Introdução
O aumento da ação antrópica próximo às regiões costeiras leva a uma concentração de poluentes que pode afetar seus ecossistemas. Avaliações ambientais são utilizadas a fim de verificar a qualidade dos ambientes e estabelecer níveis seguros de concentração dos poluentes para essas regiões. A poluição marinha pode ser avaliada através de diversas ferramentas (Zagatto, 2008). Entre elas, as mais utilizadas são as análises químicas da água e de sedimentos, que visam quantificar os poluentes no ambiente. Além disso, podem ser utilizadas análises da estrutura das comunidades de locais contaminados, identificando padrões para a poluição. Existem ainda os bioensaios em laboratório que verificam efeitos nos indivíduos de determinada espécie. Os testes em laboratório presentam uma estimativa dos poluentes através de seus efeitos em um dado organismo, denominado organismo teste (Chapman e Long, 1983). Essa é uma forma de avaliação amplamente utilizada por apresentar respostas rápidas e um bom custo benefício para a verificação da qualidade do ambiente aquático (Long e Chapman, 1985).
Usualmente, os bioensaios avaliam a letalidade de um organismo teste em diferentes concentrações do contaminante dissolvido em água (Chapman, 1985). No entanto, muitos efeitos podem não ser demonstrados por esse tipo de teste, primeiro por essa não ser a única forma de contaminação dos organismos, eles podem ser contaminados pela alimentação, também por existirem efeitos subletais nos indivíduos que não são observados em testes de mortalidade.
Alguns contaminantes se caracterizam por serem conservativos, isto é, acumulam-se no ambiente e na biota (Rainbow, 1995). Assim, estes contaminantes podem ser transferidos nas cadeias tróficas através dos alimentos contaminados (Wang e Fisher, 1999). Determinados metais, por exemplo, podem acumular-se no sedimento resultando em efeitos nos organismos detritívoros infaunais (Morrissey et al., 1996), podem também acumular-se em macroalgas e vegetais atingindo herbívoros que se alimentam desses organismos (Roberts et al., 2006) e podem ser transferidos para
predadores em geral (Wang, 2013). A alimentação, portanto, é uma via de exposição que deve ser considerada em estudos com substâncias cumulativas (Besser et al., 2005). Além disso, por se acumularem no ambiente, os poluentes podem causar efeitos crônicos nos indivíduos como variações no crescimento, reprodução e comportamento dos animais (Gale et al., 2006; Lee e Johnston, 2007; Hellou, 2011).
Os efeitos da dieta contaminada por metais são conhecidos para muitos invertebrados marinhos (Wang, 2002; Rainbow, 2002). Dentre esses invertebrados, os anfípodes tem destaque por serem amplamente distribuídos, importantes para os ecossistemas e apresentarem respostas à contaminação (Marsden e Rainbow, 2004). Os anfípodes possuem um importante papel no fluxo de materiais entre as cadeias tróficas dos ecossistemas litorâneos (Taylor, 1985), sendo que os herbívoros se alimentam de algas que podem estar contaminadas por diversos poluentes (Roberts et al., 2008b). Além disso, esses animais acumulam poluentes em seus tecidos e servem de alimento para predadores, como os peixes e outros crustáceos (Dubiaski-Silva e Masunari 2008). Portanto, os anfípodes herbívoros são importantes no estudo da rota dos poluentes nas cadeias tróficas marinhas.
As algas Phaeophyta são importantes macroalgas marinhas que servem de alimento aos anfípodes e podem absorver metais pesados (Davis et al., 2003). Essas algas possuem moléculas com muita afinidade por metais, tornando seus tecidos verdadeiros estoques de metais pesados. Entre as espécies de algas pardas que podem ser encontradas no litoral brasileiro, o Sargassum é uma das mais abundantes (Eston, 1984).
Dentre os anfípodes herbívoros encontrados no litoral do sudeste do Brasil, Cymadusa filosa, pertencente a família Ampithoidae, é uma das espécies mais abundante e amplamente distribuída. Esses anfípodes são encontrados nas regiões entre- marés, associados a diversas espécies de algas. Por alimentar-se de algas que potencialmente retém metais em seus tecidos, a poluição local pode ser um dos fatores que afetam a distribuição de C. filosa (Capítulo 1). No entanto, existe uma dificuldade em relacionar os padrões de distribuição dos organismos com a contaminação local por metais, em estudos de observação em campo (Mayer-Pinto et al., 2010). Isso pode ocorrer pela falta de réplicas ou ainda por existirem muitos outros fatores não controlados que influenciam sua distribuição (Mayer-Pinto et al., 2010). Assim,
bioensaios que simulem a contaminação podem revelar alguns dos possíveis efeitos dessa contaminação que não podem ser observados em campo (Den Besten et al., 1995; Adams, 2003).
O anfípode Cymadusa filosa mede em média 16mm quando adulto. O dimorfismo sexual é observado pelo segundo par de gnatópodos mais desenvolvido e cerdoso nos machos (Fig. 1). Os indivíduos alcançam a maturidade sexual em cerca de três semanas, a primeira reprodução resulta em média 25 jovens, fêmeas mais velhas chegam a apresentar até 60 jovens em uma ninhada. A espécie pode ser facilmente cultivada em laboratório. Essas características são importantes para organismos utilizados em bioensaios toxicológicos. Além disso, C. filosa é consideravelmente sensível a alguns poluentes, como observado por Siqueira (2012). Quando esses anfípodes são expostos a sulfeto de cobre sua tolerância é muito menor do que outros organismos similares. O anfípode C. filosa apresenta um grande potencial para ser usado como organismo teste em estudos de poluição em ambientes marinhos. Uma vez que C. filosa é um herbívoro, é importante compreender quanto e como a contaminação de sua alimentação pode interferir em sua sobrevivência, crescimento e reprodução.
Um dos metais que pode ser acumulado pelo Sargassum e transferido para sua fauna associada através da alimentação é o cobre (Cu) (Fourest e Volesky, 1996; Davis et al., 2000; Roberts et al., 2006). Apesar de ser um nutriente essencial para os anfípodes, o Cu pode ser tóxico em altas concentrações, podendo afetá-los diretamente pela exposição à água contaminada (King et al., 2006), ou indiretamente através do sedimento e alimentação contaminados (Gale et al., 2006; Roberts et al., 2006; Besser et al., 2005).
A resposta dos animais à contaminação é um importante indicador dos impactos da poluição. Compreender as vias de contaminação, como a alimentação de herbívoros, é importante para esclarecer questões sobre os efeitos de contaminantes. O objetivo desse estudo foi verificar o efeito da alimentação com Sargassum contaminado por sulfato de cobre sobre o desenvolvimento, crescimento e reprodução do anfípode herbívoro Cymadusa filosa.
Figura 1. A – Macho de Cymadusa filosa B – detalhe dos gnatópodos do macho, segundo par de ganatópodos mais desenvolvido que o primeiro. C – fêmea de Cymadusa filosa. D- detalhe dos ganatópodos da fêmea, gnatópodos semelhantes. D – própodo do gnatópodo do macho de
Cymadusa filosa. Barra de escala referente a 1mm.
Metodologia
Cultura dos anfípodes
Para iniciar a cultura de Cymadusa filosa em laboratório, os indivíduos foram coletados em bancos de Sargassum na praia da Fortaleza em Ubatuba- SP (23º32’S, 45º10’W). Frondes da alga retiradas do costão foram envolvidas em sacos de tecido de
0,2mm para contenção dos animais. O Sargassum foi transportado em caixas térmicas com água do mar até o laboratório da Base de Pesquisa “Clarimundo de Jesus” do IO/USP. No laboratório as algas foram agitadas em bandejas com água do mar e os indivíduos adultos de Cymadusa filosa foram colocados em recipientes com água do mar filtrada, aeração e folíolos de Sargassum para alimentação. Os animais foram transportados resfriados em caixas térmicas para o laboratório de aquários no Departamento de Biologia Animal da UNICAMP e acomodados em um aquário de 20L, com ramos de Sargassum para alimentação, aeração constante, temperatura de 21ºC±1 e fotoperíodo de 12h.
Coletas de água e alimento foram feitas mensalmente e, sempre que possível, mais indivíduos foram coletados para a manutenção da cultura. A cada 15 dias o aquário era lavado com água doce e toda a água do mar contida no aquário era trocada. Para alimentar os anfípodes, novos ramos de Sargassum eram acrescentados sempre que necessário.
Preparação da contaminação da alga Sargassum por Cu
A incorporação do Cu aos tecidos de Sargassum foi realizada por meio da imersão de ramos desta alga em quatro soluções de diferentes concentrações do metal. Para obtenção dessas soluções, antes de cada réplica do experimento foi elaborada uma solução estoque de 25mg/L de sulfato de cobre (CuSO4 5H2O) em água destilada, a qual foi mantida refrigerada a 4ºC para evitar a redução do metal. As soluções de contaminação da alga foram feitas a partir da diluição dessa solução de estoque em água do mar filtrada. As soluções para contaminação do Sargassum foram: solução controle (0 ug/L); 50ug/L; 250ug/L e 500ug/L. Foram selecionados ramos de Sargassum de 1±0,1g livres de epífitas e sem apressório. Cada ramo foi imerso por 24h em 1L da solução apropriada, em temperatura de 21ºC e com aeração. Após esse período os ramos foram lavados em água destilada para limpeza da superfície e utilizados nos testes.
Três amostras de ramos contaminados em cada uma das soluções e da solução controle foram retiradas para a quantificação da concentração do Cu contido no tecido de Sargassum. As amostras foram secas em estufa à 70ºC por 24h e trituradas. As amostras foram enviadas ao Laboratório de Análises Ambientais no Departamento de Ciências do Solo da Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz para as análises de concentração de Cu.
Separação de jovens de Cymadusa filosa
Para cada réplica do experimento foram individualizadas 12 fêmeas ovadas em béqueres de 200ml. As fêmeas foram acompanhadas diariamente até a liberação dos jovens do marsúpio. Os jovens liberados de 1 a 4 dias antes do início dos testes foram colocados em um mesmo recipiente a fim de serem aleatorizados para sua utilização.
Bioensaios
Em todos os tratamentos foram utilizados aquários com capacidade de 2L preenchidos com 1L de água do mar filtrada. Em cada um dos aquários foram colocados 20 jovens de Cymadusa filosa escolhidos aleatoriamente entre os jovens liberados pelas fêmeas da cultura. Para a alimentação, foi adicionado um ramo de 1g de Sargassum previamente contaminado na solução prevista para cada tratamento. Os aquários foram mantidos com aeração constante e controle da temperatura e fotoperíodo. Após uma semana do início do experimento, os jovens foram retirados para limpeza do aquário. Os anfípodes sobreviventes foram contabilizados e os aquários lavados em água doce. Os aquários eram preenchidos novamente de 1L de água do mar filtrada e os anfípodes sobreviventes devolvidos junto a um novo ramo de Sargassum de 1g contaminado de acordo com o tratamento. Após esse período reposição da alimentação e a limpeza do aquário ocorriam sempre que um dos tratamentos estava com menos de 2 folíolos. Em cada lavagem as fêmeas eram observadas a fim de encontrar jovens no marsúpio. O experimento foi finalizado quando, em algum dos tratamentos, uma das fêmeas apresentou jovens no marsúpio. Os animais foram congelados individualmente para diminuição de seu metabolismo, e em seguida foram armazenados em álcool 70% para serem fotografados e medidos. O experimento foi replicado três vezes.
Os animais foram fotografados com auxílio de uma câmera AxioCam acoplada a uma lupa ZeissSV11. As imagens foram analisadas através do programa Action Vision 4.8. O tamanho dos animais foi medido pelo comprimento corporal sendo o perímetro obtido entre a inserção do primeiro par de antenas até a extremidade posterior do telson (Fig. 2A). Para avaliar a interferência no desenvolvimento sexual dos machos, o tamanho do segundo gnatópodo foi medido através do comprimento do própodo desse apêndice (Fig. 2B). A porcentagem de fêmeas ovadas e a fecundidade foram avaliadas
como parâmetros reprodutivos. As fêmeas foram identificadas por apresentarem oostegitos. Foi calculada a razão entre o número de fêmeas ovadas e o número total de fêmeas em cada tratamento. Nas fêmeas ovadas ou que apresentavam jovens nos marsúpios, a prole foi retirada e contada. A fecundidade foi determinada pela média de número de ovos nas fêmeas ovadas.
Figura 2. A – Forma de medida do tamanho do segundo gnatópodo dos machos de Cymadusa
filosa. B- Forma de medida do tamanho dos indivíduos de Cymadusa filosa. Barra de escala
referente a 1mm.
Análises estatísticas
Os efeitos letais da contaminação do Sargassum em Cymadusa filosa foram avaliados através da mortalidade ao final de cada experimento. Para avaliar os possíveis efeitos sobre o crescimento dos anfípodes foram medidos o tamanho total dos indivíduos e o comprimento do própodo do segundo gnatópodo dos machos. Os efeitos sobre a reprodução foram avaliados através da razão entre o número de fêmeas ovadas e o total de fêmeas e a fecundidade. Análises de variâncias (ANOVA) foram utilizadas para verificar as diferenças das respostas entre os tratamentos utilizando como único fator fixo: o tratamento. A homogeneidade de variâncias foi testada através do teste de Cochran e quando os dados não apresentaram homogeneidade foram transformados em log (x+1). Quando as diferenças entre praias ou estações mostraram-se significativas (p<0,05) foi realizado o teste de Dunett para identificação das diferenças dentro de cada fator.
Resultados
A imersão dos ramos de Sargassum em soluções de Cu resultou no aumento da concentração desse metal nos tecidos dessa macroalga (Tab. 1). A relação entre a concentração dos íons de cobre presentes na solução de contaminação e a concentração desses íons no tecido de Sargassum após a contaminação apresentou uma média de 2,8 (Desvio Padrão ± 0,79).
A mortalidade, a porcentagem de fêmeas ovadas, a fecundidade e o tamanho corporal de Cymadusa filosa não diferiram entre os tratamentos de dieta contaminada e o controle (Tab.2). Ainda assim, observando os resultados podemos notar que existe uma tendência ao aumento da mortalidade e diminuição da porcentagem de fêmeas ovadas, ambos relacionados ao aumento da concentração de Cu na dieta (Fig. 1).
Tabela 1. Soluções de Cu dissolvido em água do mar e concentração após a exposição nos tecidos da alga (média ± erro padrão)
Solução (µg/L) Concentração de Cu no tecido da alga (µg/g) Controle 8,62 ± 0,46 50 19,49 ± 1,00 250 99,27 ± 1,95 500 186,72 ± 2,35
Dentre todos os parâmetros examinados o tamanho do segundo gnatópodo dos machos de Cymadusa filosa foi o único que apresentou diferença entre os tratamentos e o controle (Tab.2). O gnatópodo é menor nos machos alimentados com dieta contaminada quando comparado ao controle (Dunett p<0,05) (Fig. 2).
Tabela 2 – Análise de variância da mortalidade, porcentagem de fêmeas ovadas, fecundidade, tamanho total dos indivíduos e comprimento do própodo do segundo gnatópodo dos machos de
Cymadusa filosa em quatro níveis de tratamento: 0 ug/L; 50ug/L; 250ug/L e 500ug/L. GL-
graus de liberdade; QM- quadrado médio; F – valor do teste.
Fonte de Variação GL QM F p Mortalidade Tratamento 3 0,03 2,87 0,10 Resíduo 8 0,01 Fêmeas ovadas Tratamento 3 0,05 2,21 0,16 Resíduo 8 0,02 Tamanho Fêmeas Tratamento 3 1,99 1,51 0,21 Resíduo 103 1,32 Tamanho Machos Tratamento 3 3,76 1,48 0,23 Resíduo 89 2,75 Fecundidade Tratamento 3 51,39 1,52 0,22 Resíduo 54 33,74 Tamanho Gnatópodo Tratamento 3 0,78 5,04 <0,01 Resíduo 74 0,15
Figura 1. Mortalidade (%), fêmeas ovadas (%), fecundidade, e tamanho médio (mm) de
Cymadusa filosa exposta à dieta contaminada com sulfato de cobre em diferentes
concentrações. As diferenças não são significativas (± erro padrão).
Figura 2. Tamanho médio do gnatópodo de machos de Cymadusa filosa expostos à dieta contaminada em diferentes concentrações de Cu (± erro padrão). * Indicam diferenças significativas em relação ao controle (Dunett p<0,01).
Discussão
A alimentação de Cymadusa filosa com Sargassum imerso em soluções de sulfato de cobre pode influenciar a mortalidade e a porcentagem de fêmeas ovadas. Essa dieta influencia também o desenvolvimento do gnatópodo dos machos, pois machos alimentados com Sargassum imerso em concentrações de sulfato de cobre tornaram-se adultos com o segundo par de gnatópodos menor do que machos alimentados com algas que não foram contaminadas.
A imersão de Sargassum em soluções de Cu resultou no aumento da concentração desse metal nos tecidos da alga. Isso se deve a uma característica, compartilhada pelas algas pardas, de acumular metais em seus tecidos através de moléculas que têm alta afinidade por essas substâncias (Davis et al., 2003). A relação entre a concentração de Cu nas soluções de imersão e a concentração resultante na alga após a imersão é semelhante às encontradas por Roberts et al (2006). As variações nas quantidades de metal acumulado em laboratório na alga podem ser devido a diferenças no pH, tempo de exposição (Hamdy, 2000) e partes da alga expostas (Jothinayagi e Anbazhagan, 2009).
A primeira solução de imersão resultou em uma contaminação da alga de aproximadamente 19µg/g, esse valor aproxima-se dos valores encontrados na região da Enseada do Flamengo (primeiro capítulo desse trabalho) e na Bahia de Todos os Santos, Bahia (Amado-Filho, 2006). A segunda solução de imersão apresentou frondes com concentrações de aproximadamente 99µg/g, essa concentração de Cu no Sargassum é semelhante a locais como Gujarat, Índia que recebe diretamente efluentes industriais (Jadeja e Tewari, 2007). Já a solução de maior concentração resultou em frondes de Sargassum com 186µg/g, esses valores são próximos aos encontrados em outras algas pardas retiradas de locais contaminados (Roberts et al., 2008). Portanto, os bioensaios realizados representam condições de contaminação Sargassum por Cu próximas das encontradas em locais do litoral sudeste do Brasil e outras regiões do mundo.
Os resultados dos bioensaios sugerem que a dieta é uma das vias de contaminação por metais pesados para Cymadusa filosa. A ingestão de alimento contaminado parece alterar o desenvolvimento de caracteres secundários nos machos, como o crescimento de seu gnatópodo. Além disso, alterações em sua mortalidade e na porcentagem de fêmeas ovadas, ainda que não significativas, foram observadas.
Apesar da mortalidade não diferir significativamente entre os tratamentos, observa-se uma tendência de seu aumento relacionada ao aumento de cobre da dieta de Cymadusa filosa. A maior mortalidade observada nos testes de dieta foi de aproximadamente 30%, em algas com 186µg de Cu/g. Enquanto que, a exposição de C. filosa a uma solução de íons Cu em concentrações muito menores (10µg/L) leva a redução de 50% de sua população (CL50-48h) (Siqueira, 2012). Assim, o estudo da alimentação desse herbívoro revelou que os efeitos letais dessa via de contaminação são menores quando comparados aos efeitos da contaminação por exposição à água contaminada.
A relação entre o aumento da mortalidade de anfípodes e a quantidade de metais em sua dieta foi observada em outros estudos. O anfípode de água doce, Hyalella azteca, que possui uma dieta onívora, quando exposto a alimentos contaminados por chumbo teve sua sobrevivência afetada (Besser et al., 2005). O anfípode marinho herbívoro Perampithoe parmerong ao ingerir algas contaminadas com Cu (170µg/g) apresentou uma mortalidade 40% (Roberts et al., 2008), Cymadusa filosa quando alimentado com algas contaminadas com valores semelhantes (186µg/g) apresenta uma taxa de mortalidade pouco menor de aproximadamente 27%.
Outro parâmetro que pode ser prejudicado pela alimentação com metais é a reprodução (Fisher e Hook, 2002; Besser, 2005; Meyer, 2005; Roberts; 2008). A porcentagem de fêmeas ovadas de C. filosa não apresentou variações significativas entre os tratamentos, no entanto pode-se observar uma tendência a redução de fêmeas ovadas nos tratamentos com dieta contaminada. Os efeitos dos poluentes na reprodução dos indivíduos têm uma importância significativa, pois tais alterações podem afetar a dinâmica das populações em ambientes naturais (Fischer e Hook, 2002).
Além da sobrevivência e reprodução, o tamanho dos anfípodes pode variar em função da contaminação da dieta por metais (Besser, 2005). Os indivíduos de C. filosa, tanto machos quanto fêmeas, não tiveram seu tamanho reduzido pela dieta contaminada. O mesmo foi observado para o ampitoídeo Perampithoe parmerong, na Austrália (Roberts, 2008). Os efeitos da contaminação, tanto na fisiologia quanto no comportamento dos anfípodes dependem da taxa de detoxificação e excreção do metal, essas taxas podem variar de acordo com a espécie estudada (Rainbow, 2002).
O dimorfismo sexual de C. filosa é evidenciado pelo tamanho do segundo par de gnatópodos, sendo maiores em machos quando comparados a fêmeas (Barnard e
Kararam, 1991). A diferenciação sexual em crustáceos é controlada pela glândula andrógena e seus hormônios (Hasegawa et al., 1993). Os resultados desse estudo mostram que o tamanho do segundo par de gnatópodos de machos expostos à dieta contaminada por Cu é menor que em machos do controle. O tamanho reduzido do gnatópodo foi observado no anfípode Gammarus pulex em rios próximos a estações de tratamento de esgoto (Gross et al., 2001). Alguns poluentes, como pesticidas, herbicidas e hidrocarbonetos de petróleo, podem afetar o sistema endócrino em crustáceos (Rodríguez et al., 2007). Quanto aos metais existem algumas sugestões que e podem alterar também seu funcionamento, no entanto ainda faltam estudos para esclarecer como e onde atuam (Rodríguez et al., 2007). O mau desenvolvimento dos gnatópodos em machos de C. filosa pode alterar seu desempenho reprodutivo uma vez que esses anfípodes utilizam o gnatópodo para cópula com as fêmeas (Vandenbergh et al., 2003). Além disso, a quela é utilizada para defender territórios e em embates com outros machos por parceiras sexuais (Siqueira, 2012). Assim, mais estudos são necessários