Inicialmente, foi realizado o desenvolvimento do método cromatográfico para a análise das três classes de NSP (CS, FD e NBOMes). Foram realizadas injeções dos padrões individualmente para a otimização do método em um sistema LC-MS sem coluna nos modos de varredura de íons totais (fullscan) (intervalo de massas de 100 a 400 m/z) e escaneamento de íons produtos (intervalo de massas de 60 a 300 m/z) para avaliar o íons produtos. Após a otimização das transições MRM no modo fullscan, os respectivos tempos de retenção de cada analito foram obtidos utilizando uma coluna cromatógráfica, e os resultados da otimização
Um planejamento fatorial (D-optimal) foi elaborado através do software Design- Expert (DX 6.0.4) a fim de realizar a otimização dos solventes extratores e dispersores, para obter a melhor condição de extração dos canabinóides sintéticos. Inicialmente no procedimento 1, apenas os tipos de solventes foram variados. Outros parâmetros como volumes, salting-out, pH, tempo de agitação e centrifugação foram mantidos fixos. Para este planejamento, foram realizadas extrações usando acetonitrila (ACN), acetona, etanol e 2- propanol e metanol como solventes dispersores, e clorofórmio e diclorometano como solvente extratores. As extrações foram feitas em duplicata, com um total de 20 experimentos, por 10 combinações de solventes, desenvolvidos pelo planejamento. A matriz utilizada foi plasma, em que a primeira etapa foi constituida por precipitação de proteínas com o solvente dispersor escolhido à partir do planejamento. Com a fusão dessas duas etapas, ou seja, precipitação de proteínas utilizando o solvente dispersor, foi otimizado o tempo e volume da extração. Em seguida foi adicionado um mix de padrões de canabinóides sintéticos em tubo de polipropileno de 2 mL com tampa, na concentração de 2,5 ng/mL. Para encontrar a combinação ótima, ou seja, aquela capaz de extrair em maior quantidade todos os analitos simultaneamente, a área total de cada analito foi utilizada como resposta. As condições otimizadas são dadas por uma função denominada desejabilidade, a qual fornece, através de uma superfície de resposta, um ponto ótimo global denominado predição (0 ≤ predição ≤ 1). Dentre as 10 combinações, o software apontou as 7 melhores, como pode-se observar na Figura 8.
Tabela 3. Transições MRM monitoradas para cada NSP analisada no método proposto, e seus respectivos tempos de retenção.
ANALITOS Íon precursor
(m/z) Íon produto 1 (m/z) Íon produto 2 (m/z) Tempo de retenção (min) MDMA-d5 199,0 165,0 107,0 3,83 Acetilfentanil 323,3 188,2 105,2 5,68 Acetilnorfentanil 219,1 84,1 55,1 3,65 Acrilfentanil 335,3 105,1 188,2 6,12 Alfentanil 417,3 268,0 197,0 6,04 Carfentanil 395,3 335,1 113,2 6,27 Fentanil 337,3 105,1 188,1 6,13 Furanil fentanil 375,3 188,2 105,1 6,40 Norfentanil 233,3 84,0 55,1 4,46 Remifentanil 377,3 113,0 228,0 5,10 Sufentanil 387,2 238,1 111,0 6,62 Tiofentanil 343,1 111,0 194,1 5,98 Valerilfentanil 365,2 188,2 105,1 6,79 AB-FUBINACA 369,2 253,0 109,1 7,92 AB-PINACA 331,3 215,2 286,1 8,08 APINACA (AKB48) 366,3 135,2 107,0 9,76 AM2201 360,2 127,1 155,0 9,47 AM2233 459,1 98,1 112,1 6,47 HU-211 387,2 156,0 114,2 8,51 JWH-015 328,2 155,1 127,1 9,35 JWH-019 356,3 155,1 127,1 9,8 JWH-073 328,1 127,1 155,1 9,57 JWH-081 372,2 185,0 157,1 9,83 JWH-122 356,3 169,2 115,0 9,87 JWH-175 328,0 141,1 115,0 10,09 JWH-200 385,1 155,0 127,1 8,48 JWH-203 340,2 125,0 188,1 9,26 JWH-210 370,3 183,1 155,2 10,02 JWH-250 336,3 121,1 91,1 9,26 PB-22 359,1 214,1 144,0 9,37 RCS-4 322,3 135,1 77,0 9,21 RCS-8 376,3 121,1 91,0 9,75 XLR11 330,3 125,2 232,0 8,89 25B-NBOH 365,9 243,1 260,0 6,31 25B-NBOMe 380,0 121,1 91,1 6,91 25C-NBOH 321,9 199,1 216,2 6,13 25C-NBOMe 336,1 121,2 91,1 7,00 25D-NBOMe 316,3 121,1 91,0 6,82 25E-NBOMe 330,0 121,0 91,0 7,13 25G-NBOMe 330,0 121,0 91,0 7,13 25H-NBOMe 302,1 121,2 91,1 6,51 25I-NBOH 413,9 290,9 307,9 6,61 25I-NBOMe 428,1 121,2 91,0 7,19 25N-NBOMe 347,2 121,1 91,0 7,00 25T2-NBOMe 348,2 121,1 91,2 6,86
Figura 8. Gráfico da otimização dos solventes extrator e dispersor do método de extração por DLLME à partir do planejamento fatorial (D-optimal)
A combinação de solventes extrator e dispersor que foi considerada ótima e com melhor desejabilidade foi a mistura entre clorofórmio e acetonitrila, onde um valor 0,63 de predição, no qual indica que 63% das respostas, ou seja, área dos analitos, foi obtida em seu valor ótimo. Portanto, com o primeiro e mais importante fator otimizado, no procedimento 1, partiu-se para a realização do procedimento 2 em que outros parâmetros foram variados, os volumes de matriz foram reduzidos para 100 µL, do solvente dispersor 300 µL e a concentração do mix de padrão de CS foi de 0,1 ng/mL. Em relação à fase aquosa, não se introduziu água na amostra, apenas 600 µL de solução tampão tetraborato de sódio (TBS) pH 9, o que manteve o pH ajustado para meio básico em função das drogas sintéticas em sua maioria possuírem caráter básico, para avaliar se essa mudança no volume da solução tampão poderia influenciar na força iônica e auxiliar na separação de fases e se a diminuição do volume de fase aquosa influenciaria na solubilidade do meio. Modificações no pH da solução ou força iônica dos analitos não mostraram alterações nas áreas totais dos picos dos analitos, bem como a diminuição da fase aquosa coopera para uma possível diminuição da solubilidade do analito na fase aquosa e aumenta a eficiência de extração, o que torna o procedimento 2 mais viável do que o procedimento 1. Após extração, a análise por LC-MS foi realizada, utilizando o método otimizado.
No procedimento de LDS-DLLME é utilizado um solvente extrator de baixa densidade que é disperso diretamente na amostra, sem a presença de um solvente dispersor.
Por isso, é importante selecionar um solvente extrator que garanta uma boa eficiência de extração dos analitos de interesse. Um planejamento fatorial (One-design) através do software Design-Expert (DX 6.0.4.) foi elaborado a fim de realizar a otimização dos solventes extratores (acetato de etila e tolueno), volumes (100, 150 e 200 µL) e agitação: com agitação em ultrassom, agitação em vórtex por 3 minutos e sem agitação. Os testes foram realizados em duplicata, de acordo com a otimização do planejamento, com um total de 18 combinações. As áreas totais obtidas para a extração utilizando as diferentes combinações dos fatores, propostas pelo software, foram inseridas como resposta para que, através da função de desejabilidade fosse possível obter a combinação que favorecesse ao mesmo tempo todos os analitos. O software apontou as 10 combinações com os melhores valores de desejabilidade, como pode-se observar na Figura 9.
Figura 9. Gráfico da otimização de solvente extrator, volumes e agitação do método de extração por LDS-DLLME à partir do planejamento fatorial (One-design)
O solvente extrator considerado ótimo para a extração foi o acetato de etila em um volume de 200 µL com agitação em vórtex por 3 minutos, com um valor de desejabilidade de 0,82 de predição, indicando que 82% das respostas das áreas dos analitos foi obtida nesta condição. A Figura 10, 11 e 12 apresentam os cromatogramas dos compostos obtidos na análise utilizando o procedimento de LDS-DLLME.
Figura 10. Cromatogramas de íons extraídos da análise de CS na concentração de 1 ng/mL em plasma por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 11. Cromatogramas de íons extraídos da análise de FD na concentração de 1 ng/mL em plasma por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade do sinal, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 12. Cromatogramas de íons extraídos da análise de NBOMes na concentração de 1 ng/mL em plasma por LDS-DLLME. O eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Dentre os dois métodos de extração testados, o método de análise escolhido para a identificação das NSP foi do procedimento 3, de LDS-DLLME. O método apresentou resultados satisfatórios nas extrações das NSP estudadas, portanto o mesmo foi conduzido para os estudos de validação.
As NSP são drogas sintéticas muito potentes, e são comercializadas em concentrações desconhecidas. Odoardi et al. (15) em seu estudo, obtiveram limites de detecção de NSP que foram de 0,2 a 2 ng/mL. Portanto, foi estabelecido no método de identificação limites de detecção entre 0,1; 0,5 e 1 ng/mL, visto que são valores aproximados de concentrações geralmente encontradas em amostras de casos reais para as NSP estudadas. Uma vez que cada analito apresenta um LOD diferente e estes são consideravelmente baixos, adicionalmente foi aplicado um parâmetro de repetibilidade das áreas, para avaliar as condições de repetibilidade da medição dos LOD nas três faixas de trabalho.
Tanto o LOD quanto a repetibilidade foram avaliados em diferentes corridas durante 3 dias (inter-dia, n=3) e dentro de uma mesma corrida (intra-dia, n=3) para as 3 diferentes classes de NSP. Os resultados adquiridos de cada parâmetro podem ser observados na Tabela
2, nas concentrações de seus respectivos LOD, estes que foram obtidos experimentalmente pela reprodução dos picos dos analitos com uma resposta maior ou igual a três vezes o nível da razão de sinal/ruído (S/N ≥3), considerando critérios de detecção e identificação pré- definidos aceitáveis (como tempo de retenção, forma do pico).
Considerando os resultados do teste de precisão, expressos em coeficiente de variação (C.V.), os valores obtidos para o AB-FUBINACA, acetilnorfentanil, 25C-NBOMe foram os únicos que apresentaram-se fora da variação de precisão (até ±20%), em um dos testes intra- dia e os dois últimos nos testes inter-dia. No entanto, apesar da análise do dia II no teste intra- dia ter se apresentado fora da faixa aceitável (31,5% C.V.) para o AB-FUBINACA, este resultado exacerbado não influenciou no resultado do teste inter-dia, e pode ter ocorrido devido à alguma variação instrumental pontual do dia da análise, que causou um aumento na ionização do composto.
Um método é considerado seletivo quando produz respostas para vários analitos, principalmente pelo fato de que a matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da medição. Esses interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, comprometendo o resultado, e a concentração do analito também pode influenciar na magnitude desse efeito. Portanto, para os testes seletividade/interferência dez diferentes amostras de plasma de voluntários foram avaliadas pelo método, e nenhuma das amostras apresentou a presença de interferências ou falsos positivos (razão sinal/ruído ≥3).
Tabela 4. Valores dos testes de limite de detecção (LOD) e repetibilidade das áreas do método de LDS-DLLME aplicado nas NSP.
ANALITOS
LOD Intra-dia (%CV) Inter-dia (%CV)
ng/mL Dia 1 Dia 2 Dia 3
AB-FUBINACA 1 0,9 31,5 9,6 19,7 AB-PINACA 0,1 9 8,3 6,6 12,9 APINACA 0,5 5,5 6,2 5,5 8,2 AM2201 0,1 3,1 9,5 3,8 14,8 AM2233 0,1 15,5 9,8 2,6 9,4 JWH-015 0,1 7 11 8 15,2 JWH-019 0,1 4 7,7 2,5 14,8 JWH-073 0,1 5,5 7,7 2,5 7,7 JWH-081 0,1 4,3 6,1 7,8 5,8 JWH-122 0,1 6,8 3,5 13,5 8,8 JWH-175 0,5 1,5 10,3 16,5 19,7 JWH-200 0,5 3 6,9 4,6 7,3 JWH-203 0,5 3 4 2,4 8 JWH-210 0,5 10,3 7,2 11,7 11,1 JWH-250 0,1 14,8 14,6 18 14,3 PB-22 0,1 9,3 9,4 0,4 17,9 RCS-4 0,1 11,3 5,3 9,2 8,1 RCS-8 0,1 15 7,9 11 15,3 XLR11 0,5 3,2 9 0,8 7,2 Acetil fentanil 0,1 2,5 11,7 4 7,4 Acetil norfentanil 0,5 3,5 0,9 4,5 20,3 Acrilfentanil 0,1 8 7,3 4,5 10,4 Alfentanil 0,1 16,9 13,8 15,3 18,3 Carfentanil 0,1 5,1 5,6 5 5,7 Fentanil 0,1 6,7 3,8 7 10,5 Furanil fentanil 0,1 9,8 12,9 2,8 9,3 Norfentanil 0,5 4,5 3,2 10,5 4,3 Remifentanil 0,1 7,1 17,5 6,5 19,7 Sufentanil 0,1 11,4 5,1 6,1 14,3 Tiofentanil 0,1 1,9 9,3 14,5 14,3 Valerilfentanil 0,1 8,7 6,3 2,9 8,6 25B-NBOMe 0,5 6,4 3,7 2,3 7,4 25C-NBOMe 0,1 3,3 4,6 4 20,3 25D-NBOMe 0,1 3,4 5,1 5,2 10,4 25E-NBOMe 0,1 5,1 6,4 6,9 18,3 25G-NBOMe 0,1 9,9 7,3 2,4 5,7 25H-NBOMe 0,1 3,1 5,7 7,2 10,5 25I-NBOMe 0,1 12,9 3,7 4,3 4,3
O efeito de matriz e a recuperação (n=3) foram obtidos comparando as áreas totais dos pico dos analitos nas amostras em água ultrapura e quando adicionados em matriz antes extração das amostras. As recuperações foram avaliadas considerando as áreas totais dos picos dos analitos obtidos quando adicionados em matriz antes da extração das amostras e após a extração das amostras. Respectivamente, ambos foram avaliados em percentual, nas concentrações dos respectivos LOD de cada analito, e os valores obtidos estão representados na Tabela 3.
Comparando as áreas obtidas pelos analitos adicionados em água ultrapura e em matriz foi possível observar que os valores de efeito de matriz que se encontram dentro da faixa aceitável de ±20% variaram entre 1,6 e 13,4% para SC; 0,7 a 8% para FD e de 8,6 a 14,9% para os NBOMes. Porém, os valores de efeito de matriz do AB-PINACA, JWH-073, JWH-175, JWH-203, JWH-210 e JWH-250, acetilfentanil, acrilfentanil, carfentanil, furanilfentanil, norfentanil, remifentanil, sufentanil, 25B-NBOMe, 25D-NBOMe, 25E- NBOMe se apresentaram fora da faixa aceitável. Isso pode ter ocorrido devido à presença de interferentes ou contaminação externa às amostras, ou até mesmo pelo fato de que dentre as classes, estas NSP possuem em sua maioria uma similaridade estrutural, ou seja, são substâncias isobáricas que apresentam a mesma massa molecular e com fragmentação parecida, o que pode ter refletido tanto nos resultados de efeito de matriz e na recuperação, quanto no aumento da ionização do analito (17,33,34). Nestes casos, o efeito matriz acentuou a presença destes analitos nas amostras de plasma. Portanto, para esses analitos o método não se apresentou seletivo
,
porém esse fato não é critério para considerar o método de preparo inadequado, e, no geral, estes resultados não afetaram o LOD e a detecção dos mesmos analitos.
Tabela 5. Valores de recuperação e efeito matriz, da validação do método de LDS-DLLME aplicado nas NSP.
ANALITOS
Recuperação Efeito matriz
(%) (%) AB-FUBINACA 72,4 1,6 AB-PINACA 55,3 29,8 APINACA 31,9 11,8 AM2201 50,4 1,7 AM2233 62,3 13,4 JWH-015 51,2 5,2 JWH-019 33,5 12,2 JWH-073 45,1 25,9 JWH-081 42,8 2,9 JWH-122 46,5 2,4 JWH-175 40 68,9 JWH-200 54,2 4,3 JWH-203 55,9 34,3 JWH-210 52,2 26,8 JWH-250 114,4 192,3 PB-22 50,6 1,7 RCS-4 41,8 38,9 RCS-8 29,8 4 XLR11 53,2 33,5 Acetil fentanil 88,1 27,2 Acetil norfentanil 42 0,7 Acrilfentanil 77,8 36,3 Alfentanil 82,9 2,1 Carfentanil 69,4 37,4 Fentanil 80,7 1,8 Furanil fentanil 82,4 34,3 Norfentanil 73,6 39,9 Remifentanil 65,4 52,9 Sufentanil 69,6 45 Tiofentanil 80,1 8 Valerilfentanil 73,1 6,4 25B-NBOMe 88,1 32 25C-NBOMe 42 13,4 25D-NBOMe 77,8 23,1 25E-NBOMe 82,9 24,4 25G-NBOMe 69,4 8,6 25H-NBOMe 80,7 12,7 25I-NBOMe 73,6 14,9
Os valores de recuperação dos analitos após o método de extração apresentaram valores entre 29,8 e 114,4% para todos os analitos. Os analitos que apresentaram valores mais baixos de recuperação pode ser pelo fato de sua estrutura química apresentarem algum elemento que confere uma menor lipossolubilidade ao composto, o que pode atrapalhar na eficiência de extração, ou seja, no processo de partição do analito para a fase orgânica durante a extração (17,33).
Para os testes de carryover, os cromatogramas dos brancos injetados após as amostras fortificadas com o mix de padrões de NSP a 10 ng/mL não apresentaram picos com os íons correspondentes aos dos analitos do presente estudo. Desta forma, assegura-se que abaixo de 10 ng/mL as análises estão livres da ocorrência de contaminação por carryover.
Para os testes de estabilidade, as amostras de plasma fortificadas com os mix de padrões dos analitos foram preparadas e conservadas em freezer a -20°C. Os testes foram realizados nos intervalos de 04, 07, 15 dias na concentração de 10 ng/mL. Os valores de estabilidades de cada analito podem ser observados nas figuras abaixo.
Figura 13. Estabilidades em 0, 4, 7, 15 dias das NSP da classe de CS, respectivamente representado para cada analito. Eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, de acordo com a variação orientada pela SWGTOX (±20%) e (x) de acordo com o tempo de armazenamento (dias).
Figura 14. Estabilidades em 0, 4, 7, 15 dias das NSP da classe de FD, respectivamente representado para cada analito. Eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, de acordo com a variação orientada pela SWGTOX (±20%) e (x) de acordo com o tempo de armazenamento (dias).
Figura 15. Estabilidades em 0, 4, 7, 15 dias das NSP da classe de NBOMes, respectivamente representado para cada analito. Eixo (y) representa a intensidade das áreas dos picos, de acordo com a variação orientada pela SWGTOX (±20%) e (x) de acordo com o tempo de
armazenamento (dias).
De acordo com o guia de validação utilizado, considera-se como estável as espécies que se encontram dentro da precisão do método. Ou seja, que apresentam variação menor que ±20% em relação ao valor inicial, do intervalo zero. Através dos gráficos de estabilidade foi possível notar que, comparando os resultados dos intervalos propostos com os do intervalo zero, para as NSP da classe dos CS, os analitos se apresentaram em sua maioria decaimento com variações maiores do que ±20%. Karinen et al. (35) em seu estudo avaliou a estabilidade de 15 CS em amostras de sangue em tubos de vidro, e dentre eles, apenas um obteve uma variação maior do que ±20% (JWH-073), armazenado em -20°C. Adicionalmente, os CS podem ainda ter sofrido influência do material do tubo em que foram armazenados, polipropileno, que, segundo Karinen et al. (35) e Kneisel et al. (36) os CS possuem tal lipofilicidade a ponto de serem absorvidos pela superfície de contato do polipropileno em temperatura ambiente, ao qual as amostras foram preparadas. Para os FD e NBOMes, os resultados não se apresentaram muito diferentes, os analitos das classes se apresentaram instáveis quando armazenados por mais de 7 dias. Os decaimentos se apresentaram maiores principalmente no intervalo de 15 dias e, com isso, visto que todas as amostras do teste de estabilidade foram armazenadas nas mesmas condições, pode-se dizer que os analitos estudados são considerados instáveis quando em matriz biológica (plasma) armazenados por mais de 15 dias.
Após a validação, o método de LDS-DLLME foi aplicado na análise de dez amostras de casos reais de tentativa de suicídio. Nas figuras abaixo, os cromatogramas representam os resultados obtidos para nove amostras analisadas pelo método proposto.
Figura 16. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 1 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 17. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 2 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 18. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 3 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 20. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 5 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 21. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 6 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 22. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 7 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 23. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 8 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
Figura 24. Cromatogramas de íons extraídos da análise da amostra de plasma 9 de tentativa de suicídio por LDS-DLLME. O eixo (y) representa as áreas dos picos, e (x) o tempo de retenção (RT).
De uma forma geral, tanto a técnica de DLLME convencional, quanto a sua vertente LDS-DLLME são técnicas simples, rápidas, baratas, apresentam um alto fator de concentração, ‘environmental friendly’ (por utilizar pequenos volumes de solventes orgânicos, na escala de microlitros), que são características positivas, como mencionadas anteriormente pela literatura e comprovadas durante os experimentos. Contudo, apesar de ambas apresentarem uma boa performance analítica, seguem abaixo algumas vantagens da LDS- DLLME:
• Utiliza um solvente extrator com densidade menor que da água, facilitando assim a coleta do sobrenadante após a separação de fases, o que contribui para evitar contaminações da amostra, principalmente quando se aplica à análise de amostras biológicas;
• Pelo fato de não utilizar solvente dispersor, o solvente extrator é disperso diretamente na solução aquosa, o que aumenta a eficiência de extração dos analitos de interesse,
aliado ao fato de que torna a extração ainda mais rápida de ser operada;
• Coopera ainda mais para o meio ambiente, pelo fato de utilizar um volume ainda menor de solventes orgânicos, que são considerados tóxicos.
Frequentemente, existem situações de ingestão de mais de um agente tóxico nos casos de tentativas de suicídio, seja de medicamentos, praguicidas, drogas de abuso ou álcool. Nas dez amostras analisadas, o poli-consumo de substâncias foi observado, e das três classes de NSP estudadas, o fentanil foi detectado em nove casos, e em um deles o metabólito norfentanil, também foi detectado. Atualmente, muitos casos envolvendo mortes com o uso ilícito de fentanil e seus derivados têm sido relatados mundialmente, seja por uso terapêutico com dose elevada que leva à morte por overdose, ou com finalidade suicida. Strano Rossi et al., (37) desenvolveram um método de triagem para a detecção de fentanil, alfentanil, sufentanil, e o principal metabólito, norfentanil em urina por GC-MS, e foi aplicado em casos reais de morte por overdose e com finalidade suicida. Portanto, dada a relevância, a técnica de LDS-DLLME se demonstrou eficaz na aplicação proposta e adicionalmente foi considerada apta na identificação de drogas de outras classes, como de um outro opióide, a metadona, identificada em duas amostras, e outras drogas pertencentes à outras classes também foram detectadas. Dentre elas, as mais prevalentes foram as drogas da classe dos benzodiazepínicos e metabólitos (alprazolam, clonazepam, diazepam, temazepam, 7-aminoclonazepam), que foram detectadas em 9 casos, seguidos da presença de antidepressivos e metabólitos (citalopram, fluoxetina, mirtazapina, quetiapina, sertralina, venlafaxina, desmetilcitalopram e nortriptilina) também presentes em 9 casos. Antipsicóticos (haloperidol), e anestésicos (cetamina) também foram encontrados. Na décima amostra, não foi detectado nenhum analito proposto no método, bem como nenhum das classes encontrados nas outras. Comparando estes resultados, fica evidente que o poli-consumo de medicamentos da classe dos benzodiazepínicos e antidepressivos foram mais recorrentes dentre os casos de tentativa de suicídio avaliados. Porém, não exclui o fato de outras substâncias serem utilizadas para tal fim, como no caso do fentanil, em associação com os demais comumente utilizados.