CURSO DE FISIOTERAPIA
DANIELA BOAROLI
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA FONOFORESE NA CICATRIZAÇÃO
EPITELIAL ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO
DANIELA BOAROLI
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA FONOFORESE NA CICATRIZAÇÃO
EPITELIAL ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO
Trabalho de Conclusão do Curso, apresentado para obtenção do grau de Fisioterapeuta no
Curso de Fisioterapia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC.
Orientador: Prof. MSc Tiago Petrucci de Freitas Co-orientador: Dr. Emilio L. Streck
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pelo dom da vida, por ter me ajudado a chegar até aqui, dando força necessária para superar todos os obstáculos.
À minha família, especialmente meus pais, Sidnei e Sonia, por ter me auxiliado na minha formação tanto profissional quanto educacional. Investindo para que eu pudesse ter uma boa profissão.
Ao meu namorado André, pela paciência, apoio e auxílio para realizar este trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Mestre Tiago Petrucci de Freitas, pelos ensinamentos, dedicação e participação na execução desse trabalho.
À Profª. Bárbara Coelho, pela sua disponibilidade e dedicação.
Aos meus colegas e amigos, que estiveram presentes nestes cinco anos de caminhada e encerram comigo mais esta jornada, obrigada pela amizade, companheirismo e auxílio na execução de algumas tarefas.
Aos colegas do Laboratório de Fisiopatologia Experimental e Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício pela ajuda nos experimentos, em especial ao Prof. Dr. Emílio Streck, por abrir as portas do laboratório e permitir que este
trabalho fosse realizado.
Aos membros da banca, por aceitarem o convite e se mostrarem dispostos a me avaliar.
Enfim, a todos que de alguma forma, colaboraram para a conclusão deste trabalho.
“O primeiro passo para chegar a qualquer lugar é decidir que não
RESUMO
A pele sendo o órgão mais extenso do corpo humano, protege o mesmo do ambiente externo e tem diversas funções. Em resposta a uma lesão tecidual, há o desencadeamento de um complicado conjunto de eventos vasculares, celulares e bioquímicos. O processo de cicatrização ocorre para restaurar a integridade anatômica e funcional do tecido lesado, ocorrendo em três fases. O Ultrassom terapêutico é muito utilizado no tratamento de lesões de tecidos moles, promovendo o reparo tecidual. Na fisioterapia a fonoforese vem sendo amplamente utilizada, associada a vários agentes antiinflamatórios. No presente estudo destacamos a utilização do gel extrato glicolítico de Mikania laevigata associado ao Ultrassom terapêutico no processo de evolução cicatricial epitelial em dorso de ratos Wistar. Foi analisada a evolução cicatricial através do tamanho da ferida, medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, medida de grupos carbonil e grupos sulfidrila. Metodologia: Foram utilizados 15 ratos Wistar submetidos à lesão epitelial localizadas no dorso do animal. Os ratos foram divididos em três grupos, grupo carbopol com Ultrassom, e os animais foram tratados com Ultrassom terapêutico pulsado, com dose de 0,8 w/cm 2 durante 3 minutos. Grupo de extrato glicolítico e grupo de extrato glicolítico associado ao Ultrassom, utilizando também o Ultrassom terapêutico pulsado, com dose de 0,8 w/cm 2 durante 3 minutos. Os animais foram tratados diariamente durante 10 dias, sendo que logo após o tratamento, os mesmos foram decapitados e o tecido irradiado ao redor da ferida foi removido cirurgicamente para posterior análise bioquímica. No primeiro, quinto e décimo dia também foi mensurado o tamanho da ferida através de um paquímetro. Resultados: quanto ao tamanho da ferida não houve diferença significativa entre os três grupos. Em relação ao TBARS houve diferença significativa no grupo extrato glicólico com Ultrassom em relação ao grupo carbopol com Ultrassom. Com relação à proteína carbonil, houve uma diferença significativa no grupo extrato glicólico com Ultrassom em relação ao grupo carbopol com Ultrassom. No grupo sulfidrila, houve diferença significativa no grupo extrato glicólico com e sem Ultrassom, quando comparados ao grupo carbopol com Ultrassom. Conclusão: O Ultrassom pulsado associado ao extrato glicólico de Mikania laevigata exerce influência significativa no processo de cicatrização de feridas cutâneas induzidas em ratos.
Palavras-chave: cicatrização epitelial. Ultrassom terapêutico. Extrato glicolítico de Mikania laevigata.
ABSTRACT
The skin is the largest organ of the human body, it protects the external environment and has several functions. In response to tissue injury, there is a trigger for a complex set of vascular events, cellular and biochemical. The process of healing is to restore anatomical and functional integrity of damaged tissue, occurring in three phases. The therapeutic ultrasound is widely used in the treatment of injuries of soft tissue, promoting tissue repair. In the fonoforese therapy has been used extensively, together with several anti-inflammatory. In this study highlight the use of gel extract of Mikania laevigata glycolytic associated with therapeutic ultrasound in the process of evolution in epithelial healing back of rats. Was analyzed through the evolution of healing the wound size, extent of thiobarbituric acid reactive species, extent of carbonyl groups and sulfhydryl groups. Methodology: We used 15 Wistar rats underwent epithelial lesion located in the back of the animal. The rats were divided into three groups, group carbopol with ultrasound, and the animals were treated with therapeutic ultrasound pulse with a dose of 0.8 w / cm² for 3 minutes. Group extract glycolytic and glycolytic extract group associated with the ultrasound, also using the pulsed ultrasound treatment, with dose of 0.8 w / cm² for 3 minutes. The animals were treated daily for 10 days, whereas after the treatment, they were beheaded and irradiated tissue around the wound was surgically removed for further biochemical analysis. In the first, fifth and tenth day was also measured the size of the wound using a caliper. Results: about the size of the wound there was no significant difference between the three groups. In relation to TBARS significant difference in the glycolic extract with ultrasound in the ultrasound group with carbopol. Regarding the protein carbonyl, a significant difference in the group with glycolic extract ultrasound in the group with ultrasound carbopol. In sulfhydryl group, significant difference in the glycolic extract with and without ultrasound, when compared to the group with ultrasound carbopol. Conclusion: The ultrasonic pulse associated with glycolic extract of Mikania laevigata exerts significant influence in the process of healing of skin wounds in rats induced.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática do tecido epitelial...17
Figura 2 -Detalhe das folhas da Mikania Laevigata...25
Figura 3 - Estresse Oxidativo...28
Figura 4 - Caixa de ratos...31
Figura 5 - Modelo de lesão epitelial...32
Figura 6 - Tamanha da Ferida (cm)...37
Figura 7 - Efeitos do ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata sobre as espécies reativas de ácido tiobarbitúrico...38
Figura 8 - Efeitos do ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata sobre o carbonil...39
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µm – Micrometro cm – Centímetros
DNA – Ácido Desoxirribonucléico ERO – Espécies Reativas de Oxigênio
FISIOPAT – Laboratório de Fisiopatologia Experimental MHz – Mega Hertz
pH – Potencial Hidrogênio-Iônico
SPSS – Statistical Package for the Social Sciences TBARS – Espécies Reativas de Ácido Tiobarbitúrico UNESC – Universidade do Extremo Sul Catarinense US – Ultrassom
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...12
2 REFERENCIAL TEÓRICO...16
2.1 Tecido epitelial...16
2.2 Lesão e cicatrização epitelial...18
2.3 Ultrassom...20
2.3.1 Aspectos gerais...20
2.3.2 Efeitos do ultrassom...21
2.3.3 Terapia ultrassônica e a lesão epitelial...22
2.3.4 Fonoforese...23
2.4 Etnofarmacologia...24
2.4.1 Mikania laevigata...25
2.5 Espécies reativas de oxigênio...26
2.5.1 Definição...26
2.5.2 Estresse oxidativo...28
3 MATERIAIS E MÉTODOS...30
3.1 Caracterização da pesquisa...30
3.2 Caracterização das amostras...30
3.3 Instrumentos...31
3.4 Procedimentos para coleta de dados...32
3.4.1 Preparação do Extrato glicólico de Mikania Laevigata...34
3.4.2 Descrição da técnica de maceração...34
3.5 Procedimentos para análise de dados...35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...36
5 CONCLUSÃO...42
6. PERSPECTIVAS...43
1 INTRODUÇÃO
A pele constitui o mais extenso órgão sensorial do corpo (GUIRRO e GUIRRO, 2002). Tem como função evitar a perda de líquidos corporais, sintetizar vitamina D, auxiliar na regulação da temperatura corporal, função como órgão excretor e sensorial (MOFFAT e HARRIS, 2007). A pele é constituída por duas camadas: epiderme e derme, abaixo está a hipoderme, que embora tenha a mesma origem e morfologia da derme não faz parte da pele (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Quando ocorre uma lesão tecidual, há o desencadeamento de um complicado conjunto de eventos vasculares, celulares e bioquímicos que tem como objetivo substituir as células mortas ou imperfeitas por células saudáveis, ocorrendo o processo de reparação tecidual (THOMAZ, et al., 1996). O processo de cicatrização ocorre para restaurar a integridade anatômica e funcional do tecido lesado, ocorrendo fundamentalmente em três fases: inflamatória, de regeneração e remodelamento (KISNER e COLBY, 2005).
O ultrassom terapêutico (UST) é um dos recursos mais utilizados na Fisioterapia (KARNES e BURTON, 2002). É amplamente usado no tratamento de lesões de tecidos moles agindo nas fases do mecanismo fisiológico da lesão. A terapia ultrassônica somente pode ser segura se o terapeuta dispõe de um amplo conhecimento do processo envolvido (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
A terapia por US influencia a atividade das células, plaquetas, mastócitos, macrófagos e neutrófilos envolvidos na fase inflamatória do processo de regeneração tecidual, acelerando o processo de cicatrização (KITCHEN e BAZIN, 2001; LOW e REED, 2001). O Ultrassom na cicatrização de tecidos promove ainda um aumento na síntese de colágeno, uma maior resistência, maior capacidade de absorver energia, aumento do fluxo sanguíneo e a facilitação na proliferação de fibroblastos e a síntese de proteínas (JACKSON et al., 1991).
fonoforese vem sendo amplamente utilizada, associada a vários agentes antiinflamatórios (MITRAGOTRI, 2000), mas ainda levanta duvidas quanto à confiabilidade de seus efeitos positivos, necessitando de novas investigações (PARIZOTTO, 2003).
Aliada ou não à fonoforese, o uso de plantas medicinais vem crescendo a cada dia. Está sendo amplamente utilizada por grande parte da população mundial como fonte de recurso terapêutico eficaz (DI STASI, 1996). Pode-se destacar a Mikania laevigata, uma espécie vegetal nativa do sul do Brasil (SIMÕES et al., 1998), pertencente à família Asteraceae, conhecida popularmente por Guaco (REITZ, 1989).
O gênero Mikania já era utilizado na medicina popular para o tratamento de diversas enfermidades, devido às suas propriedades antimicrobianas, antiinflamatórias e analgésicas (FERRO, 1991). A cumarina é o principal componente químico da Mikania, ocorre em abundância nas folhas do guaco (EVANS, 1996).
Onde temos um processo cicatricial, esta envolvida uma cascata de acontecimentos, nesta o Estresse Oxidativo aumenta após iniciada a lesão, isso ocorre devido à presença de neutrófilos e macrófagos nesse local. A produção de radicais livres causa dano nas membranas lipídicas e produz necrose nas células (TOUMI e BEST, 2006; TOUMI et al., 2006).
Frente às condicionantes expostas anteriormente, apresentam-se a seguinte questão problema: O ultrassom terapêutico associado ao gel de extrato glicólico de Mikania Laevigata acelera o processo cicatricial induzido por dano epitelial em ratos?
Baseando-se na questão problema, definiram-se as seguintes questões a investigar:
1) O ultrassom acelera o processo cicatricial com o uso do antiinflamatório em forma de gel de Mikania Laevigata?
2) A utilização do ultrassom terapêutico com o uso do extrato glicólico de Mikania laevigata diminui o estresse oxidativo, provocado pelo processo de reparo?
Um fator considerável para o sucesso das ondas ultrassônicas na cicatriz epitelial é a de favorecer a migração de fibroblastos e a síntese de colágeno ao local lesado na fase de inflamação e de proliferação, diminuindo o extresse oxidativo, segundo estudos do nosso grupo de pesquisa. Com o uso do extrato sob a forma glicólica, com ou sem o ultrassom, sabemos apenas que possui excelente atividade antiinflamatória, mas quanto ao dano oxidativo não se tem relatos.
3) Qual a técnica ideal para o reparo do tecido epitelial?
Ainda não se tem um estudo com o uso da fonoforese (guaco) como fator de condução aparelho-animal, mas acredita-se que o uso das propriedades medicinais do guaco poderá levar a uma cicatrização mais rápida ao uso comum da técnica ultrassom-lesão, comumente usado na fisioterapia.
Esta pesquisa tem como objetivo geral analisar o processo de evolução cicatricial epitelial com o uso do ultrassom terapêutico com gel carbopol em relação ao uso do ultrassom terapêutico associado ao gel de extrato glicólico de Mikania laevigata. Objetiva ainda verificar o efeito do tratamento de ultrassom terapêutico com extrato glicólico de Mikania Laevigata sob lesões epiteliais de ratos através dos seguintes parâmetros: medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), um marcador de lipoperoxidação; analisar a medida de grupos carbonil, medida de dano oxidativo em proteínas; e analisar a medida de grupos sulfidrila, marcadores de oxidação de proteínas.
A pele é um órgão do corpo humano que protege do ambiente externo, em especial das bactérias. Em resposta a um traumatismo tecidual, podem ocorrer infecções, comprometimento do sistema imunológico, invasões por células carcinogênicas, perda de fluídos, hipotermia, entre outros.
Uma forma comum de lesão epitelial é a úlcera de pressão, onde alguns pacientes evoluem para óbito. É de grande importância que a recuperação dessas lesões seja rápida, onde muitas vezes acaba sendo um desafio para os profissionais da saúde.
A possibilidade de acelerar a cicatrização e o fechamento de lesões cutâneas, através de recursos químico-medicamentosos ou físicos, tem sido objeto de investigação de inúmeros pesquisadores.
Com a utilização do ultrassom associado ao gel glicolítico de Mikania laevigata, na recuperação dessas lesões, há possibilidades de acelerar o processo de cicatrização no tecido lesado, pois essa planta medicinal possui grandes propriedades antiinflamatórias, podendo levar a uma regeneração mais rápida do tecido lesado. É uma espécie com grande quantidade de cumarina, sendo o principal componente químico e provavelmente tendo um efeito biológico importante.
O guaco, como é conhecido popularmente, é um produto de baixo custo comercial, sendo bem acessível. Além disso, poucos estudos foram realizados com a Mikania Laevigata.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Tecido epitelial
A pele constitui o mais extenso órgão sensorial do corpo (GUIRRO e GUIRRO, 2002). É um sistema de camadas composto pela epiderme, derme e o tecido subcutâneo (MOFFAT e HARRIS, 2007). Outro autor cita que a pele é constituída por duas camadas, epiderme e derme, abaixo está à hipoderme, que embora tenha a mesma origem e morfologia da derme não faz parte da pele (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
A epiderme que é a camada mais externa da pele, sendo composta pelo estrato córneo, estrato lúcido, estrato granuloso, estrato espinhoso e estrato basal (GUIRRO e GUIRRO, 2002), tem aproximadamente 15 µm de espessura (MITRAGOTRI, 2000). O estrato córneo é constituído de ceratinócitos que se alongaram e perderam seus núcleos, atua como uma barreira para ameaças externas. Os ceratinócitos são responsáveis pela produção de ceratina, essas células evitam a perda de água e formam uma proteção contra microorganismos e agentes irritantes. Danos no estrato córneo aumentam o pH da pele, e assim, sua suceptibilidade a infecção por bactérias (MOFFAT e HARRIS, 2007).
Segundo o mesmo autor, a camada seguinte é o estrato lúcido, abaixo do estrato lúcido é encontrado o estrato granuloso, ambas compostas por ceratinócitos achatados. Abaixo, está o estrato espinhoso, contendo ceratinócitos maduros. A última camada que é o estrato basal é constituída de uma camada celular de ceratinócitos que estão em divisão celular contínua, migrando para a superfície da pele e formando as camadas funcionais mais externas da epiderme.
A camada papilar é constituída por tecido conjuntivo frouxo, tendo como função aumentar a zona de contato derme-epiderme, trazendo maior resistência à pele. Apresenta um suprimento sanguíneo bastante rico (GUIRRO e GUIRRO, 2002). A derme reticular é constituída por tecido conjuntivo denso, com fibroblastos que secretam colágeno e elastina (MOFFAT e HARRIS, 2007). Na camada reticular os capilares são raros (GUIRRO e GUIRRO, 2002). Estas estruturas são importantes para a regeneração da pele após a lesão (MOFFAT e HARRIS, 2007). Na presença de uma lesão, ocorrem diferentes alterações nas fibras elásticas e colágenas, na substância fundamental amorfa e nos fibroblastos (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Abaixo está a hipoderme, também conhecida como tecido subcutâneo. Esta por sua vez, sustenta a derme e a epiderme, sendo constituída de tecido adiposo, tecido conectivo e tecido elástico (MOFFAT e HARRIS, 2007). A hipoderme fixa a pele às estruturas subjacentes (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Figura 1: Representação esquemática do tecido epitelial
2.2 Lesão e cicatrização epitelial
As úlceras de decúbito são formas comuns de lesões epiteliais, que ocorrem na maioria das vezes em pacientes acamados, devido às forças de compressão e atrito quando da imobilidade do mesmo, sendo necessária uma cicatrização rápida dessas feridas (DINI et al., 2006).
Com a perda da integridade da pele, poderá levar a um aumento da perda de fluídos, infecções, comprometimento do sistema imunológico, invasões por células carcinogênicas e hipotermia (WYSOCKI, 1999).
Em resposta a uma lesão tecidual, há o desencadeamento de um complicado conjunto de eventos vasculares, celulares e bioquímicos que tem como objetivo substituir as células mortas ou imperfeitas por células saudáveis, ocorrendo o processo de reparação tecidual (THOMAZ, et al., 1996). O processo de cicatrização ocorre fundamentalmente em três fases: inflamatória, de regeneração e remodelamento (KISNER e COLBY, 2005).
A fase inflamatória ocorre nas primeiras doze horas após a lesão (GUIRRO e GUIRRO, 2002), envolve respostas celulares, vasculares e químicas do tecido. Há processos fisiológicos nessa fase que servem como mecanismo de proteção, estímulo para subseqüente regeneração e reparo que são: formação de novos capilares, atividade fibroblástica inicial, fagocitose, neutralização dos irritantes químicos (KISNER e COLBY, 2005).
Os neutrófilos são os primeiros a ingressar no leito da ferida (GUIRRO e GUIRRO, 2002), a marginação neutrofílica é observada à medida que os leucócitos começam a aderir ao epitélio lesionado (MOFFAT e HARRIS, 2007). Tendo como função eliminar do local com lesão as partículas estranhas, como exemplo as bactérias e debris teciduais lesionados (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Logo após três dias da lesão, inicia-se a fase proliferativa (GUIRRO e GUIRRO, 2002), a inflamação começa a diminuir, é iniciada então a segunda fase de cicatrização da ferida, o reparo do local da lesão e resolução do coágulo. O que caracteriza esse estágio são a síntese e a deposição de colágeno. Há o crescimento de capilares nessa área, aumento da atividade fibroblástica, que produzem novo colágeno e desenvolvimento do tecido de granulação (KISNER e COLBY, 2005).
É importante ressaltar a atividade dos fibroblastos, por sintetizarem o colágeno, que é a substância responsável pela força tênsil e integridade do tecido, que sustenta uma recente e frágil rede de capilares e mantém a base para a formação do tecido de granulação (MODOLIN e KAMAKURA, 1981).
Por volta do quinto dia começa a atividade miofibroblástica, causando a contração da cicatriz (KISNER e COLBY, 2005). O fechamento da ferida ocorre como resultado da granulação, da contração e eventual epitelialização a partir da periferia da lesão (MOFFAT e HARRIS, 2007). Nessa fase o tecido conjuntivo ainda é fino e desorganizado (KISNER e COLBY, 2005).
A terceira e última fase é a de maturação ou remodelagem, na qual o tecido de granulação é substituído pelo fibroso, há uma predominância de fibroblastos facilmente remodelados, tentando adaptar-se à orientação e função do tecido original. Esta fase pode continuar por meses ou até anos após a ocorrência da fase proliferativa do reparo (KITCHEN e BAZIN, 2001; STARKEY, 2002; LOW e REED, 2003; ZAMMIT et al., 2006). A reorganização do colágeno inclui redução e diminuição da espessura do colágeno depositado (MOFFAT e HARRIS, 2007).
2.3 Ultrassom
2.3.1 Aspectos gerais
O ultrassom terapêutico (UST) é um dos recursos mais utilizados na Fisioterapia (KARNES e BURTON, 2002). As ondas ultrassônicas são geradas por um dispositivo chamado de transdutor, que contém uma pastilha de material piezoelétrico. A piezoeletricidade é um fenômeno natural, encontrado em certos cristais, que têm a capacidade de transformar energia mecânica em elétrica e vice-versa (KANH, 1991).
A terapia ultrassônica na Fisioterapia é definida pelas oscilações de ondas cinéticas ou mecânicas produzidas pelo transdutor vibratório, que aplicado sobre a pele atravessa e penetra no organismo em diferentes profundidades, dependendo da freqüência, que varia de 0,75 a 3,0 MHz, sendo utilizado no tratamento de pequenas lesões, acelerando o processo de cicatrização muscular e epitelial (HAAR, 2007; ROBERTSON e WARD, 1997).
É amplamente utilizado no tratamento de lesões de tecidos moles agindo nas fases do mecanismo fisiológico da lesão. A terapia ultrassônica somente pode ser segura se o terapeuta dispõe de um amplo conhecimento do processo envolvido (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Os agentes de acoplamento são usados nas aplicações do ultrassom terapêutico em virtude deste não se propagar no ar, fazendo com que quase toda a intensidade incidente seja transmitida (GUIRRO e SANTOS, 1997).
2.3.2 Efeitos do Ultrassom
Uma série de fatores será considerado após as ondas ultrassônicas atingir uma determinada região, tais como: intensidade, freqüência, tempo de aplicação, área do transdutor, regime do pulso, agente de acoplamento. Quanto maior a freqüência utilizada, maior será a absorção nos tecidos superficiais e menor será a profundidade de penetração, por isso as freqüências mais elevadas são utilizadas nos tratamentos de tecidos superficiais (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
São classificados como térmico e não térmico os mecanismos físicos envolvidos na terapêutica do ultrassom que induzem respostas clinicamente significantes sobre as células, tecidos, órgãos e organismos. Os efeitos físicos desejáveis causam o aumento da permeabilidade celular, da síntese protéica, do fluxo de íons de cálcio e da passagem de metabólitos através da membrana celular, o que contribui de forma positiva na reparação tecidual (DYSON, 1987).
As ondas ultrassônicas podem ser aplicadas por dois métodos conhecidos como contínuo e pulsado (GUIRRO e GUIRRO, 2002). A diferença entre os modos está na interrupção da propagação das ondas, sendo que prevalece o efeito térmico com o feixe contínuo. A intensidade da radiação ultrassônica é fator essencial para o sucesso de qualquer terapia (GUIRRO e SANTOS, 1997).
No mecanismo térmico, o tecido biológico é aquecido ao absorver parte da energia ultrassônica, quando o mesmo atravessa esse tecido. O aumento da temperatura provoca ação analgésica, antiinflamatória ou antiespasmódica na zona tratada. Melhora a circulação do local e regional, promovendo uma leve hiperemia (KITCHEN e BAZIN, 2001; LOW e REED, 2001; MACHADO, 1991).
devido ao efeito mecânico (vibrações sônicas) que o US provoca, gera calor por fricção (SILVA, 1987; MACHADO, 1991)
As mudanças biológicas do mecanismo não térmico do ultrassom seriam o aumento da permeabilidade das membranas e difusão celular; aumento do transporte dos íons de cálcio através das membranas das células, de granulação e de mastócitos; liberação de histaminas e agentes quimiotáxicos, aumento da taxa de sínteses de proteínas, aumento da síntese de colágeno, aumento da elasticidade do colágeno, aumento da atividade enzimática nas células, diminuição da atividade elétrica dos tecidos, promoção da oscilação dos tecidos, do movimento dos fluídos e da circulação nos vasos sanguíneos expostos a ondas estáveis (FUIRINI e LONGO, 1996).
Com relação aos efeitos térmicos há o aumento da taxa metabólica dos tecidos, promoção de mudanças vasculares concomitantes, aumento da extensibilidade do colágeno, aumento das propriedades viscoelásticas dos tecidos conjuntivos, diminuição de espasmos musculares, aumento da taxa de atividade enzimática (FUIRINI e LONGO, 1996).
2.3.3 Terapia ultrassônica e a lesão epitelial
O ultrassom na cicatrização de tecidos promove um aumento na síntese de colágeno, na velocidade de cicatrização, uma maior resistência, maior capacidade de absorver energia, aumento do fluxo sanguíneo e a facilitação na proliferação de fibroblastos e a síntese de proteínas (JACKSON et al., 1991).
O ultrassom tem o potencial de acelerar a resolução normal da inflamação desde que o estímulo inflamatório seja removido. Essa aceleração pode também dever-se à suave agitação do líquido dos tecidos que pode aumentar a taxa de fagocitose e o movimento das partículas e células (AGNE, 2005; LOW e REED, 2003; KITCHEN e BASIN, 2001).
Na fase proliferativa, os fibroblastos são estimulados a produzir mais colágeno, parece ocorrer devido ao aumento na permeabilidade da membrana celular, causado pelo ultrassom, permitindo entrada de íons de cálcio que controlam a atividade celular. Ainda nessa fase, outro efeito está relacionado ao aumento da velocidade de angiogênese e aumento na secreção de colágeno presentes nesta fase (LOW e REED, 2001).
O período de remodelamento é um processo que pode levar meses ou anos, a remodelação continua até que o novo tecido atinja características semelhantes às do tecido anterior à lesão, onde o colágeno do tipo III é substituído por colágeno do tipo I (GUIRRO e GUIRRO, 2002). O tratamento com ultrassom é realizado desde o processo inflamatório até a fase de remodelagem, é ofertado melhor resistência tênsil e elasticidade de colágeno maduro (KITCHEN e BAZIN, 2001; LOW e REED, 2001).
2.3.4 Fonoforese
Na fisioterapia a fonoforese vem sendo amplamente utilizada, associada a vários agentes antiinflamatórios (MITRAGOTRI, 2000), mas ainda levanta duvidas quanto à confiabilidade de seus efeitos positivos, necessitando de novas investigações (PARIZOTTO, 2003).
mesmo passe pelo fígado, diminuindo os efeitos sistêmicos da medicação (STARKEY, 2002).
Há propostas para o mecanismo fisiológico pelo qual a fonoforese age, mas ainda não é bem conhecido. Dentre eles, a fonoforese aumenta a temperatura e hidratação do tecido, pressão da onda de radiação, aumenta a energia cinética da droga, e altera os potenciais de membrana (BARE et al, 1996).
A cavitação ultrassônica é responsável pela permeabilização de células e tecidos. O ultrassom promove o aumento da permeabilidade da membrana, sendo o fator que torna possível a maior penetração de fármacos no organismo (GUIRRO e GUIRRO, 2002). O fenômeno da cavitação resulta na formação de microbolhas gasosas na camada externa da pele (estrato córneo) que podem romper-se violentamente, e possivelmente permitir a passagem da droga (MILLER, 2000).
Deve ser tomado certo cuidado durante a aplicação da fonoforese, pois esta pode acentuar a penetração transdérmica do fármaco, enquanto promove o efeito terapêutico do ultrassom e, com isto, poderá aumentar os benefícios ou malefícios clínicos promovidos pelo medicamento no organismo (CAMERON e MONROE, 1992).
2.4 Etnofarmacologia
O uso de plantas medicinais é uma prática milenar, ultrapassou todas as barreiras e obstáculos durante o processo de evolução tecnológica, chegando até os dias atuais. Está sendo amplamente utilizada por grande parte da população mundial como fonte de recurso terapêutico eficaz. Em laboratórios é transformado o extrato medicinal em comprimidos, pomadas conservando seu princípio ativo (DI STASI, 1996).
estudo pode-se destacar a Mikania laevigata, conhecida popularmente como guaco, e utilizada pela população para o tratamento de doenças respiratórias.
2.4.1 Mikania Laevigata
A Mikania laevigata é uma espécie vegetal nativa do sul do Brasil, encontrada em São Paulo e se estende até o Rio Grande do Sul. É popularmente conhecida como guaco, e utilizada pela maioria da população para problemas respiratórios (SIMÕES et al., 1998). Sua espécie vegetal pertence à família Asteraceae, sendo uma espécie de Guaco largamente utilizada em nosso país (REITZ, 1989). A época de floração da Mikania laevigata é no mês de setembro (MORAES, 1997).
As folhas da Mikania laevigata são simples, opostas, ovadas e oblongo-lanceoladas, de base obtusa e ápice agudo, de até 15 (quinze) centímetros de comprimento e 7 (sete) centímetros de largura. Possui três nervuras bem evidentes, pecioladas, verde-brilhante na face superior e mais pálida no interior. Suas flores são hermafroditas, de cor branco-creme (SIMÕES et al., 1998).
Figura 2: Detalhe das folhas da Mikania Laevigata
O gênero Mikania já era utilizado na medicina popular para o tratamento de diversas enfermidades, devido as suas propriedades antimicrobianas, antiinflamatórias e analgésicas (FERRO, 1991). A cumarina ocorre em abundância nas folhas de guaco, sendo considerado o principal componente químico da Mikania. Sua presença caracteriza o odor fragrante e aromático dessa planta medicinal (EVANS, 1996). A cumarina está presente em cerca de 2,6 % das folhas secas da Mikania laevigata. Ao gênero Mikania pode-se atribuir a ação antiinflamatória, analgésica, espasmódica, vasodilatadora, broncodilatadora, antiulcerogênica, antimicrobiana, antialérgica, antiestresse, depressora do SNC (FERRO, 1991).
Em um estudo realizado no sentido de avaliar a ação antiinflamatória da Mikania laevigata, alguns autores demonstraram uma ação antiinflamatória sobre o edema em patas de ratos, diminuindo significativamente a migração dos leucócitos no local da lesão (SUYENAGA et al., 2002).
Em outro estudo, com relação à ação antiinflamatória, analgésicas e antimicrobianas da Mikania laevigata, concluiu que a administração do extrato hidroalcoólico de Mikania laevigata mostrou-se efetivo na prevenção do dano oxidativo pulmonar causado pelo carvão mineral (FREITAS, 2006).
2.5 Espécies reativas de oxigênio
2.5.1 Definição
German e Gilbert em 1954 propuseram que alguns efeitos tóxicos do oxigênio poderiam ocorrer pela formação de radicais livres de oxigênio. Dentre os radicais livres existem dois grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as espécies reativas de nitrogênio (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
90-95% do oxigênio consumido é reduzido à água (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
A molécula de oxigênio pode aceitar um total de quatro elétrons para a sua redução a duas moléculas de água, mas esta redução pode acontecer com apenas um elétron por vez, ocasionando a produção de espécies reativas de oxigênio, e por conseqüência a produção de radicais livres de oxigênio (MATSUO e KANEKO, 2001).
A invasão e ativação de neutrófilos no local da lesão, em adição a fagocitose, pode conduzir a liberação de radicais livres de oxigênio e proteases como potencial causa de lesão. Neutrófilos contêm mais de quarenta enzimas hidrolíticas e moléculas tóxicas em seus grânulos e podem gerar vários oxidantes, tais como, ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e ácido hipoclorídrico (TOUMI e BEST, 2006).
Os radicais exercem funções importantes no organismo, participando da fagocitose, processos de sinalização celular e estão envolvidos na síntese e regulação de algumas proteínas, em condições fisiológicas. O problema constitui-se quando a produção dos níveis totais de ERO for maior que a capacidade de defesa, podendo ocasionar danos celulares (BONDY e LE BEL, 1993).
Ocorre em três fases a produção das espécies reativas de oxigênio. Na primeira fase ocorre a inicialização onde duas moléculas se fundem e formam um radical, após temos a progressão, fase em que o radical se liga a outra molécula qualquer, gerando um radical livre e finalmente o término quando a geração de radical termina (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
2.5.2 Estresse Oxidativo
Os radicais livres são formados no metabolismo celular. As defesas antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a toxicidade dessas espécies e são responsáveis pela homeostase entre a eliminação e a produção de radicais livres. Em condições extremas ocorre o aumento da produção de radicais livres, que são responsáveis por ultrapassar a capacidade antioxidante normal presente no organismo humano ou ocasionar um déficit das defesas antioxidantes no organismo, favorecendo o aumento do estresse oxidativo (BONDY e LE BEL, 1993; CADENAS e DAVIES, 2000).
Figura 3: Estresse Oxidativo
Fonte:Adaptado de MARKS et al., (1996).
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Caracterização da pesquisa
O presente estudo é caracterizado como sendo de natureza experimental. Em relação ao problema é caracterizada como quali/quantitativa e em relação aos objetivos é de natureza descritiva. Por fim, a pesquisa ainda é caracterizada em relação aos procedimentos como de levantamento de dados (LUCIANO, 2001).
Tendo como objetivo analisar o processo de cicatrização epitelial em ratos Wistar, e seus possíveis danos oxidativos, através da utilização do ultrassom terapêutico e do extrato glicólico de Mikania laevigata.
3.2 Caracterização das amostras
Figura 4: Caixa de ratos
Fonte: dados da pesquisadora (2009).
3.3 Instrumentos
3.4 Procedimentos para coleta de dados
O estudo foi realizado no Laboratório de FisioPatologia – FISIOPAT, localizado na UNESC e vinculado ao programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde desta instituição. Preliminarmente, o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética desta universidade (CEP), sob o parecer de número 620/07.
Laceração epitelial: todos os animais foram anestesiados com Cetamina (80mg/kg peso corporal, i.p.) após a sedação foi realizada uma única incisão circular, com bisturi cirúrgico, medindo aproximadamente 2 (dois) centímetros na porção medial do dorso de cada animal, conforme modelo proposto por (PESSOA et al., 2004).
Figura 5: Modelo de lesão epitelial
Fonte: adaptado de PESSOA et al., (2004).
O ultrassom utilizado foi de 1 MHz, no modo pulsado e com dose de 0,8 w/cm2.
Após o procedimento de lesão os animais foram divididos randomicamente em 3 (três) grupos:
Grupo 2 (n=5): foram tratados com ultrassom pulsado terapêutico e gel de extrato glicólico de Mikania Laevigata, por três minutos consecutivos, durante 10 (dez) dias.
Grupo 3 (n=5): tratados apenas com o extrato glicólico de Mikania Laevigata, o qual foi aplicado sobre o dorso dos animais em movimentos circulares reproduzindo a aplicação do ultrassom por três minutos consecutivos, durante 10 (dez) dias.
Observação: Antes do processo de tratamento os animais foram anestesiados com Cetamina (80mg/kg de peso corporal, i.p.).
Todos os animais foram acompanhados diariamente com registros fotográfico, e mensuração do tamanho da ferida, com o auxílio de um paquímetro, para análise da evolução cicatricial.
Logo após a última aplicação de cada grupo os animais foram decapitados e o tecido irradiado ao redor da ferida foi removido cirurgicamente.
Parte do tecido foi imediatamente congelado a –80 C para posterior análise bioquímica.
Ensaios Bioquímicos:
A) Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS): Como índice de peroxidação de lipídeos foi verificado a formação de substâncias reativas ao aquecimento do Ácido Tiobarbitúrico medido espectrofotometricamente (532nm), conforme descrito por DRAPER e HADLEY (1990).
B) Os danos oxidativos em proteínas foram mensurados pela determinação de grupos carbonil baseados na reação com dinitrofenilhidrazina como previamente descrito por Levine et al. (1990). O conteúdo de carbonil foi determinado espectrofotometricamente em 370nm usando um coeficiente 22.0000 Molar.
derivado amarelo cuja absorção foi medida por espectrofotômetro em 412 mm (AKSENOV e MARKESBERY, 2001).
Determinação da Proteína: a quantidade de proteína nos ensaios bioquímicos foram mensurados usando a técnica de LOWRY et al., (1951).
3.4.1 Preparação do Extrato glicólico de Mikania Laevigata
Para o preparo de 100 ml do extrato glicólico foi utilizado como solvente uma mistura de 50ml de água destilada mais 50 ml de propilenoglicol e 50g de farmacógeno seco (partes aéreas), na proporção de 1:2. A técnica de extração utilizada foi maceração por um período de 21 dias. O rendimento em teor de extrativos (sólidos totais = extrativos sólidos) deste extrato foi de 0,82%.
3.4.2 Descrição da técnica de maceração
- Macerar em recipiente fechado o farmacógeno seco, na proporção indicada (farmacógeno previamente pesado e verter sobre o farmacógeno o solvente indicado)
- Em temperatura ambiente - Durante 7 a 10 dias (ou mais) - Coando, espremendo fortemente
- Filtre, se necessário complete o volume conforme a proporção indicada.
3.5 Procedimentos para análise de dados
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O ultrassom provavelmente é o recurso físico mais utilizado no tratamento de lesões de tecidos moles, podendo acelerar a reparação tecidual nos seus diferentes aspectos (YOUNG e DYSON, 1990). Com a irradiação ultrassônica é possível aumentar tanto a velocidade da cicatrização, quanto a qualidade do tecido cicatricial (BAKER et al., 2001; KITCHEN e BAZIN, 2001), além de diminuir o estresse oxidativo tão presente na fase inflamatória. Entretanto, alguns achados vêm se opondo a este desenho de estudo, devido a pesquisadores não acreditarem que as lesões possam ser reparadas prematuramente através de ondas ultrassônicas. (NUSSBAUM et al., 1994; CAMBIER e VANDERSTRAETEN, 1997).
Reforçando a idéia, vários estudos realizados de forma errônea, mal controlados e com protocolos obscuros, onde a eficácia do ultrassom desaparece. Muitas pesquisas creditam como mecanismo de cicatrização o efeito mecânico, em oposição ao efeito térmico (KARNES e BURTON, 2002; DINNO et al., 1999). O micromassageamento (cavitação) do tecido epitelial produz uma mudança na permeabilidade da membrana e estimula o segundo mensageiro, o cálcio, através da célula (KARNES e BURTON, 2002; MORITMER e DYSON, 1988). E com a proliferação das células se tem o aumento da mioglobina (DINNO et al.,1999).
O efeito antiinflamatório do ultrassom é demonstrado em alguns outros estudos. Este mecanismo é explicado pela diminuição do número de macrófagos. No estudo de YOUNG e DYSON (1990), o número de macrófagos foi reduzido significativamente após a presença da terapia ultrassônica. No mesmo estudo foi demonstrado também que a terapia ultrassônica estimulou de modo eficaz a presença dos fibroblastos (YOUNG e DYSON, 1990).
Todos os grupos tiveram um tempo de dose de três minutos cada. Como meio de condução cabeçote/animal, foi utilizado papel filme. E quando não utilizou-se o ultrassom, o contato com o animal foi manual e de forma circular, tendo duração de três minutos também, para reprodução dos movimentos ultrassônicos. Toda a ferida epitelial foi previamente limpa com água destilada, para que pudesse retirar possíveis restos de palha das caixas dos animais ali contidas.
Figura 6 - Tamanho da Ferida (cm)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Lesão 5 dias 10 dias
c
m
Carbopol c/US Glicólico s/US Glicólico c/ US
A figura acima demonstra a média das feridas cutâneas no primeiro, quinto e décimo dias, onde foram, conforme a legenda, os animais tratados com gel carbopol com a utilização de ultrassom, gel de extrato glicólico de Mikania laevigata e gel de extrato glicólico de Mikania laevigata com a utilização de ultrassom, consecutivos.
a presença do ultrassom poderá obter uma diminuição significativa se a terapia for realizada por mais de dez dias.
Estes resultados mostraram semelhança ao encontrado no trabalho realizado por (SCHWENTKER et al., 1998)em que o período de cicatrização epitelial sem o efeito da radiação ultrassônica, produz menos fibroblastos e ocasiona uma necrose epitelial sobre a célula lesada, precipitando uma atrofia microvascular.
Outros estudos reforçam o trabalho realizado por SCHWENTKER (1998), pois os investigadores demonstraram que a aplicação do ultrassom reduz a fase inflamatória do reparo, e pode auxiliar o início da fase proliferativa, e desta forma uma fase de remodelamento com a ausência de cicatriz hipertrófica (YOUNG, 1990; TASKAN et al., 1997; BYL et al., 1993).
Figura 7 - Efeitos do Ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata sobre as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico
A figura 7 demonstra os níveis de TBARs em relação às feridas cutâneas no décimo dia, onde os animais foram tratados com gel de carbopol com a utilização de ultrassom, gel de extrato glicolítico de Mikania laevigata e extrato glicolítico de Mikania laevigata associado ao ultrassom.
extrato glicólico associado ao ultrassom em relação ao grupo carbopol com ultrassom.
Estes resultados indicam a probabilidade de que o extrato glicolítico em associação ao ultrassom diminui a lipoperoxidação pela diminuição do processo inflamatório e assim a liberação de espécies reativas de oxigênio.
Atualmente sabe-se que o oxigênio livre é um inibidor e em excesso pode causar destruição tecidual e falha no processo cicatricial (OLSWER, 1999). Esse radical apresenta uma grande afinidade por lipídios e proteínas da membrana celular, o que provoca uma reação em cadeia com alto poder de destruição celular que se refletirá em um aumento dos níveis de TBARS (VALLYATHAN et al., 1998).
Figura 8 - Efeitos do Ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata sobre o carbonil
Como pode-se verificar na figura, a proteína carbonil, medida de dano oxidativo em proteína, demonstrou uma diminuição significativa no grupo de extrato glicólico com ultrassom em relação ao grupo carbopol com ultrassom.
O extrato glicólico associado ao ultrassom reduziu as reações secundárias de cadeias laterais de alguns aminoácidos com produtos de oxidação lipídica, açúcares reduzidos ou seus produtos de oxidação (DALLE-DONNE et al, 2003).
Figura 9 - Efeitos do Ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata em relação à sulfidrila
A figura 9 demonstra os níveis de sulfidrila em relação às feridas cutâneas no décimo dia, onde os animais foram tratados com gel de carbopol com a utilização de ultrassom, uso tópico do gel de extrato glicolítico de Mikania laevigata e extrato glicolítico de Mikania laevigata com a utilização de Ultrassom.
Como pode-se verificar na figura, a sulfidrila, um marcador de oxidação de proteína, demonstrou uma diferença significativa no grupo extrato glicólico com e sem ultrassom, quando comparados ao grupo carbopol com ultrassom.
5. CONCLUSÃO
Os resultados encontrados nesta pesquisa em relação ao tamanho da ferida, demonstraram que o ultrassom pulsado associado ao gel de extrato glicólico de Mikania Laevigata não acelerou de maneira significativa o processo de cicatrização epitelial, apenas foi constatado um aumento da cicatrização epitelial, levando a sugerir que o prosseguimento da terapia poderá refletir em um resultado de forma significativa.
Em relação à diminuição do dano oxidativo ficou evidenciado que o extrato glicólico de Mikania laevigata associado ao ultrassom, reduziu os níveis de TBARs e de proteína carbonil. Em relação à sulfidrila, tanto o uso do ultrassom terapêutico com o extrato de Mikania laevigata e o uso tópico do extrato de Mikania reduziram a liberação do estresse oxidativo.
A técnica ideal para o reparo do tecido epitelial é a utilização da fonoforese, através do extrato glicólico de guaco, onde obteve-se uma menor liberação das espécies reativas de oxigênio.
Assim, após a realização desta pesquisa pode-se perceber que o objetivo inicial traçado foi alcançado, mostrando que o ultrassom pulsado associado ao gel de extrato glicólico de Mikania Laevigata exerce influência significativa no processo de cicatrização de feridas cutâneas, induzidas em ratos.
É importante salientar que o presente estudo tratou de um modelo experimental, não sendo indicados a pacientes portadores de lesões epiteliais infectadas ou com neoplasias. Nossos resultados foram realizados em modelo animal de lesão, mas considerando a relativa semelhança no processo cicatricial de ratos e humanos. Devemos considerar as peculiaridades de cada um, como quantidade de gordura adiposa, grau de desnutrição, idade e cor da pele, fatores estes que influenciam nas doses ideais de ultrassom, no tratamento em seres humanos.
6. PERSPECTIVAS
As perspectivas propostas estarão sendo realizadas, na especialização, com um modelo de estudo semelhante, no laboratório de Fisiopatologia Experimental da UNESC (FISIOPAT).
• Teste cometa, marcador de dano ao DNA;
• A atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase;
• A atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia respiratória mitocondrial;
• A atividade da citrato sintase, isocitrato desidrogenase e malato desidrogenase, enzimas reguladoras do ciclo de Krebs;
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