UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Aline Binato Neufeld
Bioacumulação de metais pesados em Sargassum:
influência na distribuição e aptidão de anfípodes herbívoros
associados
CAMPINAS
2015
ALINE BINATO NEUFELD
BIOACUMULAÇÃO DE METAIS PESADOS EM SARGASSUM: INFLUÊNCIA NA DISTRIBUIÇÃO E APTIDÃO DE ANFÍPODES HERBÍVOROS
ASSOCIADOS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestra em Biologia Animal na área de Biodiversidade Animal
ORIENTADOR: FOSCA PEDINI PEREIRA LEITE
CO-ORIENTADOR: SILVANA GOMES LEITE SIQUEIRA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA ALINE BINATO NEUFELD, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. FOSCA PEDINI PEREIRA LEITE.
CAMPINAS 2015
Campinas, 17 de novembro de 2015.
Profa. Dra. Fosca Pedini Pereira Leite
Profa. Dra. Maurea Nicoletti Flynn
Profa. Dra. Lenita de Freitas Tallarico
Prof. Dr. Flavio Dias Passos
Prof. Dr. Gustavo Muniz Dias
A Ata de Defesa, assinada pelos mebros da banca, da Comissão Examinadora, consta no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedicatória
Dedico esse trabalho à minha mãe, Fleuma, que mesmo longe me apoiou nesse caminho.
Agradecimentos
À minha orientadora, Profª Drª Fosca Pedini Pereira Leite, por me mostrar a beleza de se trabalhar com algo que realmente gosta, por compartilhar sua sabedoria e pelo incentivo a fazer sempre o melhor trabalho.
À minha coorientadora Drª Silvana Gomes Leite Siqueira pela ajuda nos caminhos desconhecidos da ecotoxicologia e taxonomia.
Ao Glauco, pelas inúmeras viagens ao campo ao som dos anos 90, pela parceria, por estar sempre presente, pelos ensinamentos, confiança e apoio essencial para desenvolver esse trabalho e uma bela amizade.
Aos colegas de laboratório, Karine, Ana, Pedros, Mari, Ana Laura, Simone, Sueli, Lari, Edson e Marília pela ajuda em coletas, cuidados com o aquário por fazerem eu me sentir em uma verdadeira equipe.
À minha família, Fleuma, Lídia, Alexandre, Adriano, Marli que me fazem seguir em frente apesar das adversidades e principalmente a Larissa por ser minha fonte de alegria e inspiração.
Ao Carlos Eduardo Nunes, por se juntar a mim no meio desse caminho, por todo o carinho, a companhia do dia a dia e o apoio indispensável nos momentos difíceis.
Aos amigos de casa e vida, Maiona, Perse, Sheldon, Provs, Melô, Lui, Villa, Lana, Bianquinha, Chubs e Bruce. Pelos tantos anos de companheirismo e partilha de felicidade.
Ao Instituto Oceanográfico USP, pela estrutura para as coletas, em especial ao Manuel e Airton que sempre nos receberam bem.
Aos professores José Trigo, Cecília do Amaral e Rafael Oliveira pelo empréstimo de equipamentos e uso dos laboratórios.
Aos professores que contribuíram com sugestões e correções no processo de produção desse trabalho, Andre Garraffoni, Lenita Tallarico, Michela Borges, Marilia Bueno e Maurea Flynn.
À CAPES pelo financiamento de parte do projeto e ao programa de pós-graduação em Biologia Animal da UNICAMP.
Resumo
A ação antrópica frequentemente afeta o ecossistema marinho. As atividades industriais, portuárias e os aglomerados populacionais em regiões litorâneas são grandes fontes de poluição. Entre os poluentes despejados em grande quantidade nos ambientes marinhos estão os metais pesados, que podem ser tóxicos a diversos organismos e possuem a característica de acumulação ao longo das cadeias tróficas. Programas de monitoramento das regiões contaminadas são feitos fim de mitigar as consequências da poluição. As análises químicas, ecológicas e toxicológicas parecem fornecer resultados que indicam níveis de contaminação da realidade dos locais. A avaliação da qualidade ambiental é mais efetiva quando algumas ferramentas são combinadas. A análise de biomonitores pode fornecer informações sobre as concentrações biodisponíveis dos poluentes. Quando esses biomonitores são substratos biológicos a composição de sua fauna pode ser avaliada para análises ecológicas do local. Os bioensaios demonstram resultados dos contaminantes nos organismos que dificilmente são observados em campo. Esse projeto tem por objetivo analisar a alga Sargassum como um biomotor de metais pesados em um local contaminado e verificar se esse fator poderia influenciar na distribuição de sua fauna, principalmente os herbívoros. Além disso, foram feitos bioensaios toxicológicos para avaliação da dieta contaminada por cobre sobre o anfípode herbívoro Cymadusa filosa. A macroalga Sargassum apresentou concentrações de cobre em seus tecidos comparáveis as de locais contaminados, podendo assim atuar como um biomonitor. Tal contaminação pode ser um dos fatores para a determinação da distribuição dos anfípodes herbívoros da família Ampithoidae. A praia que apresentou Sargassum com maiores concentrações de cobre apresentou também uma composição de ampitoídeos muito diferente das demais. Os bioensaios de dieta contaminada por cobre em Cymadusa filosa indicaram que tal contaminação pode interferir no desenvolvimento sexual dos machos, como o crescimento do segundo par de gnatópodos. Além disso, há uma tendência à redução da sobrevivência e da porcentagem de fêmeas ovadas nas populações. Tais resultados reforçam a importância da integração de ferramentas para a avaliação da qualidade dos ambientes marinhos e também da alimentação como via de contaminação por metais pesados para esses organismos.
Abstratc
Human activities often impact marine ecosystems. Industrial activities, ports and urbanization in coastal areas are major sources of pollution. Heavy metals are one of the most important pollutants in marine environments. Metals can be toxic to many organisms and accumulate along trophic chains. Monitoring programs of the contaminated regions are important in order to mitigate the consequences of pollution. Chemical, environmental and toxicological analyzes together provide results indicating contamination levels close to the reality of the sites. The analysis of biomonitors can provide information on the bioavailable concentrations of the pollutants, and bioassays can demonstrate results of contaminants in organisms that are rarely observed in the field. Mixing the former tools is more effective to the evaluation of the environmental quality. When the biomonitors are biological substrates, the composition of fauna can be assessed for environmental site analysis. This project aims to analyze the Sargassum algae as a biomotor of heavy metals in a contaminated site and verify if the presence of heavy metals could influence the distribution of fauna, especially herbivores. In addition, toxicological bioassays were used for assess effects of diet spiked with copper on the herbivore amphipod Cymadusa filosa. The seaweed Sargassum from Enseada do Flamengo, Ubatuba, showed a contamination of copper in their tissues comparable to other locations, and thus it can be used as a biomonitor. The local with copper higher contamination in Sargassum also presented a Ampithoidae composition very different from the others. Thereby, the contamination can be a factor affecting the distribution of herbivore amphipods. The results of the bioassays with diet spiked with copper and Cymadusa filosa indicated that it can interfere in sexual development of males, such as the development of the second pair of gnatopods. In addition, we observed a decrease in survival and in the fertility of the females. These results reinforce the importance of integration tools for assessing the quality of marine environments and the feed contamination as an important pathway of heavy metals for these organisms.
Sumário
Introdução Geral ... 10
Capítulo 1: Bioacumulação de metais na alga parda Sargassum e a distribuição de Amphipoda associados ... 15
Introdução ... 15
Metodologia ... 18
Resultados ... 21
Discussão ... 27
Capítulo 2: Efeitos da alimentação contaminada por cobre em Cymadusa filosa... 33
Introdução ... 33 Metodologia ... 36 Resultados ... 40 Discussão ... 43 Considerações finais ... 46 Referências bibliográficas ... 47
Introdução Geral
As regiões litorâneas são frequentemente influenciadas por ações antrópicas. Os resíduos provenientes de esgotos domésticos, as atividades industriais e portuárias destacam-se como as principais fontes de poluição de ambientes marinhos costeiros. Outros potenciais poluidores dessas regiões são a navegação, as dragagens e também a deposição, por ação das chuvas, de materiais em suspensão na atmosfera (Clark, 2001).
Entre os contaminantes descartados no ambiente marinho, quatro classes principais afetam a qualidade das águas marinhas: os hidrocarbonetos derivados de petróleo, os hidrocarbonetos halogenados provenientes da indústria química, as substâncias radioativas e os metais pesados (Kennish, 1996). Os metais pesados são definidos como elementos metálicos que apresentam uma densidade alta quando comparados com a água (Fergusson, 1990). Muitos metais são importantes para os ecossistemas, mas em altas concentrações tornam-se tóxicos. Uma importante característica dos metais é sua conservação no ambiente, por serem elementos conservativos acumulam-se tanto no ambiente quanto nos organismos. O excesso desses elementos pode afetar os indivíduos e as comunidades (Rainbow, 2002; Mayer-Pinto, et. al., 2010).
Os metais podem ser divididos entre essenciais e não essenciais. Os essenciais aos organismos, como cobre, zinco e ferro desempenham um papel importante em sua fisiologia. Por sua vez, os não essenciais, como cádmio, chumbo e mercúrio, não são utilizados em nenhuma via metabólica dos organismos e precisam ser excretados mesmo em pequenas concentrações para evitar a toxicidade (Kennish, 1998). Independentemente do tipo de metal, quando se acumulam em altas concentrações nos indivíduos, eles podem prejudicar os organismos com alterações fisiológicas, morfológicas e comportamentais (Rainbow, 2002).
As principais formas de liberação de metais nos mares são as descargas de efluentes domésticos e industriais, a lixiviação de pesticidas em áreas agrícolas, o influxo fluvial e as atividades antropogênicas em regiões litorâneas (Förstner & Wittmann, 2012). Além disso, as tintas anti-incrustantes utilizadas nas embarcações podem conter metais e também contribuir para a poluição de ambientes marinhos costeiros (Turner, 2010). Em locais como as marinas, a constante liberação de metais pesados pode gerar o acúmulo dessas partículas na região e resultar em impactos nas
comunidades marinhas (Kennish, 1996; Johnston e Keough, 2002). Os metais despejados nas regiões litorâneas concentram-se principalmente no sedimento, porém, esses elementos podem ser absorvidos pela biota marinha, conservando-se em seus tecidos. Diversos organismos como macrófitas, moluscos e crustáceos, podem absorver os íons de metais dissolvidos na água e concentrá-los em seus tecidos (Rainbown, 2006).
A absorção de metais pelos animais aquáticos pode ocorrer por duas vias principais: a exposição direta à água ou a alimentação (Rainbown, 2002). Os metais essenciais são mantidos em uma forma acessível no corpo desses animais, ou seja, podem ser utilizados pelo organismo sempre que necessário. Quando as taxas de absorção são altas e as concentrações nos tecidos aumentam, existem duas rotas disponíveis para a eliminação do excesso: a excreção e a detoxificação (Deplege e Rainbow, 1990). O metal detoxificado fica ligado a alguma molécula, formando grânulos, que o torna indisponível para o organismo perdendo assim suas propriedades tóxicas (Viarengo e Nott, 1993). Esses grânulos podem ser excretados ou acumular-se no animal sem prejuízo para seu desenvolvimento (Raimbow, 2002). Quando a taxa de absorção é muito alta o animal atinge o limite de excreção e detoxificação. Isso permite o acúmulo de metais em forma disponível para o metabolismo. As grandes concentrações tornam-se tóxicas interferindo negativamente nos processos metabólicos do animal (Deplege e Rainbow, 1990). Assim, altas taxas de absorção levam a uma sobrecarga da detoxificação e excreção, resultando na bioacumulação de metais nos animais.
A presença de altas concentrações de metais, além de causar efeitos individuais nos organismos expostos, pode resultar em distúrbios em populações e comunidades. Entre os efeitos individuais é comum observar o aumento da taxa de mortalidade, a diminuição do crescimento dos indivíduos, ou ainda a redução de seu sucesso reprodutivo (Rainbow, 2002). Nas populações atingidas pela contaminação é comum ocorrerem alterações de densidades (Johnston e Keough, 2002). Em comunidades, observa-se a diminuição da diversidade e mudança na composição das espécies (Perret et al, 2006; Johnston e Roberts, 2009; Roberts et al., 2008a). A bioacumulação de metais nos tecidos dos organismos, além de prejudicar a sua fisiologia, pode também levar a um processo de biomagnificação. Isso acontece, pois, os metais acumulados em um indivíduo podem ser transferidos ao longo das cadeias tróficas marinhas (Wang e
Fisher, 1998; Wang, 2002). Os produtores absorvem os metais do ambiente acumulando-os em seus tecidos, os consumidores primários além de absorverem os metais do ambiente recebem pela dieta os contaminantes conservados nos tecidos dos produtores, os predadores ao se alimentarem de presas contaminadas por metais acumulam esses elementos em seus tecidos, assim quando não há a excreção desses metais existe um acúmulo progressivo ao longo da cadeia (Wang, 2002; Gray,2002).
A fim de mitigar as consequências da poluição, os ambientes marinhos devem ser constantemente monitorados (Zagatto, 2008) e diversas ferramentas são utilizadas para compreender os impactos da contaminação desses ambientes. Análises químicas como a quantificação de poluentes em água e sedimento apresentam as concentrações dessas partículas nos ambientes (CETESB, 2014; Wenning et al., 2005), assim como a utilização de biomonitores demonstra as concentrações dessas substâncias em tecidos de organismos (Rainbow, 2006). Além disso, respostas ecológicas podem ser demonstradas por meio de estudos de estrutura das comunidades, utilizando variáveis como a abundância de táxons sensíveis ou tolerantes (Gesteira e Dauvin, 2000; Thomas, 1993), o agrupamento de informações para a construção de índices de estruturas de comunidades (Simboura e Zennetos, 2002; Salas et al, 2006), ou ainda a mudança na composição e estrutura de espécies como um padrão para ambientes poluídos (Roberts et al., 2006). Por fim, existem ainda bioensaios toxicológicos que procuram compreender como os contaminantes atingem os organismos. Podem ser bioensaios de letalidade ou bioensaios de efeitos subletais, os quais apuram as respostas fisiológicas, comportamentais e genéticas nos indivíduos (Chapman, 1995). Assim, a integração de avaliações químicas, ecológicas e toxicológicas é importante para a completa compreensão dos efeitos dos metais em ambientes marinhos (Chapman et al., 2002; Castro-Catala et al., 2015).
As avaliações químicas são realizadas pela quantificação dos metais em compartimentos onde esses elementos são conservados. Pode-se utilizar como matriz para a análise a água, o sedimento ou a biota. O estudo da concentração desses elementos em tecidos de organismos é privilegiado por revelar a quantidade biodisponível desse material, enquanto que as análises de água e sedimento podem demonstrar valores não disponíveis à biota marinha (Rainbow, 2006). Um organismo é
denominado biomonitor quando seus tecidos são utilizados para determinar a quantidade de uma substância no ambiente (Luoma et al., 2008).
As avaliações ecológicas investigam a estrutura das comunidades marinhas. Essas comunidades costumam responder a contaminação por metais, com a diminuição da riqueza e diversidade (Johnston e Roberts, 2009), e mudança na composição de espécies, como a aumento da densidade das mais tolerantes (Milward e Grant, 1998; Stark, 1998). A fauna bentônica pode ser afetada diretamente pelo sedimento, já que este é um local de acúmulo de metais (Stark, 1998; Castro-Catala et al., 2015). De maneira semelhante, a fauna associada às algas pode ser prejudicada pelo acúmulo dos metais nos tecidos do hospedeiro (Roberts et al., 2008a).
Uma maneira de unir as avaliações químicas e ecológicas é a utilização de substratos biológicos como biomonitores, assim além da concentração de metal biodisponível, podem ser analisados os efeitos da contaminação do substrato na composição de sua fauna associada (Roberts et al., 2008b). As algas, por exemplo, acumulam metais em seus tecidos quando expostas a ambientes contaminados e podem transferi-los para a fauna que a utiliza como alimento.
Algumas questões que não são esclarecidas pelas avaliações químicas e ecológicas podem ser respondidas pelas análises toxicológicas. Os estudos de campo possuem limitações que não permitem a clara compreensão dos efeitos isolados do contaminante (Mayer-Pinto, et al., 2010). Por sua vez, os bioensaios em laboratório podem revelar consequências da contaminação exclusiva por um determinado poluente e, portanto, representam uma importante ferramenta para complementar a avaliação ambiental (Chapman, 1995).
Por fim, percebe-se que a avaliação da qualidade do ambiente depende da integração de ferramentas avaliativas e que diferentes enfoques podem ser utilizados para observar os efeitos da poluição, como por exemplo, os metais pesados. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivos: 1) avaliar a atuação de uma macroalga como biomonitor da contaminação por metais pesados; 2) analisar se as variações espaciais e temporais na composição da fauna associada, principalmente das espécies de herbívoros, estão relacionadas à contaminação da macroalga por metais pesados; 3) verificar os efeitos da dieta contaminada por metais pesados em um herbívoro.
Assim, o primeiro capítulo desse trabalho procurou verificar a atuação de uma abundante alga parda do litoral brasileiro, o Sargassum, como biomonitor em áreas com sedimento contaminado por metais pesados, e analisar as variações espacial e temporal da composição e densidade de anfípodes herbívoros associados ao Sargassum no litoral norte de São Paulo. O segundo capítulo procurou explorar o potencial do anfípode herbívoro Cymadusa filosa Savigny 1816 (Ampithoidae) para estudos toxicológicos e, assim, voltar a atenção para uma via pouco estudada de contaminação dos invertebrados marinhos por metais pesados, a alimentação dos herbívoros.
Capítulo 1: Bioacumulação de metais na alga parda Sargassum e a
distribuição de Amphipoda associados
Introdução
As principais causas de contaminação por metais nos mares são as descargas de efluentes domésticos e industriais, a lixiviação de pesticidas de áreas agrícolas, o influxo fluvial e as atividades antropogênicas em regiões litorâneas (Förstner & Wittmann, 2012). Além disso, o uso de tintas anti-incrustantes também contribui para a poluição de ambientes marinhos costeiros (Turner, 2010). Nos locais próximos à deposição antrópica de metais pesados, como marinas, por exemplo, a concentração dessas substâncias é alta e seu impacto nas comunidades marinhas é relevante (Kennish, 1996; Johnston e Keough, 2002).
Diferentes abordagens podem ser utilizadas para a compreensão dos impactos dos metais nos ambientes marinhos. Entre elas, existem análises que visam quantificar a concentração desses contaminantes em compartimentos de acumulação, como a água, o sedimento e os tecidos dos organismos (Rainbow, 1995; Davies et al, 2006). Outras análises avaliam os efeitos da contaminação por meio do estudo da estrutura das comunidades (Millward e Grant, 1995; Johnston e Keough, 2002; Johnston e Roberts, 2009) e existem ainda os testes toxicológicos (Adams e Rowland, 2003). No entanto, o uso dessas ferramentas de forma isolada pode não ser suficiente para a avaliação da qualidade dos ambientes aquáticos (Chapman, 2002). Sistemas de avaliação integrados, que combinam duas ou mais formas de avaliação, vem sendo desenvolvidos em vários países como tentativas de uma visão mais ampla dos impactos dos poluentes nos sistemas marinhos (Hellou, 2011).
Dentre as formas de avaliação da qualidade das águas marinhas, em relação à concentração de metais, as análises mais usuais avaliam a concentração de íons no sedimento ou dissolvidos na água (CETESB, 2014). Apesar de serem indicadores adequados de qualidade ambiental, esse tipo de análise não demonstra uma relação direta dos efeitos de metais sobre os organismos marinhos. A partir da concentração da água ou do sedimento não é possível saber a quantidade de metal disponível aos organismos. Para tal, é preciso avaliar a biodisponibilidade desses elementos no
ambiente, essa biodisponibilidade é medida por meio da concentração de metal acumulado no tecido de organismos (Phillips e Rainbow, 1993), sendo então possível demonstrar quanto dessa substância está presente nas cadeias tróficas. Portanto, nos estudos que visam compreender os efeitos de contaminantes nos ecossistemas é fundamental a quantificação da biodisponibilidade do metal (Rainbow, 1995).
Diversos organismos marinhos podem acumular metais em seus tecidos (Rainbow, 2002). Eles podem ser analisados a fim de quantificar as concentrações biodisponíveis no ambiente e são chamados de biomonitores (Luoma et al, 2008). A vantagem do uso de organismos em relação ao sedimento ou a água é que eles podem demonstrar a concentração dos metais em um tempo e espaço determinado, uma vez que refletem valores referentes ao período de seu ciclo de vida e da região que estão distribuídos. Alguns biomonitores, além de apresentar um panorama local recente, podem também demonstrar efeitos dessa contaminação (Roberts et al., 2008b), como mudanças morfológicas ou fisiológicas desses organismos (Prangue e Dennilson, 2000; Coelho et al.,2005; Roberts et al, 2008a). Caso esse organismo atue como substrato biológico efeitos em sua fauna associada podem ser também observados. Alterações nessa fauna, como a diminuição da diversidade (Roberts et al, 2008a), da taxa de colonização (Hulathduwa e Brown, 2006), da sobrevivência da fauna a longo prazo (Roberts et al., 2008b) e também alterações na composição de animais que se alimentam desses organismos (Marín-Guirao et al., 2005) podem evidenciar efeitos da contaminação desses substratos.
Os substratos secundários, como as diferentes espécies de algas e os bancos de mexilhões, ocupam amplas áreas nos costões rochosos (Bortaguaray e Carranza, 2007; Coutinho, 2009). As algas pardas, Phaeophyta, são um grupo de macrófitas que tem a capacidade de acumular metais em seus tecidos. As células dessas algas possuem moléculas de polissacarídeos sulfatados em suas paredes celulares, isto lhes confere uma grande afinidade por metais (Davis et al., 2003). Por essa grande capacidade de absorção de metais dissolvidos na coluna d’água, as algas pardas representam um modelo adequado em estudos de biomonitoramento (Karez et al., 1994; Jayasekera e Rossbach, 1996; Khristoforova e Kozhenkova, 2002).
O Sargassum C. Agardh é uma alga parda que ocupa grande parte dos costões dos ambientes tropicais e subtropicais (Eston et al.,1986; Coutinho, 2009). A
dominância dessa macroalga é observada inclusive na região sudeste do Brasil (Paula, 1988; Széchy et al 2000). O Sargassum forma extensos bancos na região do infralitoral e abriga uma alta diversidade de invertebrados, como moluscos, poliquetas e crustáceos (Jacobucci e Leite, 2002; Jacobucci et al., 2006). A absorção de metais nos tecidos de Sargassum pode afetar aqueles animais que se abrigam, principalmente, os que se alimentam dessa alga (Roberts, et al 2006). Dentre os grupos que utilizam o Sargassum como abrigo, os anfípodes são um grupo significativo por sua abundância e diversidade (Leite et al. 2007).
A contaminação do Sargassum pode afetar os herbívoros que se alimentam dessa alga (Roberts et al., 2006). A consequência da ingestão de metais para esses animais é o gasto de energia associado à desintoxicação ou à excreção. Caso esse gasto seja elevado, os resultados podem levar a redução no crescimento e taxa de reprodução dos indivíduos. Os metais acumulados podem ainda causar alterações no metabolismo desses animais (Marsden & Rainbow 2004). Tais efeitos, apesar de não provocarem diretamente a mortalidade, podem prejudicar as populações pela diminuição do sucesso reprodutivo. Os invertebrados herbívoros são importantes no estudo da rota dos poluentes no ambiente marinho por dois motivos: alimentam-se de algas que podem acumular metais em seus tecidos e podem servir de alimento a espécies de peixes que frequentam as regiões costeiras (Dubiaski-Silva e Masunari, 2008). Isso pode resultar na disseminação da contaminação pela cadeia trófica.
No litoral sudeste do Brasil algumas regiões encontram-se contaminadas por metais pesados. Dentre elas a Enseada do Flamengo, localizada no município de Ubatuba, litoral norte de São Paulo, tem seu sedimento contaminado principalmente por zinco e cobre (CETESB, 2014). Nas praias desta enseada é possível encontrar bancos de Sargassum perenes que possivelmente estão em contato constante com metais dissolvidos na água. Assim, é possível que essas algas acumulem contaminantes em seus tecidos e que sua fauna associada seja influenciada por esse fator, principalmente os herbívoros.
Este trabalho tem por objetivo geral analisar o papel de Sargassum como um biomonitor de metais pesados e investigar algumas das consequências dessa contaminação para a composição da assembleia de anfípodes herbívoros. Especificamente, quantificar a acumulação de metais em Sargassum de diferentes praias
da Enseada do Flamengo e investigar a distribuição e composição dos anfípodes herbívoros da família Ampithoidae associados a bancos de Sargassum expostos à contaminação.
Metodologia
Área de estudo
O estudo foi realizado na Enseada do Flamengo, no município de Ubatuba-SP (23º 30' S e 45º 5' W). Essa região foi escolhida por ter um histórico de contaminação de seu sedimento pelos metais cobre e zinco (Tab. 1).
Tabela 1. Valores mínimos e máximos de contaminação do sedimento na região do Saco do Ribeira (µg/g) retirados dos relatórios anuais de Qualidade das Águas Superficiais CETESB (2010 a 2014).
Ano Cobre (µg/g) Zinco (µg/g)
2010 6,7 - 65,5 64 - 141
2011 28,1 - 99,8 106 - 310
2012 34,7 - 96,6 98,7 - 165
2013 28,4 - 79,1 77,9 - 149
2014 28,1 - 91,8 104 - 157
A Enseada do Flamengo caracteriza-se por apresentar quatro importantes marinas e três garagens náuticas localizadas na praia do Saco da Ribeira que são potenciais fontes de contaminação por metais pesados para o local. Os costões são formados principalmente por bancos de Sargassum sendo as espécies mais comuns já relatadas para a área S. cymosum C. Agardh, S. filipendula C. Agardh e S. vulgare C. Agardh. (Machado et al., 2011).
As amostragens foram realizadas em quatro pontos da Enseada do Flamengo: Praia da Ribeira, Praia do Lamberto, Praia do Flamengo e Praia de Santa Rita (Fig. 1). As coletas foram realizadas nessas áreas por serem próximas à praia do Saco da Ribeira e possuírem costões com Sargassum em abundância. As coletas foram realizadas no inverno (julho de 2013) e no verão (janeiro de 2014).
Figura 1. Mapa da Enseada do Flamengo com os quatro pontos de coleta: Praia da Ribeira, Praia do Lamberto, Praia do Flamengo e Praia Santa Rita, município de Ubatuba, litoral norte do Estado de São Paulo.
Composição espacial e temporal de Amphipoda
Para avaliar a fauna de ampitoídeos presente em cada praia, foram coletadas oito frondes de Sargassum por meio de mergulho livre a uma profundidade máxima de 2 m. A amostragem foi realizada ao longo de uma transecção horizontal de 50m estabelecida ao longo do costão. As frondes foram coletadas com sacos de tecido de malha de 0,2mm para a contenção da fauna. O Sargassum foi congelado e transportado em caixas térmicas para o laboratório do Departamento de Biologia Animal na Universidade Estadual de Campinas.
No Laboratório de Interações Ecológicas Marinhas, as algas foram lavadas em água doce para a retirada da macrofauna vágil que, em seguida, foi conservada em álcool 70%. As frondes de Sargassum compostas pela alga e seus epibiontes (e.g. algas epífitas e animais sésseis) foram secos em estufa à 70ºC por 24h e depois pesados em balança analítica para obtenção da biomassa. A fauna vágil foi separada e os anfípodes identificados em família. Os indivíduos da família Ampithoidae foram identificados em espécie de acordo com a literatura (Ruffo, 1982; Barnard e Karaman, 1991). A
densidade da fauna foi definida pela relação entre o número de indivíduos e o peso seco em gramas da fronde de Sargassum.
Bioacumulação de metais em Sargassum
Para quantificar a concentração de metais em Sargassum sp.e, assim, avaliar o papel dessa alga como organismo biomonitor, foram feitas análises químicas das frondes retiradas de cada praia. Das frondes coletadas para análise da fauna, três foram utilizadas para as análises de metais em cada um dos dois períodos de coleta. As amostras foram lavadas em água doce para a retirada da fauna, secas em estufa à 70ºC por 24h, trituradas e enviadas ao Laboratório de Análises Ambientais no Departamento de Ciências do Solo da Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz para as análises de concentração de metais.
Análises estatísticas
Para verificar as diferenças entre os valores de biomassa das frondes de Sargassum, as concentrações de metais nos tecidos das algas e a densidade de anfípodes, foi utilizada uma análise de variância de duas vias (ANOVA), considerando como fatores fixos as estações do ano (dois níveis: inverno e verão) e os costões de cada praia (quatro níveis: Ribeira, Lamberto, Flamengo e Santa Rita). A homogeneidade de variâncias foi testada através do teste de Cochran e quando os dados não apresentaram homogeneidade foram transformados em log (x+1). Quando as diferenças entre praias ou estações mostraram-se significativas (p<0,05) foi realizado o teste de Tukey para identificação das diferenças dentro de cada fator.
A composição de espécies da família Ampithoidae foi avaliada através de uma análise multivariada utilizando a PERMANOVA (Anderson, 2001), considerando locais e estações do ano como fatores fixos. Para os testes de probabilidade, a matriz de dissimilaridade de Bray-Curtis foi utilizada com 9999 permutações. O teste a posteriori da PERMANOVA foi utilizado para indicar quais níveis dos fatores diferiam entre si. O SIMPER foi utilizado para indicar quais as espécies que mais contribuíram para as dissimilaridades entre praias e estações.
Resultados
Caracterização do Sargassum
A biomassa de Sargassum (F1,56=5,67, p=0,02) e dos epibiontes (F3,56=11,00, p<0,01) variaram entre as estações, sendo o peso da alga maior no verão e dos epibiontes maior no inverno (Fig. 2). Tanto a biomassa do Sargassum (F1,56=2,50, p=0,07) quanto a biomassa dos epibiontes (F3,56=11,00, p<0,01) não variaram entre locais. Foram encontrados como epibiontes principalmente as algas Hypnea sp., Dictyota sp., Dictyopteris sp. e briozoários.
Figura 2. Peso seco médio de Sargassum e seus epibiontes (±erro padrão).* Indicam diferença significativa (ANOVA, p<0,05)
A concentração de metais nos tecidos de Sargassum variou entre as praias e estações. As concentrações de cádmio e chumbo foram abaixo do detectável (0,25µg/g) na maioria das praias (Tab. 2). As concentrações de cobre (ANOVA Interação “Local” e “Estação” F3,16= 8,62, p<0,01) e zinco (ANOVA Interação “Local” e “Estação” F3,16= 9,80, p<0,01) no tecido das frondes de Sargassum apresentaram diferenças entre as praias dependendo das estações do ano. Durante o inverno, a praia de Santa Rita apresentou os maiores valores dos dois metais no Sargassum, seguida pela praia do Flamengo (Fig. 3). A concentração de ferro variou somente entre estações (F1,16=5,50, p=0,03) apresentando valores maiores no verão. Por sua vez a concentração de cromo variou entre estações (F1,16=8,23, p=0,01), sendo maior no verão e entre praias (F1,16=3,94, p=0,03) onde a única diferença foi entre a praia do Flamengo e a praia do Lamberto (Tab. 2).
Tabela 2. Concentrações médias de metais no tecido de Sargassum sp. (µg/g) (± desvio padrão). Valores abaixo de 0,25µg/g não foram quantificados ( - )
Cádmio Cromo Cobre Chumbo Zinco Ferro
Inverno Ribeira 0,56 ± 0,06 1,40 ± 0,84 7,90 ± 2,5 - 24,38 ± 6,32 907,19 ± 400,89 Lamberto - 1,55 ± 0,71 5,98 ± 1,58 - 22,66 ± 1,89 773,55 ± 357,09 Flamengo - 1,46 ± 0,57 12,69 ± 0,56 - 33,58 ± 3,05 759,20 ± 528,82 Santa Rita - 1,96 ± 0,75 15,48 ± 2,38 1,15 ± 0,56 41,34 ± 2,35 1502,71 ± 335,49 Verão Ribeira - 2,21 ± 0,31 7,19 ± 0,68 - 33,62 ± 2,54 1394,67 ± 337,32 Lamberto - 1,09 ± 0,17 6,35 ± 0,45 - 27,45 ± 1,80 1091,48 ± 211,32 Flamengo - 3,98 ± 0,95 6,95 ± 0,63 - 28,94 ± 1,79 1680,43 ± 466,61 Santa Rita - 2,74 ± 1,63 9,10 ± 0,83 - 34,31 ± 1,79 1227,21 ± 304,49
Figura 3. Concentrações dos metais cobre e zinco (µg/g) nos tecidos de Sargassum sp. (±erro padrão). Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os valores, (Tukey p<0,05).
Variação temporal e espacial de Amphipoda
Foram encontrados 5011 anfipodes distribuídos em 13 famílias (Tab. 3). A densidade total de anfípodes variou entre praias dependendo da estação do ano (ANOVA Interação “Local” e “Estação” F3,56=3,90, p=0,01). A densidade mais alta foi observada na praia de Santa Rita durante o verão e as menores nas praias de Santa Rita e Flamengo, no inverno (Fig. 4).
Tabela 3. Densidade média (ind/g) das famílias de Amphipoda, na Enseada do Flamengo. Valores em negrito indicam o maior valor da coluna.
Inverno, 2013 Verão, 2014
Ribeira Lamberto Flamengo Santa Rita Ribeira Lamberto Flamengo Santa Rita
Herbívoros Ampithoidae 1,19 0,84 1,78 0,51 3,73 3,45 2,46 3,54 Hyalidae 0,78 3,69 0,30 0,96 0,69 0,38 0,07 1,71 Outros Amphilochidae 1,56 1,12 0,00 0,45 0,66 1,69 0,33 13,36 Bateidae 0,14 0,88 0,09 - 6,12 1,52 2,39 1,37 Caprellidae 0,03 0,56 0,03 1,32 1,60 0,32 0,63 3,08 Corophiidae 0,07 0,10 0,64 0,18 0,68 0,75 1,87 0,28 Ischiroceridae - 0,10 0,01 - 4,09 0,24 0,14 0,10 Leucothoidae - 0,02 0,02 - 0,10 - 0,23 - Lysianassidae 3,80 0,08 0,20 - 0,12 0,21 0,58 - Melitidae 0,02 0,08 0,01 - 0,01 0,01 - 0,03 Photidae - 0,02 - - 0,42 - - - Podoceridae - - 0,03 - - - - - Stenothoidae 0,04 0,14 0,07 1,65 0,05 - - 4,75 Não identificado 0,46 0,82 0,86 0,35 0,38 0,06 0,21 1,11 Total 8,09 8,44 4,05 5,42 18,65 8,62 8,89 29,34
Figura 4. Densidade média (ind/g) de Amphipoda na Enseada do Flamengo (±erro padrão). Letras diferentes indicam valores diferentes. (Tukey p<0,05).
Foram encontrados um total de 948 exemplares da família Ampithoidae sendo seis espécies diferentes: Cymadusa filosa Savigny 1816 (346 indivíduos), Sunampithoe pelagica Milne Edwards (280 indivíduos), Ampithoe marcuzzi Ruffo 1954 (172 indivíduos), Ampithoe ramondi Audouin 1826 (30 indivíduos), Ampithoe divisura Shoemaker 1938 (16 indivíduos) e Ampithoe sp (9 indivíduos) (Fig. 6). Alguns indivíduos não puderam ser identificados por seu tamanho reduzido e foram considerados ampitoídeos jovens. A densidade dos ampitoídeos foi diferente ao longo das estações do ano (F56,1= 50,27, p<0,01) sendo o verão a estação que apresentou os valores maiores (Fig. 5). No entanto, foi semelhante entre as praias (F56,3= 0,81, p=0,49).
Figura 5. Densidade média (ind/g) de anfípodes ampitoídeos na Enseada do Flamengo (±erro padrão). * indica diferença significativa entre estações (ANOVA p<0,05).
Figura 6. Indivíduos machos da família Ampithoidae: A- Cymadusa filosa B- Sunampithoe
pelagica C- Ampithoe marcuzzi D - Ampithoe ramondi E- Ampithoe divisura. Barra de escala
referente a 1mm.
A análise da composição de espécies de Ampithoidae nas diferentes praias e estações indicou que os dois fatores influenciam a composição das espécies (PERMANOVA, F3,52=2,79, p<0,01). No inverno, a composição de espécies na praia Santa Rita foi diferente das demais, além disso, diferiram também as composições entre as praias Flamengo e Lamberto. No verão, única diferença nas composições foi entre praias Flamengo e Santa Rita (Tab. 4).
Tabela 4. Média dos valores de similaridade dentre e entre as praias nos dois períodos de coleta. Valores de similaridades significativamente diferentes em negrito (Teste a posteriori da PERMANOVA p<0,05).
Inverno
Praias Ribeira Lamberto Flamengo Santa Rita
Ribeira 50,39
Lamberto 40,72 40,10
Flamengo 49,61 37,54 45,12
Santa Rita 32,44 23,37 27,23 49,96
Verão
Praias Ribeira Lamberto Flamengo Santa Rita
Ribeira 61,04
Lamberto 65,10 66,06
Flamengo 47,73 50,11 43,30
Santa Rita 53,07 52,16 39,14 48,08
As espécies mais importantes para as dissimilaridades entre as composições de ampitoídeos das praias e períodos de coleta foram Cymadusa filosa e Sunampithoe pelagica (SIMPER). Essas foram também as espécies mais abundantes entre os Ampithoidae (Fig. 7). Ambas apresentaram densidades maiores no verão (S. pelagica-F1,56= 15,80, p<0,01 e C. filosa – F1,56= 34,64, p<0,01), C. filosa apresentou ainda diferença das densidades entre as praias (F1,56= 5,67, p<0,01) onde a praia de Santa Rita apresentou valores menores de densidade quando comparada as praias Ribeira e Lamberto (Fig. 8).
Figura 8. Densidade média (ind/g) das espécies de Ampithoidae nas praias da Enseada do Flamengo (± erro padão).
Discussão
O Sargassum pode ser um biomonitor adequado para áreas contaminadas com metais pesados, principalmente o cobre. Além de refletir a biodisponibilidade do cobre nessas áreas, a contaminação do Sargassum pode estar relacionada a alterações em sua fauna associada, como a mudança de composição ou ainda a diminuição da densidade de algumas espécies importantes.
As concentrações de cádmio e chumbo encontradas no Sargassum sp. demonstraram valores abaixo de 0,25µg/g de alga e não puderam ser mensuradas. As concentrações de zinco, cromo e ferro mostraram valores semelhantes aos de áreas não contaminadas (Roberts et al., 2008a). Áreas contaminadas por esses metais apresentam valores acima dos encontrados na Enseada do Flamengo. As concentrações de cromo e ferro em Sargassum de áreas contaminadas no México são respectivamente 36,2µg/g e 21400µg/g (Sànchez-Rodriguez et al., 2001). Já para o zinco Karez e colaboradores (1994) encontraram em áreas contaminadas do Rio de Janeiro concentrações de 108µg por grama de Sargassum. Apesar da alta concentração de zinco nos estudos de sedimento da região da Enseada do Flamengo (CETESB, 2014), a concentração desse metal no Sargassum é baixa.
Em contraste aos outros metais analisados, a concentração de cobre nos tecidos de Sargassum sp. foi semelhante a regiões consideradas contaminadas (Roberts, 2008a). Isso somado ao fato da área da Enseada do Flamengo ter um histórico de contaminação do sedimento por esse elemento (CETESB, 2014) mostra que entre os metais analisados, o cobre é o mais relevante para estudos de biomonitoramento por essa macroalga na região.
No Brasil, Amado-Filho e colaboradores (2008) realizaram estudos de monitoramento com Sargassum sp. na Bahia de Todos os Santos - BA, uma área contaminada principalmente devido a proximidade da região metropolitana e de atividade petroquímicas da costa. Eles encontraram valores de contaminação por cobre semelhantes aos encontrados na Enseada do Flamengo, 16,8µg por g de Sargassum sp.
A relação entre a contaminação por cobre no sedimento e na macroalga encontrada na Enseada do Flamengo é semelhante a de outros estudos. Na Enseada do Flamengo, no ano de 2013 o relatório da qualidade dos sedimentos realizado pela CETESB revelou uma contaminação por cobre de até 79,1µg/g de sedimento. No mesmo período, o presente estudo, encontrou uma contaminação por cobre de até 15,5µg/g de tecido de Sargassum. A alga apresenta uma menor concentração de metal em seus tecidos quando comparada ao sedimento, pois essa acumula metais por muito mais tempo, enquanto a alga absorve os metais por um período menor, ao longo de seu ciclo de vida (Rainbow, 2002). Resultados semelhantes são apontados por Khristofovora e Kozhenkova (2002) na Rússia, onde a contaminação média do
sedimento foi de 50µg/g enquanto que em tecidos de Sargassum myiabei as concentrações de cobre foram entre 10,6µg/g e 22,3µg/g.
A contaminação por metais na Enseada do Flamengo provavelmente está ligada a presença das marinas na praia do Saco da Ribeira (CETESB, 2014). O excesso de cobre observado no local, seja no sedimento, seja nas algas, pode ser resultado das tintas anti-incrustantes usadas nas embarcações. O tributilestanho (TBT) quando incorporado a essas tintas evita de forma eficiente a incrustação de invertebrados, principalmente moluscos (Lewis, 1998). O uso contínuo desse tipo de composto foi relacionado a quedas na produção em criações de ostras, além disso, pode influenciar negativamente no desenvolvimento larval, a má formação da concha e aumentar a incidência de imposex em moluscos (Dafforn et al., 2011). Em 2001 a Associação Marinha Internacional baniu o uso do TBT em tintas incrustantes (IMO, 2001). Essa proibição levou ao uso de outras substâncias como, por exemplo, o cobre (Dafforn et al., 2011) e com isso a concentração desse elemento tem aumentado nas regiões de atividades náuticas (Paradas e Amado-Filho, 2007).
A contaminação do Sargassum por cobre pode alterar a composição da fauna associada, principalmente herbívoros. A variação temporal da densidade dos anfípodes, especialmente da família de herbívoros Ampithoidae, da Enseada do Flamengo é marcada por um aumento durante o verão. Esse padrão também é apresentado por suas espécies mais abundantes, Cymadusa filosa e Sunampithoe pelagica. O aumento de densidade de anfípodes foi acompanhado pelo aumento da biomassa de Sargassum e diminuição da biomassa de epibiontes. A relação positiva entre a biomassa da alga hospedeira e a densidade da fauna associada já foi observada em outros trabalhos (Leite e Turra, 2003; Tanaka e Leite, 2003), e isso, possivelmente, ocorre devido ao fato do aumento da biomassa da alga representar um aumento na disponibilidade do espaço utilizado como abrigo por esses animais. Além disso, os ampitoídeos têm uma preferência alimentar por Sargassum em relação à maioria de suas epífitas (Machado, 2013), assim o aumento da biomassa dessa alga somado a diminuição de suas epífitas pode refletir no aumento da quantidade de alimento e, por consequência, elevada densidade dos herbívoros. Portanto, a variação temporal da densidade de ampitoídeos parece apresentar uma relação com a variação temporal da biomassa de Sargassum.
Por sua vez, a variação espacial das composições de anfípodes ampitoídeos, pode ter sido influenciada pela poluição por metais da região, uma vez que não há variação da biomassa de Sargassum entre as praias. A contaminação por metais em Sargassum é mais expressiva na praia Santa Rita durante o inverno, nesse período a composição de espécies dessa praia diferenciou-se das demais. Essa composição destacou-se por apresentar apenas duas, dentre as seis espécies de herbívoros ampitoídeos encontradas na enseada, além de uma alta dominância de Sunampithoe pelagica, incomum em relação às outras praias. Assim, é possível que a variação espacial da assembleia de ampitoídeos, especialmente na praia mais contaminada, decorre a elevada presença de cobre nos tecidos de Sargassum.
Os padrões de densidades das duas espécies principais de ampitoídeos também parecem ter relações com a contaminação da alga. A densidade de Sunampithoe pelagica não apresentou variação entre praias enquanto que Cymadusa filosa teve uma menor densidade na praia de Santa Rita, em relação as praias de Ribeira e Lamberto, no inverno. Além disso, pode-se observar que uma menor dominância de C. filosa na praia de Santa Rita durante o inverno, quando houve o pico de contaminação no Sargassum. Esses dados são evidências de que C. filosa pode ser afetada de forma diferente de S. pelagica pela alimentação em algas contaminadas. Ainda assim, diversos outros fatores não estudados podem influenciar esses padrões.
Os ampitoídeos Cymadusa filosa e Sunampithoe pelagica possuem hábitos muito semelhantes sendo tubícolas e herbívoros. C. filosa pode se abrigar e se alimentar em diversos substratos como algas vermelhas, verdes e pardas (Ruffo, 1982; LeCroy, 2002), enquanto que S. pelagica é encontrada mais restritamente em algas pardas da ordem Fucales como o Sargassum (Ruffo, 1982; Tararam et al., 1986; Dubiaski-Silva e Masunari, 1995) e tem restrições em se alimentar de outras algas (Machado, 2013). Isso pode sugerir que em um ambiente como a praia de Santa Rita no inverno, onde o Sargassum contém uma alta contaminação, C. filosa possa se abrigar e se alimentar de outras algas hospedeiras presentes no costão. Tais algas como Galaxaura, Ulva e Caulerpa podem acumular metais (Karez, 1994; Jayasekera, 1996), mas o Sargassum por ser uma alga parda tende a apresentar concentrações maiores (Sanchez-Rodrigues, 2001). A preferência por algas não contaminadas por cobre foi observada para o anfípode Peramphithoe parmerong, também ampitoídeo, em estudos de laboratório
(Roberts et al., 2006). Portanto, quando observamos uma diminuição da densidade de C. filosa em Sargassum não significa necessariamente uma diminuição da densidade da espécie na praia, somente mostra sua diminuição em um dos possíveis hospedeiros dessa espécie.Por sua vez, os indivíduos de S. pelagica parecem não ter tanta facilidade para mudança de hospedeiro, e sua densidade acaba por se manter mesmo em situações adversas como a intoxicação por cobre em sua dieta. Ou ainda podem ser mais tolerantes a intoxificação quando comparados aos indivíduos de C. filosa.
Os resultados desse estudo são corroborados por outros trabalhos que analisam os impactos da contaminação de Sargassum por cobre nos anfípodes herbívoros. Na Enseada do Flamengo foi observada uma baixa densidade do ampitoídeo C. filosa em Sargassum com concentrações de 16,5µg/g. Roberts e colaboradores (2006) observaram que Sargassum contaminado por cobre com aproximadamente 29µg/g apresenta uma colonização menor por anfípodes, principalmente o ampitoídeo Perampithoe parmerong. Já a densidade da família Ampithoidae não apresentou correlação com a contaminação do Sargassum em um estudo dos mesmos autores (Roberts, 2008a), assim como não foi observada uma diferença da densidade de Ampithoidae entre as praias no presente estudo. A diminuição de ampitoídeos em função da contaminação por cobre foi demonstrada com a alga Padina que alcança concentrações de 200µg/g em seus tecidos (Roberts et al., 2008a).
A Enseada do Flamengo mostrou resultados de contaminação de Sargassum e efeitos em sua fauna comparáveis a outros locais contaminados por cobre. O desenvolvimento da região e a constante exposição a fontes poluidoras exigem a manutenção do monitoramento da área. Tal monitoramento pode ser facilitado pelo o uso de biomonitores abundantes no ambiente como o Sargassum, que auxilia tanto na quantificação de metal biodisponível quanto na avaliação de impactos que podem ser observados em sua fauna associada.
Portanto, o Sargassum pode ser utilizado como um biomonitor da contaminação ambiental por metais pesados, como o cobre. Além disso, é importante notar que essa contaminação do Sargassum pode ser um dos fatores que influencia sua fauna associada, principalmente os herbívoros, alterando a estrutura de suas assembleias. Assim, podemos perceber que a distribuição dos anfípodes pode ser influenciada por algumas características da alga hospedeira como sua biomassa, a quantidade de
epibiontes que abriga e sua qualidade em relação à poluição. O acúmulo de cobre no Sargassum, mesmo em concentrações medianas pode influenciar a composição da fauna, principalmente os herbívoros. Como muitos fatores podem influenciar a distribuição dos animais em campo, outras abordagens são necessárias como os bioensaios em laboratório que poderiam esclarecer a relação entre a contaminação das algas e os efeitos nos indivíduos herbívoros.
Capítulo 2: Efeitos da alimentação contaminada por cobre em
Cymadusa filosa
Introdução
O aumento da ação antrópica próximo às regiões costeiras leva a uma concentração de poluentes que pode afetar seus ecossistemas. Avaliações ambientais são utilizadas a fim de verificar a qualidade dos ambientes e estabelecer níveis seguros de concentração dos poluentes para essas regiões. A poluição marinha pode ser avaliada através de diversas ferramentas (Zagatto, 2008). Entre elas, as mais utilizadas são as análises químicas da água e de sedimentos, que visam quantificar os poluentes no ambiente. Além disso, podem ser utilizadas análises da estrutura das comunidades de locais contaminados, identificando padrões para a poluição. Existem ainda os bioensaios em laboratório que verificam efeitos nos indivíduos de determinada espécie. Os testes em laboratório presentam uma estimativa dos poluentes através de seus efeitos em um dado organismo, denominado organismo teste (Chapman e Long, 1983). Essa é uma forma de avaliação amplamente utilizada por apresentar respostas rápidas e um bom custo benefício para a verificação da qualidade do ambiente aquático (Long e Chapman, 1985).
Usualmente, os bioensaios avaliam a letalidade de um organismo teste em diferentes concentrações do contaminante dissolvido em água (Chapman, 1985). No entanto, muitos efeitos podem não ser demonstrados por esse tipo de teste, primeiro por essa não ser a única forma de contaminação dos organismos, eles podem ser contaminados pela alimentação, também por existirem efeitos subletais nos indivíduos que não são observados em testes de mortalidade.
Alguns contaminantes se caracterizam por serem conservativos, isto é, acumulam-se no ambiente e na biota (Rainbow, 1995). Assim, estes contaminantes podem ser transferidos nas cadeias tróficas através dos alimentos contaminados (Wang e Fisher, 1999). Determinados metais, por exemplo, podem acumular-se no sedimento resultando em efeitos nos organismos detritívoros infaunais (Morrissey et al., 1996), podem também acumular-se em macroalgas e vegetais atingindo herbívoros que se alimentam desses organismos (Roberts et al., 2006) e podem ser transferidos para
predadores em geral (Wang, 2013). A alimentação, portanto, é uma via de exposição que deve ser considerada em estudos com substâncias cumulativas (Besser et al., 2005). Além disso, por se acumularem no ambiente, os poluentes podem causar efeitos crônicos nos indivíduos como variações no crescimento, reprodução e comportamento dos animais (Gale et al., 2006; Lee e Johnston, 2007; Hellou, 2011).
Os efeitos da dieta contaminada por metais são conhecidos para muitos invertebrados marinhos (Wang, 2002; Rainbow, 2002). Dentre esses invertebrados, os anfípodes tem destaque por serem amplamente distribuídos, importantes para os ecossistemas e apresentarem respostas à contaminação (Marsden e Rainbow, 2004). Os anfípodes possuem um importante papel no fluxo de materiais entre as cadeias tróficas dos ecossistemas litorâneos (Taylor, 1985), sendo que os herbívoros se alimentam de algas que podem estar contaminadas por diversos poluentes (Roberts et al., 2008b). Além disso, esses animais acumulam poluentes em seus tecidos e servem de alimento para predadores, como os peixes e outros crustáceos (Dubiaski-Silva e Masunari 2008). Portanto, os anfípodes herbívoros são importantes no estudo da rota dos poluentes nas cadeias tróficas marinhas.
As algas Phaeophyta são importantes macroalgas marinhas que servem de alimento aos anfípodes e podem absorver metais pesados (Davis et al., 2003). Essas algas possuem moléculas com muita afinidade por metais, tornando seus tecidos verdadeiros estoques de metais pesados. Entre as espécies de algas pardas que podem ser encontradas no litoral brasileiro, o Sargassum é uma das mais abundantes (Eston, 1984).
Dentre os anfípodes herbívoros encontrados no litoral do sudeste do Brasil, Cymadusa filosa, pertencente a família Ampithoidae, é uma das espécies mais abundante e amplamente distribuída. Esses anfípodes são encontrados nas regiões entre-marés, associados a diversas espécies de algas. Por alimentar-se de algas que potencialmente retém metais em seus tecidos, a poluição local pode ser um dos fatores que afetam a distribuição de C. filosa (Capítulo 1). No entanto, existe uma dificuldade em relacionar os padrões de distribuição dos organismos com a contaminação local por metais, em estudos de observação em campo (Mayer-Pinto et al., 2010). Isso pode ocorrer pela falta de réplicas ou ainda por existirem muitos outros fatores não controlados que influenciam sua distribuição (Mayer-Pinto et al., 2010). Assim,
bioensaios que simulem a contaminação podem revelar alguns dos possíveis efeitos dessa contaminação que não podem ser observados em campo (Den Besten et al., 1995; Adams, 2003).
O anfípode Cymadusa filosa mede em média 16mm quando adulto. O dimorfismo sexual é observado pelo segundo par de gnatópodos mais desenvolvido e cerdoso nos machos (Fig. 1). Os indivíduos alcançam a maturidade sexual em cerca de três semanas, a primeira reprodução resulta em média 25 jovens, fêmeas mais velhas chegam a apresentar até 60 jovens em uma ninhada. A espécie pode ser facilmente cultivada em laboratório. Essas características são importantes para organismos utilizados em bioensaios toxicológicos. Além disso, C. filosa é consideravelmente sensível a alguns poluentes, como observado por Siqueira (2012). Quando esses anfípodes são expostos a sulfeto de cobre sua tolerância é muito menor do que outros organismos similares. O anfípode C. filosa apresenta um grande potencial para ser usado como organismo teste em estudos de poluição em ambientes marinhos. Uma vez que C. filosa é um herbívoro, é importante compreender quanto e como a contaminação de sua alimentação pode interferir em sua sobrevivência, crescimento e reprodução.
Um dos metais que pode ser acumulado pelo Sargassum e transferido para sua fauna associada através da alimentação é o cobre (Cu) (Fourest e Volesky, 1996; Davis et al., 2000; Roberts et al., 2006). Apesar de ser um nutriente essencial para os anfípodes, o Cu pode ser tóxico em altas concentrações, podendo afetá-los diretamente pela exposição à água contaminada (King et al., 2006), ou indiretamente através do sedimento e alimentação contaminados (Gale et al., 2006; Roberts et al., 2006; Besser et al., 2005).
A resposta dos animais à contaminação é um importante indicador dos impactos da poluição. Compreender as vias de contaminação, como a alimentação de herbívoros, é importante para esclarecer questões sobre os efeitos de contaminantes. O objetivo desse estudo foi verificar o efeito da alimentação com Sargassum contaminado por sulfato de cobre sobre o desenvolvimento, crescimento e reprodução do anfípode herbívoro Cymadusa filosa.
Figura 1. A – Macho de Cymadusa filosa B – detalhe dos gnatópodos do macho, segundo par de ganatópodos mais desenvolvido que o primeiro. C – fêmea de Cymadusa filosa. D- detalhe dos ganatópodos da fêmea, gnatópodos semelhantes. D – própodo do gnatópodo do macho de
Cymadusa filosa. Barra de escala referente a 1mm.
Metodologia
Cultura dos anfípodes
Para iniciar a cultura de Cymadusa filosa em laboratório, os indivíduos foram coletados em bancos de Sargassum na praia da Fortaleza em Ubatuba- SP (23º32’S, 45º10’W). Frondes da alga retiradas do costão foram envolvidas em sacos de tecido de
0,2mm para contenção dos animais. O Sargassum foi transportado em caixas térmicas com água do mar até o laboratório da Base de Pesquisa “Clarimundo de Jesus” do IO/USP. No laboratório as algas foram agitadas em bandejas com água do mar e os indivíduos adultos de Cymadusa filosa foram colocados em recipientes com água do mar filtrada, aeração e folíolos de Sargassum para alimentação. Os animais foram transportados resfriados em caixas térmicas para o laboratório de aquários no Departamento de Biologia Animal da UNICAMP e acomodados em um aquário de 20L, com ramos de Sargassum para alimentação, aeração constante, temperatura de 21ºC±1 e fotoperíodo de 12h.
Coletas de água e alimento foram feitas mensalmente e, sempre que possível, mais indivíduos foram coletados para a manutenção da cultura. A cada 15 dias o aquário era lavado com água doce e toda a água do mar contida no aquário era trocada. Para alimentar os anfípodes, novos ramos de Sargassum eram acrescentados sempre que necessário.
Preparação da contaminação da alga Sargassum por Cu
A incorporação do Cu aos tecidos de Sargassum foi realizada por meio da imersão de ramos desta alga em quatro soluções de diferentes concentrações do metal. Para obtenção dessas soluções, antes de cada réplica do experimento foi elaborada uma solução estoque de 25mg/L de sulfato de cobre (CuSO4 5H2O) em água destilada, a qual foi mantida refrigerada a 4ºC para evitar a redução do metal. As soluções de contaminação da alga foram feitas a partir da diluição dessa solução de estoque em água do mar filtrada. As soluções para contaminação do Sargassum foram: solução controle (0 ug/L); 50ug/L; 250ug/L e 500ug/L. Foram selecionados ramos de Sargassum de 1±0,1g livres de epífitas e sem apressório. Cada ramo foi imerso por 24h em 1L da solução apropriada, em temperatura de 21ºC e com aeração. Após esse período os ramos foram lavados em água destilada para limpeza da superfície e utilizados nos testes.
Três amostras de ramos contaminados em cada uma das soluções e da solução controle foram retiradas para a quantificação da concentração do Cu contido no tecido de Sargassum. As amostras foram secas em estufa à 70ºC por 24h e trituradas. As amostras foram enviadas ao Laboratório de Análises Ambientais no Departamento de Ciências do Solo da Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz para as análises de concentração de Cu.
Separação de jovens de Cymadusa filosa
Para cada réplica do experimento foram individualizadas 12 fêmeas ovadas em béqueres de 200ml. As fêmeas foram acompanhadas diariamente até a liberação dos jovens do marsúpio. Os jovens liberados de 1 a 4 dias antes do início dos testes foram colocados em um mesmo recipiente a fim de serem aleatorizados para sua utilização.
Bioensaios
Em todos os tratamentos foram utilizados aquários com capacidade de 2L preenchidos com 1L de água do mar filtrada. Em cada um dos aquários foram colocados 20 jovens de Cymadusa filosa escolhidos aleatoriamente entre os jovens liberados pelas fêmeas da cultura. Para a alimentação, foi adicionado um ramo de 1g de Sargassum previamente contaminado na solução prevista para cada tratamento. Os aquários foram mantidos com aeração constante e controle da temperatura e fotoperíodo. Após uma semana do início do experimento, os jovens foram retirados para limpeza do aquário. Os anfípodes sobreviventes foram contabilizados e os aquários lavados em água doce. Os aquários eram preenchidos novamente de 1L de água do mar filtrada e os anfípodes sobreviventes devolvidos junto a um novo ramo de Sargassum de 1g contaminado de acordo com o tratamento. Após esse período reposição da alimentação e a limpeza do aquário ocorriam sempre que um dos tratamentos estava com menos de 2 folíolos. Em cada lavagem as fêmeas eram observadas a fim de encontrar jovens no marsúpio. O experimento foi finalizado quando, em algum dos tratamentos, uma das fêmeas apresentou jovens no marsúpio. Os animais foram congelados individualmente para diminuição de seu metabolismo, e em seguida foram armazenados em álcool 70% para serem fotografados e medidos. O experimento foi replicado três vezes.
Os animais foram fotografados com auxílio de uma câmera AxioCam acoplada a uma lupa ZeissSV11. As imagens foram analisadas através do programa Action Vision 4.8. O tamanho dos animais foi medido pelo comprimento corporal sendo o perímetro obtido entre a inserção do primeiro par de antenas até a extremidade posterior do telson (Fig. 2A). Para avaliar a interferência no desenvolvimento sexual dos machos, o tamanho do segundo gnatópodo foi medido através do comprimento do própodo desse apêndice (Fig. 2B). A porcentagem de fêmeas ovadas e a fecundidade foram avaliadas
como parâmetros reprodutivos. As fêmeas foram identificadas por apresentarem oostegitos. Foi calculada a razão entre o número de fêmeas ovadas e o número total de fêmeas em cada tratamento. Nas fêmeas ovadas ou que apresentavam jovens nos marsúpios, a prole foi retirada e contada. A fecundidade foi determinada pela média de número de ovos nas fêmeas ovadas.
Figura 2. A – Forma de medida do tamanho do segundo gnatópodo dos machos de Cymadusa
filosa. B- Forma de medida do tamanho dos indivíduos de Cymadusa filosa. Barra de escala
referente a 1mm.
Análises estatísticas
Os efeitos letais da contaminação do Sargassum em Cymadusa filosa foram avaliados através da mortalidade ao final de cada experimento. Para avaliar os possíveis efeitos sobre o crescimento dos anfípodes foram medidos o tamanho total dos indivíduos e o comprimento do própodo do segundo gnatópodo dos machos. Os efeitos sobre a reprodução foram avaliados através da razão entre o número de fêmeas ovadas e o total de fêmeas e a fecundidade. Análises de variâncias (ANOVA) foram utilizadas para verificar as diferenças das respostas entre os tratamentos utilizando como único fator fixo: o tratamento. A homogeneidade de variâncias foi testada através do teste de Cochran e quando os dados não apresentaram homogeneidade foram transformados em log (x+1). Quando as diferenças entre praias ou estações mostraram-se significativas (p<0,05) foi realizado o teste de Dunett para identificação das diferenças dentro de cada fator.
Resultados
A imersão dos ramos de Sargassum em soluções de Cu resultou no aumento da concentração desse metal nos tecidos dessa macroalga (Tab. 1). A relação entre a concentração dos íons de cobre presentes na solução de contaminação e a concentração desses íons no tecido de Sargassum após a contaminação apresentou uma média de 2,8 (Desvio Padrão ± 0,79).
A mortalidade, a porcentagem de fêmeas ovadas, a fecundidade e o tamanho corporal de Cymadusa filosa não diferiram entre os tratamentos de dieta contaminada e o controle (Tab.2). Ainda assim, observando os resultados podemos notar que existe uma tendência ao aumento da mortalidade e diminuição da porcentagem de fêmeas ovadas, ambos relacionados ao aumento da concentração de Cu na dieta (Fig. 1).
Tabela 1. Soluções de Cu dissolvido em água do mar e concentração após a exposição nos tecidos da alga (média ± erro padrão)
Solução (µg/L) Concentração de Cu no tecido da alga (µg/g) Controle 8,62 ± 0,46 50 19,49 ± 1,00 250 99,27 ± 1,95 500 186,72 ± 2,35
Dentre todos os parâmetros examinados o tamanho do segundo gnatópodo dos machos de Cymadusa filosa foi o único que apresentou diferença entre os tratamentos e o controle (Tab.2). O gnatópodo é menor nos machos alimentados com dieta contaminada quando comparado ao controle (Dunett p<0,05) (Fig. 2).
Tabela 2 – Análise de variância da mortalidade, porcentagem de fêmeas ovadas, fecundidade, tamanho total dos indivíduos e comprimento do própodo do segundo gnatópodo dos machos de
Cymadusa filosa em quatro níveis de tratamento: 0 ug/L; 50ug/L; 250ug/L e 500ug/L. GL-
graus de liberdade; QM- quadrado médio; F – valor do teste.
Fonte de Variação GL QM F p Mortalidade Tratamento 3 0,03 2,87 0,10 Resíduo 8 0,01 Fêmeas ovadas Tratamento 3 0,05 2,21 0,16 Resíduo 8 0,02 Tamanho Fêmeas Tratamento 3 1,99 1,51 0,21 Resíduo 103 1,32 Tamanho Machos Tratamento 3 3,76 1,48 0,23 Resíduo 89 2,75 Fecundidade Tratamento 3 51,39 1,52 0,22 Resíduo 54 33,74 Tamanho Gnatópodo Tratamento 3 0,78 5,04 <0,01 Resíduo 74 0,15
Figura 1. Mortalidade (%), fêmeas ovadas (%), fecundidade, e tamanho médio (mm) de
Cymadusa filosa exposta à dieta contaminada com sulfato de cobre em diferentes
concentrações. As diferenças não são significativas (± erro padrão).
Figura 2. Tamanho médio do gnatópodo de machos de Cymadusa filosa expostos à dieta contaminada em diferentes concentrações de Cu (± erro padrão). * Indicam diferenças significativas em relação ao controle (Dunett p<0,01).
