Thaís Lino da Silva
Aplicação de microextração líquido-líquido dispersiva de baixa densidade (LDS-DLLME) na identificação de novas substâncias psicoativas em plasma por
LC-MS/MS
Campinas 2019
Aplicação de microextração líquido-líquido dispersiva de baixa densidade (LDS-DLLME) na identificação de novas substâncias psicoativas em plasma por
LC-MS/MS
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, área de concentração Patologia Clínica.
Orientador: Prof. Dr. José Luiz da Costa
Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin
ESTE EXEMPLAR
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA THAIS LINO DA SILVA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. JOSÉ LUIZ DA COSTA.
CAMPINAS 2019
THAIS LINO DA SILVA
ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ LUIZ DA COSTA
COORIENTADOR: PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN
MEMBROS:
1. PROF. DR. JOSÉ LUIZ DA COSTA
2. PROF. DR. CARLA BEATRIZ GRESPAN BOTTOLI
3. PROF. DR. PAULO CÉSAR PIRES ROSA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
. Data: 22/03/2019
Primeiramente, dedico este trabalho à Deus, porque Dele, por Ele, para Ele são todas as coisas. Aos tesouros da minha vida, meus pais, por serem os primeiros a investir e acreditar em mim, que sou capaz de ser o que eles sempre sonharam, à minha família, minha raiz, meu maior laço. Às amizades raras ao qual Deus me abençoou, Gabriela, Guilherme e Fernanda. Aos meus orientadores, José Luiz e Marcos Eberlin. Ao Laboratório Thomson, onde nasceu esta pequena cientista em ‘progressing well’. E, ao grande amigo Pedro Henrique Vendramini.
A gratidão que eu sinto é tão grande, que talvez palavras sejam ínfimas para expressar... À Deus, por me amar, me fortalecer e capacitar. O meu desejo sempre foi honrar e glorificar o seu nome com meu trabalho. Pela oportunidade de crescimento, mais pessoal do que profissional, pelas dores, choros e alegrias que me permitiu viver no mestrado, e pelas pessoas maravilhosas que colocou em minha vida. Sem dúvidas, até meus 28 anos, foi a melhor fase da minha vida.
À minha família, por me apoiarem em cada passo, por acreditarem mais em mim do que eu mesma, por brigarem comigo e por nunca me deixarem desanimar. À minha avó, minha gatona, que acha que estou me tornando médica... rs... vocês são tudo pra mim, meu maior tesouro.
Ao meu orientador, Prof. Dr. José Luiz da Costa, o maior desafio da minha vida. Agradeço à Deus tê-lo colocado em meu caminho... Você foi peça fundamental na minha vida. Vou levá-lo para sempre com carinho no meu coração. Obrigada por todo investimento em mim, paciência, conhecimentos compartilhados, e até pelos desentendimentos.
Ao meu co-orientador, ou melhor, acolhedor, Prof. Dr. Marcos Eberlin. Você foi e é uma das minhas maiores motivações, a pessoa mais importante pra mim na UNICAMP, quem me abriu as portas e o primeiro a acreditar em mim ali. Sou tão grata por ter sido uma de suas filhas científicas, parte da família ThoMSon, pelas oportunidades, orações, conselhos, por estar comigo no momento mais difícil do meu mestrado e até pelas brincadeirinhas. Ahhh, família ThoMSon... desde 2015, agradeço muito por todo conhecimento compartilhado, por acreditarem em mim e por me apoiarem tanto e por todos os momentos que vivemos juntos, Deleon, Dena, Pedro (meu setor de orgânica, especialista em me colocar na parede, investiu muito tempo e carinho em mim), Damila, Ingrid, Fernanda, Jandyson, Luana, Fábio, Ana Carolina, Mariana, Adriana, Maíra, Célio, Gustavo, José, Renan, Daniele, e muitos outros, afinal, a família é bem grande, rs. Cada um, em sua especialidade, teve um papel extraordinário nessa fase da minha vida.
À outra família, que fui adotada, o CIATox. Obrigada pelos ensinamentos, paciência, por me aceitarem e pelas amizades, em especial à Adriana, Kelly e Rafael, Tais... as irmãs mais novas e a toda equipe. Vocês tem um papel importantíssimo na minha carreira, na formação da ‘quimicêutica’, e estarão em um lugar especial no meu grande coração.
Às minhas segundas famílias, em especial à Cunha. Juliana, grande amiga, que se não fosse pela sua insistência e apoio lá atrás nada disso teria se concretizado, me deu uma segunda mãe, Dena, que sempre me acudiu, chorou e sorriu comigo. Brigaram também, várias vezes... Obrigada por me fazerem parte dessa família.
À uma grande amiga, inspiração como pessoa e cientista, e que me acolheu sempre que precisei, Rafaela J. Trad. Ao grande amigo Rodolfo por me abençoar tanto nos momentos que
À Rafaela, Thalita, Letícia, Isabela, Mariana, Karen, Eduardo e Rafael... por me apoiarem e amar.
Aos ´presentinhos de 2018´, em especial, Lilian, a minha Tiru, amiga que me apoia tanto, Paulo, Flávia, e o meu Team Cinética, por malharem comigo e por termos construído uma amizade tão prazerosa e verdadeira, que quero levar pra vida toda. Pedro Falcão, Natália, Luisa, Gustavo, Felipe, João, Fernando e etc. Sara Manore, que fez meus dias mais felizes por dois meses e me fez descobrir que tenho uma alma gêmea americana.
Aos melhores amigos, Gabriela, Guilherme e Fernanda. Obrigada por serem atores principais na novela de vida da Thais Lino. Eu amo vocês, e não sou nada sem vocês.
À todos, sinto em dizer, mas não tem devolução!
À Marcinha, secretária da Ciências Médicas por tanta paciência e carinho comigo...
À Diretoria da DAC, Érica, por me darem uma segunda chance e poder chegar nessa etapa.
Agradeço também à banca de qualificação do meu trabalho, pelas críticas que levaram à construção deste trabalho e também à banca examinadora desta defesa pela disponibilidade em estar presente e contribuir ainda mais.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento nº 001.
E à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), que financiou a pesquisa que deu origem à este trabalho (Processo nº 2017/12850-0).
´Eu amo o Senhor, porque ele me ouviu quando lhe fiz a minha súplica. Ele inclinou os seus ouvidos para mim; eu o invocarei toda a minha vida. As cordas da morte me envolveram, as angústias que vieram sobre mim; aflição e tristeza me dominaram. Então clamei pelo nome do Senhor: "Livra-me, Senhor!" O Senhor é misericordioso e justo; o nosso Deus é compassivo. O Senhor protege os simples; quando eu já estava sem forças, ele me salvou. Retorne ao seu descanso, ó minha alma, porque o Senhor tem sido bom para você! Pois tu me livraste da morte, os meus olhos, das lágrimas e os meus pés, de tropeçar, para que eu pudesse andar diante do Senhor na terra dos viventes´
Salmos 116:1-9
´ Your love surrounds me When my thoughts wage war When night screams terror There Your voice will roar Come death or shadow God I know Your light will meet me there When fear comes knocking There You'll be my guide When day breeds trouble There You hold my heart Come storm or battle God I know Your peace will meet me there Oh, be still my heart I Know that You are God Oh fear no evil For I know You, are here´ Prince of peace, Hillsong
As novas substâncias psicoativas (NSP) são drogas de abuso de origem sintética que proporcionam ao usuário efeitos semelhantes aos produzidos pelas drogas de abuso “tradicionais” porém, em sua maioria, não são controladas por agências e órgãos internacionais. Atualmente, o uso de NSP vem se tornando um grande problema de saúde pública mundial, com relatos de intoxicações graves e mortes decorrentes do uso abusivo dessas drogas cada vez mais recorrentes. Devido à eficácia de NSP em doses baixas, a concentração destas substâncias em matrizes biológicas tais como sangue e seus derivados, urina, fluido oral e cabelo é extremamente baixa, exigindo técnicas analíticas extremamente sensíveis. Sendo assim, é necessário que o procedimento analítico que envolve desde o preparo de amostras à instrumentação analítica seja adequado para detectar e quantificar os analitos de maneira inequívoca. Considerando as desvantagens das técnicas tradicionais de extração, técnicas miniaturizadas vêm ganhando um foco devido à suas vantagens quanto à eficiência e baixo custo, bem como por serem procedimentos de preparos mais rápidos e fáceis. A microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME - do inglês - dispersive liquid-liquid microextraction) é uma miniaturização da técnica de extração líquido-líquido considerada muito simples, rápida e barata. O acoplamento da cromatografia líquida com a espectrometria de massas (LC-MS/MS) além de possibilitar o desenvolvimento de métodos eficientes e em tempo de análise reduzido, oferece alta seletividade e detectabilidade, e se tornou uma das técnicas mais amplamente utilizadas na área da toxicologia em análises de fármacos e drogas de abuso em matrizes biológicas. O objetivo deste projeto foi otimizar, validar e implementar uma metodologia analítica qualitativa aliando a DLLME à técnica de LC-MS/MS para a identificação de NSP da classe dos canabinóides sintéticos (CS), fentanil e derivados (FD) e NBOMes em amostras de plasma. As análises foram realizadas em monitoramento de reação múltipla (MRM), utilizando ionização por electrospray (ESI) em modo positivo. A validação qualitativa foi realizada seguindo o guia do Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX). O LOD variou de 0,1 a 1 ng / mL, concentrações esperadas em casos reais. As imprecisões foram inferiores a 20% (expressas em termos de repetibilidade). Os valores de efeitos de matriz que se encontram dentro da faixa aceitável de ±20% variaram entre 1,6 e 13,4% para os CS; 0,7 a 8% para FD e de 8,6 a 14,9% para os NBOMes. A recuperação dos analitos após o método de extração apresentaram valores entre 29,8 e 114,4% para todos os analitos. Nas análises de estabilidade, foram avaliados os intervalos de 0, 4, 7 e 15 dias, em que os analitos apresentaram em sua maioria decaimento com variações maiores do que ±20%. O método foi aplicado em dez amostras de casos de tentativa de suicídio. A técnica de DLLME forneceu resultados satisfatórios para o objetivo do estudo, podendo ser amplamente utilizada em laboratórios de toxicologia clínica e forense de acordo com os parâmetros de validação qualitativos avaliados. Além disso, alia-se ao fato da utilização da técnica analítica confiável como a de LC-MS/MS, que permite a identificação das NSP, que se tornaram um desafio mundial devido à sua grande variedade.
New psychoactive substances (NPS) are synthetic drugs of abuse that provide users with effects similar to those produced by "traditional" substance abuse drugs, but most are not controlled by international agencies and agencies. Currently, the use of NSP has become a major public health problem worldwide, it has been reported of severe poisoning and deaths resulting from the abusive use of these increasingly recurrent drugs. Because of the effectiveness of NSP at low doses, the concentration in highly complex biological matrices such as blood, plasma, urine, oral fluid and hair of such compounds is generally below the detection limit of most analytical methods. Therefore, its necessary that the analytical procedure that involves from the preparation of samples to the analytical instrumentation is adequate to detect and quantify the analytes unequivocally. Regarding the disadvantages of traditional extraction techniques, miniaturized techniques have been gaining a focus due to their advantages in terms of efficiency and low cost, as well as being quicker and easier preparation procedures. The dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) is a miniaturization of the liquid-liquid extraction technique considered to be very simple, fast and inexpensive.The coupling of liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS/MS) in addition to enabling the development of efficient methods and reduced analysis time, offers high selectivity and detectability, and has become one of the most widely used techniques in the field of toxicology in analysis of drugs of abuse in biological matrices. The objective of this project was to optimize, validate and implement a qualitative analytical methodology combining DLLME with the LC-MS/MS technique for the identification of NSP (Synthetic Cannabinoids, Fentanyl and derivatives and NBOMes) in plasma samples. Analyses were performed in multiple reaction monitoring (MRM), utilizing electrospray ionization (ESI) in positive mode. Qualitative validation was performed following the Scientific Working Group for Forensic Toxicology guideline (SWGTOX). The LOD ranged from 0.1 to 1 ng/mL, concentrations expected to be found in real cases. The imprecisions were lower than 20% (expressed in terms of repeatability). The values of matrix effects that are within the acceptable range of ± 20% ranged from 1.6 to 13.4% for SC; 0.7 to 8% for FD and from 8.6 to 14.9% for the NBOMes. The recovery of the analytes after the extraction method presented values between 29.8 and 114.4% for all the analytes. For stability analyzes, the 0, 4, 7 and 15 day intervals were evaluated, in which the analytes were mostly decreased, with variations greater than ± 20%. The method was sucessfully applied to ten samples from suicide attempt cases. The DLLME technique provided satisfactory results for the purpose of the study and can be widely used in clinical and forensic toxicology laboratories, according to the qualitative validation parameters evaluated. In addition, it’s combined with the use of a reliable analytical technique such as LC-MS, which allows for a greater identification of NSPs, which have become a worldwide challenge due to their wide variety.
Key words: New psychoactive substances (NPS); Synthetic Cannabinoids; Fentanyl, NBOMes; DLLME; LC-MS
Figura 1. Estrutura molecular do principal ativo da Cannabis, o THC... 19 Figura 2. Estruturas moleculares dos núcleos que podem servir como base estrutural dos canabinóides sintéticos, que dão origem às substâncias da classe, originados do indol, indazol e pirrol...20 Figura 3. Estruturas moleculares de CS sintetizados à partir do núcleo do grupo carbonilamida, originado à partir do indol...20 Figura 4. Estruturas moleculares dos CS sintetizados à partir do núcleo do grupo do carbonil, originado à partir do indol...21 Figura 5. Estruturas moleculares do Fentanil e alguns exemplos de seus derivados, com suas respectivas substituições estruturais...23 Figura 6. Estruturas moleculares de alguns exemplos de NBOMes...24 Figura 7. Representação esquemática de um espectrômetro de massas...31 Figura 8. Gráfico da otimização dos solventes extrator e dispersor do método de extração por DLLME à partir do planejamento fatorial (D-optimal)...44 Figura 9. Gráfico da otimização de solvente extrator, volumes e agitação do método de extração por LDS-DLLME à partir do planejamento fatorial (One-design)...45 Figura 10. Cromatogramas de íons extraídos da análise de CS na concentração de 1 ng/mL em plasma por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...46 Figura 11. Cromatogramas de íons extraídos da análise de FD na concentração de 1 ng/mL em plasma por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...47 Figura 12. Cromatogramas de íons extraídos da análise de NBOMes na concentração de 1 ng/mL em plasma por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...48 Figura 13. Estabilidades em 0, 4, 7, 15 dias das NSP da classe de CS, respectivamente representado para cada analito. Eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, de acordo com a variação orientada pela SWGTOX (±20%) e (x) de acordo com o tempo de armazenamento (dias)...54 Figura 14. Estabilidades em 0, 4, 7, 15 dias das NSP da classe de FD, respectivamente representado para cada analito. Eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, de acordo com a variação orientada pela SWGTOX (±20%) e (x) de acordo com o tempo de armazenamento
representado para cada analito. Eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, de acordo com a variação orientada pela SWGTOX (±20%) e (x) de acordo com o tempo de armazenamento (dias)...55 Figura 16. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 1 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...56 Figura 17. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 2 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...57 Figura 18. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 3 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção...57 Figura 19. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 4 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...57 Figura 20. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 5 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...58 Figura 21. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 6 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...58 Figura 22. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 7 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...58 Figura 23. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 8 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...59 Figura 24. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 9 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT)...59
Tabela 1. Parâmetros avaliados no planejamento fatorial D-optimal... 36 Tabela 2. Valores dos testes de limite de detecção (LOD) e precisão do método de LDS-DLLME aplicado nas NSP... 37 Tabela 3. Transições MRM monitoradas para cada NSP analisada no método proposto, e seus respectivos tempos de retenção... 43 Tabela 4. Valores dos testes de limite de detecção (LOD) e precisão do método de LDS-DLLME aplicado nas NSP... 50 Tabela 5. Valores de recuperação e efeito matriz, da validação do método de LDS-DLLME aplicado nas NSP... 52
ACN Acetonitrila
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APCI Ionização química à pressão atmosférica – do inglês, Atmospheric Pressure
Chemical Ionization
APPI Fotoionização à pressão atmosférica – do inglês, Atmospheric Pressure
Photoionization
CE Energia de colisão – do inglês, Collision energy
CID Dissociação induzida por colisão – do inglês, Collision Induced
Dissociation
C.V Coeficiente de variação
DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva
EMCDDA Observatório Europeu sobre Drogas e Toxicodependência – do inglês,
European Monitoring Centre for drugs and drug addiction ESI Ionização por eletrospray – do inglês, Electrospray Ionization
EUA Estados Unidos
FD Fentanil e seus derivados
FT-ICR Ressonância ciclotrônica de íons com Transformada de Fourier – do inglês,
Fourier Transformation Ion Cyclotron Ressonance
GC Cromatografia gasosa – do inglês, Gas chromatography
GC-MS Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas – do inglês, Gas
chromatography - mass spectrometry
HF-DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva por fibra oca – do inglês,
Hollow-fiber dispersive liquid-liquid microextraction
HPLC Cromatografia líquida de alta pressão – do inglês, High pressure liquid
chromatography
IL-DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva baseada em líquido iônico – do inglês, Ionic liquid dispersive liquid liquid microextraction
LC Cromatografia líquida – do inglês, Liquid chromatography
LC-MS/MS Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas – do inglês,
Liquid chromatography - mass spectrometry
LDS-DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva de baixa densidade – do inglês
Low density solvent dispersive liquid liquid microextraction
LDS-VALLME Microextração líquido-líquido dispersiva assistida por vórtex – do inglês,
Vortex assisted liquid-liquid microextraction based on low-density solvent
LOD Limite de detecção do inglês – Limit of detection
LC-QqQ Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas utilizando um analisador do tipo triplo quadrupolo – do inglês, Liquid chromatography -
triple quadrupole mass spectrometry
LC-QToF-MS Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas utilizando um analisador do tipo tempo de vôo – do inglês, Liquid chromatography -
quadrupole time of flight mass spectrometry
LLE Extração liquido-líquido – do inglês, Liquid-liquid extraction
LSD Dietilamida do ácido lisérgico – do inglês, Lysergic acid diethylamide MDMA 3,4-metilenodioximetanfetamina
MRM Monitoramento de reações múltiplas – do inglês, Multiple reaction
monitoring
NSP Novas substâncias psicoativas - do inglês, New psychoactive substances SFE Fluído super crítico - do inglês, Supercritical fluid extraction
SWGTOX Grupo de Trabalho Científico de Toxicologia Forense – do inglês, Scientific
Working Group for Forensic Toxicology
TBS Tetraborato de sódio
THC Delta-9-tetrahidrocanabinol
Trap Armadilha de íons
UA-LDS-DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva de baixa densidade assistida por ultrassom – do inglês, Ultrasonic assisted low-density-solvent liquid-liquid
microextraction
UER-UNICAMP Unidade de Emergência Referenciada da Cidade de Campinas UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
1. Introdução ... 17
1.1. Novas substâncias psicoativas ... 17
1.1.1. Canabinóides sintéticos ... 18
1.1.2. Fentanil e derivados ... 22
1.1.3. NBOMes ... 23
1.2. Toxicologia forense ... 24
1.2.1. Métodos de preparo de amostras em toxicologia forense ... 25
1.3. Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) ... 26
1.4. Técnicas analíticas aplicadas à toxicologia forense ... 30
2. Justificativa ... 33
3. Objetivo geral ... 34
4. Material e métodos ... 35
4.1. Reagentes, material de referência e padrões ... 35
4.2. Planejamento experimental e procedimentos de extração ... 35
4.2.1. DLLME ... 35
4.2.2. LDS-DLLME ... 37
4.3. Validação do método analítico ... 38
4.4. Análise de CS, FD e NBOMes por LC-MS/MS ... 40
4.5. Aplicação do método desenvolvido na análise de amostras reais ... 40
5. Resultados e discussão ... 42
6. Conclusão ... 61
7. Referências ... 62
1. Introdução
1.1. Novas substâncias psicoativas
As novas substâncias psicoativas (NSP, ou em inglês New Psychoactive Substances - NPS) são drogas de abuso de origem sintética que proporcionam ao usuário efeitos semelhantes aos produzidos pelas drogas de abuso “tradicionais”, e representam um desafio em constante evolução, pois o consumo, o tráfico e o número de NSP, tem crescido no mundo todo e preocupado os órgãos governamentais relacionados à segurança e saúde pública (1). Como citado, as NSP são substâncias ou misturas de substâncias psicoativas produzidas em laboratórios clandestinos, por síntese química numa alternativa de burlar a legislação vigente. Essas drogas possuem estruturas químicas e atividades biológicas similares a de drogas de abuso tradicionais, como a cocaína, metanfetamina, 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) e dietilamida do ácido lisérgico (LSD) (1–3). Os efeitos psicoativos das NSP são muito mais potentes, quando comparados àqueles das drogas que as originou (4). Por serem compostos de origem sintética, a sua identificação é dificultada pelos órgãos regulamentadores, polícia e laboratórios de toxicologia, principalmente devido à falta de conhecimento sobre as estruturas destes compostos, à ausência de padrões de todos os compostos e de métodos analíticos capazes de identificar os compostos por classes.
Segundo informações presentes no relatório anual do Observatório Europeu sobre Drogas e Toxicodependência (EMCDDA - do inglês, European Monitoring Centre for Drugs
and Drug Addiction), a lista de substâncias que surgem no mercado de drogas vêm
aumentando constantemente, sendo notificada pelo menos uma nova substância psicoativa por semana na Europa. Em 2016, foram notificadas quase 71.000 apreensões de NSP através do mecanismo de alerta rápido da União Europeia. Os canabinóides (CS) sintéticos e as catinonas sintéticas representaram aproximadamente 80% de todas as apreensões, 32.000 e 23.000, respectivamente. Os novos opióides têm sido apreendidos de várias formas: em pó (forma predominante), comprimidos e líquidos, e mais de 70 % de cerca de 1.600 apreensões de novos opióides sintéticos notificadas em 2016 foram de derivados do fentanil (5). No final do ano de 2017, cerca de 670 de NSP já foram notificadas, sendo que 51 foram identificadas pela primeira vez naquele ano. Dentre as classes de NSP, os CS e os opióides sintéticos, especificamente o fentanil e seus derivados (FD), são dois grupos de substâncias particularmente preocupantes, sendo considerados atualmente os mais relevantes grupos de
NSP, portanto o controle da sua comercialização constitui um desafio aos órgãos públicos (5). Embora representem uma pequena parcela do mercado de droga europeu, no total, desde 2009, foram encontrados 38 novos opióides, incluindo 13 notificados pela primeira vez em 2017. Neste total, 28 eram derivados do fentanil, dos quais 10 foram identificados pela primeira vez em 2017, substâncias consideradas muito potentes que constituem uma série de ameaças para a saúde individual e pública (5). Os CS, que apresentam efeitos psicotrópicos potencializados quando comparados com os canabinóides naturais presentes na Cannabis sativa L., continuam sendo o maior grupo de novas substâncias monitoradas pelo EMCDDA e sua diversidade química têm aumentado exponencialmente, com 179 identificações desde 2008, incluindo 10 notificações no ano de 2017 (5). No Brasil, 30 CS são nominalmente proibidos, de acordo com a última publicação da RDC Nº 254 (de 10 de dezembro de 2018) da ANVISA. Além destes, a ANVISA incluiu sete estruturas químicas distintas de substâncias canabimiméticas, passando a utilizar classificação de substâncias por analogia estrutural, expandindo largamente a lista de CS proibidos por lei. A partir de 24 de outubro de 2017, o fentanil e dezenove de seus derivados foram incluídos na lista de entorpecentes da ANVISA. Outra classe que compõe as NSP são os NBOMes, estes que possuem efeitos alucinógenos similares aos produzidos pela dietilamida do ácido lisérgico (LSD - do inglês, lysergic acid diethylamide) e no Brasil, apenas doze NBOMes são considerados proibidos desde de 28 de junho de 2016 (6–8).
O expressivo aumento no tráfico de drogas sintéticas e o crescente número das NSP são ameaças preocupantes para a polícia e órgãos de saúde mundiais (1,9). As NSP constituem um vasto conjunto de drogas que frequentemente não são controladas ou proibidas internacionalmente, o que viabiliza o comércio em alguns casos como substitutos legais de drogas ilícitas; em outros, são destinadas a pequenos grupos que querem experimentá-las em busca de novos efeitos. Estas drogas podem ser vendidas sem restrição em diversos locais, como lojas de conveniência e tabacarias. Contudo, a venda através da internet é a mais difundida. Além disso, existem relatos de vendas no mercado ilícito, algumas vezes com a própria designação e outras falsificadas como drogas ilícitas comuns, como por exemplo heroína, cocaína, ecstasy e benzodiazepínicos (2,5).
Os CS são substâncias análogas que possuem efeitos semelhantes ao delta-9-tetrahidrocanabinol (THC) (Figura 1), que é a substância responsável pela maioria dos efeitos psicoativos da Cannabis.
Figura 1. Estrutura molecular do principal ativo da Cannabis, o THC.
Possuem maior afinidade de ligação ao receptor canabinóide CB1 do que o THC, e maior afinidade no CB1 do que no receptor CB2. Estudos in vitro e in vivo apontam que CS produz efeitos fisiológicos e psicoativos semelhantes ao THC, mas com maior intensidade, resultando em emergências médicas e psiquiátricas. Os efeitos adversos em humanos incluem náusea e vômito, falta de ar ou depressão respiratória, hipertensão, taquicardia, dor torácica, espasmos musculares, insuficiência renal aguda, ansiedade, agitação, psicose, ideação suicida e comprometimento cognitivo. Efeitos a longo prazo ou residuais são desconhecidos. Devido a essas consequências para a saúde pública, os CS passaram a ser classificados como substâncias controladas. No entanto, à medida que novos grupos de CS são identificados, os produtores clandestinos frequentemente realizam modificações nas ramificações das estruturas, mantendo seu núcleo, resultando em um fluxo de CS novos que podem não ser legalmente controlado ou detectável por testes laboratoriais de rotina (5,10). Os núcleos estruturais dessas substâncias podem variar, e os mais comuns são à partir do indol, indazol e pirrol. À partir do indol e do indazol, como pode-se observar na Figura 2, outras estruturas podem ser originadas formando novas substâncias (carbonil, carboniléster e carbonilamida), que também podem ser utilizadas como base dos CS. Os CS presentes neste estudo possuem suas estruturas baseadas no núcleo do indol, e nas Figuras 3 e 4, pode-se observar como são realizadas essas modificações nas ramificações para a formação de cada CS estudado.
Figura 2. Estruturas moleculares dos núcleos que podem servir como base estrutural dos canabinóides sintéticos, que dão origem às substâncias da classe, originados do indol, indazol e pirrol. Em azul, pode-se observar onde ocorrem as variações.
Figura 3. Estruturas moleculares de CS sintetizados à partir do núcleo do grupo carbonilamida, originado à partir do indol.
Figura 4. Estruturas moleculares dos CS sintetizados à partir do núcleo do grupo do carbonil, originado à partir do indol.
Os CS foram comercializados pela primeira vez como alternativas legais ao consumo e tráfico de Cannabis na Europa no início de 2000, e são misturados a ervas (plantas secas que só servem de suporte) em produtos chamados de K2, Spice ou incensos herbais ou mesmo
como ‘misturas herbáceas para fumar’. São produzidos principalmente na Ásia, onde o controle dos órgãos reguladores é menos rigoroso (2,5,10,11).
1.1.2. Fentanil e derivados
O fentanil e seus derivados (FD) são analgésicos narcóticos sintéticos que são estruturalmente diferentes dos derivados do ópio, mas têm efeitos farmacológicos semelhantes.
Os opióides sintéticos são amplamente utilizados para fins de analgesia neuroléptica e sedação durante os períodos cirúrgicos pré-operatórios, de indução, de manutenção e pós-operatórios. O fentanil é 50 a 100 vezes mais potente que a morfina. O sufentanil é o mais potente da classe e é cerca de 5 a 10 vezes mais forte que o fentanil. Dentre os derivados, o alfentanil é o que atinge o efeito analgésico mais rápido e exibe cerca de um terço da potência clínica do fentanil. Os opióides sintéticos foram clandestinamente introduzidos no mercado de drogas ilícitas disponíveis em sites da internet e levaram a uma série de mortes por overdose nos EUA e na Europa. Entre os anos de 2013 e 2015, nos EUA foram relatados aproximadamente 52 mortes causadas pelo uso ilícito de acetilfentanil (12,13). As estruturas dos derivados são baseadas em modificações nas ramificações na estrutura molecular do fentanil, e alguns exemplo dessas modificações podem ser observados na Figura 5.
Em 2016, no mercado europeu foram apreendidos cerca de 4,6 litros de opióides sintéticos e em 96% dos líquidos apreendidos foram identificados derivados do fentanil. Já no ano de 2017, foi relatado a presença de cinco derivados do fentanil (acrilfentanil, furanilfentanil, 4-fluoro-isobutirilfentanil, tetrahidro-furanilfentanil e o carfentanil) na forma líquida em pulverizadores nasais. Além disso, houve casos em que foram detectadas misturas com outras drogas, como a heroína e a cocaína, ou presentes em medicamentos manipulados, sendo que os consumidores não estavam cientes do consumo de tais substâncias. A emergência destas drogas potentes, muitas vezes adquiridas através da internet, apresenta desafios significativos tanto para os serviços de saúde como para os serviços de aplicação da lei. As substâncias são fáceis de transportar e dissimular, e volumes pequenos estão presentes em potentes doses individuais. Do ponto de vista da saúde, estas substâncias contribuem às mortes relacionadas com opióides (5).
Figura 5. Estruturas moleculares do Fentanil e alguns exemplos de seus derivados, com suas respectivas substituições estruturais.
1.1.3. NBOMes
Os NBOMes são substâncias de efeito semelhante ao do LSD, que fazem parte da classe das feniletilaminas, que possuem ação agonista nos receptores serotoninérgicos 5-HT2A com efeitos sensíveis na percepção e consciência do usuário, ou seja, alucinógenos (2,14).
São substâncias extremamente potentes, sendo necessário poucos miligramas para causar alucinações por horas. Começaram a ser comercializados pela internet no ano de 2010 na forma de selos, semelhantes aos de LSD (consumidos por via sublingual), ou em pó (consumidos via intranasal) (2,14). O crescente consumo dos NBOMes se deve ao baixo custo, à alta disponibilidade e ao fato de muitos compostos da classe ainda serem legais em diversos países. Estruturas moleculares de alguns NBOMes, que foram abordados neste estudo podem ser observados na Figura 6.
Figura 6. Estruturas moleculares de alguns exemplos de NBOMes.
Dentre os efeitos causados pelos compostos do grupo estão: alterações na percepção visual e auditiva, taquicardia, hipertensão, agitação, confusão, agressividade, entre outros (10).
1.2. Toxicologia forense
A toxicologia forense é área da ciência Toxicologia que estuda os agentes tóxicos para elucidação de questões que ocorrem em procedimentos legais/judiciais. Está atrelada à toxicologia analítica, que é aplicada para reconhecimento através da identificação e quantificação de agentes tóxicos em materiais biológicos apreendidos que podem ter causado morte ou injúria ao homem em situações de questões judiciais implícitas (2).
No Brasil, é basicamente executada em laboratórios das Secretarias de Segurança Pública e pela Policia Federal, em que análises toxicológicas são de extrema importância para a associação entre uma ligação causal a um determinado evento e um efeito tóxico (2).
As análises toxicológicas também são aplicadas em atendimentos de emergência hospitalar, em pacientes com suspeita de ingestão de agentes tóxicos, traumas, portadores de problemas neurológicos entre outros casos, fornecendo à equipe médica a identificação e
quantificação do possível agente tóxico que auxiliará nos diagnósticos e uso de terapêutica adequada ao paciente. Casos de intoxicação e tentativas de suicídio são dois dos motivos mais recorrentes da procura por serviços de emergência, e, dentre eles os mais comuns são por uso abusivo de medicamentos como paracetamol, benzodiazepínicos e antidepressivos, drogas de abuso, como a cocaína, MDMA; pesticidas como o paraquat e bebidas alcóolicas (2).
1.2.1. Métodos de preparo de amostras em toxicologia forense
Na toxicologia forense, as análises são realizadas em matrizes altamente complexas tais como sangue, plasma, urina, fluido oral e cabelo, portanto o preparo da amostra é um passo fundamental, considerado uma etapa analítica importante que precisa garantir uma limpeza eficaz e torne a amostra analisável. As características buscadas para um método de extração ideal são, primeiramente, simplicidade e rapidez de execução, para serem aplicadas em um grande número de amostras em análises de rotina. Outro fator fundamental na escolha de um método de extração é a eficácia na purificação da amostra a partir de componentes indesejáveis da matriz, a fim de reduzir o efeito da matriz e aumentar a detectabilidade e o desempenho geral da etapa analítica instrumental (15). Devido à eficácia de NSP em doses baixas, a concentração no sangue e urina desses compostos geralmente está abaixo do limite de detecção da maioria dos métodos analíticos. Sendo assim, é necessário que o procedimento analítico que envolve desde o preparo de amostras à instrumentação analítica seja adequado para detectar e quantificar os analitos de maneira inequívoca (13,15,16).
Em laboratórios de toxicologia forense, a extração liquido-líquido (LLE – do inglês, liquid liquid extraction) e a extração em fase sólida (SPE – do inglês, solid phase extraction) combinadas com análises por cromatografia líquida (LC - do inglês, liquid cromatography) e cromatografia gasosa (GC - do inglês, gas chromatography) são técnicas largamente utilizadas para determinação de drogas em amostras biológicas. Porém, a LLE ou SPE são técnicas que demandam um volume alto de solventes orgânicos, ou mais de uma etapa de extração, consequentemente alto custo, tempo ou baixos fatores de enriquecimento (13,16).
Considerando as desvantagens das técnicas tradicionais de extração, técnicas miniaturizadas vêm ganhando um foco devido à suas vantagens quanto à eficiência e baixo custo, bem como por serem procedimentos de preparos mais rápidos e fáceis (13,16).
Uma etapa muito importante que compõe as metodologias analíticas é a validação do método de análise. A validação é basicamente a realização de um conjunto de experimentos que visa assegurar a eficácia e confiabilidade de um método analítico ou modificação para um método previamente validado, com o objetivo de demonstrar que um método é capaz de realizar com sucesso no nível de seu uso pretendido e identificar as limitações do método sob condições operacionais normais (17).
Os métodos devem ser validados quando for necessário verificar se os parâmetros de desempenho de um método estão adequados para uso em uma análise específica. Em análises de toxicologia forense são geralmente utilizados métodos de triagem, métodos de confirmação/identificação qualitativa ou métodos quantitativos. No método quantitativo, os parâmetros de validação avaliados são os limites de detecção e quantificação, arrastamento ou contaminação cruzada (carryover), exatidão, precisão, efeito matriz, estudo de interferentes/seletividade, integridade de diluição e estabilidade; e no método qualitativo: Limites de detecção, carryover, supressão iônica, efeito matriz, estudo de interferentes/seletividade e estabilidade (17).
Os estudos de validação devem ser conduzidos utilizando amostras fortificadas da matriz a que o método será utilizado, e aplicado de forma semelhante nas amostras reais (17).
1.3. Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME)
A microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME - do inglês, dispersive liquid-liquid microextraction) é uma miniaturização da técnica de LLE considerada muito simples, rápida e barata. A técnica baseia-se em um sistema ternário de solventes, em que é feita uma rápida injeção com uma seringa de uma mistura de dois solventes orgânicos - um atuando como solvente dispersivo, miscível em água - e o solvente extrator, geralmente de alta densidade, imiscível na amostra aquosa que contém os analitos de interesse. Uma solução turva é formada, contendo gotículas finas de solvente de extração totalmente dispersas em fase aquosa com uma área de superfície de troca, permitindo uma extração efetiva e alto fator de concentração dos analitos no solvente extrator. Na segunda etapa da extração, a mistura é centrifugada, e em seguida a fase sedimentada é transferida para um microvial (18,19).
Existem alguns fatores que afetam a DLLME, como volume e tipo do solvente extrator/dispersor, agitação, tempo de extração, pH e força iônica. A escolha dos solventes é um fator crucial na microextração. Ambos os solventes devem ter pressão de vapor relativamente baixa e ponto de ebulição alto, para evitar perdas significativas de solvente durante a microextração. Na seleção do solvente extrator, que é o principal parâmetro, deve ser feita com base na sua densidade, que geralmente deve ser maior que da água, o que permite a formação da fase sedimentada, baixa solubilidade, permitindo a separação adequada do extrato orgânico, capacidade de extração dos analitos de interesse e adequação à técnica analítica empregada, como por exemplo bom comportamento cromatográfico. Na técnica clássica de DLLME, os solventes extratores mais comumente utilizados são os clorados, como por exemplo clorofórmio, diclorometano ou tetracloroetileno, que são considerados de alta densidade e tóxicos. Porém, Meng et al. (20) desenvolveram a técnica utilizando o acetato de etila, solvente orgânico de baixa densidade como extrator na extração de 4 benzodiazepínicos sintéticos em amostras de urina, e Chen et al. (21) aplicaram a mesma técnica na extração de 12 antidepressivos e 2 antipsicóticos em amostras de sangue total utilizando tolueno (baixa densidade) como extrator. A recuperação de extração, o fator de enriquecimento e a seletividade dos compostos-alvo são fortemente influenciados pelo solvente de extração (18,20,22)
O parâmetro essencial para a escolha do solvente dispersor é a sua solubilidade na fase aquosa e na fase orgânica. Sua principal função é dispersar o solvente extrator na fase aquosa, portanto, o dispersor deve ser miscível em ambos. Geralmente, os mais utilizados são acetona, acetonitrila e metanol. Os volumes dos solventes influenciam na formação da fase sedimentada, pois o volume adequado de solvente dispersor para uma boa formação de microgotas, ou a ‘nuvem’, depende tanto do volume de fase aquosa quanto do volume de solvente extrator. Em relação ao volume do solvente extrator, que é considerado um fator muito importante e relevante na extração, quando o volume escolhido é baixo, o solvente extrator pode não ser efetivamente disperso na amostra, e quando o contrário ocorre, a concentração do analito pode diminuir com o aumento do volume de solvente extrator, em ambos os casos resultando em uma baixa eficiência de extração (18–20,22).
A agitação também é uma etapa essencial da DLLME. Uma boa escolha de um intervalo de centrifugação pode garantir uma boa separação de fases, que, consequentemente, aumenta a eficiência de extração. Além da centrifugação, outros tipos de agitação podem ser
efetivamente utilizados, como por vórtex, agitação manual, magnética ou microondas, que acelera a transferência do analito para a fase orgânica, e por ultrassom, pois a energia ultrassônica pode aumentar a dispersão do solvente extrator na fase aquosa, cooperando assim para a emulsificação das fases e formação da nuvem, e em ambas o equilíbrio de extração é atingido rapidamente. Porém, na agitação ultrassônica, se realizada em um espaço curto de tempo, o solvente extrator pode não atingir uma dispersão favorável para a transferência do analito e, se muito longa, pode ocorrer a volatilização do solvente extrator e consequentemente a degradação do analito devido à altas temperaturas (20,24,25)
Como o equilibrio de partição dos analitos geralmente é atingido rapidamente, o tempo de extração é definido como o intervalo entre a injeção da mistura dos solventes e o final da centrifugação. O pH exibe grande influência e deve ser otimizado em função da acidez ou basicidade dos analitos, para que os mesmos sejam extraídos em sua forma neutra, cooperando para a partição dos analitos nas microgotas do solvente extrator (12,16,18).
Como toda técnica analítica, a aplicabilidade da técnica convencional de DLLME tem se tornado muito popular e se expandido, resultando em diferentes vertentes da técnica, devido à sua versatilidade, rapidez, baixo custo, por utilizar baixos volumes de solvente, facilidade de operação e por oferecer um alto fator de enriquecimento (25). Além disso, pode ser aplicada na extração de compostos tanto orgânicos quanto inorgânicos, em diferentes matrizes e em diversas áreas da ciência como de alimentos, fármacos, ambiental, biológicas e toxicológicas (25).
A microextração líquido-líquido dispersiva de baixa densidade (LDS-DLLME - do inglês, low density solvent dispersive liquid-liquid microextraction), é realizada com um solvente extrator de baixa densidade, geralmente sem a presença de um solvente dispersor. A utilização de um solvente extrator de baixa densidade facilita a coleta do sobrenadante, consequentemente diminuindo a perda de volume do solvente extrator. Ainda utilizando um solvente de baixa densidade, porém com diferentes maneiras de dispersão do solvente, pode-se utilizar a técnica de agitação por ultrassom, chamada microextração líquido-líquido dispersiva de baixa densidade assistida por ultrassom (UA-LDS-DLLME - do inglês, ultrasonic assisted low density solvent) e devido à emulsificação decorrente da agitação ultrassônica, o solvente extrator é disperso totalmente na solução aquosa sem a presença de solvente dispersor, que aumentou a eficiência de extração dos analitos, Outro modo agitação comum é utilizando vórtex, chamada microextração líquido-líquido dispersiva de baixa
densidade assistida por vórtex (LDS-VALLME - do inglês, vortex assisted liquid-liquid microextraction based on low density solvent), e, como supracitado, esse tipo de agitação favorece o processo de emulsificação, pois acelera a transferência do analito para a fase orgânica. (21,24,26,27).
A microextração líquido-líquido dispersiva de baixa densidade por fibra oca (HF-DLLME - do inglês, hollow-fiber dispersive liquid-liquid microextraction) utiliza uma fibra porosa durante a extração que tem a função de auxiliar na área de superfície de contato do solvente extrator com a fase aquosa, com intuito de garantir um efeito de limpeza, um fator de recuperação e enriquecimento maior do analito de interesse. Meng et. al compararam as técnicas de HF-DLLME e UA-LDS-DLLME na determinação de 8 drogas de abuso em amostras de sangue e urina. Concluiram que, para ambas as amostras biológicas, as vertentes da DLLME apresentaram ótimo potencial de extração, podendo ser muito bem aplicada na análise de drogas de abuso com finalidade forense (20).
Como uma alternativa ao uso de solventes orgânicos, os líquidos iônicos vêm sendo largamente aplicados como extratores na DLLME, e foi denominada como microextração líquido-líquido dispersiva de baixa densidade baseada em líquido iônico (IL-DLLME – do inglês, ionic liquid-dispersive liquid liquid microextraction). Eles são compostos desenvolvidos à partir de cátions e ânions, e podem ser sintetizados de acordo com as propriedades físico-químicas do analito de interesse, o que pode auxiliar na eficiência da extração. Essa vertente pode ser também associada e favorecida por diferentes tipos de agitação como ultrassom, vórtex ou microondas (23,25).
Ainda com objetivo de aumentar a seletividade e eficiência da extração, a DLLME tem sido combinada à outros métodos de extração para a análise de amostras muito complexas, como por exemplo extração em fase sólida (SPE) ou extração por fluído super crítico (SFE). Esse tipo de abordagem pode contribuir para uma utilização ainda menor de solventes, aumentar a eficiência de limpeza e enriquecimento da amostra (23,24).
Outra inovação na técnica é a automação da DLLME com instrumentos analíticos de detecção, como por exemplo LC ou espectrofotometria e vem sendo citada na literatura por diferentes estratégias, tanto online quanto off-line, com o intuito de expandir o escopo das aplicações, aumentar a sensibilidade e reduzir limites de detecção (23,24).
1.4. Técnicas analíticas aplicadas à toxicologia forense
A técnica de cromatografia líquida trata-se de um método de separação baseado na distribuição dos analitos entre uma fase estacionária e fase móvel, eluída sob altas pressões. A técnica possui grande capacidade de realizar separações e análises quantitativas de variados analitos presentes em diversos tipos de amostras, em uma curta escala de tempo com alta resolução e eficiência (27).
O acoplamento da cromatografia líquida com a espectrometria de massas (LC-MS – do inglês, liquid cromatography - mass spectrometry) além de possibilitar o desenvolvimento de métodos eficientes e em tempo de análise reduzido, oferece alta seletividade e detectabilidade, e se tornou uma das técnicas mais amplamente utilizadas na área da toxicologia em análises de fármacos e drogas de abuso em matrizes biológicas (29).
A espectrometria de massas é uma técnica baseada na formação de íons em fase gasosa das moléculas de interesse e posterior separação dos íons de acordo com suas diferentes razões massa/carga (m/z). Foi desenvolvimento por J.J. Thomson com seus experimentos sobre raios catódicos. Esta técnica vem sendo bastante aplicada na toxicologia forense, por ser uma das técnicas mais sensíveis para detecção de substâncias presentes em uma amostra. Essas particularidades são de suma importância para análise de matrizes biológicas complexas, tais como sangue (sangue total, plasma, soro, manchas de sangue seco), urina, conteúdo gástrico, tecidos, cabelo, fluido oral (29).
Um espectrômetro de massas é constituído de quatro partes principais (Figura 7), sendo um sistema de introdução de amostra, que pode ser por inserção direta ou utilizando alguma técnica de separação; uma fonte de ionização; um analisador de massas e um detector. Enquanto a fonte de ionização converte moléculas em íons, o analisador de massas separa estes íons em função da sua razão massa sobre carga (m/z).
Figura 7. Representação esquemática de um espectrômetro de massas.
Nas aplicações de espectrometria de massas acopladas à cromatografia líquida, as opções de fonte de ionização mais comuns incluem a ionização por eletrospray (ESI - do inglês, Electrospray Ionization), ionização química à pressão atmosférica (APCI - do inglês, Atmospheric Pressure Chemical Ionization) e fotoionização à pressão atmosférica (APPI - do inglês, Atmospheric Pressure Photoionization). Geralmente a escolha entre estas se dá pela polaridade e massa molar da substância de interesse.
Os analisadores de massas mais comuns são: quadrupolo, ion trap, tempo de vôo (TOF - do inglês, Time of Flight), Orbitrap e Ressonância Ciclotrônica de Íons com Transformada de Fourier (FT-ICR - do inglês, Fourier Transformation Ion Cyclotron Ressonance). Espectrômetros de massas híbridos ou sequenciais referem-se à combinação de dois ou mais analisadores, como por exemplo o triplo quadrupolo. Além disso, por meio de experimentos de dissociação induzida por colisão (CID - do inglês, Collision Induced Dissociation) podem ser realizados tanto em analisadores híbridos (ex. triplo quadrupolo ou um quadrupolo-TOF) quanto em analisadores de Trap e com isso é possível selecionar os íons e depois fragmentá-los, obtendo desta forma o perfil de fragmentação do composto para auxiliar na identificação mais precisa do analito de interesse. No caso de analisadores sequenciais, a identificação de compostos em misturas complexas pode ser feita através do monitoramento de reações múltiplas (MRM - do inglês, Multiple reaction monitoring). No método de MRM, é realizada uma otimização no equipamento, como por exemplo nos parâmetros de ionização: voltagem das lentes, fluxo, temperatura dos gases. Para um triplo quadrupolo, este modo de monitoramento funciona de maneira que no primeiro quadrupolo (Q1) as massas desejadas são selecionadas entre todos os íons formados na fonte (íon
precursor). Estes íons seguem para o segundo quadrupolo (Q2), que também é conhecido
como cela de colisão, onde uma voltagem chamada energia de colisão (CE - do inglês,
Introdução de amostras Fonte de ionização Analisador (m/z) Detector Vácuo
collision energy) é aplicada causando uma fragmentação deste íon precursor, e então no terceiro quadrupolo (Q3), estes fragmentos são identificados (íon produto).
Uma vez que as amostras biológicas utilizadas na toxicologia forense são consideradas matrizes complexas, o modo MRM é aplicado de forma a confirmar a estrutura do composto devido a sua alta seletividade e sem a interferência de espécies que podem estar coeluindo com o analito de interesse (28). Nos estudos sobre identificação e quantificação das NSP, as técnicas de análise mais empregadas são a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS - do inglês, gas chromatography - mass spectrometry) (30), cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas utilizando um analisador do tipo triplo quadrupolo (LC-QqQ-MS - do inglês, liquid chromatography - triple quadrupole mass spectrometry) (31,32) e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas utilizando um analisador do tipo tempo de vôo (LC-QToF-MS - do inglês, liquid chromatography - quadrupole time of flight mass spectrometry) (15,33).
2. Justificativa
Com o exposto, embora ainda não existam estatísticas oficiais no Brasil, a venda e o abuso de NSP já é uma realidade, e diversos relatos de intoxicações graves e mortes com envolvimento destes agentes tóxicos já foram citados tanto na literatura, quanto em imprensa nacional. As referências científicas com o intuito de identificar a presença de NSP em amostras de pacientes de unidades de emergência contribuem com a melhora do prognóstico e das ações preventivas, que podem auxiliar na resolução dessa questão que afeta a saúde pública mundial.
3. Objetivo geral
O objetivo deste projeto foi otimizar, validar e implementar método analítico qualitativo baseado em DLLME e LC-MS para identificar a presença de substâncias psicoativas, em especial as pertencentes às NSP da classe dos canabinóides sintéticos, fentanil e derivados e NBOMes em amostras de plasma.
3.1 Objetivos específicos
• Otimização do método; • Validação;
• Aplicação do método de extração em análises de amostras reais de casos de tentativa de suicídio.
4. Material e métodos
4.1. Reagentes, material de referência e padrões
Os reagentes utilizados para o preparo das amostras e análise cromatográfica foram: clorofórmio grau HPLC Sigma–Aldrich (Saint Louis, EUA), acetato de etila grau HPLC Sigma–Aldrich (Saint Louis, EUA), ácido fórmico ≥ 95 % da Sigma–Aldrich (Saint Louis, EUA), acetonitrila grau HPLC da Merck (Darmstadt, Germany), metanol grau HPLC da Merck (Darmstadt, Germany) e água utilizada será ultrapurificada em sistema Milli-Q (Millipore, EUA). Os padrões 25B-NBOMe, 25C-NBOMe, 25D-NBOMe, 25E-NBOMe, 25H-NBOMe, 25I-NBOMe, 25G-NBOMe, e foram obtidos da Cayman Chemical (Ann Arbor, EUA); acrilfentanil, acetilfentanil, acetilnorfentanil, acrilfentanil, alfentanil, carfentanil, fentanil, furanilfentanil, norfentanil, remifentanil, sufentanil, tiofentanil, valerilfentanil obtidos da Cayman Chemical (Ann Arbor, EUA); AM2233, AM2201, JWH-200, JWH-203, JWH-250, JWH-015, JWH-175, JWH-081, JWH-019, JWH-122, JWH-210, RCS-4, RCS-8, APINACA, AB-FUBINACA, AB-PINACA e PB-22 obtidos da Cayman Chemical (Ann Arbor, EUA).
As soluções estoque foram preparadas a partir de um mix de padrões de cada classe (NBOMes, CS e FD) em metanol na concentração de 1 mg/mL, a partir das quais foram preparadas soluções de trabalho nas concentrações de 1, 5, 10 e 100 µg/mL. Todas as soluções foram estocadas à 4 °C.
4.2. Planejamento experimental e procedimentos de extração
4.2.1. DLLME
Um planejamento fatorial (D-optimal) foi elaborado e o software Design-Expert (DX 6.0.4) foi utilizado para a escolha dos melhores solventes extratores, para obter a condição ideal de extração dos canabinóides sintéticos, de acordo com as seguintes combinações, descritas na tabela 1:
Tabela 1. Parâmetros avaliados no planejamento fatorial D-optimal
Solvente extrator Solventes dispersores Solvente extrator Solventes dispersores Clorofórmio Acetonitrila Diclorometano Acetonitrila
Clorofórmio Acetona Diclorometano Acetona
Clorofórmio Etanol Diclorometano Etanol
Clorofórmio Metanol Diclorometano Metanol
Clorofórmio 2-propanol Diclorometano 2-propanol
A técnica de DLLME convencional foi aplicada no preparo de amostras por dois procedimentos. O planejamento experimental foi aplicado no procedimento de extração 1 e, com base neste, o procedimento 2 foi então elaborado, diminuindo em três vezes os volumes dos solventes.
• Procedimento 1: foi adicionado em tubo cônico de polipropileno de 10 mL, 400 µL de plasma, seguido de 40 µL de um mix de padrão de CS 2,5 ng/mL e agitou-se em vórtex por 30 segundos. Foi adicionado 1200 µL do solvente dispersor, agitou-se por 1 minuto e a amostra foi centrifugada à 5500 rpm por 5 minutos para precipitação de proteínas. Foi coletado 500 µL do sobrenadante, adicionado 1 mL de água purificada e 100 µL de uma solução saturada de tetraborato de sódio pH 9, seguido de 100 µL do solvente extrator utilizando uma seringa de vidro. Agitou-se por 30 segundos e então a amostra foi novamente centrifugada por 5 minutos à 5500 rpm. Um volume de 200 µL foi transferido para um tubo de polipropileno 2 mL com tampa, o solvente foi evaporado sob fluxo de nitrogênio a 50 oC e ressuspendido com 100 µL de metanol e analisados por LC-MS.
• Procedimento 2: em tubo cônico de polipropileno de 10 mL foi adicionado 100 µL de plasma, contendo 10 µL de padrão interno MDMA-d5 e 10 µL de um mix de padrão de CS 0,1 ng/mL, agitou-se em vórtex por 30 segundos. Foi adicionado 300 µL do solvente dispersor, agitou-se por 1 minuto e a amostra foi centrifugada à 5500 rpm por 5 minutos para precipitação de proteínas. Foi coletado 500 µL do sobrenadante, e adicionado 600 µL de uma solução saturada de tetraborato de sódio pH 9, seguido de
100 µL do solvente extrator utilizando uma seringa de vidro. Agitou-se por 30 segundos e então a amostra foi novamente centrifugada por 5 minutos à 5500 rpm. Um volume de 200 µL foi transferido para um tubo de polipropileno 2 mL com tampa, o solvente foi evaporado sob fluxo de nitrogênio a 50 oC e ressuspendido com 100 µL de metanol.
4.2.2. LDS-DLLME
Para o desenvolvimento dessa outra abordagem de DLLME, um planejamento fatorial (one-design) foi elaborado utilizando o software Design-Expert (DX 6.0.4) a fim de realizar a otimização dos solventes extratores bem como realizar testes variando os tipos de agitação e os volumes, conforme demonstrado na tabela 2:
Tabela 2. Parâmetros avaliados no planejamento fatorial one-design
Solvente extrator
Volume (µL) Agitação Solvente
extrator
Volume (µL) Agitação
acetato de etila 100 Ultrassom Diclorometano 100 Ultrassom
acetato de etila 100 Vórtex Diclorometano 100 Vórtex
acetato de etila 100 Sem agitação Diclorometano 100 Sem agitação
acetato de etila 150 Ultrassom Diclorometano 150 Ultrassom
acetato de etila 150 Vórtex Diclorometano 150 Vórtex
acetato de etila 150 Sem agitação Diclorometano 150 Sem agitação
acetato de etila 200 Ultrassom Diclorometano 200 Ultrassom
acetato de etila 200 Sem agitação Diclorometano 200 Sem agitação
Aplicando os parâmetros através do planejamento experimental, a técnica de LDS-DLLME foi realizada pelo procedimento abaixo:
• Procedimento 3: Em tubo de polipropileno 2 mL com tampa, foi adicionado 100 µL de plasma, contendo 10 µL de padrão interno MDMA-d5 e 10 µL de um mix de padrão de CS na concentração de 1 ng/mL, agitou-se em vórtex por 30 segundos. Foi adicionado 100 µL de uma solução saturada de tetraborato de sódio pH 9, seguido do solvente extrator utilizando uma seringa de vidro. Agitou-se (ultrassom 5 min, vórtex 3 min ou sem agitação) e a amostra foi novamente centrifugada por 5 minutos à 5500 rpm. Um volume de 200 µL foi transferido para outro tubo de polipropileno 2 mL com tampa, o solvente foi evaporado sob fluxo de nitrogênio a 50 oC, e ressuspendido com 100 µL de metanol.
4.3. Validação do método analítico
Para a validação, seguiu-se as orientações do guia de validação do Grupo de Trabalho Científico de Toxicologia Forense (SWGTOX – do inglês, Scientific Working Group for Forensic Toxicology), no qual foram avaliados os parâmetros de validação qualitativos, que são: Limites de detecção, carryover, supressão iônica, efeito matriz, estudo de interferentes/seletividade. Além disso, foi feito um estudo de estabilidade dos analitos em amostras de plasma armazenada em freezer (17).
O limite de detecção (LOD) é um parâmetro que representa a menor concentração do composto avaliado que pode ser detectado na amostra. Foram testados LODs entre 0,1 e 1 ng/mL, e os valores foram calculados levando em consideração valores de sinal ruído do pico (S/N) maior ou igual a 3 (S/N≥ 3). A precisão, um parâmetro de validação quantitativa, foi aplicada juntamente com os testes do LOD, e é expressa através do coeficiente de variação (C.V.), sendo que este deve ser sempre menor ou igual a ±20% (imprecisão). As amostras foram preparadas para as três concentrações para avaliar ambos os parâmetros em triplicata.
A seletividade, avalia o grau em que o método pode distinguir o analito na presença de outros analitos, substâncias endógenas presentes na matriz, impurezas ou compostos de degradação. Logo, no estudo de seletividade é necessário verificar também a existência de efeito de matriz. Portanto, os estudos de seletividade/interferência foram realizados para testar a credibilidade do método de extração. Sendo assim, a seletividade do método foi avaliada em dez amostras quando em presença de outros compostos comumente encontrados conjuntamente em casos de intoxicação.
Uma vez que a matriz biológica pode conter compostos que podem interferir na análise e afetar a ionização dos analitos ao se trabalhar com ESI, foram realizados testes de efeito matriz, e, apesar do guia não prever o cálculo de recuperação, este parâmetro também foi avaliado, tendo em vista que baixas recuperações podem impactar na detectabilidade do método. Para tanto, foram preparadas três grupos de amostras em triplicata para cada classe de NSP, nas três concentrações de LOD estabelecidas, em que:
(i) Amostras de água ultrapura foram fortificadas com mix de padrões de cada classe e padrão interno (MDMA-d5);
(ii) Amostras de plasma foram fortificadas com mix de padrões de cada classe e padrão interno (MDMA-d5) antes da extração;
(iii) Amostras de plasma foram extraídas, evaporadas e subsequentemente reconstituídas em metanol fortificado com o mix padrões NPS e padrão interno, após a extração.
Os efeitos de matriz e a recuperação foram estimados comparando em percentual as áreas totais dos pico dos analitos nas amostras, e calculados pelas seguintes fórmulas:
A estabilidade de um analito geralmente é afetada por condições de armazenamento e processamento de amostras. As análises de estabilidade foram são conduzidas à partir do preparo de amostras fortificadas com os mix de padrões de NSP em triplicata e conservadas em freezer a -20°C, nas concentrações de 10 ng/mL. Estas amostras fortificadas são analisadas inicialmente para estabelecer respostas do intervalo zero. As respostas são
