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TÍTULO: AVALIAÇÃO ANTI-XANTHOMONAS CITRI SUBSP. CITRI FRENTE AOS ÓLEOS-RESINA E EXTRATOS BRUTOS HIDROALCOÓLICOS DAS FOLHAS DE COPAIFERA SPP.
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): TUANY RODARTE PIMENTA DE OLIVEIRA, THAYNÁ DE SOUZA SILVA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): CARLOS HENRIQUE GOMES MARTINS ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): DANIELLE FERNANDES DA SILVA, MOACIR ROSSI FORIM, RODRIGO CÁSSIO SOLA VENEZIANI, SÉRGIO RICARDO AMBRÓSIO
RESUMO
O cancro cítrico é considerado em todo o mundo como uma das mais importantes doenças dentre aquelas que ocorrem nas plantas cultivadas. A doença ocorre nos citros e em seus aparentados, afetando diversas variedades de importância comercial, tais como laranjas, limões, limas entre outros. Causado pelo agente patogênico Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) que é uma das espécies que mais causa doenças em plantios. São bactérias que causam lesões em plantas, podendo se tornar necróticas posteriormente. O cancro está presente em pomares de citros de várias partes do mundo, o que inclui países líderes na produção de laranja para a indústria de suco, como o Brasil e os Estados Unidos. Além da produção de frutos para suco, as exportações de frutos frescos também ficam comprometidas. Sem controle químico eficaz, a única forma aconselhada de se evitar a propagação da doença é a erradicação das plantas. Essa prática, porém, não é aceita pelos citricultores. Assim na tentativa de prevenção e tratamento de tal doença, inúmeras fontes naturais têm sido estudadas e utilizadas como matérias-primas no processo para obtenção de novos pesticidas, capazes de atuarem contra micro-organismos. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito anti-Xanthomonas citri subsp. citri “ in vitro” no modo planctônico de óleos-resina e extratos brutos hidroalcoólicos das folhas de cinco espécies de Copaifera spp. Para a avaliação da atividade antibacteriana foram utilizados os métodos de diluição em caldo visando à determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentrações Bactericidas Mínimas (CBM). Os resultados da CIM e CBM não apresentaram resultados promissores
1. INTRODUÇÃO
Os citros compreendem um grande número de espécies do gênero Citrus e entre outros gêneros afins ou ainda de alguns híbridos da família Rutaceae, podendo ser dado alguns exemplos como, laranjas, limões, tangerinas entre outros (NETO et al., 2006).
De acordo com algumas escritas chinesas, os citros vêm sendo cultivados a mais de 2000 anos a.C., (FUNDECITRUS, 2006), mas mesmo sendo uma cultura muita antiga existe alguns males que até hoje assombram os agricultores, e um deles é o cancro cítrico.
O cancro cítrico, é uma doença grave da maioria dos cultivos comerciais de frutas cítricas, é endêmico em muitas partes do mundo e tem tanto um impacto significativo nos mercados nacionais e internacionais cítricos, como no comércio, esta doença é causada pelo agente patogênico Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (GOTTWALD et al., 2007).
Xanthomonas spp. é um gênero de bactérias gram-negativas (BIRCH;PATIL,
1987) que incluem numerosas espécies fitopatogênicas, caracterizado por uma estreita gama de hospedeiros, são bactérias que se movimentam através de um único flagelo, tem como características de crescimento colônias amarelas e mucoides (SCHAAD et al., 2001).
A patogenicidade da Xcc deve-se principalmente a sua capacidade de colonização no hospedeiro e subsequente produção e secreção de enzimas e proteínas que degradam constituintes da parede celular para penetrar nas células causando danos à planta. Tais enzimas de degradação, quando em conjunto com os diversos sistemas de secreção de toxinas e proteínas de virulência presentes no patógeno, estruturas de adesão bacteriana e enzimas com capacidade de neutralizar espécies reativas de oxigênio geradas pela planta hospedeira são capazes de desenvolver a patogênese, apesar dos esforços da planta hospedeira em combater a infecção (KAZEMI-POUR et al., 2004).
A sobrevivência da Xcc nas lesões ou na superfície das frutas é a chave para usar a fruta como um caminho para a disseminação do inóculo. Xcc pode sobreviver em números elevados no interior das folhas, caule e lesões nos frutos verdes (SHIOTANI et al., 2009 , GOTTWALD et al., 2002 e SCHUBERT et al., 2001 ),
enquanto que, fora dos tecidos das plantas, a bactéria aparentemente tem a capacidade de sobrevivência muito limitada (GRAHAM et al., 2000 ).
O homem é o principal responsável pela disseminação da doença, levando as bactérias de um lugar para outro nos materiais de colheita, em veículos, máquinas e implementos, ou mesmo por meio do transporte de folhas, ramos e frutos. Na natureza a bactéria também pode ser levada pelo vento, quando associado com chuvas, caracterizando uma disseminação de curta distância. As mudas contaminadas também contribuem para disseminar o cancro cítrico, levando a bactéria de uma propriedade para outra, ou para regiões distantes atingindo cidades, estados e países até então livres da doença (NETO et al., 2006).
Na tentativa de se evitar o impacto causado pelas doenças de plantas, o controle destas é tradicionalmente dependente de métodos químicos que nem sempre são eficazes ou economicamente viáveis, além dos riscos que oferecem ao meio ambiente e ao ser humano (MONTE, 2001). Frente a esses problemas pesquisas na formulação de novos princípios ativos tem sido motivada. Compostos secundários presentes em plantas medicinais podem desempenhar funções importantes em interações planta-patógeno, através da ação antimicrobiana direta (MELLO et al., 2006; FRANZENER et al., 2007; SILVA et al., 2008). Dentre as plantas medicinais com grande potencial antibacteriano podemos destacar as copaiferas, árvores capazes de produzir óleos-resina e extratos brutos hidroalcoólicos (VEIGA JR e PINTO, 2002).
Copaiferas são árvores de grande porte, e dela ocorre a extração do óleo-resina, um material transparente, líquido, amarelo ao castanho-claro (VEIGA JR e PINTO, 2002) extraído através de três métodos. Por meio da extração tradicional, no qual uma grande abertura do tronco da árvore é realizada, o que inutiliza a planta e desperdiça grandes quantidades de óleo. Na extração total se retira todo o óleo a partir de árvores derrubadas e abertas e na extração racional, que é a mais adequada, sendo realizada de modo sustentável através de uma pequena abertura no tronco da árvore, onde é inserido um cano que conduz o óleo para o exterior, permite a veda após a saída do óleo-resina e facilita futuras extrações (ROMERO, 2007; PIERI et al., 2009).
Esta resina ou óleo opera em defesa e conservação da planta diante de ações fúngicas, bacterianas e outras pragas (COSTA, 2011). Estudos com os extratos das folhas também são muito importantes devido à presença de moléculas bioativas
promissoras. O extrato das folhas da copaibeira tem sido apontado como uma de suas funções, a atividade antioxidante, função não comprovada no óleo-resina (VEIGA JUNIOR & PINTO, 2002; RIGAMONTE AZEVEDO, 2004; ARAÚJO JÚNIOR et al., 2005; RAMOS, 2006). Os extratos podem apresentar potencial inseticida, fungicida, herbicida e nematicida, sendo considerados de boa eficiência (SANTOS et al., 2013).
A obtenção dos extratos pode ser realizada através de extração a frio, a quente em sistema aberto e fechado. A utilização de extratos vegetais ressurge como uma opção diferenciada e promissora para o manejo integrado em proteção das plantas. Estes produtos são considerados uma alternativa de controle de fitopatógenos, demonstrando ótimos resultados, não causando malefícios ao meio ambiente e aos seres vivos (SANTOS et al., 2013).
2. OBJETIVO
O presente estudo teve por objetivo avaliar a atividade antibacteriana do óleo-resina e extrato bruto hidroalcoólico das folhas de diferentes espécies de copaíba frente à bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc).
3. METODOLOGIA
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) é definida como a menor concentração do agente antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano. Foi utilizado o método de determinação da CIM por microdiluição em microplaca segundo a metodologia preconizada pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CSLI, 2012), com adaptações, empregando a resazurina como revelador de crescimento bacteriano.
A Concentração Bactericida Mínima (CBM) foi definida como a menor concentração das amostras em que não houve crescimento bacteriano. Esta técnica permite verificar se as amostras avaliadas na CIM atuaram com ação bactericida (causando a morte das bactérias) ou ação bacteriostática (inibindo o crescimento bacteriano).
4. DESENVOLVIMENTO
No CIM para os óleos-resina foi pesado um miligrama do óleo-resina e solubilizado em 32μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e posteriormente acrescentado 593μL de caldo Nutriente, já para o extrato bruto foi pesado um miligrama de cada extrato e dissolvido em 125 µL de DMSO e depois acrescentado 500 µL de caldo nutriente.
Com o auxílio de uma alça de inoculação esterilizada, foram transferidas culturas do microrganismo desenvolvidas em ágar Nutriente para tubos contendo solução salina (estéril). Em uma microplaca esterilizada de 96 orifícios foi depositado um total de 50μL do caldo Nutriente (Difco), 50μL da amostra teste, posteriormente mais 30 µL do caldo e 20µL da suspensão microbiana, de forma a obter-se uma concentração das amostras de 0,195 a 400μg/mL, permitindo determinar a concentração necessária para inibir o crescimento das bactérias a serem avaliadas. Em um dos orifícios foi feito o controle de cultura, o qual deve apresentar crescimento bacteriano devido à ausência do agente antimicrobiano.
Em outros orifícios o controle de esterilidade do caldo e da amostra, e em outro o controle do solvente (DMSO) utilizado para a solubilização da amostra. A streptomicina foi o controle positivo. A placa foi incubada a 28ºC em estufa de aerobiose durante 48 a 72 horas. Posteriormente, foi adicionado em cada orifício 30μL de resazurina (Sigma) na concentração de 0,02% preparado em solução aquosa. A placa será re-incubada durante 20 minutos, sendo então observada a alteração da cor azul (sem crescimento bacteriano) e a cor rosa (crescimento bacteriano).
No CBM primeiramente foi realizada réplica da CIM, sendo que ambas as microplacas foram incubadas sob as mesmas condições em estufa B.O.D – demanda bioquímica de oxigênio, a 28°C durante 72 horas. Após esse período, uma das microplacas da réplica foi revelada com resazurina (para a determinação da CIM) e a outra foi destinada à realização da CBM.
Para a determinação da CBM, foram previamente preparados 12 tubos correspondendo às concentrações de 0,195 a 400 μg/mL, e então foi adicionado em cada um dos tubos, 500μL de caldo nutriente e uma alíquota de 50 μL do poço da microplaca, correspondente a cada concentração da CIM, esses tubos foram incubados na estufa B.O.D, a 28°C durante 48 horas, seguidos de agitação - 200
rpm (SOUZA et al., 1999). Após o período de incubação, 10 μL de cada tubo representados nas concentrações de 400 a 0,195 μg/mL foram repicados em uma placa de ágar Nutriente que estava dividida em 8 partes (HARRISON et al., 2005), a incubação dessas placas foi realizada por 72 horas a 28°C em estufa B.O.D. A técnica foi realizada em triplicata.
5. RESULTADOS
No presente trabalho foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) das amostras naturais, óleos-resina e extratos brutos hidroalcoólico das folhas de cinco espécies de Copaifera spp.
Conforme a metodologia utilizada, todos os procedimentos para determinação da CIM pelo método da microdiluição em caldo foram realizados previamente para se obter a CBM. As concentrações testadas variaram de 0,195 a 400 μg/mL para as amostras naturais e 0,0115 a 5,9 μg/mL para a estreptomicina usada como controle positivo.
Segundo Rios & Recio (2005) e Gibbons (2008), os extratos brutos que apresentaram CIM inferior ou igual a 100 μg/mL são considerados promissores nas pesquisas de novos agentes antimicrobiano, sendo assim estes foram os parâmetros utilizados no presente estudo para determinar se os óleos-resina e extratos brutos hidroalcoólicos da Copaifera spp. foram promissores ou não.
Os óleos-resina apresentaram resultado > 400 μg/mL frente às cinco cepas de Xcc. Enquanto que os extratos brutos frente a cepa Xcc 1666 das espécies vegetais C. pubiflora, C. reticulata e C. trapezifolia apresentaram efeito bactericida na concentração de 400 μg/mL. A cepa Xcc 75 observamos um efeito bactericida com o extrato bruto da C. trapezifolia também na concentração de 400 μg/mL, e na cepa Xcc 1647 o efeito bactericida com o extrato bruto da C. pubiflora na concentração de 400 μg/mL.
Os demais extratos avaliados com as outras cepas os resultados da CIM foram > 400 μg/mL.
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Todos os óleos-resina e extratos brutos hidroalcoólicos das folhas apresentaram CIM inferior ou igual 400 μg/mL considerados que todos não
apresentaram atividade significativa frente as cepas avaliadas; demonstrando que esses extratos não foram eficientes na avaliação antibacteriana da bactéria Xcc.
7. FONTES CONSULTADAS
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