UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
Fernanda Silva Rodrigues
Atraso de aprendizagem em modelos experimentais de acidemia glutárica tipo- I e o envolvimento de parâmetros colinérgicos e
células gliais: possível proteção da N-acetilcisteína
Florianópolis, SC 2018
Fernanda Silva Rodrigues
Atraso aprendizagem em modelos experimentais de acidemia glutárica tipo- I e o envolvimento de parâmetros colinérgicos e
células gliais na apoptose neuronal: possível proteção da N-acetilcisteína
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito à obtenção de grau de Doutora, sob a orientação da Prof.ª Dra. Michele Rechia Fighera e coorientação do Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos Santos
Florianópolis, SC 2018
Rodrigues, Fernanda Silva
Atraso de aprendizagem em modelos experimentais de acidemia glutárica tipo-I e o envolvimento de parâmetros colinérgicos e células gliais : possível proteção da N-acetilcisteína / Fernanda Silva Rodrigues ; orientadora, Prof.ª Dra. Michele Rechia Fighera, coorientador, Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos Santos, 2018.
220 p.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2018. Inclui referências.
1. Neurociências. 2. ácido glutárico, estriado. 3. córtex, N-acetilcisteína. 4. memória procedimental, morte neuronal. 5. células gliais. I. Fighera, Prof.ª Dra. Michele Rechia . II. Santos, Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos . III. Universidade
Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. IV. Título.
‘A beleza de ser um eterno aprendiz.’
AGRADECIMENTOS
Agradeço acima de tudo a minha família, que é a minha base de apoio, minha motivação desde o início, meu refúgio nos momentos difíceis e, com certeza, o motivo de muitas alegrias. Muito obrigada pai e mãe por moldarem a minha personalidade, me ensinarem que através dos estudos a vida pode ter um rumo diferente, que o conhecimento é um bem muito precioso que ninguém nos tira. Obrigada por sempre terem acredito que eu seria capaz de chegar aonde estou hoje, e obrigada também pelo investimento financeiro que fizeram durante toda a minha formação. Muito obrigada de coração, sou eternamente grata, eu amo vocês! Agradeço também ao meu irmão João pelo carinho e incentivo, por ter sido forte o suficiente para ‘segurar as pontas’ dentro de casa quando isso foi preciso, e por nos presentear com um anjinho que abençoou a nossa família, a minha sobrinha Luiza!
Agradeço a minha orientadora, professora Michele Rechia Fighera, por ter me aceito em seu grupo de trabalho, por todos ensinamentos compartilhados, pela confiança em mim depositada e pelo investimento no meu projeto. Muito obrigada por incentivar meu crescimento profissional e por me possibilitar conhecer o mundo científico através da pós-graduação. Nando e Mi, agradeço com muito carinho pela amizade que foi sendo construída ao longo desses anos, pela paciência e compreensão dos erros. Minha eterna admiração e reconhecimento, muito obrigada! Muito obrigada também ao professor Adair Roberto Soares do Santos por ter aberto as portas do seu laboratório e pelo investimento financeiro no meu projeto. Obrigada também por me apresentar o fantástico mundo da Neurociências.
Muito obrigada a todos os professores do PPG-Neurociências pelas excelentes aulas, vocês são maravilhosos. Em especial aos professores que participaram tanto da minha banca de qualificação, quanto da banca de defesa, muito obrigada! Agradeço ao professor Guilherme Speretta que me orientou durante o estágio docência, foi uma experiência muito motivadora. Obrigada pelas dicas, conselhos e ensinamentos.
Agradeço em especial, ao meu namorado Lucas por ter aparecido e remodelado o futuro da minha vida. Obrigada por ser meu amigo, meu companheiro, meu incentivador. Obrigada pelo apoio e pelo ombro amigo nos tantos momentos difíceis que passei até chegar essa fase de conclusão do doutorado. Obrigada por compreender as minhas ausências, pelas caronas até a UFSC, pela parceria nos finais de semana de experimentos e de estudos. Te amo muito.
Agradeço a todos meus queridos tios e tias, primos e primas, a vó Cira, vó Nelci e Vô João! Muito obrigada por tudo, por sempre me apoiarem e estarem presente quando possível, eu amo vocês, com vocês a vida sempre será uma festa, e eu fico muito feliz por isso!
Agradeço também a todos meus amigos de Cruz Alta e Santa Maria. Aos amigos que fiz em Florianópolis, que também foram essenciais na minha caminhada. Obrigada Rosane (minha mãe em Floripa), Carol (obrigada pela amizade e pelas muitas conversas) , Róli, Léo, Well, Aledson, Cris, Adriano, Ângela, Scheila, Thayza, Igor, Michael e aos demais amigos do LANDI, vocês são excelentes profissionais e pessoas especiais. Muito obrigada ao meu amigo Fernando por todo apoio nesses 4 anos e pela amizade que se fortaleceu muito desde que viemos para a UFSC. Chegamos juntos, trabalhos muito e estamos concluindo essa etapa com muita alegria, parabéns pra nós. Obrigada a família BioEx (UFSM) pelo carinho, incentivo, pelas risadas, por todos momentos alegres que passamos juntos até aqui, com certeza, vocês foram um dos maiores presentes da pós-graduação. Vocês são mais que especiais!
Muito obrigada aos funcionários do Departamento de Ciências Fisiológicas, seu Carlos e dona Vilma, por sempre nos receberem com um alegre bom dia e pelos momentos de descontração na cozinha do departamento. Obrigada também ao Nivaldo, por sempre estar pronto para ajudar nos problemas burocráticos do curso.
Obrigada à UFSC pela estrutura, e à CAPES pelo suporte financeiro durante o doutorado. Obrigada aos animais de laboratório, instrumentos do meu trabalho, todo o meu agradecimento e respeito.
E para finalizar, gostaria de agradecer a Nossa Senhora de Fátima! Mesmo acreditando que cada um é responsável pelo seu destino, sei que em algum lugar há uma força maior que ilumina meu caminho!
RESUMO
A acidemia glutárica tipo I (AG-I) é uma doença hereditária neurometabólica caracterizada pelo acúmulo de ácido glutárico (AG) nos tecidos e fluídos corporais dos pacientes. Essa patologia apresenta uma prevalência mundial estimada de 1 a cada 106.000 recém-nascidos. As crianças com AG-I podem desenvolver graves sintomas neurológicos, como comprometimento motor e também vários graus de deficiência intelectual e problemas comportamentais. Esses sintomas, frequentemente, surgem após crises encefalopáticas, mas também aparecem de forma progressiva na ausência das crises. Acredita-se que danos neuropatológicos como atrofia estriatal bilateral e atrofia cortical progressiva estejam subjacentes aos prejuízos neurológicos. No entanto, ainda não está claro o mecanismo pelo qual o AG leva a morte neuronal e os prejuízos cognitivos. Sendo assim, sabendo que há relevante disfunção estriatal na AG-I e que esta estrutura está envolvida no controle de processos cognitivos relacionados à aprendizagem de procedimentos e hábitos, este estudo propôs investigar mecanismos que levam ao dano estriatal e vias de morte neuronal, bem como possíveis prejuízos cognitivos induzidor pelo AG, através de 2 modelos experimentais de AG-I. Também investigamos se o tratamento com N-acetilcisteína (NAC) poderia melhorar as alterações dos parâmetros comportamentais, bioquímicos e moleculares induzidos pelo AG. Para isso, inicialmente, foi utilizado modelo de injeção crônica de AG. Esse modelo mimetiza uma situação de exposição contínua ao AG. Dessa forma, ratos jovens foram injetados com AG (5 μmol/g, s.c., duas vezes ao dia do 5º ao 28º dia de vida) e foram tratados com NAC (150 mg/kg, por gavagem intragástrica, do 5º ao 28º dia). Observamos que a injeção crônica de AG causou atraso na aprendizagem procedimental, observado no labirinto radial de 8 braços e no labirinto aquático de Morris (LAM). Também verificamos um aumento na concentração de citocinas, de marcadores oxidativos, nos níveis de caspases ativadas e na atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado dos animais. Interessantemente, encontramos aumento na imunorreatividade de células gliais e diminuição na imunorreatividade do receptor colinérgico nicotínico alfa7 (α7nAChR) e de NeuN no estriado. Estes resultados sugerem que a toxicidade crônica do AG possa estar acontecendo através da ativação de células gliais, inflamação e estresse oxidativo, além de indicar possível comprometimento na sinalização colinérgica estriatal. No entanto, a administração de NAC protegeu do prejuízo cognitivo, do dano oxidativo, da neuroinflamação e da ativação de caspases induzida por AG. Apesar de
não ter prevenido a morte neuronal, o tratamento com a NAC protegeu das alterações induzidas pela injeção crônica de AG na imunorreatividade de Iba-1 e GFAP e na atividade da AchE. Esses resultados sugerem que a exposição contínua ao AG gera uma neurotoxicidade estriatal, possivelmente por ativação de células gliais e comprometimento na sinalização colinérgica, capaz de alterar processos cognitivos dependentes dessa estrutura. Posteriormente, investigamos se os danos neurológicos também seriam desencadeados por apenas um aumento transiente de AG. Assim, avaliamos se uma exposição aguda ao AG, o que mimetiza uma crise de descompensação metabólica, durante o período neonatal poderia ativar processos apoptóticos e levar a posterior prejuízos na memória de procedimento. Para isso, camundongos foram injetados, entre 12 e 24 horas após o nascimento, com AG (2,5 μmol/g, pH 7,4, i.c.v.) e/ou salina 0,9%, e foram tratados com NAC (250 mg/kg, i.p.) e/ou salina 0,9%, uma vez ao dia, do 2º ao 21º dia de vida. A partir de 21 ou 40 dias de vida, os animais foram avaliados no labirinto radial de 8 braços e no LAM para análise da memória de procedimento e memória de trabalho. Observamos que animais injetados com AG apresentaram déficit na aprendizagem de procedimentos (animais com 21 ou 40 dias de vida), mas a memória de trabalho foi prejudicada apenas em camundongos com 40 dias de idade. Verificamos também que houve ativação de células gliais no estriado induzidas por AG (GFAP e Iba-1) e aumento da peroxidação lipídica. Uma vez que as células gliais fornecem suporte trófico para os neurônios, avaliamos a concentração de NGF, neurotrofina importante para neurônios colinérgicos. Assim, observamos diminuição na concentração de NGF estriatal, e aumento da imunoreatividade do receptor de morte ativado por neurotrofinas, p75NTR. Concomitantemente, verificamos diminuição na imunorreatividade de NeuN estriatal, embora moduladores apoptóticos não tenham sido alterados (clivagem da PARP e Bcl-2). Interessante, a administração de NAC protegeu da peroxidação lipídica, da ativação das células gliais e do aumento de proteínas pró-apoptóticas, bem como foi eficaz contra a morte neuronal no estriado dos animais que receberam injeção aguda de AG. Já no córtex dos animais, observamos aumento na ativação de Iba-1, porém a astrogliose reativa ocorreu apenas nos animais com 21 dias de vida. O aumento na peroxidação lipídica, p75NTR, PARP clivada/PARP total e diminuição de Bcl-2 e NGF resultaram na morte neuronal cortical induzida pela exposição aguda ao AG. O tratamento com a NAC protegeu de todas alterações nos animais cm 21 dias de vida, mas não do aumento de p75NTR e GFAP nos animais com 40 dias de vida. Embora não tenha sido capaz de proteger contra todas as alterações corticais induzidas pelo AG, o tratamento com NAC foi
eficaz na proteção do atraso da aprendizagem de procedimentos apresentado pelos animais. Em conjunto, esses dados sugerem que tanto o insulto agudo quanto o crônico podem causar comprometimento cognitivo relacionado a memória de procedimentos, devido à morte neuronal estriatal e cortical, o que pode prejudicar a plasticidade necessária para a aprendizagem e desempenho das funções cognitivas. Provavelmente, a morte neuronal está sendo desencadeada pelo aumento do receptor de morte p75NTR, aumento da clivagem da PARP, o desequilíbrio em parâmetros do sistema colinérgico, juntamente com estresse oxidativo e inflamação. Além disso, como o AG provoca disfunção astrocitária e ativação microglial, e essas células são extremamente importantes para o desenvolvimento e sobrevivência de neurônios produzindo e liberando fatores neurotróficos, como NGF, a morte neuronal também pode estar ocorrendo por disfunção astrocitária e diminuição de NGF. Adicionalmente, o tratamento com a NAC foi capaz de melhorar as alterações comportamentais e moleculares induzidas pelo AG. Dessa forma, sugerimos uma possível via de degeneração estriatal através da toxicidade as células gliais, bem como uma estratégia terapêutica que poderia contribuir no tratamento dos pacientes com AG-I. Palavras-chaves: ácido glutárico, estriado, córtex, N-acetilcisteína, memória procedimental, morte neuronal, células gliais
ABSTRACT
Glutaric acidemia type I (GA-I) is a hereditary neurometabolic disease characterized by the accumulation of glutaric acid (GA) in the tissues and body fluids of patients. This disease presents an estimated worldwide prevalence of 1 in 106,000 newborns. Children with GA-I may develop severe neurological symptoms such as motor impairment and also varying degrees of intellectual impairment and behavioral problems. These symptoms often arise after encephalopathic seizures, but also appear progressively in the absence of seizures. Neuropathological damage such as bilateral striatal atrophy and progressive cortical atrophy are believed to underlie neurological impairment. However, the mechanism by which GA leads to neuronal death and cognitive impairment remains unclear. Thus, knowing that there is relevant striatal dysfunction in GA-I and that this structure is involved in the control of cognitive processes related to learning procedural and habits, this study proposed to investigate mechanisms that lead to striatal damage and neuronal death pathways, as well as possible cognitive impairment induced by GA, through 2 experimental models of GA-I. We also investigated whether treatment with N-acetylcysteine (NAC) could improve the changes in behavioral, biochemical and molecular parameters induced by GA. For this, initially, a model of chronic injection of GA was used. This model mimics a situation of continuous exposure to GA. Thus, pup rats were injected with GA (5 μmol/g, s.c., twice daily from the 5th to the 28th day of life) and were treated with NAC (150 mg/kg, intragastric gavage from the 5th to the 28th day). We observed that the chronic injection of GA caused a delay in procedural learning in the Radial Arm-Maze task and Water Maze task. We also observed an increase in the cytokines concentration, oxidative markers, activated caspase levels and acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum of the animals. Interestingly, an increase in glial cell immunoreactivity and a decrease in the immunoreactivity of nicotinic receptor cholinergic alpha7 (α7nAChR) and NeuN in the striatum were found. These results suggests that the chronic toxicity of GA may be dependent on activation of glial cells, inflammation and oxidative stress, besides indicates a possible compromise in striatal cholinergic signaling. However, administration of NAC protected against cognitive impairment, oxidative damage, neuroinflammation and activation of caspases induced by GA. Although NAC did not prevent neuronal death, it protected from changes induced by chronic injection of GA in the immunoreactivity of Iba-1 and GFAP and in AChE activity. These results suggest that continuous exposure to GA generates striatal neurotoxicity, possibly by
activation of glial cells and impairment of cholinergic signaling, which may alter cognitive processes dependent on this structure. Subsequently, we investigated whether neurological damage would also be triggered by only a transient increase in GA. Thus, we evaluated whether an acute exposure to GA, which mimics a crisis of metabolic decompensation, during the neonatal period could activate apoptotic processes and lead to subsequent impairment on procedural learning. For this, mice were injected with GA (2.5 μmol/g, pH 7.4, i.c.v.) and/or saline 0.9%, from 12 to 24 hours after birth, and were treated with NAC (250 mg/kg, i.p.) and/or saline 0.9%, once daily, from the 2nd to the 21st day of life. From 21 or 40 days of life, the animals were evaluated in the RAM and in Water maze task for analysis of the procedural and working memory. We observed that animals injected with GA presented deficits in procedural learning (21- and old mice), but working memory was impaired only in 40-day-old mice. We also verified that GA induced glial cells activation (GFAP and Iba-1) and increased lipid peroxidation. Since glial cells provide trophic support to neurons, we evaluated NGF concentration, important neurotrophin for cholinergic neurons. Thus, we observed a decrease in striatal NGF concentration, and increased in immunoreactivity of p75 neurotrophin receptor (p75NTR). Concomitantly, we found a decrease in the immunoreactivity of striatal NeuN, although apoptotic modulators were not altered (cleavage PARP and Bcl-2). Interestingly, NAC administration protected lipid peroxidation, glial cell activation, and pro-apoptotic protein enhancement, as well as being effective against striatal neuronal death in animals receiving acute AG injection. In the cortex, we observed an increase in Iba-1 activation, but reactive astrogliosis occurred only in 21-day-old mice. The increase in lipid peroxidation, p75NTR, cleaved PARP / total PARP and decrease of Bcl-2 and NGF resulted in cortical neuronal death induced by acute exposure to GA. And the treatment with NAC protected from all changes in 21-day-old mice, but not from the increase of p75NTR and GFAP in 40-day-old mice. Although not able to protect against all cortical alterations induced by GA, NAC treatment was effective in protecting the delayed procedural learning presented by animals. Taken together, these data suggest that both acute and chronic insults may cause cognitive impairment related to procedural memory due to striatal and cortical neuronal death, which may impair the plasticity required for learning and performance of cognitive functions. Probably, neuronal death is being triggered by increased p75NTR death receptor, increased PARP cleavage, imbalance in parameters of the cholinergic system, along with oxidative stress and inflammation. In addition, as GA causes astrocytic dysfunction and microglial activation,
and these cells are extremely important for the development and survival of neurons producing and releasing neurotrophic factors such as NGF, neuronal death may also be occurring by astrocytic dysfunction and decreased NGF. In addition, treatment with NAC was able to improve the behavioral and molecular changes induced by GA. Thus, we suggest a possible pathway of striatal and cortical degeneration through glial cell toxicity, as well as a therapeutic strategy that could contribute to the treatment of patients with AG-I.
Keywords: glutaric acid, striatum, cortex, N-acetylcysteine, procedural memory, neuronal death, glial cells
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH).
... 34
Figura 2 - Similaridade estrutural entre glutamato, ácido glutárico e ácido 3-hidroxiglutárico. ... 39
Figura 3 - Efeitos citotóxicos do AG nos astrócitos. ... 40
Figura 4 - Algoritmo de diagnóstico para AG-I... 43
Figura 5 - Figura representativa dos núcleos da base em humanos. ... 56
Figura 6 - Representação esquemática da complexa conectividade dos núcleos da base. ... 56
Figura 7 - Marcadores colinérgicos no estriado de rato. ... 58
Figura 8 - Representação da síntese e degradação da ACh. ... 59
Figura 9 - Visão geral das vias de apoptose extrínseca e intrínseca. ... 68
Figura 10 - Representação da estrutura da N-acetilcisteína (NAC). ... 72
Figura 11 - Esquema representativo da síntese da glutationa (GSH) a partir da N-acetilcisteína (NAC). ... 73
Figura 12 - Representação do delineamento experimental referente ao protocolo 1. ... 80
Figura 13 - Representação do delineamento experimental referente ao protocolo 2, para os animais avaliados com 21 dias de vida. ... 89
Figura 14 - Representação do delineamento experimental referente ao protocolo 2, para os animais avaliados com 40 dias de vida. ... 89
Figura 15 - Efeito da administração crônica pós-natal de AG e NAC no tempo gasto para consumir o primeiro pellet de floco de milho no teste do Labirinto radial de 8 braços (Primeira latência). ... 94
Figura 16 - Efeitos da administração crônica pós-natal de AG e NAC sobre tempo necessário para consumir 4 pellets de flocos de milho no teste do Labirinto radial de 8 braços (Tempo total). ... 95
Figura 17 - Efeitos da administração crônica pós-natal de AG e NAC sobre a latência de escape no labirinto aquático de Morris, versão memória de procedimento. ... 96
Figura 18 - Efeito da administração crônica pós-natal de AG e NAC sobre a imunorreatividade de GFAP no estriado de ratos jovens. ... 97
Figura 19 - Efeito da administração crônica pós-natal de AG e NAC sobre a imunorreatividade de Iba-1 e concentração de citocinas no estriado de ratos jovens. ... 98
Figura 20 - Efeito da administração crônica pós-natal de AG e NAC sobre marcadores de dano oxidativo no estriado de ratos jovens. ... 99 Figura 21 - Efeito da administração crônica pós-natal de AG e NAC sobre atividade de SOD (a) e CAT (b) e conteúdo de NPSH (c) no estriado de ratos jovens. ... 100 Figura 22 - Efeito da administração crônica pós-natal de AG e NAC sobre marcadores colinérgicos no estriado de ratos jovens. ... 101 Figura 23 - Efeito da administração crônica pós-natal de AG e NAC sobre marcadores apoptóticos e imunorreatividade de NeuN no estriado de ratos jovens. ... 102 Figura 24 - Efeito dos tratamentos sobre o peso corporal dos animais.103 Figura 25 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC no tempo gasto para consumir o primeiro
pellet de floco de milho no Labirinto Radial de 8 Braços (Primeira
Latência) em camundongos com 21 dias de vida. ... 104 Figura 26 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC no tempo gasto para consumir o primeiro pellet de floco de milho no Labirinto Radial de 8 Braços (Primeira Latência) em camundongos com 40 dias de vida. ... 105 Figura 27 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC no tempo necessário para consumir 4 pellets de flocos de milho no teste do Labirinto radial de 8 braços (Tempo total) em camundongos com 21 dias de vida. ... 106 Figura 28 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC no tempo necessário para consumir 4 pellets de flocos de milho no teste do Labirinto radial de 8 braços (Tempo total) em camundongos com 40 dias de vida. ... 107 Figura 29 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC no número de erros de memória de trabalho no Labirinto radial de 8 braços de camundongos com 21 (a) e 40 (b) dias de vida. ... 108 Figura 30 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre o desempenho de camundongos com 21 (a) e 40 (b) dias de vida no labirinto aquático de Morris, versão memória de procedimento. ... 109 Figura 31 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre a imunoreatividade de GFAP e Iba-1 no estriado (a, c) e córtex (b, d) de camundongos com 21 dias de vida. ... 110
Figura 32 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre a imunoreatividade de GFAP e Iba-1 no estriado (a, c) e córtex (b, d) de camundongos com 40 dias de vida. ... 111 Figura 33 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre a imunoreatividade de 4-HNE no estriado e córtex de camundongos com 21 (a, b) e 40 (c, d) dias de vida. ... 112 Figura 34 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre a concentração de NGF e a imunoreatividade de p75NTR no estriado (a, c) e córtex (b, d) de camundongos com 21 dias de vida. ... 114 Figura 35 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre a concentração de NGF e a imunoreatividade de p75NTR no estriado (a, c) e córtex (b, d) de camundongos com 40 dias de vida. ... 115 Figura 36 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre a imunoreatividade de PARP e da Bcl-2 no estriado (a, c) e córtex (b, d) de camundongos com Bcl-21 dias de vida. ... 116 Figura 37 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre a imunoreatividade de PARP e da Bcl-2 no estriado (a, c) e córtex (b, d) de camundongos com 40 dias de vida. ... 117 Figura 38 - Efeito da administração aguda pós-natal de AG e do tratamento crônico com NAC sobre a imunoreatividade de NeuN no estriado e no córtex de camundongos com 21 (a, b) e 40 (c, d) dias de vida. ... 118 Figura 39 - Figura representativa dos efeitos protetores da NAC contra a neurotoxicidade estriatal e o prejuízo de aprendizagem induzido pela exposição crônica ao AG. ... 133 Figura 40 - Figura representativa dos efeitos protetores da NAC contra a neurotoxicidade estriatal e o prejuízo de aprendizagem induzido pela exposição crônica ao AG. ... 135
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Mecanismos de ação da NAC em diferentes transtornos neurológicos. ... 71 Tabela 2 - Efeitos da administração crônica de AG e NAC no número de erros de memória de trabalho de ratos jovens no teste do Labirinto Radial de 8 braços. ... 95
LISTA DE ABREVIATUDAS E SIGLAS 3-OH-AG Ácido 3-hidroxiglutárico
4-HNE 4-hidroxinonenal
ACh Acetilcolina
AChE Acetilcolinesterase
AG Ácido glutárico
AG-I Acidemia Glutárico do tipo I
Apaf-1 Fator de ativação da protease apoptótica-1 ATP Trifosfato de adenina
Bcl-2 Proteína linfoma de células B2 BHE Barreira hematoencefálica BSA Albumina de soro bovino C5DC glutaril carnitina
CAT Catalase
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais CFS Soro fetal bovino
ChAT Colina acetiltransferase ChI Interneurônios colinérgicos
DA Dopamina
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético EIM Erro inato do metabolismo
ELISA Ensaio de Imunoabsorção Ligado à Enzima ERN Espécie reativa de nitrogênio
ERO Espécie reativa de oxigênio GABA Ácido -aminobutírico GCDH Glutaril-CoA desidrogenase GFAP Proteína ácida fibrilar glial GPx Glutationa peroxidase GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peróxido de hidrogênio
i.p. Intraperitoneal
Iba-1 Molécula adaptadora ligante de cálcio ionizado-1 IL-1α Interleucina-1alfa
IL-1β Interleucina-1beta
iNOS Óxido nítrico sintase induzível JNK c-Jun quinase N-terminal LAM Labirinto aquático de Morris LPO Peroxidação lipídica
LPS Lipopolissacarídeo
LTP Potenciação de longa duração mAChR Receptor colinérgico muscarínico
MDA Malondialdeído
MSN Neurônios espinhos médios NAC N-acetilcisteína
nAChR Receptor colinérgico nicotínico
NeuN Neurônio maduro
NF-κB Fator nuclear kappa B
NGF Fator de crescimento do nervo
NMDA N-metil D-Aspartato
Nrf2 Fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2
O2- Radical superóxido
-OH Radical hidroxil
p75NTR Receptor de neurotrofinas p75 PARP-1 Poli (ADP-ribose) polimerase-1 PMSF Fenilmetilsulfonilfluoreto proNGF Precursor do NGF
RL Radical livre
s.c. Subcutâneo
SNC Sistema nervoso central SOD Superóxido dismutase
TBARS Espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa
TrKA Receptor do tipo tirosina-cinase A
v.o. Via oral
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 31 1.1 ERROS INATOS DO METABOLISMO ... 31 1.2 ACIDEMIAS ORGÂNICAS ... 32 1.3 ACIDEMIA GLUTÁRICA TIPO I (AG-I) ... 33 1.3.1 Definição e prevalência ... 33 1.3.2 Achados neuropatológicos ... 36 1.3.2 Fisiopatologia ... 36 1.3.3 Diagnóstico ... 41 1.3.5 Tratamento ... 44 1.4 DANOS COGNITIVOS NA AG-I ... 45 1.5 MARCADORES OXIDATIVOS E INFLAMATÓRIOS NA AG-I 47 1.5.1 Estresse oxidativo e AG-I ... 47 1.5.2 Marcadores inflamatórios e AG-I ... 50 1.6 MODELOS ANIMAIS DE AG-I ... 52 1.7 ESTRIADO E MEMÓRIA ... 53 1.7.1 Sistema colinérgico e memória estriatal ... 58 1.8 CÉLULAS GLIAIS ... 62 1.8.1 Células gliais e memória ... 64 1.8.2 Células gliais e neuroinflamação ... 65 1.9 VIAS DE MORTE NEURONAL ... 66 1.10 N-ACETILCISTEÍNA (NAC) E MEMÓRIA ... 70 2. JUSTIFICATIVA ... 75 3. OBJETIVOS ... 77 3.1 OBJETIVO GERAL ... 77 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 77 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 79 4.1 ANIMAIS ... 79 4.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ... 79 4.2.1 Protocolo 1 ... 79 4.2.1.1 Injeção crônica de AG ... 80 4.2.1.2 Administração de NAC ... 80 4.2.1.3 Labirinto radial de 8 braços ... 81 4.2.1.4 Labirinto aquático de Morris (LAM) ... 82
4.2.1.5 Imunoensaio de IL-1β e TNF-α ... 83 4.2.1.6 Mensuração do conteúdo de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) ... 83 4.2.1.7 Mensuração de proteína carbonilada ... 84 4.2.1.8 Ensaio de NOx (NO2 e NO3) como um marcador da síntese de óxido nítrico ... 84 4.2.1.9 Determinação da atividade da SOD ... 84 4.2.1.10 Determinação da atividade da CAT ... 85 4.2.1.11 Determinação de Tióis não proteicos ... 85 4.2.1.12 Western Blotting ... 85 4.2.1.13 Atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) ... 86 4.2.1.14 Isolamento e cultura de células para determinação de caspases 1, 3 e 8 ... 86 4.2.1.15 Determinação do conteúdo de proteína ... 87 4.2.1.16 Análise estatística ... 87 4.2.2 Protocolo 2 ... 87 4.2.2.1 Injeção de AG... 87 4.2.2.2 Administração de NAC ... 88 4.2.2.3 Labirinto Radial de 8 braços ... 88 4.2.2.4 Labirinto aquático de Morris (LAM) ... 90 4.2.2.5 Imunoensaio de NGF-β ... 90 4.2.2.6 Western Blotting ... 90 4.2.2.7 Determinação do conteúdo de proteína ... 91 4.2.2.8 Análise estatística ... 91 5. RESULTADOS ... 93
5.1 PROTOCOLO 1: ENVOLVIMENTO DO SISTEMA
COLINÉRGICO E DAS CÉLULAS GLIAIS NO ATRASO DE APRENDIZAGEM INDUZIDO POR INJEÇÃO CRÔNICO DE AG E A NEUROPROTEÇÃO PELA NAC ... 93 5.1.1 Efeito da injeção crônica de AG sobre a memória de procedimento e a memória de trabalho... 93 5.1.2 Efeito da injeção crônica de AG sobre células astrocitárias estriatais ... 96 5.1.3 Efeito da injeção crônica de AG sobre parâmetros inflamatórios ... 97 5.1.4 Efeito da injeção crônica de AG sobre o sistema oxidativo ... 98
5.1.5 Efeito da injeção crônica de AG sobre parâmetros do sistema colinérgico ... 100 5.1.6 Efeito da injeção crônica de AG sobre biomarcadores apoptóticos e neuronais ... 101 5.2 PROTOCOLO 2: MORTE NEURONAL APÓS CRISE ENCEFALOPÁTICA INDUZA POR INJEÇÃO AGUDA DE AG É DEPENDENTE ... 102 5.2.1 Efeito a longo prazo da injeção aguda de AG sobre a memória de procedimentos e a memória de trabalho ... 102 5.2.2 Efeito a longo prazo da injeção aguda de AG sobre células microgliais e astrocitárias ... 109 5.2.3 Efeito a longo prazo da injeção aguda de AG sobre o dano oxidativo ... 111 5.2.4 Efeito a longo prazo da injeção aguda de AG sobre a concentração de NGF e o conteúdo de p75NTR ... 113 5.2.5 Efeito a longo prazo da injeção aguda de AG sobre proteínas envolvidas na apoptose ... 115 5.2.6 Efeito a longo prazo da injeção aguda de AG sobre neurônios maduros ... 117 6. DISCUSSÃO ... 119 7. CONCLUSÕES ... 133 8. REFERÊNCIAS ... 137 ANEXOS ... 167 ANEXO 1 - CARTA DE ACEITE DO ARTIGO CIENTÍFICO 1 NO PERIÓDICO MOLECULAR NEUROBIOLOGY ... 168 ANEXO 2 - ARTIGO CIENTÍFICO 2 ... 184
1. INTRODUÇÃO
1.1 ERROS INATOS DO METABOLISMO
Os erros inatos do metabolismo (EIM) são um grupo de doenças geneticamente determinadas baseadas na deficiência enzimática em alguma via metabólica que está envolvida na síntese (anabolismo) ou degradação (catabolismo) de uma substância. Esse grupo de doenças também pode ser caracterizados por uma deficiência em transportadores, resultando no acúmulo de substratos em determinados compartimentos celulares (ILLSINGER; DAS, 2010). Em consequência desse bloqueio metabólico, há o acúmulo de substratos e a falta de produtos da reação enzimática envolvida. Pode ocorrer também acúmulo de precursores tóxicos com formação de rotas metabólicas alternativas, e deficiência de substâncias essenciais no organismo, podendo gerar distúrbios no desenvolvimento físico e mental (OBERHOLZER et al., 1967).
No início do século XX, o médico britânico Archibald Edward Garrod (1857-1936) empregou pela primeira vez o termo EIM para relatar situações clínicas as quais ele acreditou serem consequências de defeitos em vias metabólicas. A primeira doença estudada foi a alcaptonúria, que é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo do ácido homogentísico, e, clinicamente, por artrite aguda (SCRIVER, 2008). A partir de então, foi sendo estudado e descobrindo outros distúrbios metabólicos.
Hoje, os EIMs são chamados também de doenças metabólicas congênitas ou doenças metabólicas hereditárias. Quando, observadas individualmente são consideradas raras, mas, se analisadas coletivamente, são numerosas (SAHOO et al., 2012). Com os avanços nos estudos genéticos e técnicas de diagnóstico, já foram catalogados mais de 700 EIMs (ILLSINGER; DAS, 2010).
A maioria dos EIMs são doenças associadas a um único gene, e podem ser classificados em três grupos principais: (1) doenças que dão origem à intoxicação através do acúmulo de compostos intracelulares ao longo do tempo; (2) doenças envolvendo o metabolismo energético; e (3) doenças envolvendo o metabolismo de moléculas complexas. As doenças que causam intoxicação aguda ou crônica englobam as acidemias orgânicas como a acidemia metilmalônica, propiônica, isovalérica e glutárica (SAHOO et al., 2012).
Os EIM afetam aproximadamente 1 a cada 800 recém nascidos vivos (SAHOO et al., 2012), e, juntos, representam um importante problema de saúde e seu diagnóstico, frequentemente, se constitui em desafio para o clínico.
1.2 ACIDEMIAS ORGÂNICAS
As acidemias orgânicas constituem um grupo de EIM e são caracterizadas pelo acúmulo de um ou mais ácidos orgânicos nos líquidos biológicos e tecidos dos pacientes afetados, ocasionado pela deficiência, total ou parcial, da atividade de alguma enzima envolvida no metabolismo de aminoácidos, lipídeos ou carboidratos (CHALMERS; LAWSON, 1982). As acidemias orgânicas são os EIM mais frequentes na população (GOODMAN; FRERMAM, 2001; WAJNER et al., 2001). Um subgrupo das acidemias orgânicas, que apresentam manifestações predominantemente neurológicas, tem sido classificado como doenças de ácidos orgânicos ‘‘cerebrais’’. Dentro desse subgrupo, encontra-se a Acidemia Glutárica do tipo I (AG-I) (HOFFMANN et al., 1994).
Os sintomas neurológicos apresentados pelas crianças com acidemias orgânicas são frequentemente manifestados durante crises agudas precipitadas por estresse catabólico. Durante essas circunstâncias, há ocorrência de um déficit energético, com consequente mobilização dos estoques de carboidratos, ácidos graxos e proteínas. No entanto, devido ao bloqueio na rota metabólica de degradação dessas moléculas, ácidos orgânicos e outros compostos são acumulados. Nesse contexto, tem sido sugerido que alguns desses metabólitos podem agir como toxinas endógenas e tornarem-se neurotóxicos (KÖLKER et al., 2004; OLIVERA-BRAVO et al., 2011). Muitas crianças afetadas com acidemias orgânicas sofrem de crises epilépticas, atraso no desenvolvimento psicomotor e intelectual (JAMIOLKOWSKI et al., 2015).
O quadro laboratorial nas acidemias orgânicas é caraterizado por acidose, cetose, hiperamonemia, hipoglicemia e neutropenia. Para o diagnóstico, geralmente são analisados os ácidos orgânicos na urina através de cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG/MS). De modo geral, o tratamento baseia-se na restrição dietética das substâncias precursoras dos ácidos orgânicos acumulados. No entanto, esta linha de tratamento deve ser usada de forma cautelosa, uma vez que pode ser considerada uma dupla ameaça, pois a redução do acúmulo das toxinas nos tecidos sempre acarreta o risco de privação seletiva, principalmente, de aminoácidos (STRAUSS et al., 2011).
A frequência destas doenças na população em geral é pouco conhecida, podendo ser devido à falta de laboratórios especializados para o seu diagnóstico e ao desconhecimento médico sobre essas enfermidades. Na Holanda, país considerado referência no diagnóstico dos erros inatos do metabolismo, a incidência é estimada em 1: 2.200 recém-nascidos, enquanto que, na Alemanha, Israel e Inglaterra é aproximadamente 1:
6.000 – 1: 9.000 recém nascidos (HOFFMANN et al., 2004). Em países que possuem uma taxa de consanguinidade elevada, como na Arábia Saudita, a frequência de acidemias orgânicas é de 1: 740 nascidos vivos (RASHED et al., 1994).
As acidemias orgânicas mais comum são: acidemia metilmalônica (deficiência da metilmalonil-CoA mutase, uma enzima dependente de vitamina B12), acidemia isovalérica (deficiência da isovaleril-CoA desidrogenase), acidemia propiônica (deficiência na propionil-CoA carboxilase) e a acidemia glutárica tipo I (deficiência na glutaril-CoA desidrogenase) (SAUDUBRAY; SEDEL; WALTER, 2006).
1.3 ACIDEMIA GLUTÁRICA TIPO I (AG-I) 1.3.1 Definição e prevalência
A acidemia glutárica do tipo I (AG – I; OMIM # 231670) é um EIM autossômico recessivo, descrito pela primeira vez em 1975 por Goodman e colaboradores. Nesta acidemia orgânica, há deficiência, total ou parcial, da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH; EC 1.3.99.7) a qual está envolvida no catabolismo dos aminoácidos lisina, hidroxilisa e L-triptofano (GOODMAN; FRERMAN, 2001).
O gene da GCDH está localizado no cromossomo 19p 13.2 e codifica um polipetídeo de 438 aminoácidos que sofre uma clivagem na porção N-terminal, na qual são retirados 44 aminoácidos formando uma proteína madura dentro da matriz mitocondrial (GOODMAN et al., 1998). Atualmente, cerca de 200 mutações diferentes da GCDH já foram diagnosticadas em pacientes com AG-I (HEDLUND; LONGO; PASQUALI, 2006) e, apesar do conhecimento de diferentes mutações, não há correlação entre o genótipo, a atividade enzimática e a intensidade dos sintomas apresentados pelos pacientes (GOODMAN et al., 1998; KÖLKER et al., 2006; WAHAB et al., 2016; PIRZADEH et al., 2017).
A GCDH está localizada na matriz mitocondrial e catalisa a descarboxilação oxidativa do glutaril-CoA a crotonil-CoA e CO2 na proporção 1:1:1, transferindo os elétrons para a cadeia respiratória via flavoproteína transferidora de elétrons (FADH2) (LENICH; GOODMAN, 1986). Essa reação possui duas etapas: a desidrogenação de glutaril-CoA a glutaconil-CoA e a descarboxilação de glutaconil-CoA a crotonil-CoA, conforme mostrado na figura 1 (HÄRTEl et al., 1993). Em indivíduos com AG-I, tanto a desidrogenação do glutaril-CoA como a descarboxilação do glutaconil-CoA estão bloqueadas (CHRISTENSEN, 1993; LIESERT et al., 1999).
Com o prejuízo na atividade enzimática da GCDH, o catabolismo da L-lisina, L-hidroxilisina e L-triptofano ficam comprometidos, levando ao acúmulo de ácido glutárico (AG), 3-hidroxiglutárico (3-OH-AG) e ácido glutacônico nos tecidos e líquidos biológicos (plasma, urina e líquor) dos pacientes com AG-I (GOODMAN et al., 2001; Figura 1). No plasma, as concentrações desses ácidos variam de 4 a 500 μmol/L (HOFFMANN et al., 1996), mas no cérebro, as concentrações podem ser bem mais elevadas, variando entre 500 a 5000 μmol/L para o AG e entre 40 a 200 μmol/L para o 3-OH-AG (SAUER et al., 2006). Essas diferenças de concentrações do AG e do 3-OH-AG no sangue e no cérebro, podem ser explicadas pelo fato de que estes ácidos orgânicos são majoritariamente produzidos nas células neurais e a barreira hematoencefálica (BHE) é pouco permeável a eles. Além disso, o sistema de detoxificação destes ácidos através da conjugação a carnitina e a glicina, formando glutaril-carnitina e glutarilglicina é de baixa capacidade, levando ao acúmulo dessas substâncias no sistema nervoso central (SNC), o que se constitui em um fator de risco para a neurodegeneração característica dos pacientes afetados (KÖLKER et al., 2006; SAUER et al., 2006; 2011).
Figura 1 - Deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH).
Legenda: Com o prejuízo na atividade glutaril-CoA desidrogenase (GCDH), enzima responsável pelo catabolismo de lisina, hidroxilisina e triptofano, há acúmulo de ácido glutárico, ácido glutacônico e ácido 3-hidroxiglutárico (Modificado de Pasquetti, 2014).
A incidência mundial da AG-I é estimada em 1:106.00 nascidos-vivos (LINDNER et al., 2004; BONEH et al., 2008). A doença é muito frequente, 1:250, entre certos grupos étnicos aos quais a taxa de consanguinidade é elevada, tais como a comunidade Ordem Amish da Pensilvânia (MORTON et al., 1991) e o norte americano, Ojibway no Canadá (GREENBERG et al., 1995). No Brasil, ainda não há estudos epidemiológicos acerca da AG-I que abranjam todo território nacional. Somente um estudo realizado na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, o qual demonstrou a prevalência de acidemias orgânicas em pacientes brasileiros que apresentavam suspeitas de distúrbios do metabolismo. Nesse estudo, foram analisados 1.480 crianças suspeitas, investigadas entre os anos de 1994 e 2000. Desses, 73 (4,9%) foram diagnosticadas com acidemias orgânicas, sendo que dentre eles, 9 foram detectados com AG-I (WAJNER et al., 2001).
1.3.2 Achados clínicos
Os pacientes com AG-I apresentam sinais e sintomas predominantemente neurológicos, como convulsão, discinesia e distonia. No entanto, as manifestações clínicas podem variar consideravelmente entre os pacientes afetados.
Nos primeiros meses de vida, os sinais da doença são inespecíficos, incluindo hipotonia, irritabilidade e macrocefalia, sendo que a maioria dos pacientes não apresenta manifestações clínicas iniciais além da macrocefalia (HEDLUND; LONGO; PASQUALI, 2006). Em geral, os sintomas específicos da AG-I aparecem nos primeiros 36 meses de vida, podendo iniciar de modo gradual e progressivo, ou se manifestar subitamente durante um estado catabólico com uma crise encefalopática aguda. Dentre esses sintomas específicos observa-se progressiva distonia e discinesia, disfunção na fala, comprometimento motor e também vários graus de deficiência intelectual e problemas comportamentais (NAUGHTEN et al., 2004; PATIL et al., 2004; BROWN et al., 2015). Acredita-se que danos neuropatológicos como atrofia estriatal bilateral e atrofia cortical progressiva estejam subjacentes a estes prejuízos funcionais (MORTON et al., 1991; HOFFMANN; ZSCHOCKE, 1999; KYLLERMAN et al. 2004).
Alguns pacientes desenvolvem-se normalmente até o aparecimento das crises encefalopáticas, que podem ser precipitadas por processos infecciosos como doenças febris, imunizações rotineiras ou por cirurgias, situações nas quais o paciente se encontra em elevado catabolismo e, assim, com aumentada taxa de metabolização de proteínas e consequentemente de aminoácidos, resultando no acúmulo de AG, 3-OH-AG, ácido glutacônico e glutarilcarnitina no SNC (HOFFMANN et
al., 1995; JAFARI et al., 2011). Durante a crise encefalopática, as crianças muitas vezes perdem funções neurológicas, como a capacidade de se sentar, controle da cabeça ou os reflexos de sucção e deglutição (HOFFMANN et al., 1996; JAFARI et al., 2011). Curiosamente, as chances de desenvolver crises são reduzidas após os 6 anos de idade, indicando determinada vulnerabilidade em um período de desenvolvimento neurológico (HOFFMANN et al., 1995; BJUGSTAD et al., 2000). Além disso, em alguns pacientes as manifestações neurológicas também podem se desenvolver sem aparente crise encefalopática (BOY et al., 2016). Alguns estudos demonstram que danos no sistema nervoso periférico (apresentado como neuropatia periférica) e dano renal também podem estar envolvidos no curso da doença a longo prazo (HERSKOVITZ et al., 2013; KOLKER et al., 2015).
Em paralelo às manifestações clínicas, os pacientes apresentam um quadro laboratorial que se caracteriza, principalmente, por acidose metabólica, hipercetonemia, hiperamonemia, hipoglicemia, neutropenia e trombocitopenia (GOODMAN; FRERMAN, 2001).
1.3.2 Achados neuropatológicos
Patologicamente, a AG-I é caracterizada principalmente por degeneração bilateral estriatal (caudado e putâmen), fibrose dos núcleos da base e degeneração do globo pálido (GOODMAN et al., 1977; FUNK et al., 2005). Geralmente, esta perda de neurônios estriatais ocorre logo após as crises encefalopáticas, principalmente nos primeiros 36 meses de idade (FUNK et al., 2005; HOFFMANN; ZSCHOCKE, 1999). Mas, os danos neuropatológicos também podem ocorrer mesmo na ausência das crises encefalopáticas devido à neurotoxicidade intrauterina ou no início da vida, e isso pode estar associado ao atraso na mielinização e na maturação cerebral (HARTING et al. 2009; BOY et al., 2017).
Além destes achados, os pacientes com AG-I também apresentam atrofia frontotemporal cortical observada ao nascimento, formação espongiforme e redução de substância branca (leucoenfalopatia progressiva) (KYLLERMAN et al., 1994). Frequentemente, os pacientes apresentam um alargamento dos espaços subaracnóides que, devido à alta irrigação sanguínea, os tornam suscetíveis a hemorragias agudas (DRIGO et al., 1996; HOFFMANN; ZSCHOCKE, 1999).
1.3.3 Fisiopatologia
compreensão dos mecanismos pelos quais o AG é neurotóxico ainda é parcial (GOODMAN; FRERMAN, 2001; JAFARI et al., 2011).
Em 1976, Stokke e colaboradores realizaram o primeiro estudo com o intuito de explicar a fisiopatologia da AG-I. Esse trabalho demonstrou uma inibição competitiva sobre a glutamato descarboxilase, enzima que catalisa a conversão do glutamato a ácido -aminobutírico (GABA), na presença de AG, 3-OH-AG e ácido glutacônico, sugerindo assim, que um desequilíbrio na produção de GABA poderia estar envolvido na patogênese da AG-I. Nesse contexto, estudos mostraram que as convulsões induzidas pela injeção intraestriatal de AG (FIGHERA et al., 2006; MAGNI et al., 2011) e 3-OH-AG (DE MELLO et al., 2001) são prevenidas por muscimol, um agonista de receptores GABAA. Apesar disso, concentrações reduzidas de GABA no estriado foram encontradas somente em um único paciente com AG-I (LEIBEL et al., 1980). No entanto, mais recentemente, Pasquetti e colaboradores (2017) mostraram aumento da hiperexcitabilidade e diminuição na transmissão sináptica GABAérgica em neurônios corticais de camundongos Knockout para o gene da GCDH (Gcdh-/-) e submetidos a uma dieta rica em lisina. Tais alterações foram associadas ao aparecimento espontâneo de crises convulsivas, mostrando provável prejuízo no sistema GABAérgico nestes animais.
Nas últimas décadas, as pesquisas vem apontando três mecanismos principais para a fisiopatologia do dano cerebral na AG-I. São eles: prejuízos no metabolismo energético (ULLRICH et al., 1999; FERREIRA et al., 2005; LATINI et al., 2005), a presença de estresse oxidativo (LATINI et al., 2002; 2005; MARQUES et al., 2003; FIGHERA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2013) e a excitotoxicidade (DE MELLO et al., 2001; ROSA et al., 2007; LAGRANHA et al., 2014; PASQUETTI et al., 2017), os quais podem desencadear a morte neuronal tardia.
Em relação ao metabolismo energético, Silva e colaboradores (2000) mostraram que o AG inibe os complexos I-III e II-III da cadeia respiratória, diminui a produção de CO2 e os níveis de ATP em córtex cerebral de ratos. Além disso, foi demonstrado uma inibição dos complexos I-III, II, II-III em músculos esqueléticos e cérebros de ratos tratados de forma aguda e crônica com AG (FERREIRA et al., 2005). Resultados semelhantes foram descritos também in vitro, além da demonstração da inibição da enzima creatina cinase em cérebro de ratos (FERREIRA et al., 2008). No que diz respeito ao 3-OH-AG, estudos mostram que este metabólito induz uma moderada inibição dos complexos II e IV da cadeia respiratória, reduz significativamente os níveis de fosfocreatina em culturas de neurônios de ratos (ULLRICH et
al., 1999; DAS et al., 2003) e em homogeneizados de córtex cerebral e células C6 de glioma de ratos (LATINI et al., 2005). No entanto, um estudo em culturas neuronais de telencéfalos de embriões de pinto mostrou uma pequena inibição do complexo C somente em altas concentrações de 3-OH-AG (10 mM) sem nenhuma alteração dos outros complexos da cadeira respiratória (KOLKER et al., 2002). Sendo assim, tem sido sugerido que, principalmente, o AG pode causar interferência no metabolismo energético celular, levando provavelmente a uma redução na produção de ATP.
Também tem sido mostrado aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs) e a redução das defesas antioxidantes no cérebro de ratos com neurotoxicidade induzida por AG ou 3-OH-AG (LATINI et al., 2002; 2005; 2007; MARQUES et al., 2003; FIGHERA et al., 2006). Assim, foi evidenciado que o 3-OH-AG causou aumento na lipoperoxidação, na produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio, bem como levou a diminuição das defesas antioxidantes no córtex cerebral e estriado de ratos (LATINI et al., 2002, 2005). Quanto ao AG, foi demonstrado que causa aumento na produção de espécies reativas e reduz as defesas antioxidantes em cérebro de ratos (MARQUES et al., 2003), como também aumenta o conteúdo de proteína carbonil e a peroxidação lipídica no estriado e hipocampo de ratos (FIGHERA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2013). Latini e colaboradores (2007) verificaram que tanto administração aguda quando crônica de AG aumentou a peroxidação lipídica e diminuiu as defesas antioxidantes em diferentes estruturas cerebrais, no fígado e nos eritrócitos de ratos. De acordo, Magni e colaboradores (2012) mostraram que a exposição aguda ao AG causou aumento na geração de espécies reativas e redução na enzima glutationa peroxidase (GPx) e glutationa-S-transferase (GST) no estriado, mas que o uso de disseleneto de m-trifluorometil difenilo, (m-CF3-C6H4Se) 2, um composto de organoselênio com ação antioxidante, preveniu esses efeitos no estriado. Além disso, foi observada uma redução nas concentrações de glutationa reduzida (GSH) cerebral e hepática em camundongos Gcdh-/- (SAUER et al., 2005). A partir desses achados, vem sendo sugerido que o AG pode causar interferência no metabolismo oxidativo celular, levando provavelmente a uma redução nas defesas antioxidantes e/ou um aumento na produção de espécies reativas.
Além da interferência no metabolismo oxidativo, estudos mostraram que o AG e o 3-OH-AG possuem similaridade estrutural com o glutamato (HOFFMANN; ZSCHOCKE, 1999; WAJNER et al., 2004; GOODMAN, 2004; Figura 2), dessa maneira estudos sugerem que a
neurotoxicidade desta acidemia seria pela interação desses ácidos orgânicos com receptores e transportadores de glutamato.
Figura 2 - Similaridade estrutural entre glutamato, ácido glutárico e ácido 3-hidroxiglutárico.
No entanto, Ullrich e colaboradores (1999), utilizando estudos eletrofisiológicos em diferentes sistemas celulares não encontraram evidências de que o 3-OH-AG liga-se a receptores N-metil D-Aspartato (NMDA), sugerindo que um déficit no metabolismo energético poderia explicar de modo indireto a ativação desses receptores. No entanto, também foi mostrado que a pré-incubação de culturas de neurônios com antagonistas específicos de receptores NMDA, bem como a pré-administração desses antagonistas in vivo reduziram ou até mesmo preveniram o dano celular provocado pelo 3-OH-AG (DE MELLO et al., 2001). Sendo assim, considerando que os receptores NMDA são predominantemente expressos no cérebro imaturo (McDONALD; SILVERSTEIN; JOHNSTON, 1988) e que a ocorrência do dano neuronal depende do modelo em estudo, sugere-se a existência de uma dependência da distribuição regional e do período de desenvolvimento na suscetibilidade dos neurônios à toxicidade do 3-OH-AG (ULLRICH et al., 1999; GOODMAN, 2004).
Quanto ao AG, foi demonstrado que esse metabólito inibe a captação e a ligação do L-[3H]glutamato a seus transportadores em sinaptossomas de cérebro de ratos (MAGNI et al., 2007; 2009), aumentando assim o risco para hiperestimulação devido à elevação na concentração de glutamato na fenda sináptica. Também foi demonstrado que o AG reduz a captação de L-[3H]glutamato em vesículas sinápticas, além de interagir com receptores glutamatérgicos metabotrópicos e ionotrópicos do tipo AMPA (não-NMDA) em cérebro de ratos (PORCIÚNCULA et al., 2004). Entretanto, Kolker e colaboradores (2000) não encontraram evidências de que o AG possa interagir com receptores do tipo não-NMDA e relacionam seus efeitos tóxicos a receptores NMDA. Além da perturbação no metabolismo oxidativo e da L-GLUTAMATO L-GLUTARATO L-3-HIDROXIGLUTARATO
excitotoxicidade glutamatérgica, recentes achados também mostram a participação dos astrócitos na mediação da neurodegeneração observada na AG-I (OLIVERA et al., 2008; 2011; OLIVERA-BRAVO; BARBEITO, 2015; Figura 3). Os autores observaram que tanto o AG como o 3-OH-AG induziram a proliferação de astrócitos e causaram despolarização mitocondrial em culturas de astrócitos. Ainda, verificaram que uma injeção in vivo de AG induziu a proliferação de células astrocitárias, principalmente na forma imatura, culminando em uma diminuição no aporte astrocitário para neurotransmissão e sobrevivência neuronal, o que resultou em morte celular tardia dos neurônios estriatais dos animais. Além disso, esses mesmos autores observaram que a administração de antioxidantes preveniu a disfunção mitocondrial e o aumento da proliferação astrocitária in vitro e in vivo, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo na indução da astrocitose. Assim, esses resultados sugerem que a disfunção mitocondrial induzida pelos metabólitos da AG-I leva os astrócitos a adotar um fenótipo proliferativo disfuncional, o que pode ser fundamental para a perda neuronal e as alterações na estrutura cerebral encontradas na AG-I.
Figura 3 - Efeitos citotóxicos do AG nos astrócitos.
Legenda: O acúmulo de AG e 3-OH-AG na mitocôndria astrocitária causa disfunção mitocondrial associada ao estresse oxidativo e a ativação de cascatas
mitogênicas, os quais levam a proliferação celular e características fenotípicas de astrócitos indiferenciados expressando baixos níveis de GFAP. Cascatas inflamatórias também são ativadas. AG: ácido glutárico; OHAG: ácido 3-hidroxiglutárico; GCDH: glutaril-CoA desidrogenase; GFAP: proteína glial fibrilar ácida; Lis: lisina; pERK: cinases reguladas por sinais extracelulares fosforilados; TCA: ciclo do ácido tricarboxílico; Trp: triptofano; ROS: espécies reativas de oxigênio; RNS: espécies reativas de nitrogênio (Modificado de OLIVERA-BRAVO; BARBEITO, 2015).
Apesar da continuidade das investigações e dos sintomas apresentados pelos pacientes com AG-I, ainda não há na literatura trabalhos que busquem relacionar as alterações fisiopatológicas com o prejuízo de aprendizagem apresentado pelos pacientes, bem como ainda não está bem delimitado o mecanismo pelo qual o acúmulo dos ácidos orgânicos leva à neurotoxicidade.
1.3.4 Diagnóstico
Mesmo com o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento da AG-I, o diagnóstico precoce e o início rápido do tratamento aumentam a probabilidade do curso da doença ser assintomático. Sendo que 80-90% dos pacientes com AG-I permanecem assintomáticas se o iniciar tratamento no período neonatal antes do início dos sintomas (BONEH et al., 2008; HOFFMANN et al., 1996; KÖLKER et al., 2006, NAUGHTEN et al., 2004; STRAUSS et al., 2003a, 2003b, 2011).
Como os níveis de acilcarnitinas (C5DC) podem ser detectados em manchas de sangue seco (dried blood spots - DBS) de recém-nascidos através da espectrometria de massas em tandem (MS/MS), e a terapia precoce apresenta bons resultados, AG-I tem sido incluída nos exames de triagem neonatal em muitos países europeus (LOEBER et al. 2012; Figura 4) os quais tem provado ser uma estratégia de diagnóstico econômica (PFEIL et al., 2013).
No Brasil, infelizmente, esta avaliação ainda não é realizada na rotina dos exames de triagem neonatal (Teste do Pezinho). Dessa maneira, o início do diagnóstico só é realizado quando o paciente apresenta sinais clínicos ou achados neuroradiológicos sugestivos de AG-I. Macrocefalia progressiva de etiologia desconhecida, alterações atróficas cerebrais progressivas nos exames de imagem, principalmente nos gânglios da base, discinesia aguda ou atraso motor subagudo, acompanhado por crescente distonia estão entre os sinais e achados neuroradiológicos que indicam AG-I (ALMEIDA, 2007; BOY et al., 2016).
elevadas de AG e 3-OH-AG nos líquidos biológicos dos pacientes, especialmente a quantidade excretada pela urina (GOODMAN et al., 1977; KÖLKER et al., 2006). O diagnóstico é geralmente realizado através da detecção desses compostos e seus ésteres de glicina e carnitina na urina, por cromatografia gasosa acoplado à espectrometria de massa (KOLKER et al., 2006).
Nos casos em que os pacientes apresentam a excreção de AG pouco elevada, intermitente, ausente ou normal (HOFFMANN et al., 1996), a determinação da atividade da GCDH em fibroblastos ou leucócitos deve ser realizada sempre que houver fortes suspeitas clínicas e neuroradiológicas da doença (GOODMAN; FRERMAN, 2001).
Figura 4 - Algoritmo de diagnóstico para AG-I.
Legenda: A triagem neonatal é realizada analisando a concentração de
espectrometria de massas em tandem (MS/MS). O diagnóstico inclui análise quantitativa de AG e 3-OH-AG na urina e/ou no sangue, análise do gene e da atividade da GCDH. O diagnóstico diferenciado devido a alterações clínicas sugestivas, sinais bioquímicos e/ou neuroradiológicos começa com análise quantitativa de AG e 3-OH-AG na urina e/ou no sangue. *Baixos excretores podem apresentar (intermitentemente) concentrações normais de AG e 3-OH-AG na urina ou no sangue. Se sinais e sintomas altamente suspeitos para AG-I estiverem presentes, outras alternativas para diagnóstico devem ser consideradas, mas a decisão deve ser tomada com base na circunstância individual. **Se os indivíduos desse grupo mostrarem sintomas clínicos sugestivos, recomenda-se a realização do diagnóstico de acordo com o diagnóstico diferenciado. Comentário sobre a mutação e análise enzimática: uma vez que a análise do gene da GCDH está mais disponível do que a análise da atividade enzimática, e que a identificação de duas mutações causadoras da doença não só confirmam o diagnóstico como também permite o aconselhamento genético preciso e diagnóstico pré-natal, recomenda-se iniciar o diagnóstico com análise genética. No entanto, dependendo da disponibilidade e experiência, a análise da atividade enzimática pode ser realizada primeiro (Adaptado de Boy et al., 2016).
Apesar da existência destes métodos de diagnóstico (Figura 4), a identificação dessa acidemia apresenta grandes dificuldades devido à falta de evidências de uma correlação entre o genótipo, parâmetros bioquímicos e as manifestações clínicas, de forma que a excreção de AG pode ser normal em pacientes que apresentam sintomas graves (GOODMAN; FRERMAN, 2001). Desse modo, todos indivíduos diagnosticados devem receber a mesma forma de tratamento (BOY et al., 2016).
1.3.5 Tratamento
Em relação à terapia, o tratamento desses pacientes consiste na restrição dietética dos aminoácidos hidroxilisina, triptofano e principalmente lisina (KOLKER et al., 2006; BOY et al., 2016). Além da diminuição do consumo de lisina, os pacientes com AG-I recebem uma mistura de aminoácidos com reduzido conteúdo de triptofano e livre de lisina, a fim de fornecer suprimento adequado de aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais. Essa suplementação com aminoácidos segue recomendações dietéticas, considerando as necessidades, idade dependente, de uma criança em crescimento, e foram desenvolvidas por organizações internacionais como a Organização Mundial de Saúde (OMS) e as Sociedades de Nutrição da Alemanha, Áustria e Suíça (D-A-CH).
Concomitante à terapia nutricional (dieta livre lisina e suplementação com mistura de aminoácidos), é utilizada a suplementação
com L-carnitina e riboflavina a fim de ajudar da detoxificação do AG, formando glutaril-carnitina, e facilitando a atividade residual da GCDH, respectivamente (STRAUSS et al., 2003; KYLLERMAN et al., 1994; BOY et al., 2016). A L-carnitina parece contribuir para a prevenção das lesões estriatais em pacientes com diagnóstico precoce (LEE et al., 2013; STRAUSS et al., 2003b, 2011). Entretanto, a suplementação com riboflavina, apesar de ser capaz de induzir diminuição na concentração de AG e 3-OH-AG nos líquidos biológicos, sua utilização não acarreta melhora clínica aos pacientes (KOLKER et al., 2006).
Além disso, uma vez que os aminoácidos lisina e arginina compartilham um transportador cerebrovascular comum na BHE, a suplementação com arginina também é sugerida, objetivando a restrição da captação cerebral de lisina. No entanto, poucos benefícios clínicos foram observados com a implementação de altas doses de arginina via oral aos pacientes glutaricoacidêmicos (KOLKER et al., 2012; STRAUSS et al., 2011).
Também são utilizados benzodiazepínicos, toxina botulínica e anticolinérgicos para o tratamento de distúrbios do movimento, como distonia, bem como anticonvulsivantes para pacientes que apresentem convulsões recorrentes (HOFFMANN et al., 1996; BURLINA et al., 2004). No entanto, 1/3 das crianças afetadas não respondem à terapia convencional (STRAUSS; MORTON, 2003), e em casos severos de prejuízos motores e lesões estruturais, os pacientes foram submetidos a uma neurocirurgia (palidotomia), contudo os resultados foram de pobre relevância clínica (STRAUSS et al., 2003a; RAKOCEVIC et al., 2004).
Nesse sentido, novas estratégias terapêuticas estão sendo pesquisadas afim de obter resultados mais satisfatórios, com menos efeitos colaterais e que apresentem evolução no quadro clínicos além de prevenir as crises de descompensação metabólica. Além disso, ao passo que formos conhecendo mais precisamente os mecanismos envolvidos no dano cerebral dos pacientes com AG-I, melhores terapias se tornarão disponíveis.
1.4 DANOS COGNITIVOS NA AG-I
Devido as anormalidades cerebrais características frequentemente observadas na AG-I, como diminuição no volume estriatal acompanhada de atraso na mielinização, e o impacto de alterações semelhantes na substância branca observadas em outras doenças neurológicas (SCHMAHMANN et al., 2008), indivíduos com AG-I possuem maior risco para o desenvolvimento de disfunção cognitiva.
A cognição é a aquisição de informações e conhecimentos que se dá através de diferentes processos, dentre eles estão a percepção, ação, motivação, linguagem, aprendizado e memória (KANDEL et al, 2014). A memória é o processo pelo qual há a aquisição, formação, manutenção e evocação de informações, ou seja, é a capacidade que temos de armazenar informações que possam ser recuperadas e utilizadas posteriormente (LENT, 2004). Segundo Kandel; Schwartz; Jessel (1995), a aquisição de memória refere-se a reajustes em circuitos neurais já existentes devido ao contato com uma situação de nova aprendizagem. Os processos de memória envolvem mecanismos celulares e estruturas neuronais diferentes (IZQUIERDO, 2002) como hipocampo para memórias de orientação espacial, amigdala para memórias aversivas, estriado e córtex para memória de trabalho e memória de procedimentos (QUILLFELDT et al., 1996; LOVINGER, 2010).
Estudos tem relatado que crianças com AG-I apresentam alterações neurológicas relacionadas à aprendizagem (PATIL et al., 2004; BONEH et al., 2008; BEAUCHAMP et al., 2009; LEE et al., 2012). No entanto, ainda não é claro o mecanismo molecular envolvido no déficit cognitivo dessas crianças. Patil e colaboradores (2004) utilizaram testes psicoeducacionais para diagnosticar possíveis distúrbios no aprendizado de uma criança de 7 anos com AG-I. Nesses testes, a criança mostrou evidências de dislexia, disgrafia e discalculia. Os autores atribuíram esse prejuízo na aprendizagem ao elevado nível de AG detectado na urina da criança analisada. Também através de teste neuropsicológico para avaliar o desenvolvimento mental e motor de crianças de 0 a 30 meses, foi verificado que 3 crianças apresentaram atraso mental e motor, dentre 5 avaliadas e diagnosticadas com AG-I (YANG et al., 2011). Além disso, Grupta e colaboradores (2015) mostraram que de 17 pacientes glutaricoacidêmicos avaliados, 8 apresentavam atraso no desenvolvimento e/ou regressão no controle motor. Outro estudo clínico revelou uma pequena deficiência nas atividades motoras finas e diferentes níveis de anormalidades na fala em 7 pacientes com AG-I (BONEH et al., 2008). Prejuízos na fala e em habilidades motoras também foram evidenciados por Brown e colaboradores (2015) em seu estudo com 6 crianças diagnosticadas com AG-I, contudo, não foram diagnosticados prejuízos nos testes de quociente de inteligência (QI) nesses mesmos pacientes. Corroborando com este último dado, um ano depois, um estudo sobre o desenvolvimento das funções neuropsicológicas em pacientes com AG-I mostrou que esses indivíduos não apresentavam prejuízos no desempenho em tarefas de memória de trabalho visual apesar de apresentarem atrofia estriatal (BOY et al., 2015), sugerindo que outras
