DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA
ESTUDO PRELIMINAR SORREL ) SISTEMA RNA-RNase EM HEPATOPINCREASA)E LA GOSTA JOVEM PANULIRUS LAEVICAUD
(LATREILLE)
Alexandre Holanda Sampaio
Dissertagao apresentada ao Departamento de Engenha ria de Pesca do Centro de Ciancias Agrarias da Univr-sidade Federal do Ceara, como parte das exigancias para a obp6gao do titulo de Engenheiro de Pesca.
S181e Sampaio, Alexandre Holanda.
Estudo preliminar sobre o sistema RNA-RNase em hepatopâncreas de lagosta jovem Panulirus laevicauda (Latreille) / Alexandre Holanda Sampaio. – 2019.
34 f. : il.
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Curso de Engenharia de Pesca, Fortaleza, 2019.
Orientação: Prof. Gustavo Hitzschky Fernandes Vieira. 1. Lagostas. I. Título.
CDD 639.2
1982.
comIssÃo EXAMINADORA
Profa. Ass. Franciaca Pinheiro Joventino - Presidente -
Profa. Ass. Manha Soares Brandao
VISTO:
Prof. Ass. Moises Almeida de Oliveira
Chefe do Departamento de Engenharia de Pesca
Profa. Aas. Francisca Pinheiro Joventino
Ao Dr. Gustavo Hitzschky Fernandes Vieira, -pela seriedade, dedicagao e amizade, que ficaram
pa-tentes durante a orientaçao que me foi dada paraa rea lizaçao deste trabalho.
Ao ar. Jader onofre de Moraes, pela permis so do uso das insta1aç3es do LaboratOrio de Cia-ncias do Mar.
A Regine, Luiz Carlos, pelo constante apoio para execuçio deste trabalho.
Aos amigos e colegas em geral pelo apoio.
Ao Vicente de Andrade Arrais, pela excelen-te composiçao datilografica desexcelen-te trabalho.
bioquímicas de um organismo vivo, g de importância fun-damental para a compreensao das atividades naturais des te organismo, bem como facilita o entendimento das inte raçoes com o habitat, fornecendo ainda subsidios para melhor aprimoramento biol6gico da espgcie estudada.
No obstante as lagostas Panulirus laevicauda e Panulirus argus (Latreille), constituirem no princi- pal produto pesqueiro de exportação do Brasil, não hg praticamente nenhum conhecimento sobre a fisiologia e bioquimica destes crustgceos e, em particular, referen te ao ciclo de muda.
0 desenvolvimento das espacies depende sobre-tudo de sua habilidade para sobreviv.encia, crescimentoe reprodugao em ambiente natural. 0 crescimento padrao em crustgceos decgpodos e conhecido atraves do ciclo de mu da (McCARTHY et alii, 1976).
Poucos aspectos da fisiologia dos crustgceos sao to importantes quanto a muda (PASSANO, 1960).
Segundo TRAVIS, (1955 a), estes periodos ci- clicos de crescimento so acompanhados por mudanças , clicas na epiderme e no hepatopgncreas.
At algum tempo atras o termo "muda" era refe rido somente para a evaginaçao (saida da velha carapa-ça), chamada tambam por vgrios autores de ecdise. Mais recentemente este termo (muda) tem sido virias vezes usa do para incluir as preparaçoes imediatas do animal para a ecdise e a mineralizagao posteriores (PASSANO, 1960).
DRACH (1939), ap6s considerar a grande impor-tancia da muda para o estudo do crescimento e fisiolo-gia dos crustgceos e apOs exaustiva investigagao, esta-beleceu quatro períodos bgsicos de crescimento (ID-Os-mu-da, intermu(ID-Os-mu-da, pra-muda e muda) e cinco estggios maio-res da muda (estggios A, B, C, D e E). Dentro destes es
Este sistema de classificagao dos estlgios de muda ganhou bastante aceitagão, mas sofreu varias modi-ficag3es por varios pesquisadores, inclusive por DRACH (1944) e DRACH e TCHERNIGOVTEFF (1967).
Posteriormente, este sistema foi novamente mo dificado, tendo em vista adapta-lo para o uso nas diver sas especies de lagosta (DONAHVE, 1954; HEPPER, 1965; BARLOW- AND RIDGENAY,1969; AIKEN, 1973; GILGAN AND ZINCK, 1975) e variedade de outros crustaceos (HIATT, 1948; CHARNIAUX-LEGRAND, 1952; TRAVIS, 1955; KNOWLES AND CAR-LISLE, 1956; CHARNIAUX-COTTON, 1957; CRISP, 1960; PAS-SANO, 1960; SCHEER, 1960; KURUP, 1964; NAGABHUSHANAN & RAO, 1967; STEVENSON, 1968; STEVENSON et al., 1968;SPIN DLER et al., 1974).
Conforme Travis (1955 a), no estudo do ciclo de muda, varios metodos podem ser usados para designar os estagios. Dois metodos principais podem ser usados, a saber: 1) indicação do tempo real do período; e 2) in dicagão dos caracteres morfol6gicas do esqueleto e teci dos. 0 primeiro destes metodos oferece certas vanta- gens. Por este metodo, e possível determinar o cresci-mento nos períodos de intermuda em cada classe de tama nho e determinar a duragão de caracteres morfolegicos existentes no esqueleto a cada variação seasonal.
0 segundo metodo consiste na divisgo do ciclo de muda em quatro maiores estagios, A, B,CeDe subdi vidindo cada um desses estagias em substagios de acordo com DRACK (1939). Sua maior vantagem e de poder agrupar varios animais dentro dos estagios de muda sem refer2n cia do intervalo de tempo sobre o qual estende tais es-tagios. Outra vantagem do metodo de Drach e que no exi ge o conhecimento da idade ou tamanho do animal de esta gios correspondentes, podendo ser comparados igualmen te, ainda que a duração destes estagios varie com o ta-manho e estagJes do ano.
Analogamente a outros metodos de determina- çao de estagios de muda de crustaceos, o metodo prima-
rio de Drach se resume basicamente em quatro divises, ou seja:
Estagio "A" - Estagio imediatamente seguinte a muda, o exoesqueleto (nova carapaça) e de consistencia de uma membrana macia. 0 animal não se alimenta. A duração e de 24 horas aproximadamente.
Estagio "B" - Ocorre o endurecimento preliminar do es-queleto, o qual atinge a consistgncia de um pergaminho. A carapaça fica rigida em certas regi"Oes enquanto que a
_ região branquial permanece macia. 0 animal tambem no se alimenta. Ocorre um dia apOs a muda com duragão de 5 ou 6 dias.
Estagio "C" - 0 esqueleto fica inteiramente duro mas continua a engrossar durante grande parte do período. Este e um período de atividade alimentar e e o mais lon go do ciclo, durando aproximadamente do setimo ao quin quagesimo primeiro dia (519) apos a muda, corresponden do um total de aproximadamente 44 dias. Durante o final do estagio "C", as camadas membranosas e a camada prcipal da epiderme esta completa. 0 termo "animal na in-termuda" pode ser aplicado para animais com o desenvol-vimento completo do esqueleto, acontecendo no intervalo de dias entre duas mudas, isto g, 28 a 35 dias seguin-tes de uma muda e outra (TRAVIS, 1955 a).
EsCagio "D" -
0 futuro novo esqueleto g progressivamen te formado sob a velha carapaça, enquanto que esta dimi nui gradativamente a reabsorção de minerais e consti- tuintes organicos. Este período dura aproximadamente de 10 a 14 dias no qual o animal no se alimenta. A nova endocuticula g visível externamente por observação, na região central do abdomem ou por quebra das antenas ou patas, pela qual fica externamente visível.0 estagio E, conhecido como muda, era conside rado uma breve interrupção no processo normal de -vida dos decapodos, mas tem-se mostrado gradualmente sua im-portancia, algm de simples parte da vida destes crusta
ceos. Se as condig;es para a muda forem desfavoraveis, esta fase que leva alguns minutos, pode se estender por varias horas (AIKEN,1980).
Como parte essencial deste estado biolOgico da especie o hepatopancreas apresenta-se como orgao fun damental no processo fisiol6gico da muda, bem como para as varias atividades metab6licas dos crustaceos, pela acumulagao de substancias de reservas de significada im portancia para seu desenvolvimento.
PASSANO (1960), cita que a maioria das subs-tancias de reserva so estocadas no hepatopancreas, sen do usadas para alimentagao e demanda especial de mate-riais e energia durante o processo de muda.
0 hepatopancreas funciona como Org-aTo armazena dor de enzimas e reservas organicas e minerais. Em con seqUencia disto ocorre intensa mobilizagao destas reser vas para suprir a necessidade de outros tecidos(TRAVIS, 1955 a).
G acumulo de substancias organicas de reserva
tt
e realizado no estagio C11 , principalmente no estagio mas continua durante o estagio "D" (D
o e D i), ter minando quando o animal cessa a alimentagao (estagio D 2),(PASSANO, 1960).
Durante o período entre os estagios D
1 e C1 os crustaceos no se alimentam. As reservas organicas so inteiramente usadas durante este período, sendo tam bem utilizadas para construgao do novo esqueleto.
Embora os conhecimentos sobre a estocagem de protelnas e sua utilizagao sejam escassos, as protelnas parecem ser o componente essencial da reserva organica quando acumuladas no hepatopancreas durante a intermuda.
SKINER (1965 e 1966), mostrou que durante o ciclo normal de muda dos crustaceos o estagio de premu da, estagio "D", e correlacionado com uma variedade de alterag-6- es no metabolismo, incluindo aquela relacionada com a síntese de proteína e RNA.
GILBERT & KING, (1973); WILLIS, (1974) e BUR- DETTI, (1974), afirmam que estudos realizados indicam que os horm'Onios da muda, ecdysones induz diretamente a biosintese de protelnas e RNA no hepatopancreas.
Os Milhares de organismos que existem na natu reza so representados em geral, por diferenças em pro ternas. 0 DNA acido desoiciribonucleico) efetua seu con trole, principalmente, especificando a sintese de deter minadas proternas. (De Busk, 1971).
0 RNA acido ribonucleico) tem papel central neste processo altamente regulado. 0 modelo geral de in formaç3es partindo do DNA pode ser resumido como segue:
REPLICAÇÃO TRANSCRIÇÃO TRADUÇÃO
DNA > RNA PROTEÍNA
A composigao qurmica do RNA e semelhante a do DNA, deferindo apenas em 3 pontos principais: o açiicar ribose, a base pirimidica uracila e a caracteristica de um sO fio dos polimeros de RNA.
0 controle da sintese proteica e crucial para a regulação genetica. Os genes se expressam, em ultima instancia, atraves de proteinas cuja sintese eles dini gem. Um ponto central de todo o processo e a tradução de informação codificada no mRNA, na seqtrencia de ami-noacidos presentes na protelna.
Alem do mRNA (mensageiro), dois outros tipos de RNA participam do processo, ou seja, o RNA ribossiimi co (rRNA) e o RNA de transferencia (tRNA). Embora o tRNA e rRNA juntos constituam 96 a 98% de todo o RNA, eles são sintetizados a partir de apenas uma pequenapor gão de DNA total.
Evidencias bioquimicas sugerem que tanto a estrutura secundaria como tambem a função das protelnas e conseqUencia direta da sequencia linear de aminoaci dos (ou estrutura primaria) (De Busk, 1971).
um mecanismo atraves do qual ocorre a sintese de RNA e proteína. Os ribossomos, que constituem a maior parte do RNA celular, estio certamente envolvidos na sinte se proteica e a sua taxa e reduzida quando a sintesepro teica e inibida. Portanto a principal limitaçao nas ta-xas de síntese proteica e o RNA.
No obstante a grande importancia do sistema RNA-RNase nos processos metabOlicos, so escassas as in formaç3es sobre este sistema em crusteceos.
A literatura disponivel sobre o tema aborda os aspectos ligados a síntese de RNA e proteína em con-diç-Oes fisiolOgicas normais e sob a aço de estimulan-tes.(GORELL &GILBERT, 1969; KAUFMANN & GINZBURGITIETZ, 1963; SKINNER, 1966; SKINNER, 1968; JAHOTA & MANSINGH, 1970; SKINNER & KERR, 1971; McCARTHY, 1975; McCARTHY et al, 1976; DALL & BARCKAY, 1979; WORHOUDT & SELLOS,1980; SPINDLER-BARTH et all, 1980).
Estudos mais exaustivos sobre a questao sao relacionados com vegetais (MARRAM & STROMINGER, 1956; FRISH-NIGGEMEEYER & REDDI, 1957; TUVE & ANFISON, 1960; CRESTIFIELD, SMITH & ALLEN, 1960; KESSLER & ENGELBERG, 1962; LEDOUX, GALAND & HUART, 1962; PETERSON & FOWDEN, 1965; BARKER & HOLLIM SHEAD, 1967; VIEIRA et al. 1972), em bacterias (BISHOP, 1965; JONES, DIECKMANN & BERG, 1967).
Considerando a relevencia do conhecimento so-bre o comportamento da ribonuclease edo RNA para o en-tendimento dos processos fisiolOgicos de crusteceos, es te trabalho aborda a caracterizaçao da ribonuclease de hepatopencreas de lagosta jovem Pauulirus laevicauda(La treille) e seu comportamento em relaçao ao ciclo de mu-da, bem como os níveis de RNA.
II - MATERIAL E MgTODOS
Para o presente trabalho, utilizamos hepato- pancreas da lagosta jovem Panulirus laevicauda (La treine), coletadas na Praia do Meireles e Praia do Ti tanzinho (Fortaleza-Ceara), quando das mares baixas e, posteriormente, estocadas nos aquarios do Laboraterio de Ciencias do Mar, e retiradas quando do preparo dos extratos.
Varios exemplares foram separados apos deter minação dos estagios C
4 e D, a fim de acompanhar a mu-da, obtendo-se assim os estagios A e B, difíceis de se coletar devido a proteçao do animal contra seus preda-dores neste período.
0 metodo para determinaçao dos estagios de muda usado, foi o de DRACK (1939), segundoTRAVIS (1955a).
As lagostas estocadas nos aquarios para pos-terior utilização foram alimentadas com file de peixe e lagosta. Os aquarios apresentavam renovagao constan te de igua e aeraçao, possibilitando um ambiente ideal de estocagem.
A medida que as lagostas eram retiradas dos aquarios para posterior analise, eram determinados o sexo, tamanho e estagio de muda.
EXTRAÇÃO DA AMOSTRA
A extraçao do hepatopancreas foi realizada por corte quadrangular na parte superior do cefaloto rax, com auxilio de uma tesoura, sendo retirado por uma pinça e colocado em papel de filtro Framex por 2 minutos.
ApOs este periodo o hepatopancreas foi pesa-do em balança Metller P. 1.200, senpesa-do entao homogenei zado em tampão fosfato 0,1 M pH 5,7, sob banho de ge-lo, ma proporção de 1:10 (p : v).
0 homogeneizado foi centrifugado em centrí fuga refrigerada modelo PR-J International Equipament Company por 10 minutos a 4°C a 3.000 rpm. Quando o ex-trato apresentava-se com bastante gordura, o mesmo era filtrado em papel de filtro. 0 filtrado era levado a pH 5,1 com acid° clorldico 0,5N e colocado em repouso por uma noite. Em seguida, era novamente centrifugado nas mesmas condigaes anteriores, sendo desprezado o precipitado.
ANALISES QUÍMICAS
As analises químicas constaram da atividade ribonucleasica e da determinação dos cidos nucleicos. Ambas as anllises foram realizadas em lagostas jovens Panulirus laevicauda (Latreille), nos diversos esta-
gios de muda.
As determinagaes das condicaes timas da ati vidade ribonucleasica com pH de reagao, tempo-tempera- tura, relagao enzima substrato, termo-estabilidade e extragao em diversos pHs, foram feitas em lagostas no estagio C de muda.
A atividade ribonucleasica ainda foi determi -
nada nas varias fragoes oriundas da purificagao do ex- trato com sulfato de amnia. Nestas tambam foi determi nada a concentragao de proteínas.
ATIVIDADE RIBONUCLEASICA
Considerou-se a atividade ribonucleasica co-mo sendo a capacidade de hidrolizar acido ribonucleico (RNA).
A preparagao do extrato para a atividade ri-bonucleasica foi semelhante aquela utilizada por TUVE & ANFINSEN (1960), como citada acima.
0 RNA utilizado (ICN - Pharmaceuticals,Inc.), foi diluído na proporgao de 0,1% em tampo citrato de sadio 0,1M, pH 5,2.
em 260 mm em 635. 0 branco
Para o ensaio enzimatico foram tomadas 0,2 ml do extrato; 1,5 ml de tampo citrato 0,1M, pH 5,2; 0,8 ml de RNA, atingindo lm volume final de 2,5 ml. A reaçao se processou a temperatura de 45oC durante 30 minutos, sendo parada por adiço de 0,5 ml de acetato de uranila a 0,75% em HC1 25% (TUVE & ANFINSEN, 1960). Apes o termino da reagao a mistura obtida permaneceu em repouso por 10 minutos. Do sobrenadante, obtido por centrifugagao a 3.000 rpm em centrifuga International Clinical Centrifuge modelo A 4487 x 5 por 10 minutos, foram retirados 0,2 ml e adicionados 4,8 ml de
tilada, sendo a absorba-ncia lida fotSmetro VARIAN TECHTRON modelo
po zero da reaçao obteve-se pela adição do substrato apos ter sido adicionado acetado de uranila a 0,75% em HCl a 25%. A unidade de atividade enzimatica corres pondeu a variag"aTo de 0,1 de densidade iStica, sendo es-ta atividade expressa em unidade de atividade por ml. A atividade ribonucleasica foi determinada em lagostas jovens nos diversos est-agios de muda. DETERMINAÇÃO DO pH ÓTIMO
A determinagao do pH Otimo da ribonuclease efetuou-se utilizando-se tamp.ao citrato 0,1M nos se- guintes Phs: 4,0; 4,6; 5,2; 6,2 e tampo fosfato 0,1M nos pHs: 7,0; 8,0; 9,0 e 10,0.
A reagRO foi processada
a
temperatura de 45°C durante 30 minutos seguindo o procedimentonor.
ante
Atraves, da diferença de atividade 6tica en-tre os tubos brancos e problemas, calculou-se a unida-de unida-de atividaunida-de para cada pH.
DETERMINAÇÃO DO TEMPO E TEMPERATURA
Para a determinagao do tempo e temperaturas otimas, procedeu-se a reaqao do extrato com o substra-
água des eSpecto ou tem-
to em condiv;es de reagãO ja descritas nas temperatu-ras de 40 e 45°C com os tempos de 15; 30; -45; 60 e 90 minutos, utilizando-se um banho-maria ultratermostat Typ Ut, com sensibilidade de 0,1°C.
Os resultados foram expressos em U.A. x ml-1.
RELAÇÃO ENZIMA/SUBSTRATO
Para escolha da concentração de substrato a ser usado, foram feitos experimentos em que a concen tração do substrato de 0,2 mg a 1,0 mg de RNA, conser-van-se o volume do extrato em 0,2 ml.
A reagão enzimatica foi desenvolvida comodes crita anteriormente e os resultados expressos em U.A. x ml-1.
TERMO-ESTABILIDADE
Para a determinação da termo-estabilidade, o e
extrato foi submetido a temperatura de 50°C em tempos variados. Findo cada tempo, era determinada no extra-to a atividade ribonucleasica sendo expressa em
U.A. x ml-1. Estes resultados foram transformados em percentagem relativa sendo a atividade do extrato, no submetido ao aquecimento considerada como cem por cento (100%).
pH ÓTIMO DE EXTRAÇÃO
Para determinação do pH timo de extraqao, usou-se tampão acetado de sadio 0,1M para os pHs 4,0 e 5,0, tampão fosfato de sadio 0,1M pHs 6,0 e 7,0 e tampo borato de sadio pHs 8,0 e 9,0.
0 hepatopancreas foi homogeneizado em cada pH citado, sendo o homogeneizado centrifugado em cen-trifuga modelo HT da IEC a 20.000 x g com temperatura em torno de 4°C.
No extrato foi determinada a concentraçao de proteína pelo metodo do microbiureto (GOA, 1953), usan do-se como padrao a albumina serica bovina (sigma),sen do expressa em mg de proteína por ml. A curva padrao e apresentada na figura I.
A atividade proteolitica determinada no ex- trato obedeceu ao procedimento ja descrito sendo os re sultados expressos em U.A. x mg de proteina-1 (ativida de especifica).
PURIFICAÇÃO
A purificaçao da enzima ribonuclease foi rea lizada atraves da adiço de sulfato de amnia
((NH
4)2SO4).
0 homogenato foi tratado com 20% de sulfato de amonia e, apos 15 minutos, foi centrifugado a 10000
ivp-rYt por 10' em centrifuga modelo HT da IEC. 0 precipi tado foi suspenso em tampo citrato 0,1M pH 5,2 e o so brenadante utilizado para nova precipitagao com sulfa- to de amSnia, agora a 40% de saturaqao e, assim, at ao nível de saturação de 100%.
Todos os precipitados foram suspensos em tam pao citrato e os sobrenadantes foram dializados contra agua destilada a temperatura em torno de 4oC, durante um tempo suficiente para permitir uma reação negativa entre a agua e a soluço de hidrOxido de brio.
Foram convencionados os simbolos de P
1, P2' P
3' P4 e P5' para os precipitados de 0-20, 20-40, 40-60, 60-80 e 80-100% de saturaqao de (NH4)2SO 4,
respec-tivamente.
Os sobrenadantes do extrato bruto e aquele oriundo da fraqao 80-100%, foram designados de S
1 e S2' respectivamente.
Em todas as fraçOes foram determinadas as concentraçoes de proteínas pelo metodo de GOA(1953), usando a albumina serica (sigma) como padrao(figura 1)
sendo a concentraçao expressa em mg de proteína x m1-1. A atividade ribonucleasica foi determinada nas fraçges, procedendo-se como
ja
descrito anmente, sendo os resultados expressos em U.A. x mg de proteina (atividade especifica).
ÁCIDOS NUCIAICOS
A extração e a determinação de cidos nuclei cos foi feita de acordo com CHERRY (1962).
Pesou-se em torno de 0,5g de hepatopancreas e homogenou-se com 4,0 ml de metanol a frio, seguindo -se uma centrifugação. 0 precipitado foi lavado com 3 porçges de 4,0 ml de metanol repetindo-se a centrifuga gao apos cada lavagem. 0 resíduo obtido foi tratado com 6,0 ml de acido perclOrico a 0,2M, a frio. 0 preci pitado obtido mediante centrifugação foi tratado com 6,0 ml de lcool etilico absoluto e centrifugado. Nova mente, tratou-se o precipitado com 6,0 ml de uma mistu ra de etanol - eter (2:1), a 50oC por 30 minutos, com centrifugação posterior. 0 precipitado resultante, foi suspenso em acid° perc16rico a 50% e colocado em banho maria a 70°C por 40 minutos. Findo este tempo, colocou -se o homogenato em repouso por uma noite, em refrige-rador. ApOs centrifugação, o precipitado foi despreza-do. Todas as centrifugaçges foram feitas E temperatura de 4°C E 3000 x g, exceto aquelas citadas. Numa aliquo ta do sobrenadante leu-se a absorbancia nos comprimen tos de onda de 260 e 290 mm, em espectafotgmetro VARIAN TECHTRON modelo 635. Pela fOrmula de CHERRY (1962), foi obtida
_
a concentraçao de acido nucleico total, expressa em pg de acid() nucleico total por ml. Do mesmo sobrenadante usado pa-ra determinar a concentpa-ração de cidos nucleicos, reti rou-se uma amostra para a determinaçao da concentraçao de acido desoxiribonucleico (DNA). A 1,0 ml do sobrena dante adicionou-se 1,5 ml de difenil-amina a 1%, sendo a mistura aquecida a 100°C por 30 minutos. A intensida de de cor foi medida em comprimento de onda de 550 mm
Para a .determinagão das condigiies timas de ensaio, o extrato do hepatopancreas foi utilizado como fonte da enzima ribonuclease.
A curvada atividade ribonucleasica em rela- go ao pH, usando o RNA a 0,1% como substrato, mos- trou que o maximo de atividade ribonucleasica foi al- cangado nos pHs 5,2 e 8,0 (Tabela I, Figura 3), com uma leve superioridade da atividade relativa ao Ultimo pH.
A relagão enzima substrato foi determinada a fim de que a reação enzimatica se desenvolvesse no ex cesso de substrato. Pela curva obtida ficou estabeleci da a. relagão de 0,8 mg de substrato (RNA 0,1%) para 0,2 ml do extrato (hepatopancreas), em um volume total
de 2,5 ml (Tabela II, Figura 4).
Pela observação da Tabela III e Figura 5, ve rifica-se que ha um acrescimo na atividade ribonuclea-sica com o aumento da temperatura de incUbagão.
Na temperatura de 45°C e no tempo de 30 minu tos a atividade ribonucleasica apresentou um incremen to percentual-mais elevado, quando comparadas aos ou- tros valores, razão pela qual foram escolhidos este tempo e temperatura para os enzaios enzimaticos.
A estabilidade da enzima RNase, em relação a temperatura e verificada na Tabela IV e Figura 6.0b serva-se que nos primeiros 13 minutos de incubagão do extrato a 50°C, não houve alteração na atividade, veri ficando-se isto, a partir de 30 minutos e atingindo o valor maxim° em 60 minutos, quando a enzima perdeu 79% de sua atividade. A Tabela V, Figura 7, mostram a ati-vidade ribonucleasica em função do pH do tampão de ex- traço. Seu maxima e verificado no tampão acetato de sadio pH 5,0, decrescendo para os valores corresponden tes aos outros pHs, embora o valor maxim° para protei-na tenha ocorrido no pH 9,0.
gao 60 - 80% de saturagao, seguindo-se os valores cor- respondentes a 20 - 40% e 40 - 60% de saturagao (Tabe- la VI, Figura 8). Nestas fragJes houe um incremento na atividade de 18 vezes para 60 - 80%, 5,9 vezes para a fragao 20 - 40% e de 40 - 60% de saturagao de 3,5 ye
0,111
Zes em relação ao extrato bruto (S 1)._
Os resultados de atividade ribonucleasica em hepatopancreas de lagosta jovem Pauulirus laevicauda
(Latreille) so mostradas nas Tabelas VII e VIII, os quais so apenas preliminares sujeitos, portanto, a re viso e modificagiies. A atividade ribonucleasica a ati vidade especifica tem seu valor maximo no estagio C de de muda, enquanto o valor minim° ocorreu no estagio D. Quanto a proteina esta teve sua concentragao maxima no estagio D e a minima no estagio C (Tabela VIII).
0 RNA foi maxim° no estagio C e mínimo no es tagio A (Tabela VIII).
Em relagao ao comprimento a atividade ribonu cleasica teve seu pico maxim° na classe 12 - 13 cm ten do a proteína alcançado seu maxim° de concentragao na classe 8 - 9 cm (Tabela VII).
0 estudo das condig-o- es timas para o ensaio da ri- bonuclease tem sido exaustivo, principalmente para aquelas enzimas encontradas em vegetal (KHORANA, 1959; ANFINSEN
WHITE, 1965; WILSON, 1971; VIEIRA, 1975).
Os resultados referentes a atividade ribonucleasi- ca em fungo do pH mostraram dois picos maximos, um em pH 5,2 e outro em pH 8,0, sendo uma atividade mais acentuada no Ultimo pH. Isto sugere a presenga de duas enzimas em hepato pancreas da lagosta jovem Panulirus laevicauda (Latreille), certamente cada um com uma fungo fisiolOgica bastante defi-nida.
WILSON (1971) encontrou tres enzimas que degrada RNA, as quais foram denominadas de RNase I, RNase II e Nu- clease I.
ANFINSEN & WHITE (1961) citam duas enzimas que hi- drolizam RNA em pancreas bovino e em espinafre, adiantando que . o pH otimo parece variar com a fonte do RNA.
MAVER & GRECO (1956) encontraram que a ribonuclea se pancreatica tem um e'timo de atividade no pH 6,5 para RNA de rato, enquanto KUNITZ (1946) registra um pH Otimo de 7,6 para a mesma enzima quando a fonte do RNA e a levedura.
A temperatura e o tempo de ensaio, bem como a rela çao enzima-substrato, foram basicamente semelhantes aos usa-dos para outras ribonucleases (SHUSTER, 1957: TUVE &. ANFIN-SEN, 1960; KHORANA, 1961).
A satur-aço da enzima ocorreu na razao de 0,8 mg de RNA para 0,2 ml do extrato bruto.
0 sistema ribonucleasico em hepatopancreas de la-gosta parece no ser muito estavel ao calor, tendo em vista sua perda de atividade em torno de 79% da inicial, quando o extrato foi submetido ao calor por 50°C.
ao uso do tampo acetado pH 5,0, quando a atividade ribonu-cleasica foi maxima, sendo superior aquela para extrato pre parado segundo o metodo de TUVE & ANFINSEN (1960).
KUNITZ (1940) foi o primeiro pesquisador a preco-nizar um metodo de isolamento e purificagao para ribonuclea se, quando cristalizou a ribonuclease pancreatica.
A purificagao do sistema ribonucleasico com sulfa -
to de amnia mostrou um otimo de atividade na fragao 60-80%, considerando que a purificagao aumenta de 4 vezes a ativida de em relagao ao extrato bruto e a enzima mostrou uma recu- peragao de 0,71%, pode-se adimitir que este metodo seja a primeira etapa para o caminho analítico de isolamento e pu-rificagao deste sistema ensimatico.
0 comportamento dos cidos nucleicos e enzimas com agao sobre eles, relativo ao ciclo de muda de crustaceos e muito escasso. Os pesquisadores que tem se ocupado do tema •sempre utilizam um estimulante como hormSnios
ecdisones,pa-ra abreviarem o tempo de muda das lagostas, observando prin cipalmente a relagao de sinteses de proteína e RNA(SKINNER, 1968; WORMHOUDT & SELLOS, 1980; SPINDLER-BARTH et al, 1980; GORELL & GILBERT, 1969; DALL & BARCLAY, 1979).
GORELL & GILBERT (1969) observaram que os animais respondem rapidamente quando estimulados por hormOnios da muda e que ha um incremento na velocidade de síntese de RNA e proteína no período de pre-muda.
Os resultados maximos de RNA ocorridos no estagio C estariam de acordo com os estudos acima citados, sugerin-do que este compo-sto e estocasugerin-do em maior escala neste esta-gio como uma preparagao para uma maior síntese de proteína, que ocorreu no estagio D e que esta de acordo com os estu-dos de TRAVIS (1955 a) e PASSANO (1960).
A favor desta indicagao tem-se o fato de que a atividade ribonucleasica tambem foi maxima no estagio C, su gerindo um intenso "turnover" do sistema RNA-RNase.
Devido ao pequeno numero de amostras obtidas em relação aos es- tagios de muda, as conclusOes se reves tem de carater preliminar, exceto aquelas que se refe-rem as determinaçoes dos parâmetros do sistema enzimati
CO.
1- 0 pH Otimo de reação da enzima RNase em hepatopancreas de lagosta jovem Panulirus laevicauda (Latreille) apresentou dois valores maximos (pHs 5,2 e 8,0), indicando provavelmente a presença de duas enzi mas.
2- A relagão enzima-substrato foi de 0,8 mg de substrato (RNA 0,1%) para 0,2 ml do extrato de hepa topancreas.
3- 0 tempo de reagão iStimo foi de 30 minutos de incubagão a 45°C.
4- A enzima RNase apresentou estabilidade em relação a temperatura de incubagao (50°C) do extrato at 15 minutos decaindo gradativamente at o tempo de 60 minutos quando atingiu 79% de perda de atividade.
5- A eficia'ncia de extração em função do pH Otimo, da enzima RNase foi verificada em tampão acetato de sadio pH 5,0.
6- 0 Otimo de saturagao de sulfato de amnia para purificaçao da enzima, foi de 60 - 80% de concen-tragao, com aumento de 18 vezes na atividade em relação do extrato bruto.
7- A maior atividade especifica de atividade ribonucleasica em relagao a classe de comprimento, foi no intervalo de 12 a 13 cm e o menor em 8 a 9 cm.
8- A quantidade de proteína por ml, apresen tou seu maximo no intervalo de classe de 8 a 9 cm e seu mínimo de 12 a 13 cm.
VI-SUMARIO
0 presente trabalho objetivou determinar as condi goes timas do sistema RNA-RNase, bem como as caracterls- ticas basicas da enzima RNase em -hepatopancreas e sua rela gao com os estagios de muda de lagosta jovem Panulirus lae vicauda (Latreille).
0 hepatopancreas foi retirado das lagostas vivas, estocadas em aquarios no Laboraterio de Ciencias do Mar, capturadas nas praias do Meireles e Titanzinho (Fortaleza - Ceara).
•A determinagão dos estagios de muda, seguiu-se o modelo de DRACH (1939) segundo TRAVIS (1955 a), observando--se tambem o tamanho.
Todos os ensaios eazimaticos e determinagao de proteínas foram realizados em lagosta no estigio. C, exceto aqueles correlacionando o estagio de muda e/ou teor de pro tema.
0 extrato de hepatopancreas foi obtido por homoge neizagao com tampão fosfato 0,1 ml pH 5,7 sob banho de gelo na proporgao de 1:10 (p : v), centrifugando-se por 10 minu- tos a 3.000 rpm a 4°C. 0 sobrenadante foi levado a pH 5,1 com HC1 0,5 N e deixado em repouso por uma noite em geladei ra. Centrifugou-se novamente nas mesmas condiç-Oes desprezan do-se o precipitado.
A atividade ribonucleasica foi determinada pela capacidade de hidrolizar acido ribonucleico (RNA), na razão de 0,8 mg de RNA a-0,1% dissolvido em tampão pH 6,2 para 0,2 ml do extrato de hepatopancreas. A reação procedeu-se a temperatura de 45oC durante 30 minutos, sendo parada por adiço de acetato de uranila (0,5 ml) a 0,75% em HCl 25% (TUVE & ANFINSEN, 1960).
Apes 10 minutos de repouso, obteve-se um sobrena dante por centrifugagao a 3.000 rpm, por 10 minutos, o qual foi lido a 260 nm em espectrofot-Ometro.
com a determinaçao do pH Otimo, tempo e temperatura de rea- gao, relaçao enzima substrato, termo estabilidade e condi- go 6tima de extrato de enzima.
0 pH Otimo de reaçao observado apresentou dois ma- ximos (pH 5,2 e 8,0), supondo-se a presença de mais de uma enzima.
Observou-se que na relaçao enzima substrato, 0,8 mg de RNA (0,1%) foi suficiente para Haver o excesso de subs trato exigido para as condig3es timas de reagao.
0 tempo de reagao foi determinado nas temperaturas de 40 a 45°C, detendo-se o valor otimo em 30 minutos a 45°C de incubação.
A enzima ribonuclease, quanto a termo-estabilidade, mostrou seu decrescimo maxim° aos 60 minutos, quando perdeu 79% de sua atividade.
0 pH 5,0, foi o pH aim° de extraqao da enzima,cor respondendo aquele valor de melhor eficiencia de extraçao da RNase, em relaçao a atividade especifica.
A concentraçao de sulfato de amnia ideal para a purificaçao de enzima foi de 60 - 80% com incremento na purl ficação de 18 vezes do extrato bruto.
A atividade especifica ribonucleasica apresentou--se tima no estagio C e minima no. estagio D. Quanto a clas ses de comprimento o maxim° de atividade foi no intervalo de 12 a 13 cm e o mil-limo de 8a 9 cm.
A concentraçao de proteína no hepatopancreas foi maxima no estagio TY e classe de comprimento de 8 - a cm e mi nimo no estagio C e classe de comprimento 12 - 13 cm.
A maior concentraçao de RNA foi obtida no estagio C e menor no estagio A.
TABELA VI - DADOS RELATIVOS A PURIFICAÇÃO COM SULFATO DE AMNIA C(NE
4)SO4) DE RIBONUCLEASE DE
HEPATO-PINCREAS DE LAGOSTA JOVEM PANULIRUS LAEVICAUDA (Latreillel, NO ENSAIO USOU-SE RNA COMO SUBS TRATO, SENDO A INCUBAÇÃO À TEMPERATURA DE 45°C DURANTE 30 MINUTOS. % DE SULFA -1 -1 -1 , I VEZES DE -0--- TO DE AM U.A. x ml mg P x ml U.A.x mg x P NIA
RE'CUPERA gAo11PURIFICAÇÃO
0 - S1 75,0 95,4 0,79 100,0 1,0 0 - 20 P1 5,0 4,4 1,14 4,6 1,4 20 - 40 P 2 25,0 5,4 4,63 5,7 5,9 40 - 60 P3 37,5 13,4 2,80 14,0 3,5 60 - 80 P4 10,0 0,7 14,29 0,71 18,1 80 - 100 P5 5,0 1,9 2,63 2,0 3,3
TABELA VIII- VARIAÇÃO DE ATIVIDADE RIBONUCLERSICA E DE PROTEÍNA EM HEPA-TOPÃNCREAS DE LAGOSTA JOVEM PANULIRUS LAEVICAUDA(Latreille), EM FUNÇÃO DA CLASSE DE COMPRIMENTO.
CLASSE DE COMPRIMENTO (cm) N9 DE LAGOS TAS ANALISA DAS - -1
U.A. x ml mgProteinaxml-1 U.A.xmg Prot. - Mi Ma
R
Ni I MaR
Mi MaR
6 - 7 3 65,0 74,0 69,7 45,4 66,9 58,3 0,97 1,54 1,23 8 - 9 6 60,0 77,5 68,1 41,2 147,5 80,3 0,49 1,58 1,04 10 - 11 8 35,0 105,0 67,8 41,2 152,6 68,8 0,68 1,79 1,11 12 - 13 3 65,0 80,0 70,8 36,0 72,9 51,4 1,09 1,89 1,47 * Atividade Especifica Mi = Valor Mínimo Na = Valor MaximoR =
Media.VICAUDA (Latreille), EM FuNga) DOS ESTAGIOS DE MUDA.
ESTAGIO DE N9 DE LAGOSTAS U.A. x m1-1 mg Proteína x ml -1 U.A. x mg de Prot.* RNA -1 MUDA ANALISADAS Mi Ma
R
mi
1 MA 'R
Mi MaR
mg/g A 3 60,0 70,0 66,7 45,5 50,0 71,7 0,49 1,48 1,17 0,12 2 65,0 74,0 69,5 62,6 66,9 64,8 0,97 1,18 1,07 - C 12 50,0 105,0 69,9 36,2 72,9 52,9 0,99 1,87 1,36 0,81 3 62,5 77,5 70,0 61,7 91,7 74,5 0,68 1,13 0,97 0,28 Atividade Especifica Mi = Valor Mínimo, Ma = Valor MaximoR =
gadia1,0 80-
60-
0.6 0,8
FIG. 4 - Variagao da atividade ribunuclelsica de hepatopancreas de lagosta jovem Panuli- rus laevicauda (Letreille), em fungo da concentragao do substrato.
80-
60-
40-
450 C 940003b
66
TEMPO (min.) 96FIG.
5
- Variaçao da atividade ribonucleasica de hepa topancreas de lagosta joven Panulirus laevi- scauda (Latreille), em função da temperatura33 100 A TI VID A DE
so-
60- 40- 20- 10 20 30 40 50 60 TEMPO (mm)FIG. 6 - Variação da percentagem de atividade ribonuclea'sica de hepatopancreas de lagosta jovem Panulirus laevicauda (La treille), em funçao do tempo e temperatura de aquecimen to do extrato.
20-
15-
0-20 20-40 40-60 60-80 80-100
%(NH4)2 SO4
FIG.8 - Variaçao da ativldade ribonucle-asica de hepato- -
pancreas de lagosta jovem Panulirus Jaevicauda (Latreille), em funçao da percentagem de satu-rag:6:o de sulfato de am3nia.
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