ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES SERPINA1 E TFF3 NA PREDIÇÃO DO ENVOLVIMENTO DE LINFONODOS EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS

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XX Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XVI Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e VI

Encontro de Iniciação à Docência – Universidade do Vale do Paraíba. 1

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES SERPINA1 E TFF3 NA PREDIÇÃO DO

ENVOLVIMENTO DE LINFONODOS EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS

Silva RM

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_{, Ribeiro EA}

1

_{, Canto AL}

2

_{, Moraes LHF}

3

_{, Canevari RA}

1

1 _{Laboratório de Biologia Molecular do Câncer, LEVB, Universidade do Vale do Paraíba, IP&D;} 2_{Centro de Medicina Diagnóstica, São José dos Campos, Brasil;}

3_{Hospital São Francisco de Assis, Departamento de Mastologia, Jacareí, Brasil.} raissa_monteiro_silva@yahoo.com.br

Resumo – O status dos linfonodos axilares é o fator prognóstico mais informativo no tratamento das pacientes com câncer de mama. Contudo, atualmente na prática clínica a decisão da dissecção dos linfonodos é ainda realizada por meio da biópsia do linfonodo sentinela, o que muitas vezes pode trazer sequelas para a paciente ou originar resultados incorretos. Assim, a identificação de marcadores moleculares no tumor primário que possa permitir uma classificação mais precisa das pacientes em relação à necessidade ou não da dissecação dos linfonodos axilares, é extremamente importante para uma conduta clínica mais adequada. O objetivo deste estudo foi determinar se os genes SERPINA1 e TFF3 são marcadores preditivos em câncer de mama pela análise de expressão gênica de RT-qPCR. Para isto, foi comparado o grupo de tumores primários com envolvimento de linfonodos e tumores primários sem linfonodos acometidos, além da análise dos linfonodos correspondentes. Nossos resultados demonstraram que ambos os genes analisados não possuem papel preditivo relacionado ao desenvolvimento destes carcinomas.

Palavras-chave:

expressão gênica, linfonodo axilar, câncer de mama.

Área do Conhecimento: Biomedicina

Introdução

O câncer de mama é o tumor mais incidente no mundo e com a maior taxa de mortalidade no gênero feminino (WHO, 2015). Considerando ambos os sexos, este tumor é o segundo tipo de câncer mais frequente do mundo e o mais comum entre as mulheres, sendo considerada a segunda causa de morte por câncer nos países desenvolvidos e a primeira em países em desenvolvimento (WHO, 2015). Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), a estimativa do número de casos novos de câncer de mama esperados para a população brasileira em 2016 é de 57.960 (INCA, 2016). Apesar de ser considerado um câncer de bom prognóstico se diagnosticado e tratado oportunamente, as taxas de mortalidade continuam elevadas, porque muitos casos ainda são diagnosticados em estágios mais evoluídos. Do ponto de vista histológico e genético, estes tumores são heterogêneos, constituído por uma variedade de tipos celulares e apresentando perfis genéticos diferentes mesmo considerando o mesmo tipo histológico (JORNS et al., 2014).

A busca por marcadores moleculares como fatores preditivos do acometimento de linfonodos em câncer de mama auxilia na seleção mais precisa das pacientes onde a dissecação dos linfonodos axilares é indicada em relação às pacientes onde este procedimento é desnecessário (CHENG et al., 2011). Além disso, é importante identificar e determinar se as alterações na expressão gênica que ocorrem em metástases de linfonodos axilares regionais são similares ao tumor primário para evitar a dissecação total dos linfonodos axilares (SHRIVER et al., 2014). Pacientes com acometimento de linfonodos são consideradas como um subgrupo de prognóstico desfavorável, ou seja, com uma maior probabilidade de desenvolver metástase em órgãos distantes (MOEBUS et al., 2010). Com o advento dos métodos diagnósticos moleculares baseados em PCR, em especial a técnica de PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR), tem sido possível a detecção de marcadores moleculares em tumores primários de câncer de mama com significativo potencial preditivo e prognóstico em relação ao risco de metástases axilares e sistêmicas, respectivamente (KUROSUMI e TAKEI, 2007; SHRIVER et al.,2014; CANEVARI et al., 2016).

O objetivo deste estudo consistiu em avaliar o potencial preditivo dos genes SERPINA1 e TFF3 em relação ao risco das pacientes com câncer de mama desenvolver metástases axilares, e assim

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auxiliar na seleção mais precisa das pacientes onde a dissecação dos linfonodos axilares é desnecessária das pacientes onde este procedimento é indicado. Para isso, a análise de expressão gênica pela RT-qPCR foi realizada em pacientes com tumores primários com acometimento de linfonodos e pacientes com tumores primários sem envolvimento de linfonodos, além da realização da análise de expressão gênica nos linfonodos acometidos pelas células tumorais.

Metodologia

Neste estudo foram utilizadas 51 amostras de tumores primários, obtidas imediatamente após a cirurgia de pacientes com câncer de mama, sendo 28 tumores primários linfonodo negativo, 23 tumores primários linfonodo positivo e 11 amostras de metástases nos linfonodos axilares correspondentes. Duas comparações foram realizadas: na análise 1 foi comparado amostras de tumor primário de pacientes com acometimento de linfonodos versus tumor primário de pacientes linfonodo negativo; na análise 2 foi comparado o tumor primário com o linfonodo correspondente em cada paciente. Amostras de tecido normal foram obtidas de pacientes submetidas à redução mamária e serviram como controle do estudo. As amostras são provenientes do biorrepositório pertencente ao Laboratório de Biologia Molecular do Câncer (Grupo LEVB) do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento/UNIVAP. O projeto obteve aprovação do Comitê de Ética da Universidade do Vale do Paraíba (n° parecer 1.400.691).

A extração do RNA foi realizada segundo o protocolo RNeasy Lipid Tissue (Qiagen). As caracterizações quantitativas e qualitativas das amostras de RNA extraídas foram feitas pelo método de espectroscopia de absorção no ultravioleta no equipamento NanoDrop (ND-1000

Spectrophotometer v.3.0.1, Labtrade) e eletroforese em gel de agarose a 1%, respectivamente. A

síntese de cDNA foi realizada pelo sistema de pré-amplificação Superscript™ IV, que inclui os reagentes SuperScript ® IV / RNaseOUT™ Enzyme Mix, 2X First-Strand Reaction Mix, e Buffer de anelamento (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA).

Os iniciadores para a amplificação dos genes SERPINA1 e TFF3 foram desenhados no software

Primer Express (versão 3.0) (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A detecção de

alterações de expressão gênica pela RT-qPCR foi realizada no equipamento ABI PRISM 7500

Sequence Detection Systems (Life Technologies, USA). O reagente Platinum® SYBR® Green RT-qPCR Super Mix UDG (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) foi utilizado nas

reações de análise de expressão.

Foi realizada a curva padrão tanto para os genes alvos SERPINA1 e TFF3, quanto para o gene endógeno MRLP19, possibilitando o cálculo da eficiência de amplificação dos iniciadores de cada gene bem como a definição da melhor diluição a ser utilizada no experimento. A curva de dissociação, que avalia a temperatura do pico de amplificação para cada gene versus a intensidade da fluorescência, foi obtida para cada gene, onde foi possível averiguar se houve a presença de

primer dimers e a presença de quaisquer contaminantes na análise. Os thresholds definidos foram os

mesmos em todas as corridas PCR arrays.

A análise da expressão relativa para cada gene alvo e a consequente obtenção dos QR (quantificação relativa ou fold change) foi realizada pelo método Delta Delta Ct (PFAFFL, 2001). Os valores médios dos Cts obtidos para os genes alvos foram comparados com a média dos Cts do gene endógeno e posteriormente normalizados pela média das amostras normais para a obtenção dos valores de QR.

O QR ou fold change (2^(- Delta Delta Ct)), que consiste no valor da expressão do gene normalizado (2^(- Delta Ct)) nas amostras do grupo experimental dividido pela expressão do gene normalizado (2^(- Delta Ct)) na amostra do grupo controle (não tumoral), foi calculado para cada gene. Este cálculo é dado pela fórmula: 2^(-DDCt). Os valores de fold-change maior que dois indica um aumento de expressão para o gene alvo, e o fold-change menor que 0,5 indica diminuição de expressão gênica, com grau de significância de p- value < 0,05 (teste t de Mann Whitney).

Resultados

A análise quantitativa das amostras de RNA, realizada por meio da espectroscopia de absorção no ultravioleta, apresentou razões 260/280 e 260/230 acima de 1.8 e concentrações (ng/µL) em média

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de 700 ng/µL. Estes resultados demonstraram a ausência de contaminação por proteínas e reagentes, e a integridade do RNA extraído, requisito para a realização da análise de RT-qPCR.

A análise da curva padrão foi realizada pelos valores de slope fornecidos pelo software, os quais estiveram próximos ao valor de -3,3, sendo este o valor esperado. Os valores de slope, eficiência do iniciador e o coeficiente de linearidade foram de -3,31, 100 e 0,98, para o gene SERPINA1, respectivamente. Para o gene TFF3, os valores de slope, a eficiência do iniciador e o coeficiente de linearidade foram de -3,49, 93 e 0,9 , respectivamente. O gene endógeno MRLP19 apresentou os valores de -3,35, 99 e 0,99, referentes ao slope, eficiência do iniciador e o coeficiente de linearidade, respectivamente. A curva de dissociação demonstrou que não houve contaminação ou presença de

primer dimers durante a reação para todos os genes avaliados.

Na análise 1, na comparação entre o grupo de pacientes com tumores primários sem acometimento de linfonodos com o grupo de pacientes com tumores com envolvimento de linfonodos não foi detectada diferença significativa para os genes avaliados (P < 0,05) (Tabela 1 e Figura 1). Para o gene SERPINA1, no grupo de pacientes com tumor primário sem acometimento de linfonodos nenhuma amostra apresentou diminuição de expressão gênica, 14 amostras apresentaram aumento de expressão (QR = 2,71 a 2594,15) e 14 amostras apresentaram expressão normal. No grupo de pacientes com tumor primário com acometimento de linfonodos, nenhuma amostra apresentou diminuição de expressão, 10 amostras apresentaram aumento de expressão (QR = 2,54 a 87,57) e em 13 amostras apresentaram expressão normal. Na comparação entre os dois grupos não foi observada nenhuma diferença significativa (P = 0,3518).

Para o gene TFF3, no grupo de pacientes com tumor primário sem acometimento de linfonodos, sete amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,01 a 0,40), 17 amostras apresentaram aumento de expressão (QR = 2,09 a 4998,91) e em nenhuma amostra apresentou expressão normal. No grupo de pacientes com tumor primário com acometimento de linfonodos, quatro amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,02 e 1,13), 13 amostras apresentaram aumento de expressão (QR = 3,88 a 116,56) e em seis amostras apresentaram expressão normal. Na comparação entre os dois grupos não foi observada nenhuma diferença significativa (P = 0,2606).

Tabela 1. Valores de p value referentes a comparação da expressão gênica do grupo de amostras da Análise 1 e da Análise 2 (teste de Mann Whitney).

Gene p value Análise 1 p value Análise 2

SERPINA1 0,3518 0,4194

TFF3 0,2606 0,2540

Figura 1. Comparação entre as médias dos níveis de expressão dos genes SERPINA1 e TFF3 dos tumores primários linfonodo positivo versus linfonodo negativo pela análise de RT-qPCR (Análise 1).

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Na análise 2, na comparação entre os tumores primários com os linfonodos correspondentes das mesmas pacientes, não se observou diferença significativa para os genes avaliados(P < 0,05) (Tabela 1 e Figura 2). Para o gene SERPINA1 em amostras de tumor primário, nenhuma amostra apresentou diminuição de expressão, em sete amostras foi possível observar aumento de expressão (QR = 3,48 a 87,57) e quatro amostras apresentaram expressão normal. Nas amostras de linfonodos das pacientes, duas amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,12 e 0,21), em sete amostras foi possível observar aumento de expressão (QR = 2,16 e 68,75) e duas amostras apresentaram expressão normal. Quando comparado os dois não foi observada nenhuma diferença significativa (P = 0,4194).

Para o gene TFF3, nas amostras de tumor primário três amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,01 a 0,35), em sete amostras foi possível observar aumento de expressão (QR = 3,14 a 267,77) e uma amostra apresentou expressão normal. Nas amostras de linfonodos das pacientes, quatros amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,00 a 0,47), em seis amostras foi possível observar aumento de expressão (QR = 2,51 a 101,61) e uma amostra apresentou expressão normal. Quando comparado os dois grupos não foi observada nenhuma diferença significativa (P = 0,2540).

Figura 2. Comparação entre as médias dos níveis de expressão dos genes SERPINA1 e TFF3 dos tumores primários e linfonodos correspondentes pela análise de RT-qPCR (Análise 2).

QR: quantificação relativa do gene. TP: tumor primário Discussão

Em câncer de mama, os linfonodos axilares são, na maioria dos casos, o primeiro sítio de metástase, sendo considerado o fator mais importante no estadiamento e na avaliação prognóstica das pacientes com este tipo de neoplasia (MOEBUS et al., 2010; CHENG et al., 2011; LEE et al., 2011). Portanto, a identificação de genes envolvidos no estabelecimento de metástases nos linfonodos axilares poderá auxiliar no entendimento do processo metastático deste tumor.

Em um estudo recente, Shriver et al. (2014), ao avaliar o fator preditivo do acometimento de linfonodos axilares em pacientes com câncer de mama, identificaram sete genes (DKK1, IGJ,

SCGB1D2, SERPINA1, TFF1, TFF3 e TMSB15A) com expressão diferencial quando compararam

tumores primários obtidos de pacientes linfonodo negativo com tumores primários linfonodo positivo. Contudo, neste estudo não foi possível realizar a estratificação dessas pacientes por meio da avaliação do status do linfonodo do tumor primário (SHRIVER et al., 2014).

Para a validação do potencial preditivo dos genes SERPINA1 e TFF3, identificados previamente por Shriver et al. (2014), foi realizado no presente estudo a análise de expressão desses genes em tumores de pacientes brasileiras com câncer de mama com e sem metástases nos linfonodos axilares. Para o nosso conhecimento, Shriver et al. (2014) avaliou o potencial preditivo destes genes em câncer de mama, onde a maioria dos trabalhos em literatura avaliam somente o potencial prognóstico desses genes.

Os resultados obtidos do presente estudo demonstraram que os genes analisados SERPINA1 e

TFF3 não apresentaram expressão diferencial significativa em ambas as análises realizadas (Análise 1 e Análise 2), sugerindo que os mesmos não podem ser considerados marcadores preditivos em pacientes brasileiras acometidas com câncer de mama. O gene SERPINA1 é um inibidor de

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protease que degrada a matriz extracelular, conferindo capacidade invasiva e metastática em diversos tipos de cânceres tais como, pulmão, câncer gástrico, carcinoma papilífero de tireoide e câncer de mama (THONGWATCHARA et al., 2011; CHAN et al., 2015; KOWN et al., 2015). No estudo de CHAN et al. (2015) foi sugerido que o gene SERPINA1 está relacionado a menor sobrevida de pacientes com câncer de mama ER+ / HER2+ (CHAN et al., 2015). O gene TFF3 tem o papel de estimular a angiogênese, promover a proliferação celular, sobrevivência, oncogenicidade e invasão linfática em carcinomas mamários (AHMED et al, 2012; PANDEY et al, 2014). Adicionalmente, há evidências que este gene estimula a migração e invasão de células de câncer de mama, principalmente em linfonodos (MAY e WESTLEY, 2015). Embora ambos os genes analisados possuam um papel direto na carcinogênese mamária e invasão linfática, os resultados não significativos obtidos neste estudo pode ser explicado pela grande heterogeneidade genética e histológica já característica dos tumores mamários.

Além disso, um ponto adicional de nosso estudo é que atualmente na maioria dos trabalhos, o

status dos genes avaliados é determinado apenas no tumor primário, e até o momento, poucos

trabalhos foram publicados com a análise de expressão gênica comparando tumores de mama primários e metástases axilares pareadas em câncer de mama (PAULA, 2015; SHRIVER et al., 2014). Um estudo prévio do nosso grupo, Paula et al. (2015), analisou a expressão de dez genes, (PPM1D, B3GNT7, NEDD9, PHB, PIK3R5, PIP4K2A, TNKS2, BAD, GTSE1 e PAXIP1), pela técnica de qRT-PCR, com as mesmas amostras e critérios de comparação que utilizados no presente trabalho. Neste estudo foi detectado que apenas o gene PIK3R5 (phosphoinositide 3-kinase

regulatory subunit 5) apresentou aumento de expressão nas amostras de tumores primários com

acometimento de linfonodos quando comparadas com tumores primários sem acometimento. Este gene desempenha um papel importante no crescimento celular, diferenciação, proliferação, motilidade, sobrevivência e transporte intracelular (PAULA et al., 2013), sendo relatado também como um marcador molecular prognóstico em câncer de mama (CANEVARI et al., 2016).

Embora o papel preditivo dos genes SERPINA1 e TFF3 não tenha sido evidenciado no presente estudo, e devido aos dados descritos na literatura ainda sejam preliminares e controversos, com poucos marcadores moleculares de implicação prognóstica sendo utilizados na rotina clínica; acreditamos que a identificação de novos marcadores moleculares com valor preditivo seja de extrema importância para delinear o tratamento mais específico para cada paciente acometida por estes tumores.

Conclusão

Embora caracterizados previamente como marcadores preditivos de metástases axilares em câncer de mama, neste estudo os genes TFF3 e SERPINA1 não apresentaram potencial preditivo. Referências

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