfluidic technique may be used for the encapsulation of hydrophilic compounds that are sensitive to temperature, such as vitamins, probiotics and immobilization of proteins and enzymes, as well as in drug delivery.

Sumário

xi SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ... xix

LISTA DE TABELAS ... xxiii

LISTA DE NOMENCLATURA ... xxv

Capítulo 1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 1

1.1 INTRODUÇÃO ... 3

1.2 OBJETIVOS ... 5

1.2.1 Objetivo Gera1 ... 5

1.2.2 Objetivos Específicos ... 5

Capítulo 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 7

2.1 EMULSÕES ... 9

2.2 MICROGÉIS ... 10

2.3 MICROFLUÍDICA ... 11

2.3.1 Mecanismos de produção de gotas ... 13

2.3.2 Regimes de formação das gotas ... 14

2.4 MICROGÉIS EM DISPOSITIVOS DE MICROFLUÍDICA ... 16

2.5 GOMA GELANA ... 21

Capítulo 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 23

3.1 MATERIAL ... 25

3.1.1 Microgéis ... 25

3.1.2 Microcanais ... 25

3.2 MÉTODOS ... 25

3.2.1 Produção dos microcanais ... 25

3.2.2 Preparo das soluções ... 29

3.2.3 Produção dos microgéis ... 30

3.2.4 Caracterização dos macrogéis ... 38

3.2.5 Propriedades físicas das fases aquosa e oleosa ... 39

3.2.6 Caracterização dos microgéis ... 40

Sumário

xii

Capítulo 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 43

4.1 FORMAÇÃO DOS MACROGÉIS ... 45

4.1.1 Determinação das concentrações dos componentes da formulação para formação de géis ... 45

4.2 PROPRIEDADES FÍSICAS DAS FASES AQUOSA E OLEOSA ... 49

4.2.1 Comportamento reológico ... 49

4.2.2 Densidade ... 54

4.2.3 Tensão interfacial ... 55

4.3 PRODUÇÃO DAS GOTAS NOS MICROCANAIS ... 57

4.3.1 Regime de formação de gotas ... 57

4.3.2 Vazão Real das Fases ... 61

4.3.3 Taxa de deformação e Números adimensionais ... 66

4.4 PRODUÇÃO DOS MICROGÉIS DE GOMA GELANA NOS MICROCANAIS73 4.4.1 Distribuição de tamanho e Tamanho médio das partículas ... 73

4.4.2 Microscopias óticas ... 82

Capítulo 5. CONCLUSÃO ... 89

Dedicatória

xiii

A Deus, que permitiu que tudo isso pudesse ser realizado, sendo meu amparo e refúgio em todos os momentos, pois comprovado é o Teu amor por mim.

A Cláudia Isabel e Joaquim Rodrigues, que souberam abrir mão dos seus sonhos para que os meus pudessem ser realizados e que foram, nesta etapa, presença constante e grandes

incentivadores.

A minha irmã Ana Clarice fruto do cuidado de Deus para comigo, água e vinho. E como ela mesma diz: “Deixa chegar o sonho, prepara uma avenida que agente vai passar”. Ao Fábio que teve a paciência de me modelar e me mostrar que pra esta vida há outro sentido e

que sonhar juntos é muito melhor do que sonhar sozinho. Amo vocês!

Agradecimentos

xv

Ao Laboratório de Engenharia de Processos da Universidade Estadual de Campinas, pelo apoio técnico e cientifico durante o trabalho. A Vanessa Martins por todos os ensinamentos e paciência. Em especial, a Andresa Gomes pela amizade, orações e apoio na execução deste projeto. A todos os integrantes do LEP que me acolheram com tanto carinho e sempre estiveram dispostos a me ajudar.

A Universidade Estadual de Campinas pela oportunidade concedida para a realização deste mestrado. Aos professores do Departamento de Engenharia de Alimentos pelos ensinamentos e conhecimento transmitido.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa Científica e Tecnológica (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) pelo apoio financeiro.

Agradeço ao apoio técnico do Professor Ângelo Gobbi e da Maria Helena de Oliveira Piazzeto e a infraestrutura do Laboratório de Microfabricação do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) durante todo o trabalho.

Em especial, agradeço a Profª. Drª. Rosiane Lopes da Cunha pela oportunidade e confiança depositada em mim, seus ensinamentos foram essenciais para a minha formação profissional.

Aos meus amigos do MUR de Campinas que me ensinaram que podemos sim sonhar um “Sonho de Amor para o mundo” juntos. Ao Éder Valdir e Guilherme Almeida pelo colo, pelo choro, pelas risadas, amizade que vale mais que qualquer tesouro. Ao Eric Keven companheiro de caminhada, companheiro de todas as horas felizes e daquelas não tão felizes.

Epígrafe

xvii

“Eu te agradeço Senhor, de todo meu coração, por Teu amor e fidelidade. Quando eu gritei, Tu me ouviste, e aumentaste a força em minha alma. Senhor, Tu farás tudo por mim. O Teu amor é para sempre! Não abandoneis a obra de Tuas mãos.” Salmo 137

Lista de Figuras

xix

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Dispositivo de microfluídica planar obtido pela técnica de litografia macia utilizando polidimetilsiloxano (PDMS). Fonte: Oliveira (2014)... 12 Figura 2.2. Dispositivos de microfluídica: A) junção tipo T, B) co-flowing e C) focalização hidrodinâmica. Fonte: Adaptado de Zhang et al. (2013) ... 13 Figura 2.3. Regimes de formação de gotas: A) squeezing, B) gotejamento e C) jateamento. Fonte: Tarchichi; Chollet; Manceau (2013) e Utada et al. (2007)... 15 Figura 2.4. Produção de microgéis por gelificação física em dispositivos de microfluídica 16 Figura 2.5. Esquema de formação de microgéis pelo método de coalescência das gotas. Insere-se em A) a solução contendo o agente reticulante, em B) solução do biopolímero e em C) fase contínua. Adaptado de Tumarkin; Kumacheva (2009) ... 18 Figura 2.6. Esquema de formação de microgéis pelo método de gelificação interna. Insere-se em A) a faInsere-se aquosa contendo o polímero e o agente reticulante/gelificante (na forma inativa) e em B) solução ácida na fase contínua que irá desencadear a formação do

microgel. Adaptado de Zhang et al. (2007) ... 19 Figura 2.7. Esquema de formação de microgéis pelo método de gelificação externa. Insere-se em A) a faInsere-se aquosa contendo o polímero e em B) a faInsere-se oleosa com o agente reticulante que ao ionizar irá desencadear a formação do microgel. Adaptado de Zhang et al. (2007) . 20 Figura 2. 8. Esquema de formação de microgéis pelo método de mistura in-situ. Insere-se em A) a fase aquosa contendo o polímero, em B) o composto ativo, em C) o agente

gelificante (na forma ativa) e em D) fase oleosa (modificação da gelificação interna) ou em A) e C) a fase aquosa contendo o polímero, em B) composto ativo e em D) a fase oleosa contendo o agente gelificante (modificação da gelificação externa) ... 21 Figura 2.9. Unidade repetida do tetrassacarídeo que compõe a goma gelana (TANG;

TUNG; ZENG, 1996) ... 22 Figura 3.1. Processo de fabricação dos microcanais de PDMS pela técnica de litografia macia. Fonte: Vladisavljevic; Kobayashi; Nakajima (2012) ... 27 Figura 3.2. Dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica para produção de microgéis de goma gelana pelo método de gelificação externa. Entrada da A) fase dispersa (dispersão de goma gelana) e B) fase contínua (óleo de soja + PGPR). Em detalhe a região de mistura ... 28

Lista de Figuras

xx

Figura 3.3. Dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica para produção de microgéis de goma gelana pelo método de gelificação por mistura in-situ. Entrada da A) fase dispersa (dispersão de goma gelana), B) ativo (Rhodamina B) e C) fase contínua (óleo de soja + PGPR + acetato de cálcio) ... 29 Figura 3.4. Etapas para a obtenção e caracterização dos microgéis de goma gelana ... 30 Figura 3.5. Aparatos para observação da formação dos microgéis nos microcanais. A) Bomba seringa e B) microscópio... 32 Figura 3.6. Desprendimento da gota para obtenção da diferença de posição (D) e diâmetro da gota (dg) determinados a partir da análise da imagem pelo NIS- Elements D3.2 (Japão) ... 35 Figura 4.1. Macrogéis de goma gelana obtidos pelo método de gotejamento dispostos na base do texturômetro para ensaio de compressão ... 45 Figura 4.2. Força máxima dos macrogéis de goma gelana formados com acetato de cálcio. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p ≤ 0,05). Letras maiúsculas: diferenças entre as concentrações de goma gelana para uma concentração fixa de sal. Letras

minúsculas: diferenças entre as concentrações de sais para uma concentração fixa de goma gelana. AC: acetato de cálcio ... 47 Figura 4.3. A) Curva de escoamento e B) influência da taxa de deformação na viscosidade aparente da dispersão aquosa de goma gelana 0,6% (m/m) a 25°C ... 50 Figura 4.4. Curvas de escoamento das soluções das soluções oleosas (óleo de soja, acetato de cálcio e PGPR) a 25°C ... 52 Figura 4.5. Comportamento Newtoniano descrito pela Equação de Einstein da mistura do óleo de soja, PGPR e o acetato de cálcio ... 53 Figura 4.6. Tensão inicial e no equilíbrio entre as fases aquosa e oleosa dos sistemas

propostos. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p ≤ 0,05). Letras minúsculas: tensão inicial e letras maiúsculas: tensão no equilíbrio. Subíndices, O: óleo de soja; AC: acetato de cálcio; A: água; G: dispersão aquosa de goma gelana (0,6% m/m) e PGPR: polirricinoleato de poliglicerol ... 56 Figura 4.7. Regimes de formação de gotas (Qc=2µL/min). A) Squeezing (Qd= 2,0 µL/min); B) gotejamento (Qd= 0,5 µL/min) e C) jateamento (Qd= 3,5 µL/min) ... 58

Lista de Figuras

xxi

Figura 4.8. Regime de formação de gotas nas diferentes vazões de fase contínua (Qc) (óleo

de soja + PGPR) e fase dispersa (Qd) constituída de: A) água e B) dispersões aquosas de

goma gelana 0,6% (m/m)... 59 Figura 4.9. Gotas de goma gelana (0,6 % (m/m)) produzidas no microcanal e último estágio da formação da gota no microcanal. Vazão da fase dispersa constante (Qd= 1µL/min) e

vazão da fase contínua (Qc) variando de: A) 1 µL/min, B) 1,5 µL/min, C) 2,0 µL/min, D)

2,5 µL/min e E) 3,0 µL/min ... 60 Figura 4.10. Estágios de formação da gota de goma gelana (0,6% m/m) no microcanal em função do tempo espacial.Vazão da fase contínua Qc= 1µL/min e vazão da fase dispersa Qd

=1 µL/min, onde: A) 0,00 ms; B) 0,60 ms; C) 0,120 ms; D) 0,180 ms ... 61 Figura 4.11. Vazão real das fases. A fase contínua é formada pelo óleo de soja + PGPR e a fase dispersa formada por: A) água e B) dispersão aquosa de goma gelana 0,6% (m/m). Subíndices: bomba: valor imposto na bomba e real: valor calculado a partir da medida da velocidade ... 64 Figura 4.12. Regime de formação de gotas para as vazões impostas na bomba (bomba) e vazões calculadas (real) nas diferentes vazões de fase contínua (óleo de soja + PGPR) e fase dispersa constituída de: A) água e B) dispersões aquosas de goma gelana 0,6% (m/m) ... 66 Figura 4.13. Curva de distribuição de tamanho dos microgéis de goma gelana (0,6% m/m) obtidos a partir da concentração de 0,5% (m/m) de acetato de cálcio, sob condições de processo de: A) Qc bomba= 2,0 µL/min, B) Qc bomba= 2,5 µL/min, C) Qc bomba= 3,0

µL/min, D) q < 0,5 e E) q > 1,0 ... 75 Figura 4.14. Quebra das gotas de goma gelana (0,6% m/m) na saída do dispositivo de microfluídica ... 76 Figura 4.15. Curva de distribuição de tamanho dos microgéis de goma gelana obtidos a partir da concentração de 2,0% (m/m) de acetato de cálcio, sob condições de processo de: A) Qc bomba = 2,0 µL/min variando as razões entre as vazões (q) e B) q < 0,5 variando a

vazão da fase contínua ... 77 Figura 4.16. Curva de distribuição de tamanho dos microgéis de goma gelana obtidos a partir da concentração de 0,5 e 2,0% (m/m) de acetato de cálcio, sob condições de processo de: A) Qc bomba= 2,0 µL/min (q < 0,5) e B) Qc bomba= 2,0 µL/min (q > 1) ... 80

Lista de Figuras

xxii

Figura 4.17. Curva de distribuição de tamanho dos microgéis de goma gelana obtidos a partir da concentração de 0,5 e 2,0% de acetato de cálcio, sob condições de processo de: A) Qc bomba= 2,0 µL/min (q < 0,5) e B) Qc bomba= 3,0 µL/min (q < 0,5) ... 80

Figura 4.18. Microgéis de goma gelana (0,6% m/m) durante a saída dos microcanais nas razões entre vazões (q bomba) igual a 1. Vazões de fase contínua (Qc bomba): A) 2,0 µL/min,

B) 2,5 µL/min e C) 3,0 µL/min ... 83 Figura 4.19. Microscopia de fluorescência dos microgéis de goma gelana (0,6% m/m) obtidos nas condições de processo de: Qd real= 0,4 µL/min e Qc real= 1,6 µL/min (Qd bomba=

1,5 µL/min e Qc bomba= 3,0 µL/min). A) Áreas em vermelho: óleo de soja durante a

formação das gotas de goma gelana e B) áreas verdes: microgéis de goma gelana coletados na saída dos dispositivos de microfluídica (barra de escala equivale a 100 µm) ... 84 Figura 4.20. Microgéis de goma gelana obtidos na saída do dispositivo obtidos nas

condições de processo de: Qd bomba= 1,5 µL/min e Qc bomba= 3,0 µL/min (Qd real= 0,4 µL/min

e Qc real= 1,6 µL/min). As áreas em vermelho mostram a retenção da Rhodamina B dentro

das partículas ... 85 Figura 4.21. Formação das gotas de goma gelana (0,6% m/m) obtidas nas condições de processo de: Qd bomba= 1,5 µL/min e Qc bomba= 3,0 µL/min (Qd real= 0,4 µL/min e Qc real= 1,6

µL/min). A) Microscopia ótica da gelificação da gota de goma gelana pelo método de gelificação da mistura in-situ; B) microscopia de fluorescência da solução aquosa de

Rhodamina B e C) sobreposição das imagens ... 86 Figura 4.22. Microgéis de goma gelana (0,6% m/m) obtidos pelo método de gelificação mistura in-situ após 24 horas nas condições de processo de: Qd real= 0,4 µL/min e Qc real= 1,6

µL/min (Qd bomba= 1,5 µL/min e Qc bomba= 3,0 µL/min). A) Microscopia ótica e B)

microscopia de fluorescência, as áreas em vermelho mostram a retenção do corante

Lista de Tabelas

xxiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1. Etapas para avaliação da obtenção e caracterização dos microgéis de goma gelana ... 38 Tabela 4.1. Viscosidades das soluções oleosas (óleo de soja, acetato de cálcio e PGPR) a 25°C ... 54 Tabela 4.2. Efeito da concentração de acetato de cálcio na densidade das soluções oleosas (óleo de soja, acetato de cálcio e PGPR) a 25°C ... 54 Tabela 4.3. Taxas de deformação calculadas a partir da vazão da bomba e da vazão real dos sistemas com água e dispersão aquosa de goma gelana (0,6% m/m) ... 68 Tabela 4.4. Número de Capilar calculado a partir da vazão imposta na bomba e a real dos sistemas com água e dispersão aquosa de goma gelana (0,6% m/m) ... 70 Tabela 4.5. Número de Weber calculado a partir da vazão imposta na bomba e a real dos sistemas com água e dispersão aquosa de goma gelana (0,6% m/m) ... 70 Tabela 4.6. Valores das vazões e razões entre as vazões das fases dispersa e contínua, obtidas a partir das vazões impostas na bomba e as reais (calculadas) utilizadas para

produção dos microgéis nos microcanais ... 74 Tabela 4.7. Diâmetro médio (D32), span e coeficientes de variação (CV) dos microgéis de

Lista de Nomenclatura

xxv

LISTA DE NOMENCLATURA γ: tensão interfacial (N.m-1

)

ΔA: ganho de área superficial após a emulsificação (m2

) T: temperatura absoluta (K)

ΔSf: aumento da entropia devido ao processo de emulsificação (J.K-1)

ΔGf: variação na Energia Livre de Gibbs do sistema (J)

q: razão entre vazões das fases dispersa e contínua Qd: vazão da fase dispersa

Qc : vazão da fase contínua

Re: número de Reynolds Ca: número de Capilar We: número de Weber

ρc : densidade da fase contínua (kg.m-3)

ρ_d : densidade da fase dispersa (kg.m-3

) v_c: velocidade da fase contínua (m.s-1) vd: velocidade da fase dispersa (m.s-1)

𝐷H: diâmetro hidráulico (m) que é avaliado como:

𝐷𝐻= (4𝑥 Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑐𝑜𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜) 𝑃𝑒𝑟í𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑚𝑜𝑙ℎ𝑎𝑑𝑜⁄

µc: viscosidade da fase contínua (Pa.s)

L: largura do microcanal (m) γ : tensão interfacial (N.m-1

) vg : velocidade da gota (m.s-1)

Lista de Nomenclatura

xxvi V : volume da gota (m³)

f : frequência de formação da gota (s-1

) dg: diâmetro da gota (m) h: altura do microcanal (m) tg: tempo de geração (s) γ̇ : taxa de deformação (s-1) n: índice de comportamento σ_o: tensão residual (Pa)

k: índice de consistência (Pa.sn)

ni: número de partículas com diâmetro di, sendo que, d(0,1), d(0,5) e d(0,9): diâmetro abaixo

dos quais 10, 50 e 90% das partículas da distribuição encontram-se, respectivamente DP: desvio padrão do diâmetro médio superficial (D₃₂)

𝜂 : viscosidade da suspensão (Pa.s) 𝜂1: viscosidade da fase contínua (Pa.s)

Ø: fração volumétrica da fase dispersa Q: vazão de entrada das fases (m³.s-1

) v: velocidade de entrada das fases (m.s)

At: área da seção transversal do microcanal (m2) D: coeficiente de difusão dos íons cálcio (m².s-1)

C: concentração dos íons de cálcio na superfície da gota (mol.m-3

) r: raio da gota (m)

S: concentração de íons cálcio reticulados (mol.m-3) CV: coeficiente de variação (%)

Capítulo 1 Introdução

1

Capítulo 1 Introdução e Objetivos

3

1.1 INTRODUÇÃO

As emulsões são sistemas termodinamicamente instáveis, porém a redução do tamanho e da polidispersidade da distribuição de tamanho das gotas com a adição de agentes emulsificantes e/ou estabilizantes aumentam sua estabilidade cinética. Os emulsificantes atuam na interface das gotas, formando camadas protetoras que reduzem a tensão interfacial e impedem a agregação da fase dispersa (MCCLEMENTS; DECKER; WEISS, 2007). Existem duas grandes classes de emulsificantes: os de baixa massa molecular (monoglicerídeos, polissorbatos, lecitina, dentre outros) e os macromoleculares (usualmente proteínas, principalmente do leite, da soja e ovo) (DICKINSON, 1992). Além disso, a estabilidade das emulsões pode ser aumentada pela adição de espessantes, que são agentes que modificam a viscosidade ou levam à formação de gel da fase contínua. Os principais espessantes utilizados são os polissacarídeos, como as gomas carragena, xantana, gelana e jataí (MCCLEMENTS; DECKER; WEISS, 2007).

Tradicionalmente, as emulsões são obtidas a partir de processos que utilizam intensas forças mecânicas como as obtidas em equipamentos de ultrassom, ou com homogeneização a alta pressão. No entanto, estas técnicas levam a emulsões com ampla distribuição de tamanho das gotas, aquecimento das emulsões durante o processo e elevado consumo de energia, quando comparadas com emulsões obtidas por técnicas recentes. Neste sentido, técnicas inovadoras vêm sendo desenvolvidas com o intuito de se obter emulsões mais estáveis e com menor consumo de energia, como a emulsificação espontânea e a microfluídica (SHAH et al., 2008, VLADISAVLJEVIC; KOBAYASHI; NAKAJIMA, 2012).

A técnica de emulsificação em dispositivos de microfluídica é utilizada para a produção de gotas de diâmetro reduzido e com distribuição monodispersa de tamanho de

Capítulo 1 Introdução e Objetivos

4

gotas (SHAH et al., 2008, ZHAO, 2013), com menor demanda de energia. Além disso, como as emulsões são sistemas que possuem elevado potencial para encapsulação de compostos ativos, a vantagem de produzi-las em microcanais está em evitar a degradação de compostos sensíveis à temperatura e pressão. O uso de biopolímeros no preparo de emulsões pode permitir a gelificação da interface da gota, tornando as emulsões mais estáveis e com maior resistência mecânica. Do ponto de vista tecnológico, a utilização de partículas de tamanho reduzido, como os microgéis, permite entrega mais fácil e liberação do bioativo de forma mais eficiente no local alvo. Microesferas de hidrogel derivadas de biopolímeros têm uma vasta gama de aplicações, devido à sua baixa toxicidade, biocompatibilidade e a capacidade de se degradar sob a ação de estímulos biológicos, tais como mudança de pH ou interações com enzimas e proteínas (ZHANG et al., 2007).

O desafio da produção de microgéis em microcanais está na escolha da geometria do canal, definição do tempo de residência e como ocorrerão as etapas de emulsificação e gelificação do polímero no dispositivo de microfluídica. Existem diversos métodos para a produção de microgéis em dispositivos microfluídicos, sendo que os mais utilizados são a gelificação externa, gelificação interna, coalescência das gotas e a mistura in-situ. A escolha do método depende das propriedades do biopolímero, do agente reticulante/gelificante e do tipo de dispositivo de microfluídica que será utilizado para a produção dos microgéis.

A goma gelana é um polissacarídeo amplamente usado em alimentos, devido à sua elevada estabilidade térmica e capacidade de formar géis transparentes, mesmo em baixas concentrações (RODRÍGUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2003). Além disso, possui a capacidade de formar géis mais fortes em pH ácido (MORITAKA et al., 1995, YAMAMOTO; CUNHA, 2007) e na presença de sais de cátions mono e divalentes (FUJII

Capítulo 1 Introdução e Objetivos

5

et al., 2005). Apesar de sua relevância tecnológica ainda não há relatos da produção de microgéis de goma gelana em dispositivos de microfluídica. Desta forma, acredita-se que o sucesso da utilização dos dispositivos de microfluídica na produção dos microgéis de goma gelana e a potencial utilização na encapsulação de compostos ativos irão depender fortemente das condições de processo e ingredientes utilizados.

1.2 OBJETIVOS 1.2.1 Objetivo Gera1

 Contribuir na área de micropartículas, mais especificamente no desenvolvimento do processo de formação de microgéis de goma gelana em dispositivos de microfluídica.

1.2.2 Objetivos Específicos

 Determinar as concentrações adequadas para a formação dos microgéis nas diferentes concentrações da goma gelana e do agente gelificante acetato de cálcio (Ca(CH2COO)2) a partir da avaliação das propriedades mecânicas e estruturais dos

macrogéis obtidos pelo método de gotejamento.

 Avaliar o efeito das condições de processo (vazão de entrada imposta na bomba e calculada) no regime de formação de gotas, taxa de deformação e números adimensionais utilizando o mecanismo de focalização hidrodinâmica para produção de gotas nos microcanais.

 Caracterizar os microgéis de goma gelana obtidos nos dispositivos de microfluídica e estudar o potencial da utilização das micropartículas na encapsulação de compostos ativos hidrofílicos, usando a Rhodamina B como composto modelo.

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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2.1 EMULSÕES

Emulsão é a mistura de dois líquidos imiscíveis, em que um líquido é disperso na forma de pequenas gotas em outro líquido que constitui a fase contínua. As emulsões podem ser classificadas de acordo com a distribuição relativa das diferentes fases, sendo os tipos mais comuns as emulsões óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O).

A área interfacial total de uma emulsão é muito grande devido à quebra da fase dispersa em pequenas gotas. Como a área interfacial está associada com a tensão interfacial, sistemas emulsionados são termodinamicamente instáveis (CLAESSON; BLOMBERG; POPTOSHEV, 2003), pois apresentam uma quantidade de energia livre (ΔGf) de formação da emulsão sempre positiva (ANTON; BENOIT; SAULNIER, 2008),

como demonstrado na análise da Equação 2.1, derivada da Equação Fundamental da Termodinâmica. Os emulsificantes são agentes com atividade superficial ou tensoativos que tem como principal função diminuir a tensão interfacial (γ) entre a fase dispersa (gotas) e a fase contínua da emulsão. Menores valores de γ levam a uma diminuição da energia livre da emulsão, tornando-a assim mais estável cineticamente (MCCLEMENTS, 2005).

ΔG

= γΔA − TΔS

sendo que,

γ= tensão interfacial (N.m-1

)

ΔA= ganho de área superficial após a emulsificação (m2

) T= temperatura absoluta (K)

ΔSf= aumento da entropia devido ao processo de emulsificação (J.K-1)

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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A maioria dos métodos convencionais para produção de emulsões envolvem a quebra das gotas utilizando forças de cisalhamento ou tensões de impacto geradas por agitação manual ou mecânica. No entanto, tais esforços não são uniformes em todo o sistema, nem são finamente controlados devido ao variável campo de cisalhamento e pressão (SHAH et al., 2008). Consequentemente as emulsões formadas possuem maior valor de polidispersidade ou diferentes tamanhos das gotas dispersas na fase contínua, quando comparadas com emulsões obtidas por técnicas recentes, podendo causar uma alteração na organização estrutural ou na distribuição espacial das gotas da emulsão. Este tipo de emulsão é mais susceptível aos mecanismos de desestabilização física, o que é uma desvantagem quando comparada às emulsões com pequena variação nos tamanhos das gotas ou monodispersas (MCCLEMENTS, 2005).

2.2 MICROGÉIS

Os microgéis são géis com dimensões micrométricas, que podem ser produzidos por monômeros, polímeros ou biopolímeros, como proteínas e polissacarídeos. Devido à sua pequena dimensão, os microgéis têm potencial utilização em entrega e liberação de ativos, encapsulação de células ou como agentes texturizantes em alimentos ou cosméticos (RIVEST et al., 2007, HELGESON; CHAPIN; DOYLE, 2011, KESSELMAN et al., 2012). Alguns exemplos de aplicação em alimentos incluem encapsulação de óleo essencial de eucalipto em cápsulas de alginato, a encapsulação de microrganismos probióticos em cápsulas produzidas a partir de gomas gelana e xantana e partículas de κ-carragena e carboximetilcelulose para a encapsulação de beta-caroteno (CHANG; DOBASHI, 2003, MCMASTER et al., 2005, MUHAMAD et al., 2011, PERRECHIL, 2012).

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A maioria das técnicas de produção de microgéis baseiam-se em métodos tradicionais de polimerização em emulsões ou dispersões. Técnicas recentes baseadas na microfluídica proporcionam maior controle sobre a produção e distribuição de tamanho das partículas dos microgéis com polidispersidade abaixo de 5% (TUMARKIN; KUMACHEVA, 2009, FANG; CATHALA, 2011).

A produção de microgéis em dispositivos de microfluídica é geralmente feita em duas etapas. Inicialmente é feita a emulsificação (A/O) das soluções aquosas de polímeros ou monômeros e, em seguida, a etapa da gelificação das gotas resultantes por aplicação de métodos químicos ou físicos (ZHANG et al., 2007, TUMARKIN; KUMACHEVA, 2009). As dimensões, polidispersão das partículas, forma e morfologia dos microgéis são determinadas na etapa de emulsificação e estão fortemente relacionadas com o mecanismo de produção (geometria do canal) e regime de formação das gotas, bem como a composição e o tempo de residência do microgel nos microcanais (TUMARKIN; KUMACHEVA, 2009).

2.3 MICROFLUÍDICA

A microfluídica é a ciência que estuda o manuseio e processamento de fluidos em microcanais. Estudos realizados em sistemas microfluídicos baseados na formação de gotas vêm crescendo substancialmente nas últimas décadas, pois oferecem a possibilidade de manipular pequenos volumes de fluidos imiscíveis em valores muito baixos de número de Reynolds (SAMIE; SALARI; SHAFII, 2013).

Além de oferecer uma rota alternativa e versátil para a produção de emulsões, a microfluídica tem como principal vantagem a geração individual das gotas (SHAH et al., 2008), permitindo a produção de gotas pequenas e com valor extremamente reduzido de

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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polidispersidade. A geração de gotas monodispersas em dispositivos microfluídicos atrai atenção devido à potencial aplicação em áreas biológicas, médicas, químicas e alimentícias (SHUI; EIJK EL; VAN DEN BERG, 2007, DOLLET et al., 2008, LI et al., 2008).

O tamanho das gotas pode ser controlado com precisão através do ajuste da geometria dos dispositivos de microfluídica, das propriedades das duas fases líquidas (viscosidade e tensão interfacial) e dos parâmetros operacionais (vazão/velocidade de entrada das duas fases) (ZHAO; MIDDELBERG, 2011).

O polidimetilsiloxano (PDMS) é o elastômero mais utilizado na fabricação de dispositivos planares com a utilização da técnica de litografia macia (Figura 2.1) (SHAH et al., 2008). É um polímero hidrofóbico, de forma que é utilizado como material de parede dos microcanais para produzir emulsões do tipo água em óleo. Técnicas estão sendo desenvolvidas para alterar as propriedades das paredes internas de canais de PDMS para que emulsões óleo em água também sejam produzidas e a gama de aplicação dos dispositivos microfluídicos de PDMS seja aumentada (SHAH et al., 2008, ALMUTAIRI; REN; ZHOU et al., 2012).

Figura 2.1. Dispositivo de microfluídica planar obtido pela técnica de litografia macia utilizando polidimetilsiloxano (PDMS). Fonte: Oliveira (2014)

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2.3.1 Mecanismos de produção de gotas

Na etapa de emulsificação existem diferentes mecanismos para a produção das gotas. Em geral, a produção de emulsões simples em dispositivos de microfluídica envolve a injeção de uma fase líquida (fase dispersa) em outra fase líquida imiscível ou parcialmente imiscível (fase contínua) através do microcanal. As gotas são formadas e rompidas na junção dos canais onde as duas fases se encontram (ZHAO, 2013). A geração das gotas ocorre por diferentes e numerosos mecanismos que estão diretamente relacionados com a geometria do canal. Os mecanismos mais comuns de geração de gotas são: junção tipo T, co-flowing e focalização hidrodinâmica (Figura 2.2) (UMBANHOWAR; PRASAD; WEITZ, 2000, GAÑÁN-CALVO, 2004, ABATE et al., 2009).

A. junção tipo T B. co-flowing C. focalização hidrodinâmica Figura 2.2. Dispositivos de microfluídica: A) junção tipo T, B) co-flowing e C) focalização hidrodinâmica. Fonte: Adaptado de Zhang et al. (2013)

Na geometria de junção do tipo T, a fase contínua é introduzida pelo canal principal e a fase dispersa escoa através de um canal perpendicular ao principal. A combinação de tensões de cisalhamento geradas pela fase contínua e a evolução da pressão na gota

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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emergente faz com que a fase dispersa se alongue no canal principal até que se rompa em gotas (TEH et al., 2008, ZHAO; MIDDELBERG, 2011).

Nos dispositivos de co-flowing e de focalização hidrodinâmica, a geração das gotas depende das forças inerciais (CUBAUD et al., 2005, FU et al., 2009). Na geometria

co-flowing, duas correntes principais escoam na mesma direção e sentido separadas apenas

pelas paredes do canal que escoa o fluido que formará a fase dispersa. Quando o fluido do canal interno encontra a fase contínua inicia-se o processo de formação de gotas (SEEMANN et al., 2012).

Nos dispositivos de focalização hidrodinâmica a fase dispersa escoa pelo canal principal e a fase contínua pelos dois canais externos. Quando as duas fases se encontram no canal principal, a fase contínua exerce pressão e tensão de cisalhamento no fluido que escoa no canal central, levando à quebra da corrente em gotas (VLADISAVLJEVIC; KOBAYASHI; NAKAJIMA, 2012). O desenho simétrico das geometrias de focalização hidrodinâmica permite que as forças de cisalhamento sejam distribuídas mais homogeneamente, levando a uma geração mais estável e controlada das gotas (ZHAO, 2013).

2.3.2 Regimes de formação das gotas

O tamanho das gotas e polidispersidade dependem fortemente do regime de formação das gotas. Em dispositivos de microfluídica três regimes são observados:

squeezing, gotejamento e jateamento (Figura 2.3) (SEEMANN et al., 2012,

VLADISAVLJEVIC; KOBAYASHI; NAKAJIMA, 2012, ZHAO, 2013).

No regime squeezing, a fase dispersa inicialmente ocupa quase toda a seção transversal do canal principal, porque as forças associadas à tensão interfacial são mais

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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relevantes quando comparadas às tensões viscosas (DE MENECH et al., 2008, GLAWDEL; ELBUKEN; REN, 2012).

O regime de gotejamento é observado quando as gotas geradas são menores do que a largura do canal da fase contínua e o tamanho das gotas é determinado pelo equilíbrio entre a força de arrasto, que a fase contínua exerce sobre a gota emergente, e a força interfacial que se opõe ao alongamento do “pescoço” (DE MENECH et al., 2008).

Quando o ponto de ruptura se distancia do ponto de encontro entre as fases ocorre a passagem do regime de gotejamento ao regime de jateamento (VLADISAVLJEVIC; KOBAYASHI; NAKAJIMA, 2012). No regime de jateamento, a fase dispersa forma um “pescoço” longo no canal da fase contínua e a formação das gotas ocorre distante da junção dos canais (TARCHICHI; CHOLLET; MANCEAU, 2013).

Figura 2.3. Regimes de formação de gotas: A) squeezing, B) gotejamento e C) jateamento. Fonte: Tarchichi; Chollet; Manceau (2013) e Utada et al. (2007)

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2.4 MICROGÉIS EM DISPOSITIVOS DE MICROFLUÍDICA

A produção de microgéis em dispositivos de microfluídica pode ser feita de diferentes modos. A gelificação química é um método explorado para a preparação de microgéis em microcanais usando polimerização por fotoiniciação ou via redox. As gotas da emulsão de polímeros ou monômeros são formadas e expostas à radiação ultra-violeta (UV) para desencadear as reações químicas e assim, promover a gelificação das gotas. O inconveniente da técnica está na encapsulação de compostos bioativos sensíveis à radiação UV (TUMARKIN; KUMACHEVA, 2009).

A gelificação física é geralmente utilizada para a preparação de microgéis de biopolímeros, tais como agarose, alginato, carragena, quitosana, gelatina ou pectina. A gelificação dos biopolímeros é normalmente induzida por interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio ou interações eletrostáticas (TUMARKIN; KUMACHEVA, 2009). As diferentes maneiras de se realizar a gelificação física estão apresentadas na Figura 2.4.

Figura 2.4. Produção de microgéis por gelificação física em dispositivos de microfluídica Gelificação Física Gelificação Iônica Coalescência de gotas Mistura in-situ Gelificação Interna Gelificação Externa Gelificação térmica

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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Os alginatos têm sido um dos materiais mais populares na produção de microgéis devido às suas excelentes propriedades gelificantes, não toxicidade, excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade (YOO et al., 2006). Ainda não há relatos da utilização da goma gelana na obtenção de microgéis em dispositivos de microfluídica, mas de forma similar ao alginato, trata-se de um polissacarídeo biodegradável, não tóxico e de amplo uso na indústria de alimentos e em aplicações biotecnológicas. Forma géis transparentes que são resistentes ao aquecimento e à acidificação (FUJII et al., 2005, YAMAMOTO; CUNHA, 2007)

Como o foco do estudo será produzir microgéis de goma gelana, a seguir serão descritos os métodos classificados como gelificação iônica, que são os mais utilizados na produção de microgéis de alginato de cálcio.

3.4.1 Gelificação iônica

O mecanismo de gelificação iônica depende do tipo de polímero utilizado e do agente reticulante/gelificante adicionado. Os métodos mais utilizados estão descritos abaixo.

3.4.1.1 Coalescência das gotas

Inicialmente as emulsões de solução polimérica e solução gelificante são geradas em microcanais independentes através dos mecanismos de produção de gotas. As gotas da solução biopolimérica e a solução contendo o agente reticulante/gelificante são dispersas na fase contínua em comum, constituída pelo óleo e o agente emulsificante. Ambas se encontram em um canal principal denominado canal de síntese. É no canal de síntese, após a colisão das gotas, que ocorre a gelificação (ZHANG et al., 2007). A desvantagem do

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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método está na probabilidade de colisão, além da ampla distribuição do tamanho das gotas durante a coalescência fazendo com que, possivelmente, haja a necessidade do aumento da dimensão do canal para não haver adesão da gota nas paredes do canal de síntese (Figura 2.5).

Figura 2.5. Esquema de formação de microgéis pelo método de coalescência das gotas. Insere-se em A) a solução contendo o agente reticulante, em B) solução do biopolímero e em C) fase contínua. Adaptado de Tumarkin; Kumacheva (2009)

3.4.1.2 Gelificação interna

Neste processo, a fase aquosa é formada pelo biopolímero e o agente reticulante na forma inativa. As gotas formadas na fase contínua começam a gelificar pela ação do ácido liberado, presente na fase óleo, que ativa o agente reticulante (Figura 2.6). A dificuldade deste processo é alcançar o tempo espacial necessário para a gelificação das gotas (pequeno comprimento do microcanal). Além disso, a fase aquosa contém o polímero e o agente gelificante, podendo mostrar rápido aumento da viscosidade, dificultando a ruptura em gotas (TUMARKIN; KUMACHEVA, 2009, LIU et al., 2013).

Canal de Síntese C C A B C C

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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Figura 2.6. Esquema de formação de microgéis pelo método de gelificação interna. Insere-se em A) a fase aquosa contendo o polímero e o agente reticulante/gelificante (na forma inativa) e em B) solução ácida na fase contínua que irá desencadear a formação do microgel. Adaptado de Zhang et al. (2007)

3.4.1.3 Gelificação externa

Existem duas abordagens dependendo da forma de introdução do agente reticulante/gelificante. Na primeira, o agente reticulante é dissolvido na fase óleo, constituída também pelo agente emulsificante (Figura 2.7), para difundir-se para a fase aquosa, após as gotas serem geradas (ZHANG et al., 2006). A outra abordagem é que o agente reticulante é dissolvido em um banho que se localiza fora do dispositivo microfluídico. Neste caso, as gotas geradas são recolhidas e gelificadas neste banho contendo o agente reticulante (HUANG et al., 2007, YEH et al., 2009, REN et al., 2010). Zhang et al. (2007) produziram e compararam os métodos de gelificação interna e externa para a produção de microgéis de alginato de cálcio. Estes autores concluiram que a gelificação interna não permite controle sobre a morfologia do microgel, além de produzir microgéis com baixos valores de módulo de elasticidade. Em contraste, a gelificação externa produziu microgéis estáveis nas fases oleosa e aquosa, com morfologia controlada e

B B

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

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módulo de elasticidade próximo aos valores encontrados para microgéis de alginato preparados por métodos convencionais.

Figura 2.7. Esquema de formação de microgéis pelo método de gelificação externa. Insere-se em A) a fase aquosa contendo o polímero e em B) a fase oleosa com o agente reticulante que ao ionizar irá desencadear a formação do microgel. Adaptado de Zhang et al. (2007)

3.4.1.4 Mistura in-situ

Esta técnica pode ser tratada como uma modificação da gelificação interna. O polímero e agente reticulante/gelificante (na forma ativa) são inseridos no dispositivo microfluídico em dois microcanais distintos e a mistura dos fluidos ocorrerá na junção dos canais, seguida pela formação das gotas no canal principal através do mecanismo de focalização hidrodinâmica. Este tipo de método permite maior controle do processo de gelificação e aumento da viscosidade da fase dispersa. Outra abordagem é a introdução de um canal que contém o composto ativo a ser encapsulado entre os microcanais do polímero e do agente reticulante. No encontro dos canais ocorrerá a geração das gotas e posterior gelificação da macromolécula com o composto ativo encapsulado (LIU et al., 2013). A gelificação por mistura in-situ também pode ser utilizada como uma modificação da técnica de gelificação externa, onde o composto ativo a ser encapsulado e o polímero são

B

A

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

21

introduzidos em canais distintos e o agente gelificante presente na fase contínua se difunde para a interface das gotas formadas a partir do mecanismo de focalização hidrodinâmica, permitindo a gelificação do polímero (Figura 2.8).

Figura 2. 8. Esquema de formação de microgéis pelo método de mistura in-situ. Insere-se em A) a fase aquosa contendo o polímero, em B) o composto ativo, em C) o agente gelificante (na forma ativa) e em D) fase oleosa (modificação da gelificação interna) ou em A) e C) a fase aquosa contendo o polímero, em B) composto ativo e em D) a fase oleosa contendo o agente gelificante (modificação da gelificação externa)

2.5 GOMA GELANA

A goma gelana é um heteropolissacarídeo aniônico extracelular produzido pela bactéria Sphingomonas elodea, anteriormente classificada como Pseudomonas elodea (JANSSON; LINDBERG; SANDFORD, 1983).

O mecanismo de gelificação da goma gelana possui duas etapas. Inicialmente as cadeias desordenadas se organizam em duplas-hélices (transição conformacional), para

A

B

C

D

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

22

posteriormente ocorrer a interação entre as hélices (transição sol-gel) (RODRÍGUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2003). A transição conformacional ocorre com o aumento da temperatura da solução, a qual pode variar de 30 a 50 ºC, dependendo da concentração de polímero e da composição da solução (MILAS; RINAUDO, 1996, FLORES-HUICOCHEA et al., 2013). Em condições de baixa força iônica e pH neutro a interação entre as hélices é impedida pela repulsão eletrostática entre os grupos carboxílicos carregados negativamente. A adição de sal ou a redução do pH diminui a repulsão intermolecular entre as hélices permitindo a formação das zonas de junção e, consequentemente a formação do gel (YAMAMOTO; CUNHA, 2007, FUNAMI et al., 2008).

Desta forma, a interação entre as duplas-hélices depende da natureza dos cátions, sendo que o cátion divalente promove gelificação mais eficaz do que o cátion monovalente. Os cátions monovalentes diminuem a repulsão eletrostática e favorecem a agregação das duplas-hélices. Por outro lado, os cátions divalentes formam ligações iônicas diretamente com os grupos carboxílicos, em diferentes cadeias de goma gelana, resultando na agregação das duplas-hélices com pontes entre as cadeias (MIYOSHI; NISHINARI, 1999, KANESAKA; WATANABE; MATSUKAWA, 2004).

Figura 2.9. Unidade repetida do tetrassacarídeo que compõe a goma gelana (TANG; TUNG; ZENG, 1996)

Capítulo 3 Material e Métodos

23

Capítulo 3 Material e Métodos

25 3.1 MATERIAL

3.1.1 Microgéis

Para a produção dos microgéis foram utilizados óleo de soja comercial (Bunge Alimentos S.A., Brasil), goma gelana cedida pela Kelco (San Diego, EUA), emulsificante PGPR (polirricinoleato de poliglicerol) fornecido pela Danisco Brasil Ltda. (São Paulo, Brasil) e acetato de cálcio (Ca(CH3COO)2) da Sigma Aldrich – Corporation (St. Louis,

EUA).

3.1.2 Microcanais

Foi utilizado para a fabricação dos microcanais o polímero polidimetilsiloxano (PDMS) preparado com o kit Sylgard 184, composto pela base e o agente de cura (Dow Corning, EUA). Para a selagem dos canais foram utilizadas lâminas de vidro para microscopia (Ind. e Com. de Produtos Científicos Perfecta Ltda., Brasil). Mangueiras de silicone de 1 mm de diâmetro foram conectadas aos canais dos dispositivos de microfluídica, durante a etapa de deposição do PDMS no molde.

3.2 MÉTODOS

3.2.1 Produção dos microcanais

Os dispositivos foram produzidos em PDMS (polidimetilsiloxano) pelo processo de litografia macia. A Figura 3.1 mostra o processo de fabricação dos microcanais que foram produzidos no Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), no Laboratório de Microfabricação (LMF), localizado em Campinas, São Paulo.

Neste processo, um molde rígido foi fabricado contendo a imagem negativa da estrutura de interesse. O processo de fabricação do molde consistiu na deposição de um

Capítulo 3 Material e Métodos

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filme de fotorresiste (SU-8) pela técnica de “spin coating” sobre a superfície do substrato (placa de vidro ou silício). Em seguida, uma máscara contendo a imagem negativa do microcanal foi posicionada sobre a camada de fotorresiste e então uma etapa de fotolitografia foi realizada com aplicação de radiação UV.

O processo seguinte foi a revelação do molde. Uma solução de borato de potássio foi empregada para a retirada do fotorresiste dos locais onde não houve contato com a radiação. Dessa forma, obteve-se o molde negativo do dispositivo de interesse.

A próxima etapa consistiu na replicação dos dispositivos. A partir dos moldes produzidos, o PDMS foi misturado a um agente reticulante e colocado em contato com o molde. Após a reticulação, o polímero tornou-se sólido e então obteve-se o microcanal em PDMS. Por fim, foi feita uma selagem do canal com uma placa de vidro através da ativação da superfície do polímero por plasma de oxigênio.

Capítulo 3 Material e Métodos

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Figura 3.1. Processo de fabricação dos microcanais de PDMS pela técnica de litografia macia. Fonte: Vladisavljevic; Kobayashi; Nakajima (2012)

3.2.1.1 Geometria dos microcanais

As Figuras 3.2 e 3.3 apresentam as 2 (duas) geometrias dos dispositivos microfluídicos utilizadas neste projeto. Optou-se em utilizar o mecanismo de focalização hidrodinâmica devido à maior facilidade em variar os desenhos dos microcanais nos dispositivos, oferecer flexibilidade na escolha do método de gelificação, favorecer o estreitamento da fase dispersa pela fase contínua e permitir a formação de gotas em uma

Capítulo 3 Material e Métodos

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maior combinação de condições operacionais. Após a formação da gota na junção, a gota passa por uma região ondulada, determinada região de mistura, utilizada para aumentar a turbulência e facilitar a difusão do agente gelificante na gota de goma gelana (em detalhe na Figura 3.2).

Os microcanais possuíam largura de 100 μm, reduzindo a probabilidade de entupimento. A altura dos microcanais foi determinada na etapa de deposição do fotorresiste no substrato durante a etapa de “spin-coating”, pelo binômio velocidade e tempo de rotação. Neste projeto, todos os canais produzidos tiveram altura fixa de 50 μm.

Figura 3.2. Dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica para produção de microgéis de goma gelana pelo método de gelificação externa. Entrada da A) fase dispersa (dispersão de goma gelana) e B) fase contínua (óleo de soja + PGPR). Em detalhe a região de mistura

A B B C A B D

Capítulo 3 Material e Métodos

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Figura 3.3. Dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica para produção de microgéis de goma gelana pelo método de gelificação por mistura in-situ. Entrada da A) fase dispersa (dispersão de goma gelana), B) ativo (Rhodamina B) e C) fase contínua (óleo de soja + PGPR + acetato de cálcio)

3.2.2 Preparo das soluções

As dispersões de goma gelana (0,5 a 0,7% m/m) foram preparadas pela dissolução do pó em água deionizada sob agitação magnética a 80°C por 1 hora. Em seguida, as dispersões foram resfriadas até 25ºC utilizando um banho de água.

A mistura da fase oleosa foi preparada pela adição do emulsificante PGPR 4% (m/m) e o acetato de cálcio nas concentrações de 0,5 a 2% (m/m) em óleo de soja utilizando homogeneizador tipo rotor-estator (Ultra-turrax T10, Ika, Alemanha) a 14.000 rpm por 2 minutos. Em seguida, a mistura oleosa foi mantida durante 30 minutos em banho ultrassônico para retirada de bolhas, condições definidas em testes preliminares.

As soluções foram caracterizadas quanto à sua densidade, propriedades reológicas e tensão interfacial (Seção 3.2.5).

B A

A C

Capítulo 3 Material e Métodos

30

3.2.3 Produção dos microgéis

As etapas para o estudo e caracterização dos microgéis de goma gelana estão apresentadas na Figura 3.4.

Figura 3.4. Etapas para a obtenção e caracterização dos microgéis de goma gelana

3.2.3.1 Formação dos macrogéis

Ensaios preliminares foram realizados com o objetivo de determinar as concentrações adequadas do agente gelificante (acetato de cálcio) para a formação de gel das dispersões de goma gelana (0,5 a 0,7% m/m). O processo de gotejamento foi utilizado, pois permitiu a produção de macroesferas (diâmetro de aproximadamente 3 mm), facilitando a avaliação das propriedades mecânicas dos géis.

Microgéis

nos

microcanais

Formação dos

Macrogéis

Preparo das

Soluções

Propriedades físicas das fases aquosa e oleosa:

» Densidade

»Tensão interfacial

» Propriedades Reológicas

Caracterização dos macrogéis: » Compressão Uniaxial Caracterização dos microgéis: » Microscopia Ótica » Distribuição de Tamanho e Tamanho Médio

Capítulo 3 Material e Métodos

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Dispersões aquosas de goma gelana, a temperatura ambiente (25°C), foram gotejadas manualmente nas soluções contendo óleo de soja, PGPR e o agente gelificante acetato de cálcio. O gotejamento foi através da extrusão em seringa de 5 mL acoplada a agulha hipodérmica com diâmetro de 0,8 mm. A altura entre a saída da agulha e a solução gelificante foi fixada em 10 cm (CHAN et al., 2009). As partículas foram mantidas por 30 minutos no banho, posteriormente foram filtradas em peneira de abertura 0,210 mm e lavadas com água destilada. Após 24 horas foi realizada análise de compressão uniaxial (Seção 3.2.4) para determinar a força máxima das macroesferas.

3.2.3.2 Processo de obtenção dos microgéis

Os dispositivos microfluídicos foram operados em uma base de vidro, posicionada sobre um microscópio óptico Multizoom AZ100 (Nikon, Japão), a fim de visualizar a formação e gelificação dos microgéis nos microcanais. As fases oleosa e aquosa foram introduzidas pelas mangueiras de silicone fixadas no dispositivo, sendo as vazões das respectivas fases controladas por três bombas seringa (PHD22/2000, Harvard Apparatus, EUA). A Figura 3.5 mostra a disposição dos equipamentos usados para a avaliação do processo de produção dos microgéis nos microcanais.

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Figura 3.5. Aparatos para observação da formação dos microgéis nos microcanais. A) Bomba seringa e B) microscópio

3.2.3.2.1 Estudo do processo de formação de gotas

Para estudar o processo de formação das gotas (etapa de emulsificação) de goma gelana em dispositivos de microfluídica optou-se em utilizar um sistema que não houvesse a presença do agente gelificante acetato de cálcio. Desta forma, a dispersão aquosa de goma gelana foi inserida no canal A e a mistura do óleo de soja com o emulsificante PGPR no canal B (Figura 3.2). Como controle foi inserida a água no canal A e a mistura do óleo de soja com o emulsificante PGPR no canal B (Figura 3.2). Durante o processo de produção de gotas nos dispositivos microfluídicos, foi variada a vazão com que as fases do sistema atravessavam o canal. A vazão de entrada para a fase dispersa (água ou dispersão aquosa de goma gelana) variou de 0,5 a 4,0 μL/min e para a fase contínua (mistura oleosa) de 0,5 a 3,0 μL/min. Vazões maiores que 4,0 μL/min causavam elevada pressão interna nos microcanais, levando ao rompimento das mangueiras, e por isso foram evitadas. Além das

B

A

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vazões, avaliou-se as razões entre as vazões das fases dispersa e contínua (q), como dado pela Equação 3.1.

q =

Q_c (3.1)

sendo que, Qd e Qc representam as vazões das fases dispersa e contínua, respectivamente.

O objetivo desta etapa foi avaliar o regime de formação de gotas em diferentes vazões das fases e razões entre as vazões das fases dispersa e contínua, determinar as velocidades reais das fases dentro dos dispositivos de microfluídica e calcular os números adimensionais de Reynolds, Capilar e Weber que descrevem o escoamento dos fluidos nos microcanais. Os números de Capilar e Reynolds foram descritos a partir das propriedades da fase contínua (óleo de soja + PGPR), uma vez que esta possuiu a maior viscosidade atuante no sistema (η= 0,059 Pa.s) e foi predominante em termos de volume (BAROUD; GALLAIRE; DANGLA, 2010). No escoamento de fluidos nos microcanais o número de Reynolds (Re) expressa a razão entre as forças inerciais e viscosas das fases, dado pela Equação 3.2.

Re =

µ_c

O número de Capilar (Ca) descreve o efeito relativo entre forças viscosas e interfaciais que agem sobre os fluidos durante o escoamento, e é descrito pela Equação 3.3.

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Ca =

γ (3.3)

O número de Weber compara a importância dos efeitos inerciais com as forças interfaciais, dado pela Equação 3.4, e é normalmente definido a partir das propriedades da fase dispersa.

We =

γ (3.4)

sendo que,

ρc = densidade da fase contínua (kg.m-3)

ρ_d = densidade da fase dispersa (kg.m-3) v_c= velocidade da fase contínua (m.s-1) v_d= velocidade da fase dispersa (m.s-1)

𝐷_H= diâmetro hidráulico (m) que é avaliado como:

𝐷𝐻= (4𝑥 Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑐𝑜𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜) 𝑃𝑒𝑟í𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑚𝑜𝑙ℎ𝑎𝑑𝑜⁄

µc= viscosidade da fase contínua (Pa.s)

l= largura do microcanal (m) γ = tensão interfacial (N.m-1

)

3.2.3.2.2 Determinação da velocidade real das fases

Determinou-se a velocidade real das fases pelo método desenvolvido por Steegmans el al. (2009), adaptado para a geometria desenvolvida neste projeto. A vazão real da fase contínua foi determinada através da velocidade das gotas, assumindo que a velocidade da

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gota após o desprendimento era igual à velocidade da fase contínua. Usando o software NIS- Elements D3.2 (Japão) a distância entre a junção e o lado esquerdo da gota foi determinada imediatamente após o desprendimento da gota. A velocidade foi calculada pela diferença da posição da gota (D) em um intervalo de tempo (t) de 0,60 ms, que é o intervalo de tempo entre dois frames (Figura 3.6). A vazão da fase contínua (Qc) foi

calculada pela multiplicação dessa velocidade (v_g) pela área da seção transversal (A_t) do microcanal, de acordo com a Equação 3.5.

Q

= v

. A

Figura 3.6. Desprendimento da gota para obtenção da diferença de posição (D) e diâmetro da gota (dg) determinados a partir da análise da imagem pelo NIS- Elements D3.2 (Japão)

A vazão da fase dispersa (Qd) foi calculada a partir do volume da gota (V) e da

frequência (f) de formação da gota, como mostra a Equação 3.6.

Q

= V ∙ f (m

. s

)