UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas
RAFAEL MARÓSTICA
Influência das vias de sinalização de Grelina e Orexina sobre a expressão gênica de Tirosina Hidroxilase em linhagem de células neuronais
CAMPINAS 2020
RAFAEL MARÓSTICA
Influência das vias de sinalização de Grelina e Orexina sobre a expressão gênica de Tirosina Hidroxilase em linhagem de células neuronais
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
Orientadora: Profª Drª. Joseane Morari
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO RAFAEL MAROSTICA, ORIENTADO PELA PROFª DRª. JOSEANE MORARI.
CAMPINAS 2020
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
RAFAELMAROSTICA
ORIENTADORA: PROFª DRª. JOSEANE MORARI
MEMBROS:
1. PROFª. DRª. JOSEANE MORARI 2. PROFª. DRª. SANDRALUCINEIBALBO
3. PROFª.DRª.VANESSA CRISTINA DIAS BÓBBO
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A Ata da Defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
DEDICATÓRIA
Nunca em minha juventude sonharia em construir um legado tão lindo, e ainda mais poder dedicá lo…E por mais singelo que seja é fruto de muito esforço e amor....
É em reconhecimento a esse amor que dedico esse trabalho a Deus por se fazer presente em todos os momentos.
Dedico a quem sempre se dedicou a mim, minha mãe, que em sua pequenez soube ter discernimento e sabedoria em todos os momentos dessa caminhada.
Ao meu pai que em toda sua humildade, mesmo na incerteza, acreditou no meu sonho em seguir a carreira de cientista.
Que se sintam parte, todos aqueles que de alguma forma contribuíram para tornar esse processo mais sereno e tranquilo.
AGRADECIMENTOS
Por toda a vitória e conquista, sou grato primeiramente a Deus, por atender minhas preces e me guiar por esse caminho.
O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa processo nº130552/2018-6 e com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP a quem agradeço pela oportunidade que oferecem a alunos que, como eu, realmente precisam de ajuda financeira para se dedicar ao Mestrado, além de verbas que possibilitaram que este trabalho e muitos outros pudessem ser desenvolvidos.
Me lembro de ingressar na faculdade e não ter idéia do que se tratava uma “pos- graduação”. Ouvia as pessoas almejando os títulos de mestre e doutor e com toda ingenuidade tinha uma ideia bem diferente do significado dessas palavras. Hoje, carregando uma bagagem singela, porém maior do que havia naquele tempo, agradeço a primeira pessoa que acreditou que eu fosse digno de estar numa universidade tão bem conceituada, minha querida orientadora da iniciação científica, Erika Anne de Freitas Roubles Roman, por todos os ensinamentos, apoio e sabedoria que me transmitiu todos esses anos.
Agradeço à minha orientadora Joseane Morari, que me incentivou e acreditou no meu potencial mesmo quando duvidei da minha própria capacidade de estar onde estou. Agradeço por toda sua dedicação e paciência, por todo o conhecimento que me proporcionou. Hoje acredito que ela foi a melhor escolha de orientador que eu poderia ter. Foi uma honra ser seu primeiro aluno de mestrado.
Ao professor Gabriel Forato Anhê, por ter me amparado em seu laboratório no primeiro momento do desenvolvimento desse projeto e por todos os ensinamentos e dedicação.
Ao professor Lício Augusto Velloso, por ter me recebido em seu laboratório desde sempre. Sinto-me orgulhoso e grato por ter feito parte do grupo tão maravilhoso, o Laboratório de Sinalização Celular, do qual o senhor é líder e exemplo de respeito, sabedoria e competência.
Agradeço imensamente meus pais, Nilda Gonçalves Massafera Maróstica e Edson Maróstica, que além de subsidiar e tornar esse sonho capaz de ser realizado proveram uma fonte infinita de amor e aconchego, cruciais em vários momentos dessa trajetória.
Ao Murilo Maziero Serpa, que dedicou todo seu amor e paciência nos momentos de tensão e fragilidade.
A todos os colegas de laboratório que eu tive o prazer de trabalhar todos esses anos. São muitos para serem citados em um único agradecimento, que carreguem minha eterna gratidão.
“Nada na vida deve ser temido, somente compreendido…”. Marie Curie
RESUMO
Sabe-se que o controle da fome se dá através dos sistemas homeostático e hedônico. O sistema homeostático é representado pelo hipotálamo, o qual apresenta importante função na regulação da homeostase energética através de sua sensibilidade e resposta aos principais hormônios reguladores de fome (grelina) e saciedade (leptina e insulina). Uma das principais regiões do sistema hedônico é chamada de Midbrain. Ela é composta por uma estrutura importante no controle da busca pelo alimento, a área ventral tegmental (VTA). Esta região é capaz de responder ao hormônio periférico Grelina e ao neuropeptídeo Orexina. A Grelina é um dos principais hormônios responsáveis por regular a ingestão alimentar.Tal hormônio apresenta seus receptores (GHSR1a) em neurônios dopaminérgicos presentes na região do VTA podendo influenciar a produção de dopamina. Já a Orexina éliberada pelo hipotálamo lateral e encontra seus receptores HCRTR1 em
neurônios dopaminérgicos presentes na VTA e estimula a liberação de dopamina. Entretanto, pouco se conhece a respeito dos mecanismos de controle de produção
de dopamina em resposta à Grelina e Orexina. Nesse contexto, resolvemos avaliar o envolvimento desses peptídeos em linhagem de células neuronais. Um delas, a Neuro 2a, tem capacidade de se diferenciar em uma célula dopaminérgica através do aumento na expressão de Tirosina Hidroxilase (Th). Essa diferenciação repercutiu no aumento da expressão gênica de Orexina (Hcrt) e de seu receptor Hcrtr1, sendo que o último, quando inibido através de um siRNA, repercutiu na ausência de aumento da expressão de Th de Hcrt. Portanto, o receptor Hcrtr1, parece ter importante papel na diferenciação de Neuro2a em células dopaminérgicas através da modulação da expressão de Th. Pelo fato da linhagem Neuro2a não responder ao tratamento com Hexarelina (agonista da Grelina), resolvemos avaliar a resposta da linhagem de células hipotalâmicas mHypoA 2/29 ao tratamento com este agonista. Esse tratamento nos mostrou que a Hexarelina apresenta função relevante nessa linhagem celular hipotalâmica por ser capaz de ativar a expressão gênica de AgRP.
ABSTRACT
Hunger control is known to occur through homeostatic and hedonic systems. The homeostatic system is represented by the hypothalamus, which plays an important role in regulating energy homeostasis through its sensitivity and response to the main hormones that regulate hunger (ghrelin) and satiety (leptin and insulin). One of the main regions of the hedonic system is called Midbrain. It consists of an important structure in controlling the search for food, the ventral tegmental area (VTA). This region is capable of responding to the peripheral hormone Ghrelin and the neuropeptide Orexin. Ghrelin is one of the main hormones responsible for regulating food intake. Such a hormone has its receptors (GHSR1a) in dopaminergic neurons present in the VTA region and may influence the production of Dopamine. Orexin is released by the lateral hypothalamus and finds its HCRTR1 receptors in dopaminergic neurons present in the VTA and stimulates the release of Dopamine. However, little is known about the mechanisms for controlling Dopamine production in response to Ghrelin and Orexin. In this context, we decided to evaluate the involvement of these peptides in neuronal cell lineage. One of them, Neuro 2a, has the ability to differentiate into a dopaminergic cell by increasing the expression of Tyrosine Hydroxylase (Th). This differentiation also reflected in the increase in the gene expression of Orexin (Hcrt) and its receptor Hcrtr1, the latter, when inhibited by a siRNA, reflected in the absence of increased expression of Hcrt Th. Therefore, the Hcrtr1 receptor seems to have an important role in the differentiation of Neuro2a in dopaminergic cells through the modulation of Th expression. Because the Neuro2a strain does not respond to treatment with Hexarelin (ghrelin agonist), we decided to evaluate the response of the cell line hypothalamic mHypoA 2/29 to treatment with this agonist. This treatment showed us that Hexarelin has a relevant function in this hypothalamic cell line because it is capable of activating the gene expression of AgRP.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AgRP: Agouti Related peptide
AMP: Adenosina 3',5'-monofosfato BSA: albumina sérica bovina BSA: Bovine serum albumin
CART: Transcrito regulado pela cocaína e anfetamina CCK: Colecistoquinina
cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid CrH: Corticotropin-releasing hormone
DA: Dopamina
DAT: Transportador de dopamina
dbcAMP: N6,2′-O-Dibutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt DMEM HG: Dulbecco's Modified Eagle Medium High glucose
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DOPA: dihidroxifenilalanina
FBS: Fetal Bovine Serum
GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GHSR: Growth hormone secretagogue receptor GLP-1: Glucagon-like peptide-1
GOAT: ghrelin O-acil transferase HcrTR1: Hypocretin Receptor 1 HL: Hipotálamo lateral
MAO: Monoamina oxidase
mHypoA-2/29: Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-2/29 NAc: Núcleo Accumbens
Neuro2a: linhagem celular de neuroblastoma de camundongo NPY: Neuropeptídeo Y
NTS: Núcleo do trato solitário
PBS 1X: Phosphate buffered saline 1X PBS: phosphate buffered saline
PBST: phosphate buffered saline Tween 20 PCR: Polymerase Chain Reaction
POMC: Pró-opiomelanocortina PYY: Peptídeo YY
RNA: RiboNucleic Acid
SiRNA: Small interference RNA SNC: Sistema nervoso central TrH: Thyrotropin-releasing hormone
VIC: 2′-chloro-7′phenyl-1,4-dichloro-6-carboxy-fluorescein
VTA: Ventral tegumental area
SUMÁRIO 1. Introdução………...…....……... 14 2. Justificativa………...…...…... 20 3. Objetivos………...…....….. 20 3.1 Objetivos gerais………...…..…... 20 3.2 Objetivos específicos………...…... 20 4. Material e método………... 21
4.1 Cultura celular de neurônios dopaminérgicos Neuro2A... 21
4.2 Experimentos com células Neuro2A diferenciadas………...…... 22
4.2.1 Inibição do receptor de Orexina Hcrtr1 através da técnica de SiRNA…... 22
4.2.2 Tratamento com Hexarelina………...….. 23
4.3 Experimentos com células mHypoA-2/29 (CLU189)... 23
4.3.1 Tratamento com Hexarelina………... 23
4.4 Extração de RNA e PCR em tempo real... 24
4.5 Imunohistoquímica………...…….... 24
4.5.1 Marcação com anticorpos anti-Ghsr e anti-TH………...…. 24
4.6 Análise dos resultados………...…… 26
5. Resultados e Discussão……….………...…… 26
5.1 Padronização da diferenciação das células Neuro2a com dbcAMP em neurônios dopaminérgicos... 26
5.2 Expressão de genes alvo em neurônios dopaminérgicos... 27
5.3 Inibição da via de sinalização da Orexina………...……….. 28
5.4 Estímulo da via de sinalização de Grelina - Neuro 2a………...…….. 29
5.5 Imunofluorescência de GHSR e TH em células Neuro2a…………...….. 30
5.6 Imunofluorescência de GHSR1a em células Neuro2a e mHypoA-2/2... 31
5.7 Sinalização da Grelina em linhagem hipotalâmica mHypoA -2/29 (CLU189)... 32
6.Conclusão... 34
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1) INTRODUÇÃO
O controle da fome no sistema nervoso central ocorre principalmente pelos sistemas homeostático e de recompensa (hedônico). Uma das principais regiões do sistema homeostático é o hipotálamo, que se localiza no diencéfalo e é responsável por uma série de funções no organismo além da homeostase energética, tais como: controle hídrico, controle endócrino, controle do comportamento sexual (1). Desta forma, o hipotálamo exerce um papel regulador sobre o sistema nervoso autônomo e endócrino.
O hipotálamo é dividido em subpopulações de neurônios especializados no controle da fome e termogênese (2). Uma dessas regiões é o núcleo arqueado, que abriga populações de neurônios que expressam peptídeos orexigênicos, tais como as proteínas relacionadas ao agouti (AgRP), neuropeptídeo Y (NPY); além de neurônios produtores de peptídeos anorexigênicos, pro-opiomelanocortina (POMC) e peptídeo regulado por cocaína e anfetamina (3).
Os neurônios componentes do núcleo arqueado emitem projeções para outras regiões hipotalâmicas contendo neurônios de segunda ordem, sendo elas núcleo paraventricular (PVN) e hipotálamo lateral (HL). A primeira é também conhecida como centro da saciedade por conter populações de neurônios anorexigênicos e pró-termogênicos, tais como hormônio liberador de corticotrofina (CRH) e hormônio liberador de tireotrofina (TRH) respectivamente. A última é chamada de centro da fome por receber projeções do núcleo arqueado que estimulam uma resposta orexigênica através do estímulo de neurônios produtores de Orexina e do hormônio concentrador de melanina (MCH) (2-4).
A sensação de fome é percebida pelos neurônios hipotalâmicos através de estímulos periféricos. Portanto, em períodos de jejum onde há uma menor concentração de insulina e leptina e uma maior concentração de grelina circulantes, ocorre modulação positiva da expressão de NPY e AgRP no núcleo arqueado inibição de POMC e CART. Esses neurônios apresentam os receptores para os peptídeos supracitados provenientes da periferia (3). Já em estados pós-prandiais, há aumento da produção de insulina, peptídeo produzido pelas células beta-pancreáticas que além de participar do metabolismo da glicose desempenha papel anorexigênico importante ao se ligar aos seus receptores (IRs) localizados nos neurônios NPY/AgRP inibindo-os, reduzindo o apetite e estimulando o gasto
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energético (5), com consequente redução da produção hepática de glicose e diminuição da glicemia (6).
A insulina, além de desempenhar suas ações no sistema homeostático, também atua sobre o sistema hedônico. Inicialmente a insulina é capaz de modular a expressão do transportador de dopamina (DAT), responsável pela recaptação de dopamina, e da monoamina oxidase (MAO), enzima que degrada dopamina. Ainda, a insulina pode afetar a síntese de tirosina hidroxilase (TH - enzima conversora de L-Dopa em dopamina) e consequentemente regular negativamente a síntese de dopamina. Portanto, a insulina é capaz de interferir na resposta hedônica (7-8).
A leptina, por sua vez, é um hormônio produzido majoritariamente pelo tecido adiposo branco. Ela é responsável por ativar através de seu receptor ObRb os neurônios POMC/CART, e inibir os neurônios NPY/AgRP. Ao agir sobre os neurônios POMC, a leptina estimula a produção de alfa-MSH e CART gerando uma resposta anorexigênica (9-10). A leptina também é capaz de modular a resposta hedônica por apresentar seus receptores em regiões produtoras de dopamina (VTA e substância nigra) e em regiões responsivas à dopamina (Núcleo Accumbens - NAc). A sinalização positiva de leptina na VTA leva à supressão da produção de dopamina e menor liberação de dopamina no NAc, acarretando uma diminuição no valor de recompensa atribuído ao alimento (11-12).
O sistema hedônico é composto por várias regiões do cérebro com funções distintas que em conjunto resultam na resposta hedônica (13). As regiões são: (I) O
córtex orbitofrontal, giro do cíngulo e córtex insular - responsáveis pela expectativa de recompensa; (II) córtex dorsolateral e pré-frontal que determinam a tomada de decisão para obtenção da recompensa; (III) complexo hipocampal e amígdala, relacionados às funções de aprendizado da palatabilidade e recompensa do alimento; (IV) dorso estriatal e substância nigra são responsáveis pela aquisição de hábitos de busca da recompensa; (V) núcleo accumbens (NAc), pálido ventral, área ventral tegmental (VTA) e hipotálamo lateral (HL) se relacionam à determinação do valor de recompensa do alimento. Após atribuição do valor de recompensa, o córtex motor é ativado para que ocorra a busca pelo alimento almejado (14).
Figura 1. Possíveis interações entre o sistema homeostático
homeostático representado pelas linhas azuis e sistemas neurais referentes ao processamento de informações sensoriais externas demonstrados em marrom. Processos relacionados a recompensa (roxo) e funções cognitivas e de execução (vermelho) correspondem ao
Modulações do sistema hedônico pelo sistema homeostático são indicadas pelas
linhas azuis pontilhadas representam a ação dos hormônios circulantes, metabólitos e outros fatores.
O desenvolvimento de uma resposta hedônica se inicia no momento em que receptores de células gustativas identificam os sabores e as text
são então ativados. O sinal produzido por essa ativação é emitido às células da região do núcleo do trato solitário (NTS) por meio de fibras aferentes. O NTS emite estímulos para o córtex orbitofrontal onde as demais informações refere
alimento tais como: odor, aspectos físicos, visuais e cognitivos, se integram. Essas informações são enviadas para regiões como o Núcleo Acumbens (NAc), Região Ventral Tegumental (VTA), Tálamo, Córtex Cerebral e Núcleo Estriado. Coletivamente essas regiões atribuem um “valor de recompensa” para o alimento. O córtex orbitofrontal junto com a amígdala são responsáveis por codificar informações relacionadas ao valor da recompensa dos alimentos (
processa informações relac
Fonte: (
Figura 1. Possíveis interações entre o sistema homeostático e os sistemas sensoriais.
homeostático representado pelas linhas azuis e sistemas neurais referentes ao processamento de informações sensoriais externas demonstrados em marrom. Processos relacionados a recompensa (roxo) e funções cognitivas e de execução (vermelho) correspondem ao
Modulações do sistema hedônico pelo sistema homeostático são indicadas pelas
linhas azuis pontilhadas representam a ação dos hormônios circulantes, metabólitos e outros fatores.
O desenvolvimento de uma resposta hedônica se inicia no momento em que receptores de células gustativas identificam os sabores e as texturas dos alimentos e são então ativados. O sinal produzido por essa ativação é emitido às células da região do núcleo do trato solitário (NTS) por meio de fibras aferentes. O NTS emite estímulos para o córtex orbitofrontal onde as demais informações refere
alimento tais como: odor, aspectos físicos, visuais e cognitivos, se integram. Essas informações são enviadas para regiões como o Núcleo Acumbens (NAc), Região Ventral Tegumental (VTA), Tálamo, Córtex Cerebral e Núcleo Estriado. s regiões atribuem um “valor de recompensa” para o alimento. O córtex orbitofrontal junto com a amígdala são responsáveis por codificar informações relacionadas ao valor da recompensa dos alimentos (15-16). A ínsula,
processa informações relacionadas ao sabor do alimento. A intensidade de uma
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Fonte: (BERTHOUD, 2011). e os sistemas sensoriais. Sistema homeostático representado pelas linhas azuis e sistemas neurais referentes ao processamento de informações sensoriais externas demonstrados em marrom. Processos relacionados a recompensa (roxo) e funções cognitivas e de execução (vermelho) correspondem ao sistema hedônico. Modulações do sistema hedônico pelo sistema homeostático são indicadas pelas setas azuis. As linhas azuis pontilhadas representam a ação dos hormônios circulantes, metabólitos e outros fatores.
O desenvolvimento de uma resposta hedônica se inicia no momento em que uras dos alimentos e são então ativados. O sinal produzido por essa ativação é emitido às células da região do núcleo do trato solitário (NTS) por meio de fibras aferentes. O NTS emite estímulos para o córtex orbitofrontal onde as demais informações referentes ao alimento tais como: odor, aspectos físicos, visuais e cognitivos, se integram. Essas informações são enviadas para regiões como o Núcleo Acumbens (NAc), Região Ventral Tegumental (VTA), Tálamo, Córtex Cerebral e Núcleo Estriado. s regiões atribuem um “valor de recompensa” para o alimento. O córtex orbitofrontal junto com a amígdala são responsáveis por codificar informações ). A ínsula, por sua vez, ionadas ao sabor do alimento. A intensidade de uma
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recompensa é determinada pela liberação de dopamina por neurônios do VTA, sendo a mesma liberada na região do NAc e estriado, regulando as propriedades motivacionais e de incentivo na busca pelo alimento (17-18). Já o hipotálamo lateral (HL) quando estimulado promove o aumento da ingestão alimentar, regulando respostas de recompensa relacionadas à palatabilidade do alimento e ao comportamento de busca pelo mesmo (19).
Estímulos periféricos hormonais são capazes de sinalizar regiões tanto do sistema homeostático quanto do hedônico, de forma a integrá-los. Os principais hormônios são: colecistoquinina (CCK), peptídeo semelhante ao glucagon (GLP-1), péptido YY (PYY), grelina, leptina e insulina (20). A grelina é um dos principais hormônios envolvido nessa integração. É um hormônio produzido pelas glândulas oxínticas do estômago que desempenha ação orexigênica. A grelina desencadeia suas ações por meio da ativação dos receptores growth hormone secretagogue receptor type 1A (GHSR-1A), tais receptores são localizados predominantemente em neurônios hipotalâmicos NPY/AgRP que quando ativados pela ação da grelina desencadeiam uma resposta orexigênica. Além da ativação de uma resposta orexigênica, a grelina também é capaz de inibir a liberação do hormônio anorexigênico estimulante de melanócito (alpha-MSH), produto clivado de neurônios POMC. Quando inibidos, os neurônios NPY/AgRP são incapazes de desencadear uma resposta orexigênica por meio da ação da grelina, no entanto, o bloqueio da via de sinalização da grelina não é capaz de diminuir o apetite de animais submetidos a uma dieta palatável, sugerindo assim uma ação independente do sistema homeostático na alimentação (21).
Com relação à via de sinalização da grelina, seu receptor funcional é acoplado à proteína G. Para desenvolver suas ações nos receptores GHSR-1a, a preprogrelina (molécula precursora da grelina) passa por um processo de acilação por meio da enzima ghrelin O-acil transferase (GOAT) (22). Além de possuir receptores (GHSR1a) na região do hipotálamo onde desempenha sua ação oxigênica, a grelina também atua em receptores localizados em populações de neurônios dopaminérgicos da VTA, aumentando os níveis de produção de dopamina (DA) (23). A DA produzida nesta região está diretamente ligada à funções hedônicas, tais como a busca pelo alimento e recompensa (24).
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Outro peptídeo firmemente estabelecido como regulador da busca por alimento é a Orexina, também conhecida como Hipocretina (HCRT). É um peptídeo produzido em neurônios residentes no HL que emitem projeções para algumas áreas hedônicas, dentre elas o VTA e NAc (25). Estudos demonstraram que as fibras de neurônios orexina se co-distribuem com fibras de neurônios dopaminérgicos sugerindo que a dopamina e a orexina interagem nas áreas hedônicas supracitadas (26).
Existem ao menos três maneiras pelas quais a orexina pode influenciar o aumento da ingestão alimentar através da modulação do sistema mesolímbico dopaminérgico: (I) os neurônios produtores de orexina induzem a liberação e bloqueio da recaptação de DA no NAc, (II) grandes quantidades de orexina são liberadas no VTA estimulando neurônios dopaminérgicos a aumentar a liberação de DA no NAc e no córtex pré-frontal, (III) neurônios produtores de orexina enviam projeções excitatórias para neurônios do núcleo paraventricular do tálamo, que por sua vez inervam o NAc e induzem a liberação de DA, sendo uma via independente de estimulação de neurônios do VTA (27).
A dopamina é um neurotransmissor monoaminérgico sintetizados por neurônios de várias regiões do cérebro, mas principalmente pela VTA. A tirosina, aminoácido encontrado em nossa dieta alimentar, é o precursor necessário para a síntese da dopamina. Após ingerida, a tirosina é transportada para o sistema nervoso central (SNC) através de transportadores de aminoácidos. Uma vez nos neurônios, a tirosina é convertida em L-Dopa por meio da enzima Tirosina Hidroxilase (TH). A L-Dopa sofre a ação da enzima dopa descarboxilase e se transforma em DA. Após este processo a dopamina é transportada para dentro de vesículas para que não seja degradada pela enzima monoaminoxidase (MAO) (28-29).
A fim de caracterizar o papel da dopamina no sistema hedônico, estudos in vitro utilizaram linhagens de neuroblastoma provenientes da crista neural de camundongos que apresentavam quantidades significativas de dopamina quando submetidas ao processo de diferenciação. Essa linhagem é chamada de Neuro2a, que foi submetida a tratamentos com diversos compostos, tais como: fator de crescimento transformador-1 (TGF1); proteína morfogenética óssea 4 (BMP4); fator neurotrófico derivado das células da glia (GDNF); e ácido retinóico (AR). Nenhum
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dos tratamentos acima citados foi capaz de induzir a diferenciação dessas células em dopaminérgicas, uma vez que não houve modulação na expressão gênica de Tirosina Hidroxilase (Th) e produção de dopamina. Contudo, as células se diferenciaram quando submetidas ao tratamento com o composto N6 ,2′-O-Dibutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (dbcAMP). Tais resultados elucidaram mecanismos relacionados à estímulos periféricos e centrais capazes de induzir a produção de dopamina (30).
A dopamina possui receptores em diversas regiões do cérebro, sendo estes subdivididos em receptores D1, D2, D3, D4 e D5. Apesar de possuir influência significativa no desenvolvimento de atividades emocionais e cognitivas, durante muito tempo a DA se destacou por seu papel nas respostas motoras, associadas a ritmos locomotores, mastigação, respiração e ritmos gástricos (31-32). Os gatilhos que estimulam o sistema dopaminérgico são diversos. Entretanto, os relacionados ao prazer gerado pelo alimento são os principais já estudados. Como já descrito, a modulação dopaminérgica está diretamente ligada a atribuição de um “valor de recompensa” para um determinado alimento, que desencadeia uma resposta por meio do sistema locomotor para a sua aquisição.
Para que ocorra um controle energético adequado do organismo os sistemas homeostático e hedônico atuam de forma a estimular a ingestão alimentar e o gasto energético. Ambos os sistemas possuem características de singular importância na garantia do controle alimentar, mas com resultados diferentes. O sistema hedônico abrange as características relacionadas à busca do alimento e recompensa. Já o sistema homeostático é responsável pelo controle da ingestão e do gasto energético. Estudos demonstram de forma cada vez mais robusta que tais sistemas atuam de forma integrada para que ocorra uma resposta positiva na obtenção de energia para garantir a sobrevivência (13-33).
Assim, o entendimento dos mecanismos envolvidos na integração desses sistemas é imprescindível para uma maior compreensão dos mecanismos de controle de fome e saciedade.
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2) Justificativa
Baseados em estudos prévios realizados pelo nosso grupo (dados não publicados) em que observamos diferença no comportamento alimentar e no gasto energético e modulação da expressão do gene Tirosina Hidroxilase (Th) no VTA de camundongos alimentados com dieta padrão; e ainda compreendendo a importância das vias de sinalização da Grelina e da Orexina na produção de dopamina pelo VTA, resolvemos verificar em linhagens de células neuronais de que maneira a Grelina e a Orexina poderiam influenciar a expressão gênica de Th, enzima fundamental para a produção de DA.
3) Objetivos
3.1) Geral: Avaliar em cultura celular neuronal (linhagem mHypo2/29 e Neuro 2a) a expressão de Tirosina hidroxilase (Th) em resposta ao tratamento com Hexarelina (agonista da grelina) e frente à inibição do receptor de Orexina (Hcrtr1) com siRNA.
3.2) Específicos:
1) Tratar células Neuro 2a com dbcAMP para diferenciação em células dopaminérgicas;
2) Verificar se essa célula apresenta receptores GHSR e HCRTR1 através de PCR em tempo real e imunofluorescência;
3) Tratar as células Neuro2a já diferenciadas com Hexarelina (agonista da Grelina) e verificar a repercussão na expressão gênica de Tirosina Hidroxilase (Th). O aumento da expressão gênica desta enzima é associado ao aumento da produção de Dopamina (30).
4) Tratar células mHypo2/29 com Hexarelina e verificar a repercussão na expressão gênica de Orexina (Hcrt) e Tirosina Hidroxilase (Th).
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4) Material e Método
4.1) Cultura de células de neurônios dopaminérgicos – Neuro2a
Os experimentos foram realizados com uma linhagem celular de neuroblastoma de camundongo, a Neuro-2a. Essa linhagem é capaz de se diferenciar em neurônios produtores de dopamina (DA) através da privação de soro fetal bovino (FBS); privação de glicose (meio DMEM low glucose) aliado ao tratamento com análogo de AMP (30).
As células foram descongeladas e cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium High Glucose (DMEM-HG) 25mM de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). Foram mantidas em estufa a 37°C sob atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Inicialmente foram semeadas em torno de 40 mil células em
meio DMEM HG 10% FBS em placas de 24 poços. No dia seguinte, as células foram divididas em grupos controles e grupos tratados com o análogo do AMP - N6 ,2′-O-Dibutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (dbcAMP - Sigma-Aldrich - 16980-89-5) Primeiramente, realizamos uma dose resposta com as seguintes concentrações: 0,5mM e 1mM como demonstrado na tabela abaixo. A cultura foi tratada diariamente com dbcAMP até o terceiro dia.
Tratamentos 0,5mM e 1mM
1, 2 e 3 Dia tratamento 4 Dia
Tratamento DMEM 0,5% FBS 0,5 ou 1mM dbcAMP Coleta
Controle DMEM HG 10% FBS - Coleta
Para comprovar a eficácia do tratamento para diferenciação foram observadas alterações morfológicas nas células e a modulação na expressão gênica de Tirosina Hidroxilase (Th) por meio da técnica de PCR em tempo real (qPCR). Um dia de incubação com o dbcAMP foi suficiente aumentar a expressão gênica de Th, entretanto, a morfologia celular não era compatível com neurônio, e muitas células morriam antes de alcançar o terceiro dia. Pensando nisso, testamos uma dose menor de dbcAMP, 0,2mM a cada dois dias, durante 6 dias.
Tratamentos 0,2mM
1 Dia 3 Dia 6 Dia
Tratamento DMEM 0,5% FBS 0,2mM dbcAMP
DMEM 0,5% FBS 0,2mM dbcAMP
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Controle DMEM HG 10% FBS - DMEM HG 10% FBS - coleta coleta
Verificamos que a dose de 0,2mM reposta no meio de cultura a cada três dias, durante seis dias, foi a melhor dose para diferenciação celular pois aumentou a expressão gênica de Th e a morfologia celular mostrou-se compatível com neurônio. Após estabelecida a dose e o tempo de tratamento, utilizamos para os outros experimentos de diferenciação abaixo descritos.
4.2) Experimentos com as células Neuro2a diferenciadas
4.2.1) Inibição do receptor de Orexina Hcrtr1 através da técnica de SiRNA Para verificarmos a função da via de sinalização da Orexina na diferenciação das células Neuro2a em células dopaminérgicas, utilizamos a técnica de inibição chamada Small Interference RNA (SiRNA). Nesta técnica utilizamos um RNA de tamanho pequeno que se liga ao mRNA do gene de interesse que se quer silenciar. Ao se formar uma dupla fita de RNA dentro da célula, a enzima DICER reconhece e degrada a dupla fita de RNA.
Primeiramente cultivamos aproximadamente 50.000 células Neuro2a em DMEM High Glucose 10% FBS em placas de 24 wells por 24 horas. Em seguida, realizamos o protocolo de inserção do siRNA na célula com uso de Lipofectamina ( Invitrogen - protocolo sugerido pelo fabricante). Após 72 horas da realização do protocolo de inibição, as células foram então tratadas com dbcAMP seguindo o protocolo de diferenciação acima descrito.
4.2.2) Tratamento com Hexarelina
Primeiramente diluímos a Hexarelina (agonista da Grelina) em meio de cultura DMEM na concentração 1mg/ml (1,13mM). As células foram então diferenciadas em células dopaminérgicas com dbcAMP 0,2mM e após seis dias de diferenciação, realizamos os seguintes grupos de tratamento nas células:
Grupo 1) controle: meio DMEM High Glucose 0,5% FBS (controle sem diferenciação);
23
Grupo 3) tratada: meio DMEM low glucose 0,5%FBS + 0,2mM dbcAMP + 1uM de Hexarelina – incubação de duas horas;
Grupo 4) tratada: controle: meio DMEM low glucose 0,5%FBS + 0,2mM dbcAMP + 1uM de Hexarelina – incubação de seis horas;
Em seguida, retiramos o meio de cultura e adicionamos à essas células o reagente TRIzol Reagent (Invitrogen) para extração de RNA total.
4.3) Cultura de células neuronais hipotalâmicas – Linhagem mHypoA-2/29 (CLU 189)
4.3.1) Tratamento com Hexarelina
Para verificarmos o efeito da Hexarelina nas células neuronais hipotalâmicas, primeiramente as células foram cultivadas em meio DMEM 25mM de glicose, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), mantidas em estufa a 37°C sob atmosfera úmida contendo 5% de CO2.
Quando as células atingiram confluência de aproximadamente 90% adicionamos Tripsina 0,025% (Gibco) para o descolamento das células, as quais foram contadas e semeadas em placa de 24 poços (aproximadamente 50.000 células). Aguardamos 24 horas e então as células foram divididas em grupos que passaram pelos tempos 2 horas; 4 horas; 6 horas e 8 horas de tratamento.
Grupo 1) controle: meio DMEM low glucose 0,5% FBS;
Grupo 2) tratada: meio DMEM low glucose 0,5% FBS, 1uM de Hexarelina; Grupo 3) controle: meio DMEM high glucose 0,5%FBS;
Grupo 4) tratada: meio DMEM high glucose 0,5%FBS; 1uM de Hexarelina. Em seguida, retiramos o meio de cultura e adicionamos à essas células o reagente TRIzol Reagent (Invitrogen) para extração de RNA total.
24
4.4 Extração de RNA e PCR em tempo real
Após os tratamentos específico, as células Neuro-2a e mHypo2/29 foram homogeneizadas em Trizol. O RNA total foi isolado de acordo com as recomendações do fabricante e em seguida 1000ng de RNA foram transcritos utilizando-se o High Capacity cDNA kit (4368814, Applied Biosystems).
As reações de PCR em tempo foram feitas através do sistema TaqMan (Applied Biosystems), que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. Foram utilizados os seguintes primers:
AgRP - Mm00475829_g1; Drd1 - Mm01353211_m1; Hcrt - Mm01964031_s1; Hcrtr1 Mm01185776_m1; Th – Mm00447557_m1; Vmat2 – Mm00553058_m1
O gene gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase GAPDH (4326317E - Applied Biosystems) foi utilizado como gene referência da reação.
As reações de PCR foram realizadas em duplicata a partir de: 3,0 μL de Lumino CT PCR Master Mix 2x (L6669-100RXN-Sigma-Aldrich), 0,25 μL de primers, 0,75μL de água e 4,0 μL de cDNA, totalizando 7,5μL de reação final. As condições de ciclagem utilizadas foram: 95 °C por 2 minutos, 45 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 60 °C por 30 segundos. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa Step One Plus (Applied Biosystems). Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa Step One Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 4.5 Imunohistoquímica
4.5.1 Marcações com anticorpos anti-Ghsr e anti-TH
As lamínulas contendos células da linhagem mHypoA-2/29 e Neuro2A foram lavadas com PBS (Phosphate-bufferid saline)1X, por 3 vezes de cinco minutos. Após as lavagens, as lamínulas passaram pelo processo de permeabilização com solução
25
de PBS 1X, 0,5% de saponina durante dez minutos. Ao final da permeabilização, foi realizada a lavagem de 3 vezes de cinco minutos com PBS 1X.
Na etapa seguinte as células passaram pelo processo de bloqueio com uma solução de PBST (PBS 1X, 0,1% Tween20), juntamente com 1% de BSA (Albumina Bovina) pelo período aproximado de 30 minutos à uma hora. Em seguida foi realizado o processo de lavagem de 3 vezes de cinco minutos com PBS 1X. Após as lavagens, as lamínulas foram incubadas com uma solução de PBST, 1% albumina sérica bovina (BSA), contendo o anticorpo primário anti-GHSR (ab95250- ABCAM) na proporção 1:200 e anti-TH (sc- 25296 - Santa Cruz) na proporção 1:100 por 12 horas. Após o período de incubação as células passaram por mais uma série de lavagens com PBS 1X para serem então submetidas a incubação com o anticorpo secundário (1:500) em uma solução de PBST, 1% BSA por um período de 1 hora. Após essa etapa as lamínulas passaram novamente pelo processo de lavagem e em seguida de vedação, utilizando-se o Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories).
As lamínulas contendos células da linhagem CLU189 e Neuro2A aderidas passam pelo processo de lavagem com PBS por cinco minutos por 3 vezes sob agitação leve no rocker . Após as lavagens, as lamínulas passam pelo processo de permeabilização, onde serão submetidas a exposição a uma solução de PBS com 0,01% de Triton x100 durante dez minutos e em seguida a realização de mais uma série (3 vezes por 5 minutos) de lavagens com PBS. Na etapa seguinte as células passam pelo processo de bloqueio , onde é utilizada uma solução de soro Goat 10% em PBS pelo período aproximado de 30 minutos à uma hora, sem seguida acontece mais uma série de três lavagens com PBS por 5 minutos. Após as lavagens, as lamínulas são incubadas com uma solução de PBS 1,5% de soro Goat, contendo anticorpo primário (1:100) pelo período de 12 horas. Após o período de incubação as células passam por mais uma série de lavagens para serem submetidas a incubação com o anticorpo secundário (1:500) em uma solução de PBS 1,5% de soro Goat por um período de 1 hora. Após essa etapa as lamínulas passam pelo processo de vedação, utilizando o Vecta Shield, e estão prontas para a análise microscópica.
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4.6) Análise dos resultados
Para comparações entre apenas dois grupos, realizamos teste t de student. Para comparações entre 3 ou mais grupos com apenas uma variável, utilizamos análises de variância (ANOVA one-way). Para comparações entre 3 ou mais grupos com mais de uma variável, utilizamos análises de variância (ANOVA two-way). Havendo diferença entre os grupos, foram aplicados testes de comparações múltiplas pos hoc Bonferroni. Todos os experimentos foram realizados em duplicata, com número de amostras maior ou igual a quatro.
5) Resultados e Discussão
5.1) Padronização da diferenciação das células Neuro2a com dbcAMP em neurônios dopaminérgicos
Inicialmente, nos baseamos na metodologia de diferenciação celular descrita em (30). Neste artigo, as células Neuro2a eram submetidas à doses de 0,5mM e 1mM de dbcAMP por alguns dias. Por isso, realizamos tratamentos com 0,5mM e 1mM de dbcAMP e verificamos que em apenas um dia de incubação com o dbcAMP foi suficiente para quase dobrar a expressão gênica de Th de forma significativa (Figura 1a). Entretanto, muitas células morriam com o tratamento de dois e três dias (dados não mostrados). Pensando nisso, resolvemos testar uma dose menor de dbcAMP. Esta dose foi a de 0,2mM que foi reposta na cultura a cada dois dias durante seis dias de tratamento. Observamos um aumento bastante acentuado na expressão gênica de Th (Figura 1b), enzima crucial para produção de dopamina, além de uma alteração morfológica bastante interessante e compatível com neurônio (Figura 1c e 1d).
Figura 1. a) Expressão gênica de
gênica de Th após seis dias de tratamento com dbcAMP. meio DMEM high glucose, 10% FBS).
dias (meio DMEM low glucose, 0,5% FBS + 0,2mM de dbcAM
5.2) Expressão de genes alvo em células Neuro2A diferenciadas em neurônios dopaminérgicos
Após a diferenciação celular (comprovada pelo aumento de alteração da morfologia celular), realizamos qPCR para verifica genes alvo do estudo. Observamos um aumento na expressão de (Orexina e seu receptor, respectivamente). A expressão de
formação de vesículas secretórias de DA) teve uma importante tendência de aumento, enquanto o receptor de dopamina, Drd1, não apresentou alteração na expressão gênica. É importante ressaltar que o receptor de grelina (
detectado neste tipo celular.
Expressão gênica de Th em um, dois e três dias com 0,5mM e 1mM de dbcAMP.
após seis dias de tratamento com dbcAMP. c) Morfologia das células Neuro2a indiferenciadas (em meio DMEM high glucose, 10% FBS). d) Morfologia das células Neuro2a diferenciadas com o tratamento de seis dias (meio DMEM low glucose, 0,5% FBS + 0,2mM de dbcAMP). n≥6, p<0,05, test t student.
Expressão de genes alvo em células Neuro2A diferenciadas em neurônios dopaminérgicos
Após a diferenciação celular (comprovada pelo aumento de alteração da morfologia celular), realizamos qPCR para verifica genes alvo do estudo. Observamos um aumento na expressão de (Orexina e seu receptor, respectivamente). A expressão de Vmat
formação de vesículas secretórias de DA) teve uma importante tendência de anto o receptor de dopamina, Drd1, não apresentou alteração na expressão gênica. É importante ressaltar que o receptor de grelina (
detectado neste tipo celular.
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em um, dois e três dias com 0,5mM e 1mM de dbcAMP. b) Expressão Morfologia das células Neuro2a indiferenciadas (em Morfologia das células Neuro2a diferenciadas com o tratamento de seis
P). n≥6, p<0,05, test t student.
Expressão de genes alvo em células Neuro2A diferenciadas em
Após a diferenciação celular (comprovada pelo aumento de Th e pela alteração da morfologia celular), realizamos qPCR para verificar a expressão de genes alvo do estudo. Observamos um aumento na expressão de Hcrt e Hcrtr1 Vmat (importante na formação de vesículas secretórias de DA) teve uma importante tendência de anto o receptor de dopamina, Drd1, não apresentou alteração na expressão gênica. É importante ressaltar que o receptor de grelina (Ghsr) não foi
Figura 2. a) Expressão gênica de Drd1;
Expressão gênica de Hcrt após o tratamento com dbcAMP. n≥6, p<0,05, teste estatístico Anova One Way.
5.3) Inibição da via de sinalização da Orexina em células Neuro2A Por ter sido verificado um aumento da expressão gênica de
a diferenciação das células Neuro2a em células dopaminérgicas, resolvemos inibir o receptor de orexina (HCRTR1) por meio da técnica de siRNA. Após a inibição do receptor observamos a diminuição na expressão gênica de
Neuro2a não foram capazes de se diferenciar em células dopaminérgicas. Isso nos encorajou a hipotetizar que a via de sinalização da orexina é crucial para o processo de diferenciação e síntese de DA por essas células.
Assim como observado em nosso exp
pesquisadores da Filadélfia foram capazes de demonstrar, por meio da utilização de um modelo animal, que camundongos
diminuíram a motivação para obter recompensa, reforçando a impor sinalização da orexina para a síntese de DA (
Expressão gênica de Drd1; b) Expressão gênica de Vmat; c) Express
após o tratamento com dbcAMP. n≥6, p<0,05, teste estatístico Anova One Way.
Inibição da via de sinalização da Orexina em células Neuro2A Por ter sido verificado um aumento da expressão gênica de
a diferenciação das células Neuro2a em células dopaminérgicas, resolvemos inibir o receptor de orexina (HCRTR1) por meio da técnica de siRNA. Após a inibição do receptor observamos a diminuição na expressão gênica de Th, ou seja, as célu Neuro2a não foram capazes de se diferenciar em células dopaminérgicas. Isso nos encorajou a hipotetizar que a via de sinalização da orexina é crucial para o processo de diferenciação e síntese de DA por essas células.
Assim como observado em nosso experimento acima descrito, um grupo de pesquisadores da Filadélfia foram capazes de demonstrar, por meio da utilização de um modelo animal, que camundongos knockout (KO) para o receptor HCRTR1, diminuíram a motivação para obter recompensa, reforçando a impor
sinalização da orexina para a síntese de DA (34).
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Expressão gênica de Hcrtr1 e d) após o tratamento com dbcAMP. n≥6, p<0,05, teste estatístico Anova One Way.
Inibição da via de sinalização da Orexina em células Neuro2A
Por ter sido verificado um aumento da expressão gênica de Hcrt e Hcrtr1 após a diferenciação das células Neuro2a em células dopaminérgicas, resolvemos inibir o receptor de orexina (HCRTR1) por meio da técnica de siRNA. Após a inibição do , ou seja, as células Neuro2a não foram capazes de se diferenciar em células dopaminérgicas. Isso nos encorajou a hipotetizar que a via de sinalização da orexina é crucial para o processo erimento acima descrito, um grupo de pesquisadores da Filadélfia foram capazes de demonstrar, por meio da utilização de para o receptor HCRTR1, diminuíram a motivação para obter recompensa, reforçando a importância da via de
Figura 3. a) Expressão gênica de
Hcrtr1 em células Neuro2A após a inibição do gene dois dias. n≥6, p<0,05, teste estatístico Anova Two Way.
5.4) Estímulo da via de sinalização de Grelina nas células Neuro 2a
A partir desses resultados, é possível inferir que a Orexina atua como um fator importante na modulação da expressão de
localizadas na área ventral tegumental (VTA) apresentam um aumento na produção de dopamina quando estimu
de grelina nessa região, indicando uma ação independente da via de sinalização hipotalâmica da grelina (
células Neuro2a já diferenciadas em dopa receptor de Grelina -
aumentar a expressão de
de dopamina em 2 ou 4 horas de tratamento.
Expressão gênica de Hcrtr1; b) Modulação na expressão gênica de Th e
em células Neuro2A após a inibição do gene Hcrtr1 por meio de SiRNA e diferenciação com dbcAMP por dois dias. n≥6, p<0,05, teste estatístico Anova Two Way.
5.4) Estímulo da via de sinalização de Grelina nas células Neuro 2a
A partir desses resultados, é possível inferir que a Orexina atua como um fator importante na modulação da expressão de Th. Estudos mostram que células localizadas na área ventral tegumental (VTA) apresentam um aumento na produção de dopamina quando estimuladas por meio de uma injeção intracerebroventricular de grelina nessa região, indicando uma ação independente da via de sinalização hipotalâmica da grelina (35-36). Para comprovar esta hipótese resolvemos tratar as células Neuro2a já diferenciadas em dopaminérgicas com Hexarelina (agonista do Ghsr). Observamos que a Hexarelina não foi capaz de aumentar a expressão de Th e de nenhum outro gene relacionado à via de produção de dopamina em 2 ou 4 horas de tratamento.
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Th e c) Expressão gênica de por meio de SiRNA e diferenciação com dbcAMP por
5.4) Estímulo da via de sinalização de Grelina nas células Neuro 2a
A partir desses resultados, é possível inferir que a Orexina atua como um . Estudos mostram que células localizadas na área ventral tegumental (VTA) apresentam um aumento na produção ladas por meio de uma injeção intracerebroventricular de grelina nessa região, indicando uma ação independente da via de sinalização Para comprovar esta hipótese resolvemos tratar as minérgicas com Hexarelina (agonista do ). Observamos que a Hexarelina não foi capaz de e de nenhum outro gene relacionado à via de produção
Figura 4a). Expressão gênica de
Expressão gênica de Th e e) Expressão gênica de
de duas e quatro horas com 1mM de Hexarelina. n≥6, p<0,05, te
5.5) Imunofluorescência de GHSR e TH em células Neuro2a
Realizamos imunofluorescência para as proteínas GHSR e TH. Sabemos que a célula possivelmente produz a proteína Tirosina Hidroxilase pois observamos variações na expressão do gênica de
em Tempo Real. Entretanto,
marcação da Proteína GHSR não foi conclusiva, como podemos observar na figura 6b abaixo.
ressão gênica de Hcrtr1; b) ; Expressão gênica de Hcrt; c) Expressão gênica de
Expressão gênica de Drd1 em células Neuro2A já diferenciadas após tratamento de duas e quatro horas com 1mM de Hexarelina. n≥6, p<0,05, teste estatístico Anova One Way.
5.5) Imunofluorescência de GHSR e TH em células Neuro2a
Realizamos imunofluorescência para as proteínas GHSR e TH. Sabemos que a célula possivelmente produz a proteína Tirosina Hidroxilase pois observamos variações na expressão do gênica de Tirosina hidroxilase (Th)
em Tempo Real. Entretanto, a expressão do gene Ghsr nestas células foi nula marcação da Proteína GHSR não foi conclusiva, como podemos observar na figura
30
Expressão gênica de Vmat; d) já diferenciadas após tratamento ste estatístico Anova One Way.
5.5) Imunofluorescência de GHSR e TH em células Neuro2a
Realizamos imunofluorescência para as proteínas GHSR e TH. Sabemos que a célula possivelmente produz a proteína Tirosina Hidroxilase pois observamos Tirosina hidroxilase (Th) na técnica de PCR nestas células foi nula, e a marcação da Proteína GHSR não foi conclusiva, como podemos observar na figura
a)
Figura 5. a) Observação da expressão do receptor GHSR em verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI); Observação da expressão de TH em verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI) na linhagem Neuro2a.
5.6) Imunofluorescência de GHSR e TH em células mHypoA
Com base nos resultados acima, resolvemos tratar uma linhagem celular hipotalâmica, a mHypoA
células hipotalâmicas respondem ao estímulo
através do aumento na expressão gênica de neuropeptídeos orexigênicos, tais como Npy e AgRP. Primeiramente, verificamos que as células mHypoA
receptor de grelina (GHSR) e também produzem Tirosina Hidroxilas a) b)
Figura 6. a) Expressão do receptor GHSR em verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI); verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI) na linhagem hipotalâmica mHy
b)
Observação da expressão do receptor GHSR em verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI); Observação da expressão de TH em verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI) na linhagem Neuro2a.
5.6) Imunofluorescência de GHSR e TH em células mHypoA - 2/29
Com base nos resultados acima, resolvemos tratar uma linhagem celular hipotalâmica, a mHypoA-2/29 com Hexarelina (agonista da grelina) visto que as células hipotalâmicas respondem ao estímulo da grelina gerando uma resposta através do aumento na expressão gênica de neuropeptídeos orexigênicos, tais como
. Primeiramente, verificamos que as células mHypoA receptor de grelina (GHSR) e também produzem Tirosina Hidroxilas a) b)
Expressão do receptor GHSR em verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI); verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI) na linhagem hipotalâmica mHypoA - 2/29.
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Observação da expressão do receptor GHSR em verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI); b) Observação da expressão de TH em verde (FITC) e do núcleo em azul (DAPI) na linhagem Neuro2a.
2/29
Com base nos resultados acima, resolvemos tratar uma linhagem celular 2/29 com Hexarelina (agonista da grelina) visto que as da grelina gerando uma resposta através do aumento na expressão gênica de neuropeptídeos orexigênicos, tais como . Primeiramente, verificamos que as células mHypoA-2/29 apresentam o receptor de grelina (GHSR) e também produzem Tirosina Hidroxilase (TH).
5.7) Sinalização da Grelina em linhagem hipotalâmica mHypoA
Baseados nos resultados acima da imunofluorescência, e também no fato de que o hipotálamo apresenta diferentes respostas aos estímulos pré e pós prandiais, pensamos em um experimento em que as células teriam maior ou menor concentração de glicose a fim de
Dessa maneira, tratamos as linhagens hipotalâmicas com DMEM (meio com baixa concentração de glicose)
de Hexarelina por 2, 4, 6 e 8 horas. Verificamos diminuiçã Orexina (Hcrt) após duas horas de tratamento,
quatro horas. Isso reforça nossa ideia de que a expressão de
por Hcrt, pois uma diminuição na expressão gênica deste último pode te diminuição na expressão gênica de
de AgRP após seis horas de incubação com Hexarelina, indicando que a célula apresentou uma resposta orexigênica ao tratamento realizado em baixa concentração de glicose.
Figura 7. a) Expressão gênica de tratamento com DMEM low glucose teste estatístico Anova One Way.
5.7) Sinalização da Grelina em linhagem hipotalâmica mHypoA
Baseados nos resultados acima da imunofluorescência, e também no fato de que o hipotálamo apresenta diferentes respostas aos estímulos pré e pós prandiais, pensamos em um experimento em que as células teriam maior ou menor concentração de glicose a fim de simularmos os estados pré e pós prandiais.
Dessa maneira, tratamos as linhagens hipotalâmicas com DMEM
(meio com baixa concentração de glicose), 0,5% FBS (situação pré prandial) e 1mM de Hexarelina por 2, 4, 6 e 8 horas. Verificamos diminuição na expressão gênica de
após duas horas de tratamento, seguido da diminuição de Isso reforça nossa ideia de que a expressão de Th
, pois uma diminuição na expressão gênica deste último pode te
diminuição na expressão gênica de Th. Em contrapartida, houve aumento do mRNA após seis horas de incubação com Hexarelina, indicando que a célula apresentou uma resposta orexigênica ao tratamento realizado em baixa
e.
Expressão gênica de Th; b) Expressão gênica de Hcrt e c) AgRP em células CLU189 após o low glucose com 0,5% de FBS e 1mM de Hexarelina por 2, 4, 6 e 8 horas. n≥6, p<0,05, teste estatístico Anova One Way.
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5.7) Sinalização da Grelina em linhagem hipotalâmica mHypoA -2/29 (CLU189) Baseados nos resultados acima da imunofluorescência, e também no fato de que o hipotálamo apresenta diferentes respostas aos estímulos pré e pós prandiais, pensamos em um experimento em que as células teriam maior ou menor
simularmos os estados pré e pós prandiais.
Dessa maneira, tratamos as linhagens hipotalâmicas com DMEM low glucose 0,5% FBS (situação pré prandial) e 1mM o na expressão gênica de seguido da diminuição de Th após Th pode ser modulada , pois uma diminuição na expressão gênica deste último pode ter levado à . Em contrapartida, houve aumento do mRNA após seis horas de incubação com Hexarelina, indicando que a célula apresentou uma resposta orexigênica ao tratamento realizado em baixa
em células CLU189 após o com 0,5% de FBS e 1mM de Hexarelina por 2, 4, 6 e 8 horas. n≥6, p<0,05,
Quando tratamos as linhagens hipotalâmicas com DMEM
com alta concentração de glicoise) 0,5% FBS, portanto, simulando uma situação pós prandial; e 1mM de Hexarelina por duas e seis horas, verificamos que há uma diminuição do mRNA de
aumento na expressão gênica de expressão gênica de Orexina (
variação na concentração de glicose durante o tratamento com situações pré-prandiais (em meio DMEM
estimular a fome; e situações pós prandiais (em meio DMEM aumentando a resposta hedônica (com tendência de aumento de Th).
Figura 8. Expressão gênica de
glucose com 0,5% de FBS e 1mM de Hexarelina por 2, 4, 6 e 8 horas. n≥6, p<0,05, test T student. Quando tratamos as linhagens hipotalâmicas com DMEM
com alta concentração de glicoise) 0,5% FBS, portanto, simulando uma situação pós prandial; e 1mM de Hexarelina por duas e seis horas, verificamos que há uma diminuição do mRNA de AgRP após 6 horas de tratamento, enquanto que há um aumento na expressão gênica de Th seguido da tendência de aumento na expressão gênica de Orexina (Hcrt) após 2 horas de incubação. É possível que a variação na concentração de glicose durante o tratamento com
prandiais (em meio DMEM low glucose), aumentando AgRP para estimular a fome; e situações pós prandiais (em meio DMEM
aumentando a resposta hedônica (com tendência de aumento de
Expressão gênica de Th, Hcrt e Agrp em células mHypoA-2/29 após o tratamento com DMEM com 0,5% de FBS e 1mM de Hexarelina por 2, 4, 6 e 8 horas. n≥6, p<0,05, test T student.
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Quando tratamos as linhagens hipotalâmicas com DMEM high glucose (meio com alta concentração de glicoise) 0,5% FBS, portanto, simulando uma situação pós prandial; e 1mM de Hexarelina por duas e seis horas, verificamos que há uma após 6 horas de tratamento, enquanto que há um seguido da tendência de aumento na após 2 horas de incubação. É possível que a variação na concentração de glicose durante o tratamento com a Hexarelina simule ), aumentando AgRP para estimular a fome; e situações pós prandiais (em meio DMEM high glucose), aumentando a resposta hedônica (com tendência de aumento de Hrct e aumento de
2/29 após o tratamento com DMEM high com 0,5% de FBS e 1mM de Hexarelina por 2, 4, 6 e 8 horas. n≥6, p<0,05, test T student.
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6) Conclusão
As células Neuro 2a são capazes de se diferenciar em neurônios dopaminérgicos através do aumento na expressão gênica de Tirosina hidroxilase. Também foi verificado um aumento da expressão gênica de Hcrt e de seu receptor Hcrtr1 concomitante ao aumento de Th.
A inibição através de um siRNA do receptor Hcrtr1 repercutiu na ausência do aumento da expressão gênica de Th e de Hcrt, revelando que a via de sinalização da orexina parece ter importante papel na expressão gênica de Th e possível influência na produção de dopamina em células Neuro 2a. Além disso, essas células não respondem ao tratamento com Hexarelina. Já a linhagem celular hipotalâmica mHypoA - 2/29 é responsiva à Hexarelina, e esta resposta é dependente da concentração de glicose presente no meio de cultura.
De forma geral, concluímos que a orexina parece exercer um importante papel em células dopaminérgicas (Neuro 2a), influenciando a expressão gênica de Th. Entretanto, essas células parecem não responder diretamente à Hexarelina (análogo grelina). Contudo, a Hexarelina apresenta função relevante nas células hipotalâmicas na medida em que é capaz de ativar a expressão gênica de AgRP e induzir a orexigênese quando em baixa concentração de glicose.
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