Luciana de Lourdes Souza

Luciana de Lourdes Souza

“ESTUDO DO REPARO DAS LESÕES INDUZIAS PELA RADIAÇÃO UVB (UVB) NO DNA DE Escherichia coli E Saccharomyces cerevisiae”

TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE

DOUTOR EM CIÊNCIAS

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 9

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Ficha Catalográfica

Souza, Luciana de Lourdes

Estudo do Reparo das lesões induzidas pela radiação Ultravioleta B (UVB) no DNA de Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae.

Rio de Janeiro, UFRJ, IBCCF, 2009.

x..., 94f.

Tese: Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica) 1. Reparo 2. Ultravioleta B

3. DNA 4. Lesão 5. Tese

I Universidade Federal do Rio de Janeiro II Título

Este trabalho foi desenvolvido sob orientação dos professores Alvaro Augusto da Costa Leitão e Marcelo de Pádula no Laboratório de Radiobiologia Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, com auxílios concedidos por: CNPq (Conselho Nacional d Desenvolvimento Científico e tecnológico), FINEP (Financiadora de Estudos e Projetos), FAPERJ (Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro), PRONEX (Programa de Núcleos de Excelência) e CEPG-UFRJ (Conselho de Ensino para Graduados da Universidade Federal do Rio de Janeiro).

Tua caminhada ainda não terminou A realidade te acolhe dizendo que pela frente o horizonte da vida necessita

de tuas palavras e do teu silêncio.

Se amanhã sentires saudades, lembra-te da fantasia e sonha com tua próxima vitória.

Vitória que todas as armas do mundo jamais conseguirão obter...

É certo que irás encontrar situações tempestuosas novamente, mas haverá de ver sempre o lado bom da chuva que cai e não a faceta do raio que destrói.

Não faças do amanhã o sinônimo de nunca, nem o ontem te seja o mesmo

que nunca mais.

Teus passos ficaram.

Olhes para trás...

mas vá em frente pois há muitos que precisam que chegues para poderem seguir-te.

- Charles Chaplin –

Agradecimentos

Por tudo o que tens feito...

Por tudo que vais fazer...

Por tuas promessas e tudo que és Eu quero te agradecer com todo o meu ser.

Te agradeço Senhor.

“Quando tudo diz que não tua voz me encoraja a prosseguir...”.

Ao meu pai, por ter em vida transmitido importantíssimos ensinamentos como:

enfrentar as dificuldades e não desanimar. Obrigada por ter construído a minha base para que eu possa construir os degraus.

À minha mãe Lourdes e meu padrasto Messias por sempre me incentivarem.

Às minhas irmãs Renata, Jessica e meu cunhado Elber por acreditarem em mim.

Às minhas tias Maria e Ivanilda por todo amor e cuidado dados a mim.

A minha amiga e praticamente irmã gêmea, Ivy Ribeiro por estar do meu lado em todos os momentos da minha vida.

Aos meus orientadores Alvaro Leitão e Marcelo de Pádula, pelos ensinamentos, orientação, mas principalmente pela paciência e confiança dadas desde a minha iniciação científica.

A todos os amigos do Laboratório de Radiobiologia Molecular: Barbara pelo carinho que tem comigo, Claudia Lage por transmitir “ricos” conhecimentos, Janine por ter aberto as portas da pesquisa para mim, Rita pela amizade, companheirismo e agradáveis conversas, Roberto pelo amigo que sempre demonstrou ser desde a faculdade, Tatiana por sempre me dar força nos momentos de insegurança, Claudia Ribeiro, Elder, Eliza, Gabriel, Glória, Ivan, Larissa, Léo, Marcus, Mariana, Tula e Viviana pela preciosa amizade no dia a dia de trabalho.

Siglas e Abreviaturas

ºC- graus Celsius

AP- apurínico ou apirimidínico ATP- adenosina tri-fosfato BER- reparo por excisão de base Can- canavanina

DIP- dipiridil (2,2’-Bipyridyl) DL- Dose Letal

DNA- ácido desoxirribonucléico E. coli- Escherichia coli

Endo- endonuclease

ERO- espécies reativas de oxigênio Exo- Exonuclease

g- grama h- hora J- Joules L- litro Lac- Lactose

LB- meio rico de crescimento bacteriano M9- tampão para diluição de células mg- miligrama

min- minuto mL- mililitrp

mM- milimolar µg- micrograma µL- microlitro

nm- nanômetro

NIR- reparo por incisão de nucleotídeo NUV- near UV, UV longo

O₂^•- radical superóxido OH^•- radical hidroxila Rif- rifampicina

RNA- ácido ribonucléico

S. cerevisiae- Saccharomyces cerevisiae SOD- Superóxido Dismutase

UFC- Unidade formadora de colônia UV- Ultravioleta

UVA- Ultravioleta A UVB- Ultravioleta B UVC- Ultravioleta C

%- porcentagem

Resumo

O espectro da radiação eletromagnética está dividido em três regiões do comprimento de onda: ultravioleta (UV), visível e infravermelho. A radiação UV está dividida em três seções, cada uma com distintos efeitos biológicos: UVA (320-400 nm), UVB (290-320 nm) e UVC (200-290 nm). O comprimento de onda do espectro solar que corresponde ao UVB é absorvido pela pele, produzindo eritema, queimaduras e eventualmente câncer de pele.

A luz UVB estimula a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). ERO são importantes mensageiros na indução de vários genes em diversas condições fisiológicas e patológicas. UVB induz lesões oxidativas e não oxidativas. O mecanismo de reparo por excisão de bases tem um importante papel no reparo de lesões oxidativas.

Exo III e Endo IV apresentam importante papel no reparo por excisão de bases (BER) de Escherichia coli. Ambas possuem atividade AP endonucleolítica clivando a ligação 5’ fosfodiéster adjacente ao sítio abásico espontâneo ou induzido. Mutantes deficientes na Exo III (xthA) são hipersensíveis a agentes oxidantes como por exemplo peróxido de hidrogênio, UV longo e UV médio, raios X, enquanto que mutantes deficientes em nfo não são sensíveis como a cepa xthA. Nós avaliamos a sensibilidade e mutagênese das cepas xthA e nfo após tratamento com UVB e comparamos com UVC. O uso do quelante de Fe⁺² (dipiridil) antes da irradiação protegeu completamente o mutante xthA dos efeitos letais do UVB, sugerindo a geração de lesões oxidativas tóxicas, via reação por metal de transição. A cepa nfo apresentou aumento na mutagênese induzida por

UVB. Este aumento foi significativamente suprimido pelo pré - tratamento com dipiridil. Entretanto, a cepa xthA não apresentou aumento de mutagênese após tratamento com UVB e UVC. Após a irradiação com UVB o espectro de substituição de base da cepa nfo, revelou aumento de transição AT→GC e aumento de transversão CG→GC, este aumento é suprimido após o pré – tratamento com quelante de Fe⁺².

Em Sacharomyces cerevisiae, as AP endonucleases codificadas pelos genes APN1 e APN2 participam do reparo de sítios abásicos. A Endo IV de E. coli é similar à proteína Apn1 de Sacharomyces cerevisiae. A segunda família de classe II das AP endonuclease inclui exonuclease III (Exo III) de E. coli, cuja proteína similar é Apn2 de S. cerevisiae. Nossos resultados revelaram aumento na mutagênese para a cepa apn1 após tratamento com UVB. Este aumento foi significativamente suprimido após o pré – tratamento com dipiridil. O mesmo foi observado com o gene similar de E. coli. Com base nas diferenças de sensibilidade e mutagênese para UVB e UVC nós propomos um importante papel de ExoIII e Endo IV de E.

coli assim como para Apn1 e Apn2 de S. cerevisiae no reparo de lesões oxidativas geradas pelo UVB.

Abstract

The spectrum of electromagnetic radiation is divided into three main regions of wavelengths: ultraviolet (UV), visible and infrared. The UV radiation is divided into three sections, each one producing distinct biological effects: UVA (320-400 nm), UVB (290- 320 nm) and UVC (200-290 nm). UVB wavelengths are absorbed by the skin, producing erythematic lesions, burns, and eventually skin cancer.

UVB light stimulates the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are important messengers for the induction of several genes in a variety of physiological and pathological conditions. UVB induces non oxidative and oxidative lesions. Base excision repair (BER) has an important role in the repair of oxidative lesions.

Exonuclease III (Exo III) and endonuclease IV (Endo IV) play a critical role in the base excision repair (BER) of Escherichia coli. Both are endowed with AP endonucleolytic activity, cleaving the 5’ phosphodiester bond adjacent to spontaneous or induced abasic sites in DNA. Although mutants defective in Exo III (xthA) are usually hypersensitive to oxidative agents such as hydrogen peroxide, near-UV-light and X rays, mutants defective in Endo IV (nfo) are not as sensitive as the xthA strain. We evaluated the sensitivity and mutagenesis of xthA and nfo strains after UVB treatment and comparison with UVCirradiation. The use of Fe⁺² ion chelator (dipyridyl), prior to irradiation, completely protected the xthA mutant against UVB lethal lesions, suggesting the generation of toxic oxidative lesions mediated by transition metal reactions. Although xthA strain did not display increased mutagenesis after UVC and UVB treatments. After UVB irradiation, the base substitution spectra of nfo strain revealed a bias towards AT→GC transitions and CG→GC transversions, which were also suppressed by previous treatment with the iron

chelator. In Sacharomyces cerevisiae, the AP endonucleases encoded by the APN1 and APN2 genes provide alternate pathways for the removal of abasic sites. The endonuclease IV of E. coli is similar to the Apn1 protein of Sacharomyces cerevisiae. The second family of class II AP endonucleases includes exonuclease III (Exo III) of E. coli, which

similar is the Apn2 protein of S. cerevisiae. Our results with yeast revealed the apn1 strain displayed increased UVB induced mutagenesis, which was significantly suppressed by pre- treatment with dipyridyl. The same was observed to similar gene in E. coli. In sum, based on the differential sensitivities and mutational spectra displayed after UVC and UVB treatments, we propose a role for Endo IV and Exo III to counteract DNA damage induced by the oxidative counterpart of UVB in Escherichia coli as to Apn1 and Apn2 in Sacharomyces cerevisiae.

ÍNDICE

1-Introdução...01

1.1- Radiação Ultravioleta...01

1.1.2- Lesões induzidas pelas Radiações UV...04

1.1.3- UV e câncer de pele...06

1.2- Fototerapia...09

1.2.1- Fotobiologia...10

1.3- Mutagênese...12

1.4- Estresse Oxidativo...14

1.4.1- Oxidação de lipídeos...15

1.5- Principais Mecanismos de Reparo...17

1.5.1- Reparo por Excisão de Bases...17

1.5.1.1- DNA-N- glicosilase...18

1.5.1.2- AP endonuclease relevantes neste trabalho...21

1.5.1.2.1- Exonuclease III...21

1.5.1.2.2- Endonuclease IV...23

1.5.2- AP endonucleases de leveduras...26

1.5.2.1- Apn1...26

1.5.2.2- Apn2...26

1.5.3- Reparo por Incisão de Nucleotídeos...27

2-Objetivos...29

3- Material e Métodos...30

3.1- Cepas utilizadas...30

3.1.1- Manutenção das cepas...32

3.1.2- Obtenção das culturas para os experimentos...33

3.2- Meios de cultura e tampões para bactéria...34

3.2.1- Meio Seletivo para Mutagênese Lactose...35

3.3- Meios de cultura para levedura...36

3.4- Construção de cepas...36

3.5- Competência e transformação bacteriana...38

3.6- Sobrevivência e mutagênese bacteriana...39

3.7- Sobrevivência e Mutagênese de leveduras...41

3.8- Lipoperoxidação (TBARS)...42

4- Resultados...44

5.1- Resultados com bactéria...44

5.1.1- Mutagênese induzida pela radiação UVB...47

5.1.2- Resultados com TBARS (Lipoperoxidação)...58

5.2- Resultados com levedura...60

5.2.1- Resultados de Mutagênese...65

5-Discussão...70

6-Conclusão...78

6.1- Comclusões-Bactéria...78

6.2- Conclusões-Levedura...79

7-Perspectiva...80

8- Referências Bibliográficas...81

9-Anexo...94

1-Introdução

1.1-Radiação Ultravioleta

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Em1801, a radiação ultravioleta foi descoberta pelo físico Johannw Wilhelm Ritter.

Ao fazer a dispersão de um feixe de luz visível através de um prisma, ele deslocou uma chapa fotográfica ao longo do espectro obtido e demonstrou que em uma região situada acima do violeta, ou seja, de maior energia, ocorria maior enegrecimento da chapa fotográfica. Devido ao fato desta região do espectro ser mais energética do que a do violeta, Ritter denominou-a de ULTRAVIOLETA.

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A radiação ultravioleta é uma radiação eletromagnética não ionizante para moléculas biológicas, que ao ser absorvida pelas substâncias químicas produz excitação dos elétrons dos átomos e moléculas, produzindo, como conseqüência, quebras de ligações químicas modificação de moléculas, etc (Pfeifer et al., 2005).

A radiação ultravioleta apresenta três denominações em função do comprimento de onda. A faixa de comprimento de onda que compreende 320-400 nm é classificada como UVA, entre 290-320 nm é classificada como UVB e a faixa de 190-290 nm é denominada UVC ou UV germicida (Pfeifer et al., 2005).

A luz solar está envolvida no surgimento de câncer de pele e diversas evidências experimentais indicam que dentre os comprimentos de onda da radiação solar que atravessam a camada de ozônio, o responsável pela carcinogênese na pele é o UVB,

contudo os mecanismos envolvidos no reparo das lesões e na indução de mutações que causam câncer de pele induzido por esta faixa de comprimento de onda ainda não foram completamente esclarecidos (Armstrog & Kunz, 1990). De fato, desordens humanas como o xeroderma pigmentosum; que conduzem ao câncer de pele entre outros, estão correlacionadas com defeitos no reparo de lesões induzidas por UV (Armstrog & Kunz, 1990).

As macromoléculas de DNA absorvem, com maior intensidade, na região UVC entre 240 e 280 nm. Há alguns anos atrás, foi detectado que o UVC poderia ocasionar mutações e letalidade através da absorção da radiação pelos ácidos nucléicos (Eisenstark, 1987). Todavia, a região que compreende UVA e UVB é absorvida com menor intensidade pelos ácidos nucléicos e proteínas, e consequentemente, a absorção por outros cromóforos torna-se relativamente importante (Eisenstark, 1987).

A letalidade mediada pelas radiações UVA e UVB não é totalmente devida a danos diretos no DNA, mas sim por dependência do oxigênio (Eisenstark, 1989). Isto sugere que os efeitos das radiações UVA e UVB podem envolver espécies reativas de oxigênio (ERO), como peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singleto (¹O2), radical superóxido (O2

·- ) e radical hidroxil (OH^•), todas estas espécies são tóxicas para a célula (Shennan et al., 1996).

O comprimento de onda ideal para estudar os efeitos que possivelmente estão envolvidos com câncer de pele seria na região do UVC, o comprimento de onda de 260 nm, já que é nessa faixa que ocorre o pico de absorção dos ácidos nucléicos. Entretanto, a camada de ozônio que envolve o planeta filtra com bastante eficiência o UVC, permitindo apenas a passagem do UVB e UVA, caracterizando-os, com relação ao que atinge a superfície terrestre como UV solar ou NUV (near UV) (Eisenstark, 1987).

A radiação NUV pode ter influências em vários sistemas biológicos como microrganismos, plantas e animais.

Diferentes estudos indicam que os comprimentos de onda mais eficientes na geração de carcinogênese e eritema na pele humana compreendem a faixa de 290-320 nm, portanto UVB. Há fotoprodutos produzidos por estes comprimentos de onda diferentes daqueles produzidos pelo UVC e, além disso, estas radiações podem atuar em outros sítios além do DNA, como a membrana celular (Brash, 1988).

Os mecanismos de ação da radiação são bastante diferentes quanto aos efeitos celulares, assim sendo, a resposta a estes agentes é provavelmente bastante complexa, pois várias moléculas de importância biológica podem ser atingidas. Deve-se ressaltar, porém, que o DNA e os mecanismos de reparo que resguardam sua integridade devem ser os alvos mais importantes para o comprometimento da viabilidade celular (Brash, 1988).

Na figura 1 está representado o espectro das diferentes radiações destacando a radiação UV.

Figura 1: Espectro de diferentes radiações.

100 150 200 250 300 350 400

Raios - X Luz

Visível Radiação Ultravioleta

UVC UVB UVA

1.1.2- Lesões induzidas pelas Radiações UV

A radiação UVC é conhecida como sendo capaz de induzir principalmente dímeros ciclobutano de pirimidina (CPD), além de fotoprodutos do tipo 6-4. A dimerização ocorre principalmente entre timinas (T^T) e em menor proporção entre timinas e citosinas (T^C) e entre citosinas (C^C), além disso, a dimerização é fortemente influenciada pelas seqüências adjacentes. CPDs são formados entre as ligações 5,6 de duas pirimidinas adjacentes e os fotoprodutos são formados por ligações instáveis entre os carbonos 6,4 de bases vizinhas.

Destas as que se formam com maior freqüência são 5’TC e 5’ CC, no entanto, estes fotoprodutos se formam em níveis menores quando comparados aos CPDs (Pfeifer et al., 2005). Em quantidades mais restritas, a radiação UVC de 254 nm também pode induzir hidratos de pirimidina (Sage, 1993).

A radiação UVB pode induzir a formação de dímeros de pirimidina em menor proporção do que a radiação UVC, se compararmos doses iguais de cada radiação. A formação de fotoprodutos 6,4 existe igualmente assim como uma fotoisomerização concomitante destas lesões gerando os fotoprodutos de Dewar (Taylor & Cohrs, 1987., Sage, 1993).

O UVA pode induzir CPDs no DNA e, também através de mecanismos indiretos, pode promover a formação de radicais oxigenados que reagem com o DNA, levando à formação de bases oxidadas, podendo gerar quebras, ligações DNA-proteína, hidratos, etc (Pfeifer et al., 2005). Esta produção de radicais ocorre através da participação de moléculas fotossensibilizadoras, presentes na própria célula ou de moléculas exógenas, capazes de captar a energia fotônica e de transferi-la para outras moléculas (como a água ou oxigênio,

por exemplo) que vão poder causar lesões na célula. A este fenômeno damos o nome de fotossensibilização (Piette et al., 1986).

Os CPDs são produzidos em frequência três vezes maior que os fotoprodutos 6-4 (Tornaletti & Pfeifer, 1996). Ambas as lesões ocorrem mais frequentemente em resíduos pirimidínicos conhecidos como ‘hot spots’ de mutações induzidas por UV (Kanjilal &

Ananthaswamy, 1996). Embora ambas as lesões sejam potencialmente mutagênicas, os CPDs são considerados os maiores contribuidores de mutações em mamíferos (Matsumura

& Ananthaswamy, 2003); fotoprodutos 6,4 são reparados muito mais rapidamente que os CPDs em células de mamíferos (Mitchell & Nairm, 1989).

Se não reparadas, as lesões induzidas por UV podem aumentar as mutações nas sequências de DNA. Estas mutações são transições de C→T e CC→TT. A regra do “A” tem explicado o aumento das mutações a partir das lesões induzidas por UV (Tessman et al., 1992). De acordo esta regra, a DNA polimerase insere adenina (A) em frente à lesão que não pode ser interpretada. O dímero TT não resulta em mutação, pois A normalmente é pareado com T. Entretanto, com CPDs CC, uma transição dupla CC→TT ocorre pois dois resíduos de A são colocados opostos ao dímero no lugar de dois resíduos de guanina (Kanjilal & Ananthaswamy, 1996).

Sabe-se que UVA não induz significativamente transições C→T e CC→TT, estas mutações são específicas para UVB e não se verificam transversões T→G (Pfeifer et al., 2005) como pode ser visto na figura 2.

G→C+C→G G→T+C→A G→A+C→T GG→AA+CC→TT T→A+A→T T→C+A→G T→G+A→C

múltiplas substituições de bases

deleção/inserção

Figura 2: Espectro de mutagênese do UVB que se caracteriza pela predominância de C→T e CC→TT. Adaptado de Pfeifer et al., 2005.

1.1.3- UV e câncer de pele

Câncer de pele é o mais comum dos tumores diagnosticados e o número dos cânceres não melanoma e melanoma tem aumentado dramaticamente nas últimas décadas (Houghton & Polsky, 2002).

Melanoma é a forma mais letal de câncer (Gilchrest et al., 1999). Há evidências epidemiológicas sugerindo que um histórico de queimadura e intermitente exposição à forte luz solar, particularmente durante a infância pode promover o desenvolvimento de melanoma (Gilchrest et al., 1999).

A principal conclusão de vários estudos é que UVB está claramente relacionado com o câncer não melanoma e que UVA tem um papel importante na indução de melanoma (Pfeifer et al., 2005). Enquanto, UVB domina os efeitos carcinogênicos da luz solar,

estima-se que UVA contribua com apenas 10-20% dos efeitos carcinogênicos da luz solar (Pfeifer et al., 2005).

A exposição contínua e por longo tempo à luz solar acarreta danos progressivos às várias estruturas da pele, como: queratinócitos, melanócitos, vasos, fibras e glândulas, entre outras. Aparentemente, isto ocorre como resultado do acumulo de lesões no DNA e de efeitos inflamatórios crônicos, que resultariam no câncer de pele (Pfeifer et al., 2005).

A irradiação UV causa mutações e aumento na proliferação celular e é capaz de ocasionar o câncer de pele sem que iniciadores ou promotores adicionais estejam presentes e é, de fato, denominada como um “completo carcinógeno” (Matsuma & Ananthaswamy, 2003), (ver figura 3).

Figura 3: Efeitos da radiação UV na pele (Matsuma & Ananthaswamy, 2003).

Efeitos do UV

Queimadura, Bronzeamento, Hiperplasia Epidérmica

Lesões no DNA

Indução de p53

Imuno supressão

Controle do ciclo celular Apoptose

Manutenção da estabilidade genômica

Replicação do DNA e reparo

Inibição da angiogênese

O gene p53 é o mais freqüente alvo de alterações genéticas identificados em cânceres humanos (Hollstein et al., 1991). A perda ou mutação de p53 foi identificada em aproximadamente 50% de todos os cânceres humanos examinados, contudo a freqüência de mutações varia dependendo do tipo de câncer. A função básica da proteína p53 é manter a célula em estado normal contra vários estresses extracelulares, incluindo a irradiação ou a indução de apoptose quando o DNA é severamente lesado, para poder prevenir a carcinogênese (Matsumura & Ananthaswamy, 2003).

Além de contribuir para a estabilidade genômica, p53 promove a replicação correta do DNA, o reparo e inibe a angiogênese, que é um fator crítico na progressão da malignidade. Desta forma, p53 tem um papel relevante na proteção do genoma, células e pele contra a irradiação UV (Matsumura & Ananthaswamy, 2003).

Os cânceres de pele são influenciados por vários fatores (Matsumura & Ananthaswamy, 2003):

• Tempo total de exposição ao sol

• Intensidade e duração do componente UV

• Predisposição genética

O câncer ocorre nas áreas expostas ao sol e há maior incidência em indivíduos de pele clara. A exposição intensa à luz solar, com queimadura pode ser fatal ao indivíduo, quando este ingerir algum produto (medicamento por exemplo) fotossensibilizante, o qual é capaz de aumentar o efeito da radiação solar no DNA (Matsumura & Ananthaswamy, 2003).

1.2-Fototerapia

A fototerapia é uma modalidade terapêutica empregada para tratamento de várias dermatoses. O início de sua utilização data da antiguidade, e sua classificação é feita segundo o tipo de irradiação utilizada (UVA ou UVB), variável de acordo com os comprimentos de onda (Roelandts, 2002).

As primeiras descrições do uso da fototerapia datam de 1400 e dizem respeito à prática dos hindus no emprego de plantas medicinais associadas à exposição ao sol para tratamento de vitiligo. Foi, porém, a partir de 1903, quando Niels Finsen recebeu o prêmio Nobel pelo sucesso do tratamento de lúpus com a radiação UV, que a fototerapia começou a ser realmente estudada e praticada para o tratamento de várias dermatoses (Roelandts, 2002).

→ → →

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• Acne, alopecia;

• Casos de alterações circulatórias periféricas e

• Pele com infecções bacterianas, infecções por fungos, feridas infectadas.

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→

• Tuberculose pulmonar;

• Eczema;

• Dermatites agudas e

• Pessoas muito sensíveis à luz solar, com pele branca, olhos claros (fotofobia).

1.2.1-Fotobiologia

A radiação UVA atinge a epiderme, derme superficial e média e o UVB atinge principalmente a epiderme. Tanto UVB como UVA agem sobre os queratinócitos.

PUVA (psoraleno + ultravioleta A) e a terapia UVB são bastante usados no tratamento de muitas desordens na pele incluindo psoríases, dermatites atópicas, vitiligo e linfomas cutâneos. O uso reduzido de PUVA deve-se à intenção de diminuir a incidência de doenças de pele por repetições do tratamento e para controlar reações fototóxicas. Estas reações ocorrem somente quando psoralenos são ativados por UVA. A fototerapia UVB também vem sendo usada com muito sucesso principalmente no tratamento de doenças inflamatórias de pele. A radiação UVB é considerada por exercer efeitos terapêuticos por inibição da proliferação celular, indução de apoptose e imunossupressão (Matsumura &

Ananthaswamy, 2003).

Além disso, a foterapia pode ser utilizada associada a vários outros medicamentos sistêmicos, como os retinóides e outros (Roelandts, 2002).

Como em toda fototerapia, o potencial fotocarcinogênico do UVB está presente. O potencial fotocarcinogênico foi identificado após a observação da produção de lesões como CPD e 8-oxoguanina. Estas lesões causam mutações em oncogenes e genes supressores de tumores aumentando a fotocarcinogênese. Avaliando a formação dessas lesões pelo Narrowband, banda estreita de UVB (311-312 nm) e Broadband, banda larga de UVB (290-320 nm), após a exposição a equivalentes doses terapêuticas foi verificado que a proporção de formação de CPD é similar no Narrowband UVB e no Broadband UVB, no

entanto, a formação de 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxiguanina (8 oxoguanina) é até 3 vezes maior após o tratamento com Narrowband UVB (Budiyanto et al., 2002).

Os efeitos colaterais do tratamento são temporários, sendo o mais comum um eritema transitório. Pessoas submetidas ao tratamento têm maior probabilidade de desenvolver câncer de pele (Yashar et al, 2003).

O Narrowband UVB permite que os pacientes recebam o tratamento com menos riscos de queimaduras ou exposição ao UV em níveis prejudiciais e evita os efeitos colaterais de psoralenos usados no tratamento com PUVA (Psoraleno + UV-A) (Yashar et al, 2003).

Além de o UVB ser menos maléfico que o PUVA, ele também tem ação benéfica já que age na pele promovendo a ativação da pró-vitamina D e no máximo de absorção de 297 nm ocorre em maior quantidade a síntese da vitamina D3. Esta vitamina se liga ao cálcio (Ca⁺⁺) e o conduzem à matriz óssea. Este fenômeno de absorção e deposição do Ca⁺⁺ nas células ósseas previne o raquitismo, a osteomalácea e a osteoporose (Yashar et al, 2003).

1.3- Mutagênese

Os efeitos em longo prazo das lesões no DNA envolvem indução de mutações via replicação do DNA lesado que podem levar à transformação neoplásica das células. A radiação UVB induz câncer em mutantes com predisposição à síndrome de Cockayne e pode levar também ao envelhecimento precoce observável em pessoas cronicamente expostas ao sol. Em termos de saúde coletiva, o risco mais significativo da irradiação UV é a fotocarcinogênese (Van der Host et al., 2002).

As mutações C→T foram identificadas como sequências dipirimidínicas nos genes ras e p53 isolados de cânceres de pele e transições em tandem C→T também foram detectados nos genes p53. Contudo, o mecanismo preciso de como a luz UV causa transições de citosinas em sítios dipirimidínicos ainda não é conhecido (Pfeifer et al., 2005).

O CPD é considerado como a lesão mais importante devido à sua abundância, reparo lento e conhecida mutagenicidade (Lee & Pfeifer, 2003). Já foi observado que duas citosinas metiladas formam 15 vezes mais CPD após exposição ao UVB quando comparado ao UVC Lee & Pfeifer, 2003). O fotoproduto 6-4 parece ser muito mais mutagênico do que o CPD em experimentos com lesões sítio específica (Pfeifer et al., 2005). A frequência de mutação obtida com um sítio específico 5’-TT-CPD é geralmente baixa (Taylor & O’Day, 1990), ainda que o dímero de TT cis-syn não seja altamente mutagênico (1% TT→TC, 5%

TT→TC (Smith et al., 1996). O isômero de “Dewar” é menos mutagênico, causando

somente 32-42% de mutações, das quais 20-30% também são mutações TT→TC (LeClerc et al., 1991).

A excisão de nucleotídeo (NER) constitui mecanismo envolvido no reparo de CPD e fotoproduto 6-4. Sabe-se que NER também participa do reparo das lesões induzidas por UVB (Souza, 2004).

Resíduos de guaninas lesadas oxidativamente podem estar envolvidos na mutagênese induzida por UVB. Há evidências que este componente da luz solar pode ser capaz de produzir ERO através de um processo que envolve absorção de luz e subseqüente transferência de energia para o átomo de oxigênio. Interessantemente, a 8 oxoguanina, uma forma de guanina lesada oxidativamente, pode originar uma transversão G→T, C→A (Kunz

& Armstrong, 1998).

Há fortes evidências sugerindo que as lesões causadas por NUV sejam substratos para Exo III, devido à sensibilidade dos mutantes xthA. A lesão no DNA pode ser uma quebra simples com um terminal 3’ que pode ser ativado pela Exo III para permitir a síntese pela DNA polimerase I. Isto é consistente com as observações de mutantes de E. coli xthA (deficientes em exonuclease III) e polA (deficientes em DNA polimerase I) sejam sensíveis a H₂O₂ e NUV. Algumas características das lesões no DNA são semelhantes para NUV e H2O2, porém há algumas que são específicas de NUV. Isto provavelmente deve-se ao fato do fotoefeito de NUV poder ocasionar lesões indiretas do DNA, talvez via lesões na membrana (Kelland et al, 1984), tRNA (Blanchetot et al, 1984) e/ou outros fotorreceptores (Blanchetot et al, 1984).

1.4- Estresse Oxidativo

Todos os organismos aeróbios vivem em função do oxigênio molecular, utilizando- o como aceptor final de quatro elétrons da cadeia respiratória. No entanto, se a redução do oxigênio for incompleta, espécies reativas desta molécula irão se formar (Rocha et al., 1996). Quando a cadeia respiratória não está com sua eficiência máxima, há a produção de uma quantidade insuficiente de elétrons podendo fazer com que muitas moléculas de O₂ sofram uma redução incompleta, levando à geração de formas intermediárias chamadas de espécies reativas de oxigênio (ERO) (Halliwell & Gutteridge, 1984). Há três tipos de ERO:

• radical superóxido (O2^•-

), formado a partir do recebimento de um simples elétron pela molécula de O2, podendo também ser gerado pela oxidação do peróxido de hidrogênio,

• peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical O2

•-

pode receber um segundo elétron dando origem ao íon O2--

. Este íon captura dois prótons gerando peróxido de hidrogênio.

• Radical hidroxila (OH^•), sua formação pode se dar através da fissão da ligação O-O do H2O2 gerando dois radicais hidroxila OH^•.

Estas formas de oxigênio causam danos aos constituintes celulares como DNA, lipídeos e proteínas e, portanto, para sobreviverem os organismos tiveram que desenvolver mecanismos de proteção antioxidantes (Cooke et al., 2003). Além do processo de respiração, espécies reativas de oxigênio podem ser geradas por outros processos metabólicos como na síntese de ácidos graxos insaturados da membrana citoplasmática (Cooke et al., 2003). ERO também podem ser formadas pela exposição das células à radiação ionizante, a agentes químicos ou a metais pesados (Asad et al., 1998). Portanto,

através destes mecanismos todo organismo aeróbio é constantemente exposto a agentes pró-oxidantes. Quando a concentração destes agentes ultrapassa a capacidade antioxidante da célula ocorre o que se chama de estresse oxidativo, que se caracteriza pelo acúmulo intracelular de ERO (Heck et al., 2003).

O estresse oxidativo tornou-se de grande interesse para inúmeros grupos de pesquisa, uma vez que está associado a várias enfermidades, como o câncer, doenças cardiovasculares, artrite, doença de Alzheimer, síndrome de Down, Parkinson e mostrou estar envolvido no aumento da expressão e replicação do HIV-1 (Schreck et al., 1991).

1.4.1- Oxidação de lipídeos

A oxidação das membranas é uma outra consequência bastante frequente em decorrência do ataque de qualquer espécie reativa de oxigênio. Este ataque pode ter como alvo os ácidos graxos livres, lipídeos de membrana ou proteínas de membrana (integrais ou não). A taxa de peroxidação lipídica é diretamente proporcional ao número de ligações insaturadas C=C, ou seja, uma membrana celular rica em ácidos graxos poli-isaturados é mais susceptível ao ataque das espécies reativas de oxigênio (Mahmutoglu & Kappus, 1985).

Os ácidos graxos celulares são oxidados prontamente por espécies ativas de oxigênio para produzir os radicais peróxidos de lipídeos e hidroperóxidos de lipídeos (Rice- Evans e Burdon, 1993). Hidroperóxidos de lipídeos são reduzidos através de glutationas peroxidases para formas alcoólicas de ácidos graxos não reativos ou eles reagem com metais para produzir uma variedade de produtos que são reativos (por exemplo, epóxidos,

aldeídos, etc.). Os principais aldeídos produtos de peroxidação de lipídeos são malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal (HNE) (Shauenstein & Esterbauer, 1978).

A peroxidação de lipídeos pode resultar em vários possíveis danos, inclusive oxidação de proteínas (Rice-Evans e Burdon, 1993).

Pode-se dividir a peroxidação lipídica em 3 fases: iniciação, propagação e terminação. Kappus, em 1985, propôs um mecanismo cujas reações em cadeia levam a peroxidação lipídica. O processo é iniciado com a abstração de um átomo de hidrogênio de um ácido graxo poli-insaturado, dando origem a um radical lipídico.

lipídeo-H + OH^•

→

+

Este radical lipídico tende a se estabilizar através de um rearranjo molecular para produzir um conjugado dieno, que então reage rapidamente com O₂ produzindo um radical lipídico.

lipídeo^·+ O2

→

Esta reação é propagada através do ataque deste radical a outros ácidos graxos, abstraindo destes o átomo de hidrogênio para formar o radical hidroperóxido (Lipídio- O2H).

lipídeo- O2· + lipídeo-H

→

Estes radicais hidroperóxicos parecem sofrer ainda fragmentação na presença de O2,^- metais de transição ou por aumento de temperatura, gerando novos radicais peróxi- lipídicos (LOO^·) ou radicais alcoxi lipídicos, capazes de iniciar nova peroxidação lipídica (Mahmutoglu & Kappus, 1985).

1.5-Principais Mecanismos de Reparo de DNA Envolvidos Neste Estudo

1.5.1- Reparo por Excisão de Bases

O reparo por excisão de bases é provavelmente o mais importante sistema de reparação de lesões oxidativas, bases modificadas, sítios com perda de bases, quebras simples e pequenas lacunas de DNA. Tanto procariotos como eucariotos possuem uma grande variedade de DNA glicosilases, enzimas hidrolíticas responsáveis pela retirada de bases alteradas do DNA, cada qual possuindo especificidade para um ou alguns tipos de lesão ( revisto por Cunningham, 1997).

Dependendo da lesão, o reparo pode ser iniciado por enzimas que hidrolisam a ligação N-glicosídica que une a base nitrogenada ao DNA. Como resultado, é gerado um sítio apurínico ou apirimidínico (AP). O reparo de sítio AP pode ser feito de duas formas: a ligação fosfodiéster pode ser clivada do lado 5’ do mesmo por uma AP endonuclease de classe II [(Exo III) ou (Endo IV)], e o resíduo de desoxirribose 5’-fosfato remanescente é removido por uma 5’ desoxirribofosfodiesterase (dRPase). A outra via de reparo de sítios AP ocorre pela clivagem da ligação fosfodiéster por um mecanismo de β-eliminação promovido por uma AP endonuclease de classe I ou AP liase [(Fpg) ou (Endo III)] (esta atividade AP liase está presente em algumas DNA glicosilases), gerando terminais 5’- fosfato e resíduos 3’ contendo um aldeído α, β insaturado. Nesta segunda via (pelas AP liases), pode ocorrer ainda δ-eliminação do aldeído, mediada pela enzima Fpg, deixando um terminal 5’-fosfato e um terminal 3’-fosfato. Tanto o terminal 3’-fosfato como o aldeído insaturado, podem ser removidos pela atividade 3’ fosfodiesterásica presente nas AP endonucleases de classe II (Demple e Harrison, 1994).

Ambas as vias culminam com a excisão da base lesada e do resíduo de desoxirribose fosfato, deixando uma lacuna que pode ser preenchida pela enzima DNA polimerase I e o (s) nucleotídeo (s) incorporado (s) será (ão) ligados ao restante da cadeia fosfodiéster pela ação da DNA ligase, desta forma, completando o reparo (Demple e Harrison, 1994).

.

1.5.1.1- DNA- N-glicosilases

Na categoria de BER estão incluídas as enzimas que apenas retiram a base nitrogenada danificada através da quebra da ligação glicosídica, gerando sítios AP no DNA.

As DNA glicosilases são capazes de romper a ligação entre a base e a desoxirribose. Muitas DNA glicosilases reconhecem somente um tipo particular de lesão e a maioria das DNA glicosilases é altamente específica para classes de bases oxidadas. Elas são proteínas pequenas, com aproximadamente 30 kDa e o aparecimento de bases livres após tratamento do DNA com agentes genotóxicos é a maior demonstração da atividade das DNA glicosilases (Friedberg et al., 2006). Sítios AP também podem ocorrer a partir da depurinação ou depiridiminação do DNA devido à hidrólise espontânea da ligação glicosídica (Friedberg et al., 2006). O reparo de sítios AP requer sucessivos eventos bioquímicos para completar o processo. A remoção dos sítios AP é iniciada por uma segunda classe de enzimas envolvidas no BER, conhecidas como AP endonucleases, que reconhecem os sítios AP. Diversos estudos estimaram que aproximadamente 20.000 sítios AP são gerados por dia por célula humana em condições fisiológicas normais (Friedberg et

al., 2006). AP endonucleases produzem incisões ou quebras na dupla fita de DNA por hidrólise de uma ou outra ligação fosfodiéster. Como será discutido, a maioria das AP endonucleases têm especificidade pela ligação 5’ fosfodiéster. É importante frisar que as endonucleases que realizam a incisão do lado 3’ adjacente ao sítio AP, não são verdadeiras AP endonucleases, pois não realizam a hidrólise da ligação fosfodiéster, mas sim uma reação de β-eliminação sem deixar uma extremidade 3’OH livre. As enzimas da classe I clivam a ligação 3’, e as de classe II clivam a ligação 5’ do açúcar abásico. Todas as enzimas de classe I conhecidas são glicosilases com AP liases associadas (Friedberg et al., 2006).

Dentre as DNA glicosilases conhecidas em bactérias podemos citar: as 3-metil adenina DNA glicosilases (I e II), responsáveis pela eliminação de bases metiladas ou com radicais maiores (Bjelland & Seeberg, 1987); a uracil DNA glicosilase, responsável pela eliminação de uracil no DNA (Cone et al., 1977). É importante lembrar que estes dois exemplos possuem seus similares em leveduras e em células humanas. A atividade correspondente a uma 3-metil adenina DNA glicosilase em células humanas é codificada pelo gene AAG (3-alquiladenina DNA glicosilase) ou MPG (N-metil purina DNA glicosilase) (O’ Connor e Laval, 1990). Já em leveduras, encontramos o gene MAG de Saccharomyces cerevisiae (Chen et al., 1989).

Existem em diversos organismos, assim como no homem, DNA glicosilases que possuem uma atividade AP liase associada. A proteína MutY bacteriana possui uma atividade glicosilase que remove adenina emparelhada com guanina, além de ser uma AP liase (Boiteux et al., 2004). O homólogo da proteína MutY em levedura ainda não foi encontrado, entretanto, o homólogo funcional de mutY humano (hMYH) já foi identificado

e possui grande homologia de seqüência com o gene bacteriano. Porém a atividade tipo Mut Y em levedura está a cargo do mismatch repair MSH2 e MSH6 (Memisoglu &

Samson., 2000).

A proteína Fpg codificada pelo gene fpg, é uma DNA glicosilase com função AP liase que reconhece principalmente lesões geradas em purinas oxidadas (Memisoglu &

Samson., 2000).

É importante frisar que em bactérias existe um sistema responsável pela proteção contra mutações espontâneas devido a danos oxidativos. Neste sistema, as proteínas MutY, Fpg e MutT tomam parte impedindo transversões. Este é o chamado sistema GO que impede a presença de 8-oxoguanina no DNA ou sua inserção a partir do “pool” de dGTP intracelular contendo dGTP oxidada (Memisoglu & Samson, 2000).

Em E. coli também podemos encontrar uma DNA glicosilase/ AP liase capaz de reconhecer produtos oxidado de pirimidina: a endonuclease III (Nth) ou timina glicol DNA glicosilase codificada pelo gene nth.

A MutY-DNA-glicosilase que catalisa a remoção de adenina de um pareamento 8- oxoguanina-adenina, mostra significativa homologia com a Endo III (Michaels et al., 1990).

Em leveduras encontramos duas proteínas que partilham funções similares às da proteína Nth bacteriana: as proteínas Ntg1 e Ntg2 (Memisoglu & Samson., 2000).

Algumas AP liases, como a Endo III, incisam o DNA por uma reação de β- eliminação o que produz resíduos de desoxinucleosídeo 5’- fosfato 5’- terminais e aldeídos alfa beta-insaturados 3’ terminais (Cunningham & Weiss, 1985).

1.5.1.2-AP endonucleases relevantes neste trabalho

Exonuclease III (Exo III), codificada pelo gene xthA, e Endonuclease IV (Endo IV), codificada pelo gene nfo, possuem importante papel no reparo das lesões induzidas por UVB (Souza et al., 2006). Ambas apresentam atividade AP endonucleolítica clivando a ligação 5’ fosfodiéster adjacente ao sítio AP (Souza et al., 2006).

Estudaremos a seguir a atividade destas enzimas a fim de compreender suas importâncias em nosso trabalho.

1.5.1.2.1- Exonuclease III (Exo III)

A Exo III, produto do gene xthA, é uma proteína de ~ 28kDa com atividade endonucleásica dependente de Mg²⁺, sendo inibida em presença de EDTA. A enzima catalisa a hidrólise, em hélice dupla, de sítios AP no lado 5’ da perda da base, deixando terminais 3’ OH e 5’P (o 5’P ficando no açúcar abásico). É geralmente aceito que a função AP endonucleásica da Exo III reconhece sítios AP oriundos da perda de pirimidinas ou purinas do DNA com igual facilidade; contudo, comparações quantitativas deste parâmetro não foram relatadas. A enzima é menos ativa no DNA que contem sítios AP reduzidos com borohidrato de sódio como um substrato, sugerindo que o grupo aldeído do C-1 na deoxirribose não está sendo necessário para a ação da enzima. O mecanismo de ação da enzima é distinto das reações de β-eliminação catalisada por álcalis ou AP liases (Friedberg et al., 2006).

O gene xthA foi clonado e sequenciado (Lehmann et al., 1993). O cálculo do peso molecular e a seqüência amino terminal do polipeptídeo estão em concordância com as da proteína purificada. Um gene homólogo (exoA), que não codifica uma exonuclease com

muitas das propriedades da Exo III, foi isolado a partir de Streptococcus pneumoniae (Lavin & Schroeder, 1988).

A presença de diversas funções catalíticas associadas a uma pequena proteína sugere que um único sítio ativo catalisa todas as reações enzimáticas da Exo III, através de três importantes domínios em sua estrutura. Um é o sítio ativo que catalisa a clivagem das ligações fosfodiéster em uma das hélices do DNA. O segundo reconhece a estrutura de dupla hélice e o terceiro reconheceria o espaço deixado pela base retirada, facilitando a função AP endonuclease (Doetsch & Cunningham, 1990).

A hidrólise da ligação 5’ fosfodiéster de um sítio AP gera um resíduo 5’deoxirribose fosfato. A remoção deste resíduo durante o reparo por excisão de bases requer uma outra classe de enzimas: nucleases que podem iniciar a degradação deste terminal. Estas enzimas são conhecidas como exonucleases. Ao contrário das DNA-N-glicosilases e AP endonucleases, as exonucleases não são enzimas específicas de reparo. Elas podem degradar terminações de DNA em uma variedade de processos do DNA, incluindo reparo, recombinação e replicação (Doetsch & Cunningham, 1990).

O resíduo 5’deoxirribose fosfato originado pela atividade da Exo III pode ser clivado por uma deoxiribofosfodiesterase (dRPase) gerando uma lacuna no DNA. Esta lacuna pode ser facilmente reparada pela DNA polimerase I e DNA ligase. Durante o reparo do DNA a eliminação de bases oxidadas por uma DNA glicosilase origina sítios AP que são substratos da Exo III (Doetsch & Cunningham, 1990).

1.5.1.2.2- Endonuclease IV (Endo IV)

Há uma outra enzima codificada, pelo gene nfo, que é responsável por uma pequena parte da atividade AP endonucleolítica. A Endo IV reconhece e cliva o DNA da mesma maneira que a Exo III, ela atuaria na ausência da Exo III ou complementando sua atividade.

Semelhante à atividade da Exo III, a Endo IV ataca as ligações fosfodiéster no lado 5’ do sítio AP, deixando grupos 3’OH. Adicionalmente, ela também pode remover fosfoglicoaldeído 3’-fosfato, desoxirribose -5-fosfato e resíduos 4-hidroxi-2-pentenal do terminal 3’ do DNA dupla fita. Ela também tem uma ação sobre resíduos de uréia. Em verdade, a única diferença é que a Exo III tem uma ação 3’ exonuclease que não está presente na Endo IV. A enzima Endo IV parece servir como “reserva” em relação a Exo III para uma série de substratos (Friedberg et al., 2006).

Os mutantes deficientes em Endo IV são sensíveis a metil metano sulfanato (MMS), mitomicina C e aos agentes oxidantes tert-butil hidroperóxido e à bleomicina. Em presença da mutação xthA a sensibilidade a estes agentes e às radiações ionizantes é aumentada. Os mutantes nfo são mais sensíveis ao tert-butil hidroperóxido e à bleomicina que os mutantes xthA sugerindo que a Endo IV pode reconhecer algumas lesões que não são reconhecidas pela Exo III (Friedberg et al., 2006).

A Endo IV está presente nas células em níveis dez vezes menores que a Exo III após tratamento das células com agentes que geram superóxido ou pelo óxido nítrico, que ativam o regulon SoxRS (Nickoloff & Hoekstra, 1998).

A redundância das atividades de AP endonuclease em E. coli comprova a sua fundamental importância no reparo por excisão de bases no DNA (Friedberg et al., 2006).

Agentes químicos como paraquat e menadiona, que são reduzidos enzimaticamente in vivo via transferência de um elétron e então auto-oxidados gerando

radicais superóxido, induzem um aumento de 10 a 20 vezes no nível de Endo IV (Chan &

Weiss, 1987). A Endo IV também é induzida quando as células deficientes em superóxido dismutase são cultivadas em presença de oxigênio puro e esta indução é independente do gene oxyR que controla o regulon do estresse oxidativo induzido por peróxido (Friedberg et al., 2006).

Sabe-se que a ausência de Endo IV também interfere na sensibilidade de células deficientes no mecanismo de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) após tratamento com UVB. Estudos realizados com duplos mutantes nfo uvrA, nfo uvrB e nfo uvrC mostraram que os duplos mutantes são mais sensíveis que o simples mutante nfo e o simples mutante uvrC apresentou sensibilidade semelhante ao duplo mutante nfo uvrC.

Estes resultados sugerem a participação da proteína UvrA e UvrB de maneira independente de Endo IV. Esta estaria atuando de maneira semelhante à proteína UvrC (Souza, 2004).

Figura 4: Esquema proposto para o BER em E. coli adaptado de Nickoloff & Hoekstra., 1998.

5’-AP Endonuclease (Classe II)

*

5’ 3’

5’

3’

5’

3’ 5’

3’

5’

5’

3’

3’

5’ OH 3’

3’ 5’

3’

3’

5’

5’

OH

3’

3’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

MODIFICAÇÃO DE BASE (EX.: ALQUILAÇÃO, OXIDAÇÃO)

(DNA GLICOSILASE OU PERDA ESPONTÂNEA)

3’-AP Liase (Classe I)

Desoxirribofosfodiesterase 3’-Diesterase de reparo

*

Ligação (DNA ligase) P

P REMOÇÃO DA BASE

Polimerização (DNA pol I)

1.5.2- AP endonucleases de leveduras 1.5.2.1- Apn1

Possui aproximadamente 97% da atividade AP-endonuclease e 3’-fosfodieterase em leveduras. Em células humanas encontramos também conservada esta atividade que é codificada pelo gene HAP1 (Memisoglu & Samson, 2000). O gene APN1 está localizado no cromossomo XI (Boiteux & Guillet, 2004). Apn1 é uma enzima monomérica composta de 367 aminoácidos com peso molecular de 41.4 kDa e tem homologia com Endo IV de E.

coli. Apn1 é uma proteína nuclear, porém estudos revelaram que ela também pode estar localizada na mitocôndria (Vongsamphanh et al., 2001). O mesmo estudo mostra que a translocação de Apn1 dentro da mitocôndria requer uma interação física entre Apn1 e Pir 1, uma proteína inicialmente descrita como constituinte da parede celular (Vongsamphanh etal., 2001).

1.5.2.2- Apn2

A inativação de Apn1 não resulta em uma instabilidade genética para a célula visto que, Apn2 apresenta cerca de 3% da atividade AP endonuclease/3’ fosfodiesterase que pode atuar na ausência da proteína Apn1. Apn2 apresenta homologia com Xth de E. coli (Exo III) e Ape 1 em humanos (Boiteux & Guillet, 2004). Além disso, Apn2 também possui uma porção carboxi terminal presente em Ape 2 de humanos e ausente em ExoIII e Ape1. Isto classifica Ape 2 como uma subfamília dentro das proteínas homólogas de Apn2 (Unk et al., 2002).

O gene APN2 está localizado no cromossomo II e codifica uma proteína com 520 aminoáciddos com massa molecular de 59.4 kDa. Quanto à sua localização estudos bioquímicos indicam uma localização nuclear (Unk et al., 2002).

1.5.3- Reparo por Incisão de Nucleotídeos (NIR)

Evidências sugerem a existência de uma via alternativa de reparo em que a Endo IV incisa ligações fosfodiéster no lado 5’ das bases lesadas, gerando 3’-hidroxil e 5’ fosfato terminal. Entre algumas bases modificadas incluem-se a 5,6 dihidrotimina, 5,6 dihidrouracil, 5-hidroxiuracil e 2,6 diamino-4-hidroxi-5-N-metilformamidopirimidina (Ischenko & Saparbaev, 2002). Radicais hidroxila reagem predominantemente com carbonos 5 e 6 da dupla ligação de pirimidinas formando timina e uracil glicóis (Tg e Ug), 5-hidroxiuracil (5OHU), 5-hidroxicitosina (5OHC) e com carbono 8 de purinas formando 7,8-dihidro-8-oxo-2’guanina (8oxoG). 5,6 dihidroxiuracil (DHU) e resíduos α anômero de 2’-deoxiadenosina (α dA) constituem os principais adutos gerados pela radiação ionizante em condições anóxicas. Os α anômeros de 2’-deoxinucleosídeos (α dN) incluindo α dA, α T e α C são gerados por abstração de um átomo de hidrogênio do C1 por um radical hidroxila (Daviet et al., 2006).

Endo IV promove uma incisão a 5’ do DNA nas bases lesadas de maneira independente de uma DNA glicosilase (Daviet et al., 2006).

A via NIR é evolutivamente conservada em E. coli, leveduras e células de mamíferos. Em células humanas a principal AP endonuclease, Ape1/Ref 1/HAP-1, incisa

oligonucleotídeo duplex contendo DHU, 5ohU, α dA e α T. Ape 1 foi descrita como uma AP endonuclease homóloga da proteína Xth de E. coli (Daviet et al., 2006).

O homólogo da proteína Nfo de E. coli foi identificado em Saccharomyces cerevisae. Trata-se da AP endonuclease Apn1 que contribui com mais de 90% da atividade AP endonucleolítica da célula. Assim como Nfo a Apn1 tem atividade 3’ diesterase e 3’

fosfatase. Mutantes Apn1 são hipersensíveis a agentes oxidantes como H₂O₂ e tert-butil- hidroperóxido (Ishchenko et al., 2004).

Ishchenko e colaboradores em 2002 mostraram que as AP endonucleases Nfo em E.

coli, Apn1 em Saccharomyces cerevisiae em levedura e Ape1 em humanos estão envolvidas no reparo por incisão de nucleotídeos. Ainda que NIR seja evolutivamente conservado desde bactérias até humanos, esta via é proposta como um “backup” de DNA glicosilase na via BER e que α dA e α T quando presentes no DNA são reconhecidas por Nfo e Apn1. Porém, o reparo não é finalizado, a enzima incisa no lado5’ da lesão gerando uma quebra simples (Ishchenko et al., 2004).

2-Objetivos

→

→

→

→ Geral

Estudos demonstraram que o UVB causa efeitos letais em Escherichia coli, sobretudo nas cepas deficientes no mecanismo de reparo por excisão de bases. Deste modo objetivamos estudar os efeitos letais e mutagênicos nestas células bem como em organismos eucarióticos usando como modelo Saccharomyces cerevisiae. A similaridade que possui a levedura (Saccharomyces cerevisiae) com as células de mamíferos em relação aos genes de reparação do DNA (Friedberg et al., 2006) justificam a escolha desse modelo para o estudo proposto.

→

→

→

→ Abordagens

1- Realizar um estudo de mutagênese específica no gene lacZ de E. coli que permite a determinação de substituição de seis bases por monitoramento da reversão para Lac ⁺ (Cupples & Miller, 1989).

2- Construir cepas mutantes nos genes de interesse em cada uma das seis cepas utilizadas para detecção de trocas de bases supracitadas.

3- Avaliar a participação de íons Fe⁺² nas cepas que apresentarem elevado índice de mutagênese.

4- Avaliar também os efeitos lesivos provocados pelas EAO nos lipídeos de membrana através da técnica TBAR.

5- Avaliar a sensibilidade da cepa selvagem de Saccharomyces cerevisiae bem como dos simples mutantes apn1, apn2 e do duplo mutante apn1apn2 deste organismo às radiações UVC e UVB.

6- Obtenção das colônias de mutantes Can^R (células passam a ser resistentes ao antibiótico canavanina) tratadas com UVB.

3-Material e Métodos

3.1- Cepas Utilizadas:

→

→→

→ Cepas Bacterianas e plasmídeo:

Foram utilizadas, nos experimentos, cepas bacterianas derivadas de E. coli K12. No quadro abaixo encontram-se relacionadas todas as cepas, bem como suas características genéticas mais relevantes para este estudo.

Designação Substituição de Bases

Genótipo Relevante Origem

AB1157 - WT P.Howard-Flanders

(Univ. of Yale, USA)

BW9091 - xthA B. Weiss (Univ.of

Emory, USA)

BW9116 ∆ xthA B. Weiss (Univ.of

Emory, USA)

BW527 - nfo B. Weiss

BW544 - xthA nfo B. Weiss

CC101 AT→ CG WT J.H. Miller (UCLA)

CC102 GC → AT WT J.H. Miller

CC103 GC → CG WT J.H. Miller

CC104 GC → TA WT J.H. Miller

CC105 AT → TA WT J.H. Miller

CC106 AT → GC WT J.H. Miller

CC101 xthA AT→ CG xthA Este Trabalho

CC102 xthA GC → AT xthA Este Trabalho

CC103 xthA GC → CG xthA Este Trabalho

CC104 xthA GC → TA xthA Este Trabalho

CC105 xthA AT → TA xthA Este Trabalho

CC106 xthA AT → GC xthA Este Trabalho

CC101 nfo AT→ CG nfo Este Trabalho

CC102 nfo GC → AT nfo Este Trabalho

CC103 nfo GC → CG nfo Este Trabalho

CC104 nfo GC → TA nfo Este Trabalho

CC105 nfo AT → TA nfo Este Trabalho

CC106 nfo AT → GC xthA nfo Este Trabalho

CC101 xthA nfo AT→ CG xthA nfo Este Trabalho

CC102 xthA nfo GC → AT xthA nfo Este Trabalho

CC103 xthA nfo GC → CG xthA nfo Este Trabalho

CC104 xthA nfo GC → TA xthA nfo Este Trabalho

CC105 xthA nfo AT → TA xthA nfo Este Trabalho

CC106 xthA nfo AT → GC xthA nfo Este Trabalho

pBW21 - nfo B. Weiss (Univ.of

Emory, USA) Quadro 1: Cepas de E. coli utilizadas neste trabalho.

Os antibióticos foram acrescentados ao meio de cultivo das cepas bacterianas resistentes nas concentrações abaixo (Quadro 2).

Antibióticos Cepas Concentração Final

Estreptomicina AB1157, BW9091, BW544 100 µg/ml

Kanamicina BW527, BW544 e CCs nfo 40 µg/ml

Tetraciclina CC xthA 15 µg/ml

Quadro 2: Antibióticos utilizados. Fornecedor-Sigma-Aldrich.

Cepas de Levedura:

Foram utilizadas, nos experimentos, cepas de levedura de Saccharomyces cerevisae.

No quadro abaixo encontram-se relacionadas todas as cepas, bem como suas características genéticas mais relevantes para este estudo.

Designação GENÓTIPO

RELEVANTE

ORIGEM

FF 18733 MATa, his7, leu2, lys1, ura3, trp1

F. Fabre (CEA-França)

BPS1088 apn1::URA3 S. Boteux (Fontenary aux

Roses, France)

BPS 1085 apn2::KANMX S. Boteux (Fontenary aux

Roses, France) BPS 1087 apn1:: URA3 apn2::KANMX S. Boteux (Fontenary aux

Roses, France) Quadro 3: Cepas de Saccharomyces cerevisiae cerevisae utilizadas neste trabalho.

KANMX é o gene responsável pela resistência ao antibiótico Geneticina (G418), cuja concentração final é 200 µ g/ml.

3.1.1- Manutenção das cepas

As cepas utilizadas neste estudo foram mantidas em estoques tipo “slants”, que consistem de meio LB (Miller, 1992) suplementado com timina 50 µ g/ml e solidificado com ágar 0,75%, à temperatura ambiente. Para utilização freqüente das cepas, as culturas foram transferidas dos “slants” com auxílio de alça de platina, para Erlenmeyers contendo

meio LB líquido com os antibióticos apropriados, mantidas a 37ºC sob agitação por 24 horas (pernoite) e então transferidas, na proporção de 1:1 para “criovials” contendo glicerol 85% (Merck).

No caso das leveduras as cepas foram crescidas a 30ºC sob agitação até a fase estacionária e então transferidas para “criovials” contendo glicerol 85% (Merck). Estas culturas estoque foram então mantidas sob refrigeração à temperatura de –70º C.

3.1.2- Obtenção das culturas para os experimentos

→ Bactérias

Para as culturas utilizadas nos experimentos foram transferidos, alíquotas com auxílio de micropipetas, dos estoques a –70ºC para Erlenmeyers contendo 10 mL de LB líquido, com ou sem antibiótico dependendo da cepa, sendo incubadas a 37ºC com agitação (150 rpm) durante a noite, atingindo desta forma, a fase estacionária de crescimento (aproximadamente 10⁹ células/mL). Os antibióticos foram acrescentados ao meio de cultivo das cepas resistentes nas concentrações descritas no quadro 2. Inóculos na proporção de 1:40 foram feitos em meio líquido a partir dessas culturas em fase estacionária e cultivadas até a fase exponencial de crescimento (1-2x10⁸ células/mL) a 37º C com agitação.

→ Leveduras

Para cada experimento realizou-se uma pré-cultura a partir do estoque em 10 mL de meio rico incubadas a 30ºC com agitação por 24 h. Após este período (a cultura atingiu a fase exponencial de crescimento) foi realizado um outro repique em um meio de cultura novo (10 mL de YPG líquido), deixando-as incubadas a 30ºC por 48 h com agitação.

3.2- Meios de cultura e soluções tampões para bactérias

• Meio LB (Miller, 1992) NaCl 1% (Merck);

Bacto-triptona 1% (Difco Laboratories);

Extrato de levedura 0,5% (Difco Laboratories);

• Meio LB sólido-meio LB solidificado com ágar 1,5% (Difco Laboratories)

•Tampão M9 pH 7,0 (Miller, 1992) Na₂HPO₄ anidro 0,6%

KH2PO4 0,3%

NH4Cl 0,1%

NaCl 0,05%

Água deionizada (q.s.p) 1000 ml

•••• Tampão

•••• Citrato de Sódio 1 M

Na3C6H5O7. 2H2O ---2,94 g 10 ml de H2O

•••• Sais MMM-10X

Fosfato de Potássio dibásico (K2HPO4) ---105 g Fosfato de Potássio monobásico (KH2PO4) ---45 g Sulfato de amônio (NH₄)₂SO₄ ---10 g Citrato de Sódio (Na3C6H5O7.2H2O)---5 g

Água destilada---ajustar até 1000 ml

Os meios LB, líquido e sólido, após preparação, eram autoclavados por 20 min a 120ºC, assim como os componentes do tampão M9, dos sais MMM e citrato, acima mencionados. Após autoclavagem do tampão M9, adicionou-se 100 µL de MgSO4 7 H2O 1 mM () e 100 µL CaCl2 0,1 mM a cada 100 ml de tampão. Os sais foram obtidos das Indústrias Químicas Merck.