Reagente de diagnóstico para a determinação quantitativa in-vitro da percentagem de Hemoglobina A1c (%HbA1c) por colorimetria e turbidimetria.

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Reagente de diagnóstico para a determinação quantitativa in-vitro da

percentagem de Hemoglobina A1c (%HbA1c) por colorimetria e

turbidimetria.

Instruções do teste

Para ensaio de HbA1c: A1c-H

■ Mundialmente, exceto nos EUA: 5.xx ■ Apenas para os EUA: 3.xx

Para ensaio de hemoglobina total: THb-H

■ Mundialmente, exceto nos EUA: 5.xx ■ Apenas para os EUA: 2.xx

Utilização

O ABX Pentra HbA1c WB Hemolysis é um reagente

adicional para utilização combinada no método quantitativo ABX Pentra HbA1c WB. As medições

percentuais de HbA1c são utilizadas na gestão clínica de diabetes, para avaliar a eficácia a longo prazo do controlo diabético.

Interesse clínico

(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7)

O valor HbA1c é obtido pela fixação não-enzimática do fragmento N-terminal da cadeia β da hemoglobina A0. Os níveis de HbA1c, que são proporcionais aos níveis de glicose no sangue, reflectem a concentração diária média de glicose durante os dois meses que antecedem a amostra de sangue. Estudos recentes mostram que a medição regular de HbA1c pode levar a alterações no tratamento da diabetes e ao aumento do controlo metabólico, indicado por uma redução nos valores de HbA1c.

O presente método de diagnóstico in vitro é, assim, utilizado para a determinação quantitativa da hemoglobina A1c (HbA1c), um marcador de diabetes, no

sangue humano. As medições obtidas com este procedimento podem ser utilizadas para o controlo da diabetes a longo prazo.

Método

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HbA1c é expresso como uma percentagem do conteúdo total de hemoglobina. De forma a que se determine as concentrações de THb por espectrofotometria, as diferentes formas de hemoglobina têm de ser convertidas em uma única forma, com um espectro de absorvância uniforme.

Os valores de HbA1c e hemoglobina total (THb) em µmol, obtidos com o teste, são utilizados para calcular a relação HbA1c/THb e não deverão ser utilizados individualmente para efeitos de diagnóstico.

Princípio (8):

As concentrações de hemoglobina total e o HbA1c são medidos, e a relação é expressa como uma percentagem de HbA1c. De modo a determinar o HbA1c como uma percentagem, são utilizados cinco reagentes: Antibody Reagent (R1) diluído com Diluent I (R5), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) e Total Hemoglobin Reagent (R4).

A amostra de sangue total é misturada com o Hemolysis Reagent (R3) (1 volume de amostra para 50 volumes de R3): Os glóbulos vermelhos são lisados e a cadeia da

hemoglobina é hidrolisada, pela acção de uma protease presente no reagente.

O Total Hemoglobin Reagent (R4) é utilizado para

deteminar a hemoglobina total. O método baseia-se na conversão de todas as formas de hemoglobina em hematina alcalina, numa solução alcalina de detergente não iónico, consoante a descrição no procedimento ■ ABX Pentra 400

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original, de Wolf et al. A reacção é activada pela adição de uma amostra de sangue previamente processada com

Total Hemoglobin Reagent (R4), resultando na

coloração verde da solução. A conversão dos diferentes tipos de hemoglobina em hematina alcalina com um espectro de absorvância definido permite calcular a concentração total de hemoglobina. A hemoglobina é medida através do método do ponto final, a 550 nm. Os níveis de hemoglobina são directamente proporcionais ao aumento no OD observado.

O teste de inibição da aglutinação de partículas de latex é utilizado para medir o HbA1c específico. Uma aglutinina (polímero sintético contendo várias cópias da porção imunorreactiva de HbA1c) causa a aglutinação das partículas de latex cobertas com anticorpos monoclonais de ratinhos, específicos para HbA1c.

Na ausência de HbA1c na amostra, a aglutinina no

Agglutinator Reagent (R2) e as micropartículas cobertas

com aglutinado do Antibody Reagent (R1).

A aglutinação leva ao aumento na absorvância da suspensão. A presença de HbA1c na amostra reduz a taxa de aglutinação, uma vez que o HbA1c entra em competição com o Agglutinator Reagent (R2) nos

pontos de docking dos anticorpos das micropartículas. Quanto maior a quantidade de HbA1c na amostra, menor a taxa de aglutinação. A reacção é medida pela absorvância a 550 nm, e a taxa de aglutinação é utilizada para calcular a concentração a partir de uma curva de calibração.

A percentagem de HbA1c é, então, calculada, utilizando-se os valores de HbA1c e hemoglobina total, em µmol.

Reagentes

O ABX Pentra HbA1c WB é um kit de vários reagentes.

Conteúdo do kit: Reagente 1: Antibody Reagent 1 x 23 mL Reagente 2: Agglutinator Reagent 1 x 23 mL Reagente 3: Hemolysis Reagent 1 x 110 mL Reagente 4:

Total Hemoglobin Reagent 2 x 21 mL

Reagente 5:

Diluent I 1 x 23 mL

Antibody Reagent (R1)

contém: partículas acopladas com anticorpos HbA1c (ratinho); albumina de soro bovino; solução tampão; surfactantes; conservantes.

Agglutinator Reagent (R2)

contém: hapteno de ligação covalente de polímeros; albumina de soro bovino; solução tampão; conservante; surfactantes.

Hemolysis Reagent (R3)

contém: pepsina de suíno; solução tampão; conservante. Este reagente também é vendido em separado, sob a referência A11A01730.

Total Hemoglobin Reagent (R4)

contém: hidróxido de sódio; surfactante.

Diluent I (R5)

contém: Conservante; NaCl.

ABX Pentra HbA1c WB deve ser utilizado de acordo

com a nota informativa deste reagente. O fabricante não se responsabiliza pelo seu desempenho caso seja utilizado de outro modo.

Preparação

1. Misture 1 volume de Antibody Reagent (R1) com 1

volume de Diluent I (R5) num frasco MBU de 100 mL,

Ref. A11A01759 e entorne-o num frasco de reagente de 15, 10 ou 4 mL.

2. Misture cuidadosamente o Agglutinator Reagent (R2)

virando-o ao contrário, e entorne-o num frasco de reagente de 10 ou 4 mL.

3. Misture cuidadosamente o Total Hemolysis Reagent

(R4) virando-o ao contrário, e entorne-o num frasco de

(3)

4. Coloque os frascos numa das áreas disponíveis. Utilize uma das seguintes opções:

■ um frasco de reagente de 15 mL

■ um frasco de reagente de 10 mL + um adaptador específico

■ um frasco de reagente de 4 mL + um adaptador específico

R 2

R 1 (diluído) R 4

5. Em caso de formação de espuma, retire-a com uma pipeta de plástico.

6. Coloque o tabuleiro de reagentes no compartimento de ABX Pentra 400 refrigeração de reagentes.

7. Antes de os utilizar, aguarde até que os reagentes se estabilizem no compartimento de refrigeração de reagentes durante uma hora.

Nota: Utilize apenas a quantidade necessária, e depois de os utilizar, coloque imediatamente os reagentes num ambiente frio, num frasco fechado.

As amostras e os controlos têm de ser diluídos a 1:51 com o Hemolysis Reagent (R3). Misture

cuidadosamente (evite a formação de espuma) e aguarde cinco minutos à temperatura ambiente, antes de proceder ao teste no dispositivo.

Exemplo de diluição:

6 µL de amostras/controlos + 300 µL de R3

As amostras necessitam de ser bem homogeneizadas antes do teste.

A utilização de uma pipeta de deslocamento positivo é recomendada, para a recolha do sangue total.

■ Os resultados de cada método (hemoglobina total e HbA1c) não devem ser utilizados em separado: apenas a relação HbA1c/THb deve ser utilizada.

■ Os ensaios têm de ser solicitados apenas utilizando a relação. Nunca solicite os ensaios HbA1c e THb em separado. A fórmula da relação tem de ser criada a partir da relação do NGSP (ver o Manual do Utilizador do ABX Pentra 400).

Calibrador

Para calibrar, utilize:

ABX Pentra HbA1c WB Cal, Ref. A11A01703 (não

incluído)

1 x 8 mL + 5 x 2 mL

A hemoglobina total é calibrada com o ABX Pentra HbA1c WB Cal (CAL 1), utilizando um valor alvo de

hemoglobina total.

Os calibradores e reagentes não dependem do lote, e são submetidos a um controlo de qualidade interno na HORIBA Medical.

A calibração do método HbA1c é levada a cabo utilizando

o ABX Pentra HbA1c WB Cal, que contém seis níveis de

calibrador de HbA1c.

Esses procedimentos de calibração são compatíveis com o certificado NGSP/DCCT.

Posição dos calibradores na prateleira de amostras correspondente: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Posição 1: CAL 1 (200 µL) para THb Posição 2: CAL 1 (200 µL) para HbA1c Posição 3: CAL 2 (150 µL)

Posição 4: CAL 3 (150 µL) Posição 5: CAL 4 (150 µL) Posição 6: CAL 5 (150 µL) Posição 7: CAL 6 (150 µL)

Nota: o CAL 1 na posição 1 é tomado como exemplo, e também pode ser colocado na posição 8, 9 ou 10.

Controlo

Para controlo de qualidade interno, utilize:

ABX Pentra HbA1c WB Control, Ref. A11A01704 (não

incluído)

Controlo normal: 2 x 0,25 mL (liofilisado) Controlo patológico: 2 x 0,25 mL (liofilisado)

Cada controlo deve ser analisado diariamente e/ou após a calibração.

A frequência dos controlos e os intervalos de confiança devem estar de acordo com as normas laboratoriais e com as diretivas específicas de cada país. Deve cumprir as diretrizes federais, estaduais e locais relativamente ao teste de controlo de qualidade dos materiais. Os resultados devem ficar dentro do intervalo dos limites de confiança definidos. Cada laboratório deve estabelecer o procedimento a seguir se os resultados excederem esses limites de confiança.

(4)

Materiais necessários mas não fornecidos

■ Analisador automático de química clínica:

ABX Pentra 400

■ Calibrador: ABX Pentra HbA1c WB Cal, Ref. A11A01703

■ Controlo: ABX Pentra HbA1c WB Control, Ref. A11A01704

■ ABX Pentra HbA1c WB Hemolysis Reagent, Ref. A11A01730, 1 x 110 mL

■ Frasco MBU de 100 mL, Ref.A11A01759 ■ Equipamento standard de laboratório.

Amostra

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■ Sangue total em EDTA.

Os anticoagulantes que não estão presentes na lista não foram testados pela HORIBA Medical e, portanto, não são recomendados para utilização com este ensaio.

Estabilidade (10):

■ A 20-25°C: 3 dias ■ A 2-8°C: 8 dias ■ A -20°C: 60 dias

As amostras congeladas devem ser descongeladas à temperatura ambiente e, de seguida, devem ser cuidadosamente misturadas, antes de serem utilizadas. Misture cuidadosamente as amostras de sangue, imediatamente antes de proceder ao teste, de forma a poder garantir a precisão dos resultados de THb.

Intervalo de referência

(4, 11, 12, 13, 14, 15) Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios intervalos de referência. Os valores aqui fornecidos são utilizados apenas como linhas de orientação.

Cada laboratório deverá certificar-se de que os seus valores standard são compatíveis com os valores de referência do NGSP.

Esta técnica obteve o certificado NGSP, com 4 a 6% de HbA1c como valor standard em não diabéticos, com o objectivo terapêutico de obter valores < 7%, consoante recomendação da ADA (American Diabetes Association). Todos os resultados deverão ser interpretados à luz das análises clínicas gerais dos pacientes.

Limites do método (11):

A maioria dos pacientes possui níveis de hemoglobina entre 4,4 mmol/L e 14,4 mmol/L.

No entanto, as publicações especializadas demonstram que os níveis de hemoglobina dos pacientes com anemia grave podem ser inferiores a 4,4 mmol/L, e que os níveis de hemoglobina dos pacientes com policitemia podem exceder 14,4 mmol/L. Quando forem conhecidos pacientes que tenham estes sintomas, estes deverão ser testados utilizando-se outro método, se os seus valores de hemoglobina estiverem fora do intervalo de medição. Qualquer condição que afecte o ciclo de vida dos glóbulos vermelhos (tal como uma anemia hemolítica ou outras doenças hemolíticas, gravidez ou uma perda de sangue significativa...) causa uma redução na exposição dessas células à glicose e, consequentemente, uma redução nos níveis de hemoglobina glicada (Ghb). Os resultados de Ghb % não são fiáveis nos pacientes que sofrem de perda de sangue crónica e, consequentemente, ciclos de vida variáveis dos eritrócitos.

As amostras contendo hemoglobina C e S podem causar um aumento do valor esperado de HbA1c. Para além disso, as amostras contendo altos níveis de hemoglobina F (> 15%) poderão gerar resultados de HbA1c menores do que os esperados.

Não existe interferência com a hemoglobina carbamilada e acetilada.

Este teste não é fiável para o diagnóstico de diabetes mellitus (16, 14).

Este teste não é útil para avaliar o controlo diário de glicose, e não deverá ser utilizado para subsituir os testes diários caseiros de glicose sanguínea (14).

Armazenamento e Estabilidade

Proteger contra temperaturas extremamente quentes ou frias e manter ao abrigo da luz.

Os reagentes, nos frascos abertos ou por abrir, mantêm-se estáveis até à data de validade indicada no rótulo, mantêm-se armazenados bem fechados na embalagem original, entre 2-8°C, e evitando-se contaminação.

Estabilidade do reagente:

A estabilidade do reagente após a reconstituição é de 60 dias se armazenado num frasco MBU fechado entre 2 e 8°C.

Gestão de resíduos

(5)

Precauções gerais

a

■ Este reagente destina-se apenas a diagnóstico in vitro profissional.

■ Sujeito a prescrição.

■ Este reagente é classificado como perigoso de acordo com a regulamentação (EC) N°.1272/2008.

■ Antibody Reagent (R1):

Cuidado

H317: Pode provocar uma reacção alérgica cutânea. Aviso: Este reagente é obtido a partir de substâncias

de origem animal. Consequentemente, deve ser tratado como potencialmente infeccioso e manuseado com a devida cautela, de acordo com as boas práticas laboratoriais (17).

P261: Evitar respirar as poeiras/fumos/gases/névoas/

vapores/aerossóis.

P272: A roupa de trabalho contaminada não pode sair

do local de trabalho.

P280: Usar luvas/vestuário de protecção e protecção

ocular/facial.

P302 + P352: SE ENTRAR EM CONTACTO COM A

PELE: lavar com sabonete e água abundantes.

P321: Tratamento específico (ver [***] no presente

rótulo).

P333 + P313: Em caso de irritação ou erupção

cutânea: consulte um médico.

P362 + P364: Retirar a roupa contaminada e lavá-la

antes de a voltar a usar.

P501: Descartar o conteúdo e os recipientes de

acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais.

■ Agglutinator Reagent (R2):

Cuidado

H317: Pode provocar uma reacção alérgica cutânea. Aviso: Este reagente é obtido a partir de substâncias

vapores/aerossóis.

P280: Usar luvas/vestuário de protecção e protecção

ocular/facial.

rótulo).

■ Hemolysis Reagent (R3):

Aviso: Este reagente é obtido a partir de substâncias

■ Total Hemoglobin Reagent (R4):

Cuidado

H290: Pode ser corrosivo para os metais.

P234: Conservar unicamente no recipiente de origem. P390: Absorva o derramamento para não danificar o

material.

P406: Armazenar num recipiente resistente à corrosão

com um revestimento interior resistente.

(6)

■ Diluent I (R5):

Perigo

H314: Provoca queimaduras na pele e lesões oculares

graves.

H318: Provoca lesões oculares graves.

H317: Pode provocar uma reacção alérgica cutânea. P260: Não respirar as poeiras/fumos/gases/névoas/

vapores/aerossóis.

P264: Lavar as mãos cuidadosamente após

manuseamento.

P280: Usar luvas de protecção/vestuário de

protecção/protecção ocular/protecção facial.

P301 + P330 + P331: EM CASO DE INGESTÃO:

enxaguar a boca. NÃO provocar o vómito.

P303 + P361 + P353: SE ENTRAR EM CONTACTO

COM A PELE (ou o cabelo): retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água/ tomar um duche.

P304 + P340: EM CASO DE INALAÇÃO: retirar a

pessoa para uma zona ao ar livre e mantê-la numa posição que não dificulte a respiração.

P305 + P351 + P338: SE ENTRAR EM CONTACTO

COM OS OLHOS: Enxaguarcuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto,retire-as, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar.

P310: Contacte imediatamente um CENTRO DE

INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico.

rótulo).

P363: Lavar a roupa contaminada antes de a voltar a

usar.

P405: Armazenar em local fechado à chave.

■ Os frascos de reagente são descartáveis e devem ser eliminados de acordo com os requisitos da legislação local.

■ Consulte a MSDS (folha de dados de segurança do material) relacionada com o reagente.

■ Não utilizar o produto se houver evidência visível de deterioração biológica, química ou física.

■ É da responsabilidade do utilizador verificar se este documento se aplica ao reagente utilizado.

Desempenho do ABX Pentra 400

Os dados de desempenho enunciados em seguida foram obtidos a partir do analisador ABX Pentra 400.

Número de testes: 381 testes

Volume da amostra (após o processamento):

Hb: 25 µL/teste HbA1c: 3 µL/teste

Limite de deteção (THb):

O limite de detecção é determinado de acordo com o protocolo CLSI (NCCLS), EP17-A (18) e equivale a 1,61 µmol/L (0,42 g/dL).

Limite mínimo de interpretação:

O limite mínimo de interpretação (MIL) de HbA1c é avaliado através de várias determinações de amostras de baixa concentração, e equivale a 0,17 µmol/L (0,05 g/dL).

Exactidão e Precisão:

■ Repetibilidade (precisão no mesmo ciclo)

3 amostras de concentrações baixa, média e alta e 2 controlos são testados 20 vezes de acordo com as recomendações especificadas no protocolo Valtec (19).

Valor médio %HbA1c CV %

Amostra de controlo 1 4,94 0,88

Amostra 1 5,14 0,64

Amostra 2 6,97 1,06

Amostra 3 9,32 1,16

■ Reprodutibilidade (precisão total)

3 amostras de nível baixo, médio e elevado e 2 controlos são testados em duplicado durante 20 dias (2 séries por dia) de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP5-A2 (20).

Valor médio %HbA1c CV %

Amostra 1 4,76 1,37

Amostra 2 6,75 1,90

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Gama de medição da hemoglobina total e método de HbA1c:

A linearidade do reagente é determinada de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP6-A (21).

Linearidade baixa:

para Hemoglobina total: 1,60 µmol/L (0,42 g/dL)

para HbA1c: 0,17 µmol/L (0,05 g/dL)

Linearidade elevada:

para Hemoglobina total: 85,00 µmol/L (22,41 g/dL)

para HbA1c: 10,80 µmol/L (2,85 g/dL)

O intervalo do método de hemoglobina total no qual o valor %HbA1c é considerado preciso, encontra-se entre 17,5 a 85,0 µmol/L (4,61 a 22,41 g/dL).

O ensaio confirmou uma gama de medição de 4,44 a 16,68 %HbA1c.

As amostras não devem ser diluídas, caso a concentração de HbA1c seja superior ao ponto mais elevado de calibração de 10,80 µmol/L (2,85 g/dL). No caso em que a concentração em HbA1c é superior ao ponto mais elevado de calibração, as amostras não devem ser diluídas. No entanto, é possível calcular o menor valor de %HbA1c da amostra com a concentração em THb, fornecendo o resultado como: “Superior a...xxx”. Exemplo:

Se a concentração de THb for 44,0 µmol/L (11,6 g/dL), o menor valor de %HbA1c para o método será:

- Em µmol/L: (10,80)/44,00 x 100 = 24,6 %HbA1c (aplicar a estes resultados o fator de correção = 12,8%).

- Em g/dL: (2,85)/11,6 x 100 = 24,6 %HbA1c (aplicar a estes resultados o fator de correção = 12,8%).

O resultado de %HbA1c para esta amostra é: Superior a xxx.

xxx = (a x 24,6%) + b a = curva de NGSP b = intersecção de NGSP

Correlação:

120 amostras de pacientes (sangue total) estão correlacionadas com um reagente já comercializado tomado como referência de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP9-A2 (22). Valores no intervalo de 4,51 a 12,56% de HbA1c.

A equação da linha alométrica obtida por meio do procedimento de regressão Passing-Bablock (23) é: Y = 1,10 X - 0,58 (%HbA1c)

com um coeficiente de correlação r2_{= 0,9944.}

Interferências:

Triglicéridos: Não se observa influência significativa até uma concentração de Intralipid® (representativa de lipémia) de 7 mmol/L (612,5 mg/dL).

Bilirrubina total: Não se observa influência significativa até 561 µmol/L (32,8 mg/dL).

Bilirrubina

directa: Não se observa influênciasignificativa até 587 µmol/L (34,3 mg/dL).

Ácido ascórbico: Não se observa influência significativa até 3,40 mmol/L (59,8 mg/dL).

Hemoglobina

lábil: Não se observa interferência com ahemoglobina lábil. Outros limites são fornecidos por Young através de uma lista de medicamentos e variáveis pré-analíticas conhecidas que afectam esta metodologia (24, 25).

Estabilidade de calibração:

O reagente é calibrado no Dia 0. A estabilidade de calibração é verificada testando 2 amostras de controlo. A estabilidade da calibração é de 30 dias.

Nota: Recomenda-se uma recalibração quando os lotes de reagente mudam e quando os resultados do controlo de qualidade ficam fora do intervalo de valores estabelecido.

Relação do NGSP:

A fórmula tem de ser introduzida no analisador utilizando a última relação do NGSP disponível em

www.horiba-abx.com/documentation. O manual do operador do analisador contém mais informação acerca deste tópico.

Exemplo de fórmula para NGSP 2015: ■ No certificado: HbA1c (%) = (0,43*X) + 2,25 ■ No instrumento: HbA1c (%) = (4300*(A/B)+225)/100 Nota: A = A1c-H B = THb-H

Os resultados em %HbA1c são determinados para o método de referência do Diabetes Control and Complications Trial (DCCT).

Instruções do teste:

Mundialmente, exceto nos EUA: para ensaio de HbA1c (A1c-H): 5.xx

para o ensaio de hemoglobina total (THb-H): 5.xx Apenas para os EUA:

(8)

para o ensaio de hemoglobina total (THb-H): 2.xx

Bibliografia

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