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Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Sistema de Información Científica

Pereira Soares, Nicolle; Medeiros, Alessandra Aparecida; de Paula Castro, Igor; Meziara Wilson, Taís; Carvalho Guimarães, Ednaldo; de Almeida Moreira, Thaís

Imunohistoquímica em miocárdio de cães naturamente infectados por Leishmania chagasi Acta Scientiae Veterinariae, vol. 42, núm. 1, enero, 2014, pp. 1-7

Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre, Brasil

ISSN (Versão impressa): 1678-0345 ActaSciVet@ufrgs.br

Universidade Federal do Rio Grande do Sul Brasil

Pub. 1248

Received: 8 August 2014 Accepted: 30 November 2014 Published: 24 December 2014

1_{Laboratório de Patologia Animal, Faculdade de Medicina Veterinária (FAMEV), Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Uberlândia, MG, Brazil.} 2_{Faculdade de Matemática (FAMAT), UFU, Uberlândia. CORRESPONDENCE: N.P. Soares [nicolle.pereira@hotmail.com - Tel.: +55 (34)3291-8432].} Laboratório de Patologia Animal, Faculdade de Medicina Veterinária (FAMEV), Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade

Imunohistoquímica em miocárdio de cães naturamente

infectados por Leishmania chagasi

Immunohistochemistry in Myocardium of Dogs Naturally Infected with Leishmania chagasi Nicolle Pereira Soares1_{, Alessandra Aparecida Medeiros}1_{, Igor de Paula Castro}1_,

Taís Meziara Wilson1_{, Ednaldo Carvalho Guimarães}2 _{& Thaís de Almeida Moreira}1

ABSTRACT

Background: Canine visceral leishmaniasis is a chronic and endemic disease, widespread zoonotic infection with a great

impact on public health. The domestic dog is the main reservoir and also a source of infection for humans in the urban environment. Canine visceral leishmaniasis is a multisystem disease that affects several organs, mainly the heart. The aim of this study was to verify the presence of amastigotes of Leishmania chagasi in myocardium of dogs naturally infected by immunohistochemistry. In addition, to correlate the number of parasitized cells with the intensity of the inflammation, the macroscopic and microscopic lesions.

Materials, Methods & Results: It were used 52 dogs positive for leishmaniasis diagnosed by clinical examination, Indirect

Immunofluorescence (RIFI), ELISA and cytological analysis of popliteal lymph nodes. The positive animals were eutha-nized and submitted a necropsy. Following necropsy, the macroscopic analysis was done, and samples from the region of the cardiac apex were collected at the transition between the two ventricles. Fragments of heart tissues were fixed in 10% neutral formalin for histopathological and immunohistochemistry analysis. The inflammatory process of the myocardium and lesions semi-quantitatively scored for myocardial injury on a scale of 0 to 3: (0) absent, (1) mild = small focal lesions, (2) moderate = larger, multifocal lesions and (3) severe = affecting most areas with coalescence. On immunostaining, the animal was classified according to the parasite load: - (no microorganism), mild (1-100 microorganisms), moderate (101-300), intense parasitism (> 300). At the macroscopically analysis, 33 animals (63.46%) had at least one lesion. The concentric hypertrophy left ventricular was the most frequent cardiac alteration followed by right ventricular dilatation, and biventricular cardiac dilation. During of microscopic examination, it revealed the coagulation necrosis, myocarditis lympho-histioplasmocitic and, myofibrillar degeneration in 40 (76.92%) animals. The inflammatory infiltrates were com-posed of mononuclear cells with a predominance of macrophages or lymphocytes. In 21 (40.38%) animals showed mild inflammatory infiltrate in myocardium, and seven (13.46%) animals exhibited moderate infiltrate and no animal showed severe myocarditis and abscess. Immunohistochemical analysis revealed amastigotes in the heart of 28 (53.84%) animals examined. The amastigotes were within macrophages. The number of amastigotes found ranged from one to 15, therefore it is a low parasitism load. There is a negative correlation between macroscopic findings and parasitism or histologic le-sions. And a positive correlation between the number of parasitized cells and the severity of inflammation could suggest a direct role of the parasite in cardiac inflammation.

Discussion: In canine visceral leishmaniasis, tissue parasite load is important to the inflammatory reaction pathogenesis.

The parasite stimulates cell infiltrates that determine the local intensity of the injury. However, in the heart, this inflam-matory process is mild. Furthermore, inflaminflam-matory lesions in organs that belong to the mononuclear phagocyte system are moderate or severe. And, these alterations reflect the degree of disease progression, since infection was chronic. Im-munohistochemistry is essential for the identification of parasites in the myocardium and, in generally this organ exhibits low parasite load. However, if the parasitic load becomes high the severity of inflammation will be severe. A low parasite load and mild inflammatory response would be insufficient to produce macroscopic changes.

Keywords: canine, heart, immunohistochemistry, Leishmania sp., myocarditis. Descritores: cão, coração, imunohistoquímica, Leishmania sp., miocardite.

N.P. Soares, A.A. Medeiros, I.P. Castro, et al. 2014. Imunohistoquímica em miocárdio de cães naturamente infectados

por Leishmania chagasi. Acta Scientiae Veterinariae. 42: 1248.

INTRODUÇÃO

A leishmaniose visceral é uma doença de cará-ter crônico e endêmico, além de uma zoonose, sendo o cão doméstico o principal reservatório e fonte de infecção para o homem no meio urbano [15]. A leish-maniose visceral canina é causada pelo protozoário

Leishmania sp. sendo a Leishmania chagasi, observada no Brasil [7]. Há duas formas distintas do parasito: a forma promastigota, encontrada no trato digestivo dos flebotomíneos da espécie Lutzomyia longipalpis; e a forma amastigota, parasita intracelular de diversos vertebrados [6].

No cão, por se tratar de uma doença multissis-têmica, elevado número de parasitos são encontrados em órgãos linfáticos, o que permite a multiplicação e disseminação para outros órgãos, dentre eles, o cora-ção [13,14]. As amastigotas de Leishmania chagasi ao parasitarem o miocárdio de cães positivos são res-ponsáveis alterações morfológicas e funcionais, além de miocardite linfohistioplasmocitária e necrose do miocárdio [1,3,4,9,12,18].

O exame parasitológico é usado na identifi-cação do parasita em órgãos como linfonodo, baço ou medula óssea e é considerado como método de diagnóstico definitivo [2]. Entretanto, esse método de diagnóstico não demonstra eficácia quando utili-zado no coração [1]. No miocárdio, o parasito pode ser identificado por avaliação histopatológica [12] e imunohistoquímica [1,3,9,12].

Objetivou-se verificar a presença de amasti-gotas de Leishmania chagasi em miocárdio de cães positivos para leishmaniose visceral canina por meio de imunohistoquímica; além de classificar a carga pa-rasitária e correlacioná-la com as alterações cardíacas macro e microscópicas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Para a realização desse trabalho, foram utili-zadas 52 amostras de miocárdio de cães positivos para leishmaniose, evidenciados em pesquisa epidemioló-gica do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Uberlândia. Para diagnóstico, os cães foram submeti-dos ao exame clínico, aos testes de Imunofluorescência Indireta (RIFI Kit IFI - Calazar canino)1 _{e ELISA (Kit}

EIE leishmaniose visceral canina)1 _{e análise citológica}

de punção de linfonodo poplíteo. Os animais positivos foram eutanasiados e posteriomente necropsiados.

Durante a necropsia, após análise macroscópi-ca do coração, foram coletadas amostras da região de ápice cardíaco na transição entre os dois ventrículos. Essas foram fixadas em formol 10% tamponado e submetidas ao processamento histológico para con-fecção de lâminas de hematoxilina e eosina [17]. Foi realizada avaliação semi-quantitativa das lesões no miocárdio quanto à distribuição, natureza da lesão e severidade do infiltrado inflamatório. Na avaliação do processo inflamatório utilizou-se escala de 0 a 3: sendo (0) ausente; (1) discreto = pequenas lesões focais; (2) moderado = lesões extensas e multifocais e (3) intenso = maioria das áreas com coalescência [12].

As amostras de miocárdio foram submetidas à imunohistoquímica [16]. A recuperação antigênica foi feita pelo calor em banho maria a 96ºC por 40 min em solução tampão citrato pH 6. Em seguida, as lâminas foram resfriadas em temperatura ambiente (25ºC) por 20 min.

Para o bloqueio das peroxidases endógenas, utilizou-se peróxido de hidrogênio 5% por 20 min em câmara escura. Soro hiperimune de cão naturalmente infectado com Leishmania chagasi, diluído 1:100 em soro albumina bovina (BSA) 1% foi utilizado como anticorpo primário. Os cortes receberam 100 µL cada e posteriormente, as lâminas foram incubadas 18 h, a 5ºC em câmara úmida. O anticorpo anti-Ig G coelho anti-cão biotinelado (Dako, Link, K0690)2 _foi

adicio-nado aos cortes durante 30 min seguido do complexo estreptavidina-peroxidase (Dako, K069011 - LSAB + HRP rabbit/mouse/goat)2 _{por 30 min a 25ºC. A reação}

foi desenvolvida com diaminobenzina Diaminobenzi-na - Dako- K3468, DAB)2_{, 100 µL por corte durante 3}

min. Finalmente, as lâminas foram contra coradas com Hematoxilina de Harris por 3 min e montadas. Como controle negativo da reação substituiu-se o anticorpo secundário por Tris-HCl (2-Amino-2-hydroxymethyl--propane-1,3-diol).

A análise das lâminas e classificação de inten-sidade de carga parasitária foi feita utilizando micros-cópio de luz em objetivas de 10 e 40x. Contou-se 20 campos e a quantidade total de parasitos por lâminas. Conforme o número de parasitos visualizados, o ani-mal foi classificado de acordo com a carga parasitária: - (nenhum microorganismo); discreto (1-100 microor-ganismos); moderado (101-300) e intenso parasitismo (>300) [5]. Após essa classificação, a intensidade da

carga parasitária e as alterações macro e microscópicas de cada animal foram correlacionadas.

Para a análise estatística utilizou-se o progra-ma Action 2.5 (Software Action 2.5)3 _{no Microsoft}

Excel 2007. A comparação do grau de dependência entre a carga parasitária e as alterações macroscópicas com as alterações microscópicas identificadas nos animais utilizou-se o teste Qui-quadrado (χ2_{). E para}

comparação do número de células parasitadas com o grau da miocardite utilizou-se o teste de correlação de Spearman.

RESULTADOS

Macroscopicamente, 33/52 animais (63,46%) apresentaram pelo menos uma alteração cardíaca sendo a mais frequente, hipertrofia cardíaca concêntrica do ventrículo esquerdo [22/52 (42,30%)] (Figura 1A), seguida da dilatação ventricular direita [13/52 (25%)] (Figura 1B) e da dilatação cardíaca biventricular [10/52 (19,23%)] (Figura 1C). Concomitantemente mais de uma alteração foram observadas em 12/52 (23,07%) animais e 19/52 (36,53%) não tinham lesões macros-cópicas.

Alterações histopatológicas foram identifi-cadas em 40/52 animais (76,92%), sendo que 18/40 (45%) animais apresentavam mais de um tipo de alteração concomitantemente (Tabela 1 e Figura 2). Não foram diagnosticadas alterações microscópicas no miocárdio de 12/52 (23,07%) cães.

Quanto à severidade do infiltrado inflamatório 21/52 animais (40,38%) apresentaram infiltrado discre-to, sete animais [7/52 (13,46%)] infiltrado moderado e nenhum animal apresentou miocardite severa. Vinte

e quatro cães [24/52 (46,15%)] não apresentaram in-flamação no miocárdio.

Amastigotas de Leishmania sp. foram identi-ficadas no interior de macrófagos de 28/52 (53,84%) amostras de miocárdio (Figura 3), sendo que desses, 26/28 (92,85%) apresentavam miocardite. Dois cães [2/28 (7,14%)] não tinham infiltrado inflamatório no miocárdio, entretanto apresentaram marcação. Vinte e três [23/52 (44,23%)] amostras não apresentaram imu-nomarcação e miocardite e apenas um [1/52 (1,92%)] tinha miocardite e a amastigota não foi identificada pelo método de imunohistoquímica.

Quanto à intensidade da carga parasitária, o número de amastigotas encontradas variou de um a 15, caracterizando discreto parasitismo. A correlação entre o número de células parasitas e a severidade da inflamação do miocárdio apresentou correlação posi-tiva (P < 0,05, c = 0,7).

Nos animais com imunomarcação [28/52 (53,84%)] também foi diagnosticado outras alterações histopatológicas, como a necrose de coagulação ou a degeneração miofibrilar. Doze [12/52 (23,07%)] ani-mais apresentaram uma dessas lesões microscópicas e não apresentaram imunomarcação. E foram ausentes em 12/52 (23,07%) animais, as alterações microscópi-cas e a imunomarcação. Neste trabalho, as alterações microscópicas observadas nos animais apresentam relação com a presença do parasito no tecido cardíaco (P < 0,05).

Alterações macroscópicas e microscópicas e a imunomarcação positiva para o parasita foi identificada em 19/52 (36,53%) animais. Porem não houve relação de dependência entre essas variáveis (P > 0,05).

Tabela 1. Alterações microscópicas dos cães positivos para leishmaniose visceral, Uberlândia, MG, Brasil, durante o período de 2014.

Alteração microscópica Número de animais %

Necrose de coagulação 27 51,92%

Miocardite linfohistioplasmocitária 27 51,92%

Degeneração miofibrilar 10 19,23%

N.P. Soares, A.A. Medeiros, I.P. Castro, et al. 2014. Imunohistoquímica em miocárdio de cães naturamente infectados

por Leishmania chagasi. Acta Scientiae Veterinariae. 42: 1248.

Figura 1. Em (A) coração de cão positivo para leishmaniose visceral, com espessamento de musculatura do ven-trículo esquerdo (seta maior) e estreitamento de lúmen cardíaco (seta menor). Em (B) adelgaçamento da parede do ventrículo direito (seta maior) e com aumento da câmara cardíaca direita (seta menor). Em (C) coração de cão positivo para leishmaniose visceral com dilatação biventricular. Notar presença de sufusões na musculatura (seta).

Figura 2. (A) Fotomicrografia de corte histológico de miocárdio apresentando fibras cardíacas anucleadas, sem estriações (seta) indicando necrose de coagulação e degeneração miofibrilar. Corado em hematoxilina-eosina (HE) [40x]. (B) Fotomicrografia de miocardite linfoplasmocítica moderada em miocárdio, HE [40x]. Em (C)

fotomicro-A B

C

A _B

Figura 3. Fotomicrografia de amastigota de Leishmania sp. em miocárdio de cão positivo para leishmaniose visceral (seta). Imunohistoquímica, contra coloração com hematoxilina 100x.

DISCUSSÃO

A alteração cardíaca macroscópica mais frequente no presente trabalho também foi relatada em casos de cães com o diagnóstico de leishmaniose visceral canina [9,18]. Em relato de caso de tampona-mento cardíaco em um cão com leishmaniose visceral, evidenciaram dilatação cardíaca bilateral [4].

No presente trabalho o processo inflamatório do miocárdio foi do tipo linfohistioplasmocitário se-melhante ao evidenciado na literatura [1,9,18]. Além do processo inflamatório linfohistioplasmocítico no miocárdio, há relatos de epicardite [4], pericardite [14] e miocardite não supurativa acompanhada com pericardite [11] provocadas pela Leishmania sp.

A formação de granulomas no miocárdio cães positivos para leishmaniose visceral é relatada [12], entretanto nos cães do presente estudo, esse achado foi ausente. A leishmaniose apresenta curso crônico e neste trabalho, utilizaram-se cães eutanasiados após o diagnóstico. Possivelmente a ausência de granulomas, se relaciona ao fato que nesses cães não houve tempo para formação desse achado.

Em relação aos processos degenerativos, degeneração miofibrilar e necrose de coagulação no músculo miocárdio observadas no presente trabalho, são achados semelhantes aos encontrados na literatura [3,13,18].

Na leishmaniose visceral, a carga parasitá-ria tecidual é importante na patogênese da reação inflamatória, pois o parasita estimula infiltrados ce-lulares que determinam a intensidade local da lesão. Estudos têm demonstrado que a amastigota pode

componente da matriz da pele [8], o que possivel-mente ocorre em outros tecidos, como o músculo cardíaco, contribuindo para o desenvolvimento de alterações teciduais [1].

Observou-se que o processo inflamatório esti-mulado pela Leishmania sp. no miocárdio é discreto a moderado por células mononucleares, assim como relatado em experimento com miocárdio e pulmão de cães com leishmaniose. Diferentemente ocorre em pulmão, no qual a intensidade do processo inflamatório é moderado a severo [1].

A quantidade de parasitos identificados no miocárdio dos cães positivos para leishmaniose foi baixa quando comparadas a trabalhos que utilizaram a imunohistoquímica na identificação da Leishmania sp. em órgãos como o fígado ou linfonodo. Entre-tanto, devido à excassez de trabalhos sobre a carga parasitária em miocárdio, a classificação utilizada neste trabalho, baseiou-se em imunoensaios reali-zados em fígado de cães positivos para a doença [5]. Contudo, sabe-se que lesões em órgãos que não pertencem ao sistema mononuclear fagocitário não evoluem na mesma maneira, com a progressão da doença [1]. Além disso, os achados deste trabalho, são condizentes com experimentos em miocárdio de cães naturalmente infectados por Leishmania sp. [1,12].

A técnica de imunohistoquímica é a mais sen-sível e específica para identificação de amastigotas em fígado [5] e demonstra ser importante na identificação do parasito no miocárdio [1]. Além disso, a presença das amastigotas é associada à inflamação e lesão

N.P. Soares, A.A. Medeiros, I.P. Castro, et al. 2014. Imunohistoquímica em miocárdio de cães naturamente infectados

por Leishmania chagasi. Acta Scientiae Veterinariae. 42: 1248.

A Leishmania sp., quando identificada no miocárdio, provoca necrose e degeneração cardíaca das fibras musculares, além de inflamação por linfó-citos, plasmócitos e histiócitos parasitados [1,4,12]. Entretanto, por se tratar de uma doença crônica e de animais naturalmente infectados, torna-se difícil determinar a fase da doença em que o animal se encontra, desse modo alguns animais estão na fase aguda da doença e outras na fase crônica com lesões mais evidentes. Naqueles animais em que houve imu-nomarcação para o parasita e ausência de processo inflamatório pode-se associar esse fato a mecanismos de evasão imune, como por exemplo, a indução da apoptose [10].

Assim como em experimento com

Leish-mania sp. [1], no presente estudo o baixo grau de necrose miocárdica, a baixa carga parasitária e a discreta resposta inflamatória possivelmente seriam insuficientes para produzir alterações ma-croscópicas.

CONCLUSÃO

A imunohistoquímica é fundamental na identi-ficação do parasito em miocárdio e a Leishmania

cha-gasi pode parasitá-lo, assim o sistema cardiovascular deve ser incluído na avaliação clínica da leishmaniose visceral. A carga parasitária no miocárdio é baixa, po-rém quanto maior a carga parasitária maior a severidade da inflamação que é detectada somente microscopica-mente, uma vez que as alterações macroscópicas não apresentam correlação com o parasitismo.

MANUFACTURERS

1_{Bio-Manguinhos, FIOCRUZ. Manguinhos, RJ, Brazil.} 2_{Dako North America, Inc. Carpinteria, CA, USA.} 3_{Free Software Foundation Inc. Boston, MA, USA.}

Ethical approval. O protocolo experimental foi aprovado pelo

Comitê de ética da Universidade Federal de Uberlândia (UFU) conforme os processos CEUA/UFU 007/10 e 104/12.

Declaration of interest. The authors report no conflicts of

interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper.

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