UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CAROLINA LAMBERTINI
OCCURRENCE PATTERNS OF Batrachochytrium dendrobatidis IN
AMPHIBIANS FROM BRAZILIAN ATLANTIC FOREST AND
AMAZONIA
PADRÕES DE OCORRÊNCIA DE Batrachochytrium dendrobatidis EM
ANFÍBIOS DA MATA ATLÂNTICA E AMAZÔNIA BRASILEIRAS
CAMPINAS 2019
OCCURRENCE PATTERNS OF Batrachochytrium dendrobatidis IN AMPHIBIANS FROM BRAZILIAN ATLANTIC FOREST AND AMAZONIA
PADRÕES DE OCORRÊNCIA DE Batrachochytrium dendrobatidis EM ANFÍBIOS DA MATA ATLÂNTICA E AMAZÔNIA BRASILEIRAS
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor, in the area of Animal Biology, specific area of Animal Biodiversity
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Biologia Animal, na área de Biodiversidade Animal
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA CAROLINA LAMBERTINI, E ORIENTADA PELO PROF. DR. LUIS FELIPE DE TOLEDO RAMOS PEREIRA
Orientador: Prof. Dr. Luis Felipe de Toledo Ramos Pereira
CAMPINAS 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.(a) Dr.(a). Luis Felipe de Toledo Ramos Pereira Prof.(a). Dr.(a) Cinthia Aguirre Brasileiro
Prof.(a) Dr(a). Rodrigo Lingnau Prof.(a) Dr(a). Mariana Lucio Lyra Prof.(a) Dr(a). Marcelo José Sturaro
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho à minha família, que esteve sempre ao meu lado em momentos difíceis e felizes, me incentivando e me dando forças para seguir em frente.
“And those who were seen dancing were thought to be insane by those who could not hear the music”
Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Animal da UNICAMP.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP #2011/51694-7; #2014/23388-7; #2016/25358-3) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq #405285/2013-2; #312895-2014-3) pelo financiamento do presente trabalho.
Ao meu orientador Prof. Dr. Luís Felipe Toledo, por estar ao meu lado durante nove anos de orientação, por todo seu tempo e dedicação em me ensinar e me formar intelectualmente, e pelas inúmeras oportunidades de crescimento profissional que me concedeu. Além da orientação, pela amizade, confiança e parceria que desenvolvemos durante todos esses anos, e por me ajudar a superar alguns dos momentos mais difíceis que tive de passar em meu caminho. Meu eterno carinho e gratidão.
Ao Prof. Dr. Domingos da Silva Leite, que me abriu as portas da carreira científica, sempre com muita paciência e atenção ao me ensinar diversas técnicas laboratoriais. Muito obrigada por toda dedicação.
Aos membros da banca de avaliação prévia, Prof. Dr. Rodrigo Lingnau, Prof. Dr. André Rinaldo Senna Garrafoni, Prof. Dra. Elaine Maria Lucas Gonsales, e aos membros da banca examinadora Prof. Dr. Rodrigo Lingnau, Prof. Dra. Cinthia Brasileiro, Prof. Dr. Marcelo José Sturaro, Dra. Mariana Lyra, pela disponibilidade e auxílio para grandes melhorias na qualidade do presente trabalho.
Aos Professores Doutores Danilo Ciccone Miguel, André Rinaldo Senna Garrafoni, Martin Francisco Pareja e Adriano Cappellazzo Coelho por toda a ajuda, paciência e compreensão no processo de qualificação.
Ao Instituto Chico Mendes de Biodiversidade e ao Instituto Florestal pela concessão das autorizações necessárias para a elaboração do presente trabalho.
À minha família, Nuno Lambertini, Divina Felício de Souza Lambertini, Nuno Lambertini Jr., Marlene Soares Lambertini, Bruno Lambertini, Keylla Mara Campos Lambertini, Pedro Campos Lambertini, Fernanda Lambertini Piva, Adailton Renato Piva, e aos dois novos membros Vinicius Lambertini Piva e Felipe Lambertini Piva,
À minha família científica, Camila Zornosa Torres, Simone Dena, Mariane de Oliveira, Guilherme Augusto Alves, Raoni Rebouças, Ronaldo M. N. Santos, Mariana Rettuci Pontes, Diego Moura, Tamilie Carvalho, Luisa de Pontes Ribeiro, Anat Belasen, Carlos Henrique L. N. Almeida, Victor Fávaro Augusto, Janaina Serrano, Raquel Salla Jacob, Joice Ruggeri Gomes, Daniel Christofer Medina López, Thomas S. Jenkinson, Lucas Forti, Prof. Dr. C. Guilherme Becker, Prof. Dr. Timothy Y. James, Prof. Dr. David Rodriguez, Prof. Dra. Kelly R. Zamudio, muito amor e gratidão a todos.
Aos meus amores da vida, Anita C. Presotto, Fernanda C. O. Fernandes, Marjori Laporte, Carolina Marcucci, Luís Fernando Moreno de Lima, Lucas Beraldo Martins, por estarem sempre ao meu lado, mesmo eu estando ausente em diversos momentos, obrigada pela compreensão, amizade e parceria eterna.
À minha família de Barão Geraldo, Bruno Polato Sanches, Eduardo Teodoro Fernandes, Mariane de Oliveira Freitas, Lucas Madureira e Júlia Lombardi, por compartilharmos a mesma casa, nos unirmos nas situações difíceis que já enfrentamos, pelo suporte que damos uns aos outros em diversos momentos, por sermos família!
À Sandra Borsetti, pela enorme ajuda no início de tudo. Um anjo que caiu no meu caminho, sem você nada disso seria possível.
À Dra. Ana Paula José e Dr. Mário Fernando Oliveira Rocha pelo acompanhamento e ajuda excepcional no meu processo de formação. Muito carinho e eterna gratidão por vocês!
Doenças infecciosas emergentes são consideradas uma das principais ameaças à biodiversidade mundial, e sua ocorrência é determinada através da influência do ambiente nas interações entre patógenos e hospedeiros. A quitridiomicose, causada pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), é uma doença infecciosa emergente que acomete populações de anfíbios em todo o mundo, e sua dinâmica de infecção já foi diretamente associada à variação ambiental, direcionando condições para o desenvolvimento do patógeno e/ou interferindo na susceptibilidade do hospedeiro. O Bd é um patógeno generalista, infectando em sua maioria Anura, porém já detectado em Caudata e Gymnophiona, mas até então não existem informações sobre os padrões de ocorrência de Bd em cecílias no mundo. No Brasil, o bioma Amazônia foi considerado como região de baixa adequabilidade ambiental para o desenvolvimento do Bd, e dois estudos retrospectivos corroboraram esse padrão. A Mata Atlântica, por sua vez, é uma região que apresenta alta adequabilidade ambiental para o Bd, na qual o patógeno já foi amplamente detectado, principalmente na porção sul. Contudo, não existem estudos até então que analisaram padrões de ocorrência do Bd em populações naturais de anfíbios da Amazônia, e abrangendo a Mata Atlântica como um todo. Com isso, realizamos uma ampla amostragem de espécimes fixados da ordem Gymnophiona ao longo da América do Sul, para verificar se existe variação nos padrões de ocorrência do Bd nesse grupo. Realizamos também uma amostragem de populações naturais de anfíbios na região amazônica, abrangendo não somente espécies da ordem Anura, mas também das ordens Gymnophiona e Caudata, verificando potenciais associações entre variáveis bióticas e abióticas com as taxas de infecção, e testando experimentalmente o efeito da potencial chegada de cepas exóticas de Bd em hospedeiros endêmicos da região. Finalmente, realizamos uma ampla amostragem de anuros ao longo de um transecto latitudinal na Mata Atlântica, identificando padrões de ocorrência do Bd, e potenciais associações entre variáveis bióticas e abióticas nas taxas de infecção dos hospedeiros. Descrevemos aqui o primeiro registro de infecção por Bd no Brasil em espécies da ordem Caudata e Gymnophiona, propondo que as últimas podem servir como reservatório patógeno, devido à história de vida dos hospedeiros. Na região amazônica, detectamos altas taxas de prevalência de infecção, padrão oposto ao esperado para região, onde as variáveis ambientais não foram boas preditoras de ocorrência do patógeno, e detectamos experimentalmente variação em resposta dos hospedeiros à infecção por diferentes
abióticas e bióticas associadas às taxas de infecção encontradas, e detectamos um efeito de amplificação da riqueza de espécies de hospedeiros nas taxas de infecção por Bd. O presente trabalho traz informações inéditas sobre os padrões de ocorrência do Bd nos biomas Mata Atlântica e Amazônia.
Emerging infectious diseases are one of the main threats to worldwide biodiversity, being determined by the environmental influence on host-pathogen interactions. Chytridiomycosis, caused by the fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), is an emerging infectious disease that affects amphibian populations worldwide, and its infectious dynamics has been already directly associated to environmental variation, by basically driving conditions for the pathogen development and/or interfering on host’s susceptibility. Bd is a generalist pathogen, infecting mostly Anuran species, but also detected in Gymnophiona and Caudata species. However, there is no information until now on Bd occurrence patterns in Gymnophiona species in the world. In Brazil, Amazonia was considered a region with low environmental suitability for Bd, and two retrospective studies detected low Bd infection prevalence rates. On the other hand, Atlantic Forest is a region considered environmentally suitable for Bd, and it has been already widely detected, mainly in the south portion of the biome. But, no studies attempted to analyze Bd occurrence patterns on amphibian natural populations from Amazonia and in Atlantic Forest as a whole. Given this, we broadly sampled Gymnophiona museum specimens across South America, to verify if Bd occurrence patterns vary in this group. We also sampled wild amphibian populations across Brazilian Amazon, including Gymnophiona and Caudata species, to test for potential associations between biotic and abiotic variables and infection rates, and we experimentally tested the effects of exotic Bd strains on host species from the region. Finally, we broadly sampled anuran species along a latitudinal transect across Brazilian Atlantic Forest, identifying Bd occurrence patterns and potential associations between biotic and abiotic variables with Bd infections. We describe here the first report of Bd infections in Caudata and Gymnophiona species from Brazil, and propose that individuals from the last order may serve as pathogen reservoir because of host’s life history. In Amazonia, we detected higher Bd infection prevalence, which is the opposite pattern expected for the region, where environmental variables were not good predictors for Bd occurrence, and we experimentally detected variation in host response to the infection by exotic Bd strains. We detected a positive relationship between Bd infection rates and latitudinal variation across the transect in Atlantic Forest. We also identified biotic and abiotic variables associated to Bd infections, and an amplification effect of
Introdução Geral
Figura 1. Modelo conceitual do triângulo da doença, representando os três vértices e
suas interações: impacto do ambiente, susceptibilidade dos hospedeiros e virulência do patógeno. Fonte: Scholthof 2007... 20
Figura 2. Distribuição mundial dos fungos Batrachochytrium dendrobatidis e Batrachochytrium salamandrivorans. Fonte: Bower et al. 2017... 22
Figura 3. Esquema simplificado representando o ciclo de vida do Bd. Zoósporo livre
(A), após penetrar na epiderme do hospedeiro inicia-se o desenvolvimento do zoosporângio (B), seguido do processo de maturação e produção de zoósporos, e formação de papilas de descarga (C), com a liberação dos zoósporos recém-formados (D). Fotos: Luís Felipe Toledo... 23
Capítulo 1. Spatial Distribution of Batrachochytrium dendrobatidis in South American
Caecilians
Figura 1. Amostragem de Batrachochytrium dendrobatidis em espécimes fixados de
cecílias do Brazil e Uruguai (amostras positivas: círculos vermelhos; amostras negativas: círculos brancos), e cecílias coletadas na natureza (amostras positivas: cruz vermelha; amostras negativas: cruzes brancas; Vásquez-Ochoa et al. 2012, Gower et al. 2013, Rendle et al. 2015, presente trabalho). Siphonops paulensis é uma espécie terrestre fossorial encontrada na porção leste do Brazil, e Chthonerpeton
indistinctum é uma espécie aquática, e representa a única espécie de cecília
encontrada no Uruguai. Créditos: Dr. Daniel Loebmann (fotos), US National Park Service (layer)... 41
Figura 1. Pontos de amostragem de Batrachochytrium dendrobatidis (pontos pretos)
ao longo da Amazônia brasileira. O tamanho dos pontos representa o valor da prevalência de infecção para cada localidade amostrada... 57
Figura 2. Associações entre prevalência (A) e carga de infecção (B) por Batrachochytrium dendrobatidis e tipo de habitat das espécies de hospedeiros. As
letras minúsculas (a, b e c) representam diferenças entre cada categoria... 58
Figura 3. Curvas de sobrevivência de Atelopus aff. spumarius. Grupos infectados
por Batrachochytrium dendrobatidis são representados pela linha marrom (CLFT 156), linha amarela (CLFT 102), e grupo controle pela linha azul (A). Diferenças entre carga de infecção dos grupos experimentais no meio (ou morte) e ao final do experimento (B)... 59
Figura S1. Ponto de coleta de Atelopus hoogmoedi (azul: Manaus, Amazonas,
Amazon), e localidades de isolamento de cepas de Batrachochytrium dendrobatidis (marrom = CLFT 156: Morretes, Paraná; amarelo = CLFT 102: Camacan, Bahia; ambos na Mata Atlântica)... 60
Figura S2. Dendrograma da análise de cluster utilizando variáveis bioclimáticas de
temperatura e precipitação, mostrando similaridade climática entre localidades de isolamento de cepas de Batrachochytrium dendrobatidis (CLFT 156 e CLFT 102), e localidade de coleta de Atelopus aff. spumarius (Manaus). O eixo y representa distâncias Euclidianas... 61
Capítulo 3. Latitudinal Distribution of the Frog-Killing Fungus across the Brazilian
Atlantic Forest
Figura 1. Pontos de amostragem de Batrachochytrium dendrobatidis (pontos pretos)
ao longo de um transecto latitudinal na Mata Atlântica. Pontos vermelhos a azuis são extremos de um contínuo de prevalência e carga de infecção para cada ponto de
inseridos na figura... 75
Figura 2. Associação entre prevalência e carga de infecção de Batrachochytrium dendrobatidis com tipo de hábito (A, B) e habitat dos hospedeiros (C,
Capítulo 1. Spatial Distribution of Batrachochytrium dendrobatidis in South American
Caecilians
Tabela 1. Famílias, espécies tamanho amostral, tipo de ambiente e país nos quais
indivíduos da família Gymnophiona foram capturados, e prevalência de infecção por
Batrachochytrium dendrobatidis (número de positivos/total)... 39
Tabela 2. Resultados da análise de model averaging, com o ranqueamento de
variáveis ambientais que explicam a ocorrência de Batrachochytrium dendrobatidis em cecílias da América do Sul... 40
Tabela S1. Contempla os dados brutos das análises referentes ao presente capítulo.
Material em formato de mídia eletrônica com acesso disponível em: < https://www.int-res.com/articles/suppl/d124p109_supp.pdf >.
Tabela S2. Seleção de modelo com variáveis bioclimáticas associadas à infecção por Batrachochytrium dendrobatidis... 42
Capítulo 2. The Killing-Chytrid Fungus in Amphibian Populations from the Brazilian
Amazon
Tabela 1. Prevalência (positivos/total) e carga de infecção (g.e.) por Batrachochytrium dendrobatidis (valores representam média ± desvio padrão) por
local de coleta na bacia Amazônica Brasileira... 55
Tabela 2. Prevalência [porcentagem (positivo/total)] e carga de infecção (valores são
média ± desvio padrão) de Batrachochytrium dendrobatidis por local de coleta na bacia Amazônica Brasileira... 56
Tabela S1. Contempla os dados brutos das análises referentes ao presente capítulo.
Este material será disponibilizado em formato de mídia eletrônica no momento da publicação.
Tabela 1. Prevalência (positive/total) e carga de infecção de Batrachochytrium dendrobatidis (rounded without decimals) por família e modo reprodutivo. Valores
de intensidade de infecção (equivalentes genômicos de zoósporos - g.e.) são média ± desvio padrão (variação)... 72
Tabela 2. Localidades de coleta e detecção de Batrachochytrium dendrobatidis ao
longo do transecto latitudinal na Mata Atlântica... 73
Tabela 3. Melhor modelo para prevalência de infecção por Batrachochytrium dendrobatidis ao longo do transecto latitudinal... 74
Tabela S1. Contempla os dados brutos das análises referentes ao presente capítulo.
Este material será disponibilizado em formato de mídia eletrônica no momento da publicação.
Tabela S2. Cinco melhores modelos para prevalência e carga de infecção por Batrachochytrium dendrobatidis. Bio 1 = Temperatura Média Anual; Bio 2 =
Variação Média Diurna; Bio 4 = Sazonalidade de Temperatura; Bio 5 = Máxima Temperatura do Mês Mais Quente; Bio 12 = Precipitação Anual; Bio 18 = Precipitação do Quarto Mais Quente... 77
INTRODUÇÃO ... 19
Capítulo 1. SPATIAL DISTRIBUTION OF Batrachochytrium dendrobatidis IN SOUTH AMERICAN CAECILIANS ... 30
Capítulo 2. THE KILLING-CHYTRID FUNGUS IN AMPHIBIAN POPULATIONS OF THE BRAZILIAN AMAZONIA ... 44
Capítulo 3. LATITUDINAL DISTRIBUTION OF THE FROG-KILLING FUNGUS ACROSS THE BRAZILIAN ATLANTIC FOREST ... 62
SÍNTESE GERAL ... 78
REFERÊNCIAS ... 81
INTRODUÇÃO
Doenças infecciosas emergentes (DIE) são definidas como aquelas que aparecem pela primeira vez em uma população, aumentando em incidência, patogenicidade, impacto, distribuição geográfica e número de hospedeiros afetados em um curto período de tempo (Morse 1995, revisado em Williams et al. 2002, Daszak et al. 2003). Eventos de DIE’s aumentam substancialmente ao longo do tempo, afetando tanto seres humanos quanto diversos outros táxons na natureza (Daszak et al. 2001, Daszak et al. 2003, Jones et al. 2008, Tompkins et al. 2015). As DIE’s são causadas por uma grande diversidade de patógenos como bactérias, vírus/príons, fungos, protozoários e helmintos (Daszak et al. 2000, Jones et al. 2008). Em seres humanos, a maioria dos agentes infecciosos que causam DIE’s são bactérias (principalmente estirpes que apresentam resistência a antibióticos) e, pelo menos 60% dos eventos de DIE’s são representados por zoonoses (doenças infecciosas de origem animal), sendo a grande maioria de origem selvagem (Jones et al. 2008). Em outros vertebrados, vírus representam a maioria dos agentes infecciosos responsáveis por surtos de doenças, seguidos de bactérias e fungos (Dobson e Foufopoulos 2001, Tompkins et al. 2015).
A origem e emergência de doenças infecciosas representam um risco crescente tanto para seres humanos, quanto para a biodiversidade como um todo (Daszak et al. 2000, Cunningham et al. 2017), e são diretamente associadas ao declínio de populações de diversas espécies no mundo (Lips et al. 2006, Skerrat et al. 2007, Blehert et al. 2009, Vredenburg et al. 2010, Tompkins et al. 2011, Lorch et al. 2016). Duas hipóteses competem pela explicação da origem de uma doença infecciosa. A Novel Pathogen Hypothesis (NPH) sugere que, em um período recente, determinado patógeno se espalhou afetando novas espécies ou espécies altamente susceptíveis. A Endemic Pathogen Hypothesis (EPH) por sua vez, sugere que um patógeno já estabelecido e disseminado em determinado ambiente encontra novos hospedeiros ou apresenta aumento em patogenicidade (Laurance et al. 1996, Alford 2001, Rachowicz et al. 2005, Skerrat et al. 2007). A origem de diversas doenças pode ser explicada tanto pela NPH quanto pela EPH e, a classificação dentre essas duas hipóteses, pode influenciar diretamente em medidas de conservação que podem interferir na disseminação de um dado patógeno novo, ou prevenir surtos de um patógeno endêmico (Rachowicz et al. 2005).
Dentre os potenciais fatores que direcionam a emergência de doenças infecciosas em vertebrados, além de alterações ecossistêmicas de origem natural ou antropogênica e movimentação de patógenos ou vetores (revisado em Willians et al. 2002), podemos citar fatores relacionados aos hospedeiros como instabilidade e baixa diversidade genética,
Figura 1. Modelo conceitual do triângulo da doença, representando os três vértices e suas interações: impacto
do ambiente, susceptibilidade do hospedeiro e virulência do patógeno. Fonte: Sholthof (2007).
deficiência nutritiva e pouca variação de suplementos alimentares, exposição a agentes infecciosos provenientes de outras populações naturais ou domésticas, estresse relacionado à alteração de habitats e alterações na resposta imunológica, estresse térmico e mudanças climáticas (Daszak et al. 2003, Tompkins et al. 2015). Em resumo, as inter-relações entre ambiente e características dos patógenos e hospedeiros determinam diretamente a emergência de doenças infecciosas na natureza (Scholthof et al. 2007, Engering et al. 2013).
Para uma melhor compreensão de tais interações, foi desenvolvido um modelo conceitual denominado triângulo da doença (McNew 1960), que descreve como fatores ambientais afetando a susceptibilidade do hospedeiro e a virulência do patógeno, podem resultar em potenciais surtos de doenças (Figura 1) e, como estas podem ser previstas, limitadas ou controladas (Keane and Keer 1997, Scholthof 2007).
Por exemplo, sabe-se que a variação em temperatura e precipitação impactam as interações patógeno-hospedeiro em diferentes sistemas de doenças (Altizer et al. 2006), resultando em uma alta incidência do patógeno em uma população e potencial morte dos hospedeiros (Altizer et al. 2006, Fisher et al. 2012, Flory et al. 2012, Ruggeri et al. 2018).
Diversos grupos de vertebrados são afetados por doenças infecciosas, resultando em declínios de populações e extinções de espécies por todo o mundo (McMichals 2004, Tompkins et al. 2015), com surtos de doenças ocorrendo principalmente durante modificações
ambientais (Anfíbios: Daszak et al. 2000; Peixes: Snieszko 1974; Humanos: Eisenberg et al. 2007). Um dos mecanismos pelos quais a variação ambiental pode influenciar o desenvolvimento de uma determinada doença pode ser exemplificado com a White-Nose
Syndrom, uma doença infecciosa cutânea causada pelo fungo Geomyces destructans. Essa
doença afeta seriamente morcegos que hibernam em cavernas nos Estados Unidos e Canadá (Blehert et al. 2009, Warnecke et al. 2012), e a variação de temperatura dentro dos hibernáculos, pode influenciar tanto na severidade do patógeno quanto nas taxas de sobrevivência dos hospedeiros afetados por essa doença (Boyles et al. 2010, Verant et al. 2012). Outro exemplo importante é a Snake Fungal Disease, uma doença infecciosa causada pelo patógeno Ophidiomyces ophiodiicola, que afeta diversas espécies de serpentes distribuídas ao leste dos Estados Unidos (Allender et al. 2016, Lorch et al. 2016), e foi detectada uma correlação negativa entre a média de temperatura mensal e severidade dos sinais clínicos apresentados pelos hospedeiros infectados (McCoy et al. 2017).
A quitridiomicose, mais um exemplo de DIE, afeta uma grande diversidade de espécies de anfíbios e já teve sua dinâmica diretamente associada à variação ambiental em diversas localidades no mundo (Kriger et al. 2007, Becker e Zamudio 2011, Bacigalupe et al. 2017, Carvalho et al. 2017, Greenberg et al. 2017). Esta doença é causada pelos fungos patogênicos Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) e Batrachochytrium salamandrivorans (Bsal), que ameaçam de forma imperativa diversas populações de anfíbios no mundo (Martel et al. 2013, James et al. 2015, Berger et al. 2016, Scheele et al. 2019).
Os anfíbios são classificados como o grupo de vertebrados mais ameaçado do planeta (Stuart et al. 2004), apresentando o maior número de representantes dentro de categorias de ameaça (pelo menos 40% das espécies) (IPBES 2019, IUCN 2019), e diversos fatores como poluição ambiental, introdução de predadores e competidores (Daszak et al. 1999), contaminações químicas, comercialização de espécies, aumento na incidência de radiação UV (Semlitsch 2003, McMenamin et al. 2008, Mann et al. 2009), mudanças climáticas (Pounds et al. 2006), fragmentação e perda de habitats (Becker et al. 2007, Skerrat et al. 2007), e doenças infecciosas (Daszak et al. 2000, Blehert et al. 2009, Allender et al. 2016, Scheele et al. 2019) exercem influência no declínio de populações. A fragmentação de habitats atua de forma direta na ameaça aos anfíbios, como por exemplo, através do processo de desconexão de habitats (Habitat split), que representa um grande risco para espécies de anfíbios que necessitam realizar migrações reprodutivas (Becker et al. 2007). Em conjunto com a fragmentação e perda de habitats, a quitridiomicose representa um impacto cada vez mais significativo no declínio e extinção de anfíbios ao redor do mundo (Berger et al. 1998,
Figura 2: Distribuição mundial dos fungos Batrachochytrium dendrobatidis e Batrachochytrium
salamandrivorans. Fonte: Bower et al (2017).
Lips et al. 2006, Skerrat et al. 2007, Kriger & Hero 2008, Vredenburg et al. 2010, James et al. 2015, Berger et al. 2016, Scheele et al. 2019).
O Bd foi descoberto em 1998 (Berger et al. 1998), descrito no ano de 1999 (Longcore et al. 1999), e já foi registrado acometendo além de Anura, espécies de Caudata e Gymnophiona (Longcore et al. 1999, Raffel et al. 2010, Doherty-Bone et al. 2013, Berger et al. 2016). O Bsal foi descrito recentemente e, acreditava-se que acometia apenas espécies de Caudata (Martel et al. 2013, Martel et al. 2014), mas atualmente sabe-se que também infecta anfíbios anuros (Stegen et al. 2017). Além disso, foi descrito recentemente o primeiro caso de coinfecção de Bd e Bsal em uma população de salamandras de fogo na Alemanha (Lötters et al. 2018).
Enquanto Bsal possui registros de ocorrência apenas na Europa e Ásia (Martel et al. 2013, Martel et al. 2014, Bower et al. 2017, Lötters et al. 2018), Bd foi amplamente detectado em todo o mundo (Olson & Ronnenberg 2014, Bower et al. 2017, Scheele et al. 2019) (Figura 2) e associado a declínios substanciais de populações e extinções de espécies em determinadas regiões na Austrália, América do Norte, América Central e América do Sul (Berger et al. 1998, Lips et al. 2005, Lips et al. 2006, Vredenburg et al. 2010).
Cepas do Bd possuem faixa de temperatura de crescimento que em geral varia entre 4 e 28ºC (Piotrowski et al. 2004). Porém, recentemente foi detectada uma variação em tolerância térmica, e determinadas cepas apresentaram viabilidade de crescimento mesmo
Figura 3: Esquema simplificado representando o ciclo de vida do Bd. Zoósporo livre (A), após penetrar na
epiderme do hospedeiro inicia-se o desenvolvimento do zoosporângio (B), seguido do processo de maturação e produção de zoósporos, e formação de papilas de descarga (C), com a liberação dos zoósporos recém-formados (D). Fotos: Luís Felipe Toledo.
após choques de baixa (-12ºC) e alta (28ºC) temperatura, mas em geral apresentam faixa ótima de crescimento entre 17 e 23ºC, o que influencia diretamente sua virulência/patogenicidade (Piotrowsky et al. 2004, Voyles et al. 2017). O Bsal, por sua vez, possui uma faixa ótima de crescimento que varia entre 10 e 15ºC, com cepas apresentando mortalidade acima de 25ºC e, essa variação em preferência térmica em comparação com o Bd, pode explicar sua distribuição geográfica mais restrita (Martel et al. 2013).
Ambos patógenos são aquáticos, apresentando ciclo de vida similar com fase infectante representada pelo zoósporo móvel, e fase séssil representada pelo zoosporângio, com formação em talo monocêntrico ou colonial (Longcore et al. 1999, Martel et al. 2013, James et al. 2015). Os zoósporos colonizam a epiderme do hospedeiro (Figura 3A), formam um tubo germinativo que penetra na membrana celular, transferem seu conteúdo para o interior das células, e após esse processo ocorre o início da maturação dos zoosporângios (Figura 3B) e formação de papilas de descarga (Figura 3C) que atravessam a epiderme para a liberação dos zoósporos recém-formados (Figura 3D) (Berger et al. 2005, Greenspan et al. 2012). O mecanismo pelo qual o Bsal penetra e se desenvolve na epiderme de seus hospedeiros provavelmente varia em comparação com o Bd, já que os sinais clínicos são mais agressivos (Martel et al. 2013), porém não existem trabalhos que descrevem esse mecanismo até então.
O desenvolvimento da quitridiomicose nos hospedeiros infectados pelo Bd afeta processos fisiológicos de troca de água, gases e eletrólitos que ocorrem através da pele, desencadeando um desequilíbrio nas concentrações de íons no plasma sanguíneo e morte através de parada cardíaca em assistolia (Voyles et al. 2009). Além disso, ocorre a inibição da resposta imune devido à produção de fatores tóxicos pelo patógeno (Fites et al. 2013). Hospedeiros infectados pelo Bsal apresentam lesões erosivas multifocais e ulcerações
profundas, mostrando taxa de mortalidade rápida pós-infecção (Martel et al. 2013, Martel et al. 2014).
O Bd é um patógeno generalista, tendo sido detectado em pelo menos 600 espécies de anuros ao redor do mundo (Olson e Ronnenberg et al. 2014, Scheele et al. 2019). Em relação às outras ordens de anfíbios, infecções por Bd já foram relatadas em mais de 80 espécies de Caudata (Olson & Ronnemberg 2014), provenientes de diversas regiões nas Américas (Davidson et al. 2003, Padgett-Flohr & Longcore 2007, Gaetner et al. 2009, Van Rooij et al. 2011), Ásia (Parto et al. 2013) e Europa (Bovero et al. 2008). No Brasil não existem registros, até então, de infecção por Bd em espécies de Caudata, que possuem distribuição restrita à região Amazônica. Em relação à Gymnophiona, pelo menos sete espécies testaram positivo para Bd (Olson & Ronnemberg 2014), com registros na África (Doherty-Bone et al. 2013, Gower et al. 2013) e Guiana Francesa (Rendle et al. 2015). Esforços amostrais foram realizados em outras regiões (e.g. Savage et al. 2011, Vasquez-Ochoa et al. 2012, Penner et al. 2013, Labisko et al. 2015), porém todas as amostras foram negativas. No Brasil, até o momento não existem registros de Bd infectando representantes dessa ordem.
Aplicando o modelo conceitual do triangulo da doença à quitridiomicose, diversos estudos correlacionaram cada vértice aos padrões de ocorrência da doença no mundo. Em termos de variação ambiental, estudos demonstraram uma associação negativa entre temperatura e taxas de infecção por Bd (Pushendorf et al. 2009, Ruggeri et al. 2015, Becker et al. 2016, Carvalho et al. 2017, Lambertini et al. 2017). Precipitação, por sua vez, foi positivamente associada às taxas de infecção (Pushendorf et al. 2009, Becker & Zamudio 2011, Ruggeri et al. 2015, Becker et al. 2016, Lambertini et al. 2017), além de densidade de vegetação (Pushendorf et al. 2009, Becker et al. 2012, Becker et al. 2016), e elevação, que frequentemente apresentam associação positiva com as taxas de infeção (Brem & Lips 2008, Gründler et al. 2012, Catenazzi et al. 2013), e possivelmente a última apenas em faixas de altitudes mais elevadas (Lambertini et al. 2016). Além desses fatores, grau de desmatamento (Becker & Zamudio 2011), sazonalidade (Kriger & Hero 2007, Longo et al. 2010, Ruggeri et al. 2015), complexidade topográfica (Becker et al. 2016) e grau de perturbação antrópica (human footprint) também já foram associados às taxas de infecção por Bd (Becker et al. 2016, Carvalho et al. 2017).
Em relação ao patógeno, diversas características já foram diretamente associadas aos padrões de infecção por Bd nos hospedeiros. Cepas de Bd isoladas de diversas localidades do mundo apresentam variação genotípica, com o genótipo que apresenta distribuição global
denominado Global Pandemic Lineage (Bd-GPL) (Farrer et al. 2011, Schloegel et al. 2012), considerado uma linhagem hipervirulenta, e previamente associado a surtos epizoóticos que declinaram diversas populações de anfíbios em diversas regiões como Américas e Austrália (Berger et al. 1998, Lips et al. 2005, Lips et al. 2006, Vredenburg et al. 2010, Farrer et al. 2011, James et al 2015). Outras linhagens com distribuição mais restrita foram descritas em diferentes regiões, como Bd-CH (Europa), Bd-CAPE (África), e Bd-Brazil, e consideradas como linhagens enzoóticas (Farrer et al. 2011, Schloegel et al. 2012), além de linhagens genéticas altamente divergentes e endêmicas da Ásia (Bataille et al. 2013). Recentemente, o sequenciamento genômico de diversos isolados de Bd no mundo, e a descoberta de uma linhagem hiperdiversa na península Coreana, redefiniram essas linhagens e suas relações, sendo então as principais linhagens divergentes de Bd definidas como: Bd-GPL, Bd-Asia-1, CAPE, Asia-2/Brazil (O´Hanlon et al. 2018). No Brasil, além da linhagem Bd-GPL, detectada por toda extensão da Mata Atlântica e recentemente na Amazônia, e da linhagem endêmica Bd-Brazil, foi detectado pela primeira vez um genótipo híbrido entre as linhagens Bd-GPL e Bd-Brazil, isolado na porção sul da Mata Atlântica, sendo a primeira evidência de reprodução sexuada do patógeno (Schloegel et al. 2012, Rosenblum et al. 2013 Jenkinson et al. 2016).
A diversidade de genótipos de Bd e genótipos híbridos podem acarretar variação em virulência do patógeno, afetando diretamente hospedeiros infectados (Jenkinson et al. 2016, Greenspan et al. 2018). Recentemente, um estudo avaliou a variação de virulência do Bd utilizando cepas pertencentes aos três genótipos encontrados no Brasil, e detectou alta virulência em cepas de genótipos híbridos, em comparação com hospedeiros infectados com as linhagens Bd-GPL e Bd-Brazil, em um hospedeiro nativo (Brachycephalus ephippium), evidenciando então o risco do processo de hibridização deste patógeno (Greenspan et al. 2018).
Além de variação genotípica, cepas de Bd também apresentam variações fenotípicas. Inicialmente, foi detectada uma associação entre tamanho dos zoosporângios e diferenciação genética de cepas isoladas na Europa (Fisher et al. 2009). Em seguida, o tamanho dos zoósporos foi linearmente associado à variação de conteúdo de DNA de cepas provenientes do Brasil, Panamá e Estados Unidos (Schloegel et al. 2012). Recentemente, a variação fenotípica de cepas de Bd foi associada às taxas de infecção do patógeno na natureza. Especificamente, o tamanho dos zoósporos e zoosporângios provenientes de um transecto de elevação realizado na Mata Atlântica, foi positivamente associado às taxas de prevalência e intensidade de infecção ao longo das áreas amostradas (Lambertini et al. 2016).
Além disso, foi detectado um efeito da variação de temperatura na plasticidade fenotípica de cepas de Bd, para os três diferentes genótipos encontrados no Brasil, principalmente em relação ao tamanho dos zoosporângios, que são maiores em temperaturas mais baixas (Multez-Wolz et al. 2019).
Finalmente, diferentes espécies de hospedeiros apresentam variações em susceptibilidade ou resistência às mesmas ou diferentes cepas do patógeno (Andre et al. 2008, Gahl et al. 2012, Peterson et al. 2013, Greenberg et al. 2017). Fatores intrínsecos ao hospedeiro podem mediar a variação em susceptibilidade apresentada por diferentes espécies, com modificações temporais na intensidade de infecção por Bd espécie-específicas (Gervasi et al. 2013). A riqueza de espécies dentro de uma comunidade é um fator que pode gerar efeito tanto de diluição quanto de amplificação da doença, basicamente devido aos processos pelos quais o patógeno é transmitido (Becker & Zamudio 2011, Searle et al. 2011, Becker et al. 2014, Lambertini et al. em prep.). Além disso, o comportamento agregativo de determinadas espécies, tanto para forrageamento quanto como defesa contra predadores (Han et al. 2008), aumenta as taxas de infecção por Bd, pois representa uma maior fonte de disseminação de zoósporos em uma dada área (Venesky et al. 2011) e, o tipo de desenvolvimento de espécies de hospedeiros influencia taxas de infecção por Bd, que são maiores em espécies de desenvolvimento direto devido à deficiência de respostas adaptativas (Mesquita et al. 2017).
Inicialmente, acreditava-se que o Bd possuía a África como localidade de origem, e que o comércio mundial de espécies africanas como Xenopus leavis e Xenopus tropicalis contribuía para a disseminação do patógeno, o que suportava a hipótese de patógeno novo (NPH) (Daszak et al. 1999, Weldon et al. 2004). Além disso, o comércio mundial da espécie norte-americana Lithobates catesbeianus também foi reconhecido como parte fundamental do mecanismo de disseminação do patógeno no mundo, por ser uma espécie tolerante à infecção por Bd e comercializada para fins alimentícios (Fisher e Garner 2007, Schloegel et al. 2012). Outras regiões já foram apontadas como potenciais localidades de origem do Bd, como Américas do Sul e Norte (Rodriguez et al. 2014, Talley et al. 2015). Atualmente, a origem de ambos os patógenos foi estabelecida para o continente asiático, com o Bsal apresentando uma recente incursão em populações de salamandras na Europa (Martel et al. 2014), e com o surgimento do Bd coincidindo com expansão do comércio global de anfíbios, sendo o leste da Ásia considerado como hotspot de biodiversidade de linhagens genéticas de Bd (O’Hanlon et al. 2018).
No Brasil, o primeiro registro de infecção por Bd foi realizado na Mata Atlântica, na qual o patógeno foi detectado infectando uma espécie de riacho (Hylodes magalhaesi) de altitude elevada no estado de Minas Gerais (Toledo et al. 2006). A partir deste registro, muitos trabalhos foram realizados até então, principalmente na porção sul do bioma (Toledo et al. 2006a, Toledo et al. 2006b, Vieira et al. 2012, Vieira et al. 2013, Lisboa et al. 2013, Rodrigues et al. 2014, James et al. 2015, Preuss et al. 2015, Ruggeri et al. 2015, Valencia-Aguilar et al. 2015, Jenkinson et al. 2016, Lambertini et al. 2016, Carvalho et al. 2017, Lambertini et al. 2017, Lambertini et al. in prep).
Ao contrário de outras regiões nas Américas, declínios e extinções de espécies não haviam sido associados a surtos epizoóticos de Bd no Brasil. Um estudo retrospectivo de anuros, na porção sul da Mata Atlântica, detectou prevalência de infecção por Bd relativamente constante ao longo do tempo, indicando um padrão enzoótico de dinâmica do patógeno (Rodriguez et al. 2014). Porém, declínios enigmáticos de espécies de anfíbios que ocorreram entre as décadas de 80 e 90 foram recentemente associados à quitridiomicose (Carvalho et al. 2017), com comunidades de anfíbios apresentando uma proporção alta de declínio, similar às comunidades afetadas pelo Bd em locais onde epizootias foram acompanhadas e documentadas, como na América Central (Lips et al. 2008, Carvalho et al. 2017).
A Amazônia brasileira, por sua vez, é uma região pouco explorada em termos de detecção do Bd. Trabalhos de modelagem de nicho fundamental consideraram este bioma como uma região com probabilidade de ocorrência do Bd extremamente baixa ou nula, de acordo com suas condições de adequabilidade para o patógeno (Ron et al. 2005, Rödder et al. 2010). O primeiro registro de Bd contou com a detecção do patógeno em um indivíduo da espécie Adelphobates galactonotus (Valencia-Aguilar et al. 2015), apresentando carga de infecção baixa em comparação com a média conhecida para a Mata Atlântica (Rodriguez et al. 2014). Outro estudo realizou uma amostragem mais ampla na região, analisado a distribuição histórica do Bd e variáveis ambientais que explicavam a prevalência de infecção (Becker et al. 2016). No entanto, as análises foram restritas a espécimes depositados em coleções científicas e pertencentes à família Leptodactylidae, cujos representantes apresentam hábito altamente aquático e desenvolvimento indireto (Haddad et al. 2013). Carvalho et al. (2017) analisaram a ocorrência do Bd com o diagnóstico de infecção pela análise do aparato bucal de girinos, também depositados em coleções científicas. Esses estudos nos trazem uma compreensão sobre determinados padrões de ocorrência do Bd, porém não existem estudos analisando a dinâmica de infecção do Bd em populações naturais de anfíbios (incluindo
cecílias e salamandras), abrangendo uma maior diversidade de espécies e ocupando diferentes microhabitats.
Além de ser uma região de ocorrência exclusiva de espécies da ordem Caudata, outra particularidade da Amazônia brasileira é a presença de anuros do gênero Atelopus. Em outras regiões das Américas, representantes deste gênero foram classificados como em condição crítica, com suas populações sofrendo um declínio dramático, sendo que pelo menos 81% das espécies do gênero mostraram evidências de declínio e desaparecimento, e pelo menos 30 espécies já foram extintas na natureza (LaMarca & Lötters 1997, Ron et al. 2003, LaMarca et al. 2005). Declínios associados à infecção por Bd foram registrados em algumas regiões como Costa Rica, Panamá, Equador, Venezuela e Peru (Berger et al. 1998, Lips et al. 2008, LaMarca et al. 2005, Lampo et al. 2006, Rodríguez-Contreras et al. 2008), e um estudo recente identificou Atelopus como o gênero mais afetado pelo Bd no mundo (Scheele et al. 2019). No entanto, não se sabe se no Brasil as espécies do gênero presentes na Amazônia estão infectadas pelo Bd, e qual seria a resposta dos indivíduos frente a potenciais eventos de infecção por cepas exóticas, já que diferentes cepas de Bd podem ser amplamente disseminadas por vias naturais e antropogênicas (Kilburn et al 2011, Garmyn et al. 2012, Pontes et al. 2018).
Desde o primeiro registro de ocorrência do Bd na Mata Atlântica, muitos trabalhos que exploram diferentes aspectos relacionados à dinâmica de infecção foram desenvolvidos, mas a grande maioria se concentra na porção sul do bioma (James et al. 2015, Jenkinson et al. 2016, Lambertini et al. 2016). Até então, não existem trabalhos que exploraram a variação dos padrões de infecção por Bd ao longo do bioma por inteiro. Além disso, os trabalhos desenvolvidos na região amazônica até então, são restritos a espécimes depositados em coleções científicas, o que obviamente nos trazem informações importantes e possibilitam uma ampla amostragem ao longo do bioma, mas não refletem com acurácia a dinâmica de infecção do Bd em populações naturais.
Frente a todos os fatores acima citados, este trabalho analisou os padrões de ocorrência do Bd nos biomas Amazônia e Mata Atlântica, explorando variáveis relacionadas aos hospedeiros e ao ambiente dentro deste contexto. Levando em conta a escassez de trabalhos que abordam a dinâmica de infecção por Bd espécies de Gymnophiona, realizamos uma ampla amostragem de espécimes depositados em coleções científicas, e identificamos os padrões de ocorrência do patógeno em cecílias ao longo da América do Sul. Além disso, realizamos uma amostragem na região amazônica, identificando padrões de ocorrência do Bd em populações naturais de anfíbios, buscando associações entre variáveis bióticas e abióticas
com as taxas de infecção detectadas. Também amostramos espécies de Caudata, que ocorrem exclusivamente na região amazônica e, não existem até então, registros de Bd para tais espécies no Brasil. Avaliamos através de experimentação em laboratório, os efeitos de infecção por cepas exóticas de Bd em hospedeiros endêmicos da Amazônia, evidenciando assim os riscos da disseminação de cepas do patógeno. Finalmente, realizamos uma ampla amostragem de anfíbios anuros ao longo de um transecto latitudinal por toda extensão da Mata Atlântica. Essa amplitude de amostragem nos possibilitou analisar a variação dos padrões de infecção por Bd ao longo do bioma, e detectar associações entre variáveis bióticas e abióticas e as taxas de infecção detectadas. O presente trabalho foi dividido em três capítulos, os quais estão completamente detalhados a seguir, em formato de publicações científicas.
Capítulo 1. SPATIAL DISTRIBUTION OF Batrachochytrium dendrobatidis IN SOUTH
AMERICAN CAECILIANS
** Artigo publicado no periódico
Diseases of Aquatic Organisms (2017)
Carolina Lambertini*,1, C. Guilherme Becker2, Cecilia Bardier1,3, Domingos da Silva Leite4, Luís Felipe Toledo1
1
Laboratório de História Natural de Anfíbios Brasileiros (LaHNAB), Departamento de Biologia Animal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, 13083-862, Brazil.
2
Departamento de Zoologia, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, São Paulo, 13506-900, Brazil.
3
Laboratorio de Sistemática e Historia Natural de Vertebrados, Instituto de Ecología y Ciencias ambientales, Universidad de la República, Montevideo, 11400, Uruguay.
4
Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, 13083-862, Brazil.
*Corresponding author:
Carolina Lambertini
Abstract
The amphibian-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) is linked to population declines in anurans and salamanders globally. To date, however, few studies attempted to screen Bd in live caecilians; Bd-positive caecilians were only reported in Africa and French Guiana. Here, we performed a retrospective survey of museum preserved specimens to (i) describe spatial patterns of Bd infection in Gymnophiona across South America and (ii) test whether areas of low climatic suitability for Bd in anurans predict Bd spatial epidemiology in caecilians. We used quantitative PCR to detect Bd in preserved caecilians collected over a 109-year period, and performed autologistic regressions to test the effect of bioclimatic metrics of temperature and precipitation, vegetation density, and elevation on the likelihood of Bd occurrence. We detected an overall Bd prevalence of 12.4%, with positive samples spanning across the Uruguayan savanna, Brazilian Atlantic Forest, and the Amazon basin. Our Autologistic models detected a strong effect of macroclimate, a weaker effect of vegetation density, and no effect of elevation on the likelihood of Bd occurrence. Although most of our Bd-positive records overlapped with reported areas of high climatic suitability for the fungus in the Neotropics, many our new Bd-positive samples extend far into areas of poor suitability for Bd in anurans. Our results highlight an important gap in the study of amphibian chytridiomycosis: the potential negative impact of Bd on Neotropical caecilians and the hypothetical role of caecilians as Bd reservoirs.
Keywords: Chytrid infection dynamics, Gymnophiona, Life history, Environmental
Introduction
Amphibian fungal pathogens of the genus Batrachochytrium are linked to population declines in anurans and salamanders globally through the infectious disease chytridiomycosis (Berger et al. 1998, Lips et al. 2008, Martel et al. 2013). The amphibian-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) has been acknowledged as one of the most destructive wildlife pathogens to wildlife (Fisher & Garner 2007, Skerratt et al. 2007), causing population declines in a large fraction of infected species. Bd is generalist among amphibians (Valencia-Aguilar et al. 2015), infecting anurans and salamanders from tropical and temperate regions (Lips et al. 2006, Lips et al. 2008, Vredenburg et al. 2010, Cheng et al. 2011). Reports of Bd infection in caecilians (Gymnophiona), however, are rare in the literature. To our knowledge, only four reports of Bd from wild-caught caecilians are available to date (Doherty-Bone et al. 2013, Gower et al. 2013, Hydeman et al. 2013, Rendle et al. 2015).
The first study screening for Bd in caecilians reported 53 Bd-positive caecilians out of 85 tested individuals from Cameroon (Doherty-Bone et al. 2013). In the same year, Gower et al (2013) reported the first case of lethal chytridiomycosis in caecilians from Cameroon and Tanzania. They reported that wild-caught specimens from the genus Geotrypetes seraphini that tested positive for Bd died in captivity with signs of chytridiomycosis. Bd infections were also confirmed in an endemic caecilian (Schistometopum thomense) from an island of the archipelago of São Tomé and Príncipe (Hydeman et al. 2013). The only record of Bd infecting caecilians outside Africa was recently published for a wild-caught specimen from French Guiana (Rendle et al. 2015). Despite the observed high Bd prevalence in African caecilians, sampling efforts to detect Bd in Gymnophiona have been made in other regions but without any Bd-positive samples from specimens collected in the wild in peninsular Malaysia (n=2; Savage et al. 2011), Colombia (n=1; Vasquez-Ochoa et al. 2012), West Africa (n=6; Penner et al. 2013), and the Seychelles archipelago (n=78; Labisko et al. 2015). The small sample sizes of these published reports reflect the difficulty and/or lack of effort in working with this generally inconspicuous taxon (e.g. Gower & Wilkinson 2005), it cannot be ruled out that Gymnophiona suffers with Bd as extensively as do anurans. Furthermore, conspicuous die-offs due to chytridiomycosis, such as those observed in anurans, are relatively unlikely to be observed in caecilians (Gower et al. 2013: p.180) due to their fossorial or fully-aquatic life styles (Wells 2007, Vitt & Caldwell 2014). Caecilians are broadly distributed in the tropics (Taylor 1968, Frost 2016), often
co-occurring with anuran populations heavily impacted by chytridiomycosis (James et al. 2015, Seimon et al. 2007, Gower et al. 2012, Bataille et al. 2013), and inhabiting microhabitats within Bd’s optimal growth conditions of temperature and humidity (Piotrowski et al. 2004). Determining whether caecilians are suffering with chytridiomycosis as do anurans and salamanders, and if they are serving as pathogen reservoirs, is relevant for amphibian conservation (Gower & Wilkinson 2005).
Several environmental factors influence Bd infection in anurans. Infection prevalence and zoospore loads are often positively correlated with elevation (Brem & Lips 2008, Gründler et al. 2012, Catenazzi et al. 2013), vegetation density (Puschendorf et al. 2009, Becker & Zamudio 2011, Becker et al. 2015), precipitation (Becker & Zamudio 2011), and negatively correlated with temperature (Becker & Zamudio 2011, Becker et al. 2015, Ruggeri et al. 2015). Because most caecilians are fossorial, they are likely exposed to lower microclimatic fluctuations dictated by land cover, insolation, and humidity. Therefore, microclimatic optimum/average of caecilians might fall within Bd’s optimal growth conditions, allowing Bd to persist in areas where it would otherwise not endure year-round.
Here, we performed a retrospective survey of museum preserved specimens to (i) describe spatial patterns of Bd infection in Gymnophiona in South America and (ii) test whether areas of low climatic suitability for Bd in anurans predict Bd spatial epidemiology in caecilians. We used quantitative PCR to detect Bd in preserved caecilians collected over a 109 year period, and performed autologistic regressions to test the effect of bioclimatic metrics of temperature and precipitation, vegetation density, and elevation on the likelihood of Bd occurrence. Our results provide novel information on Bd spatial epidemiology and suggest that caecilians could be potentially threatened or serve as a Bd reservoir in regions where anurans are not infected during most of the year.
Methods
Species sampling
We sampled 193 museum-preserved specimens of Gymnophiona; 160 from Brazil (Caeciliidae, Siphonopidae, and Typhlonectidae) and 33 from Uruguay (Typhlonectidae; Table 1). We screened specimens from three our of four South American caecilian families housed at the following herpetological collections: Museu Paraense Emílio Goeldi (MPEG), Museu de Zoologia “prof. Adão José Cardoso”,
Universidade Estadual de Campinas (ZUEC), Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro (MNRJ), Coleção de Anfíbios Célio F. B. Haddad, Universidade Estadual Paulista (CFBH), and Colección de Vertebrados de la Universidad de La Republica, Montevideo (ZVCB) (Table S1). For standardization purposes, we did not include in our analyses published Bd data from wild caught caecilians from French Guiana, Guyana and Colombia (Vásquez-Ochoa et al. 2012, Gower et al. 2013, Rendle et al. 2015). We gathered GPS coordinates in decimal degrees for each sampled specimen based on museum data. We used the geographic centroid of municipalities as an approximation when precise geographic coordinates were not available. We did not consider records of Bd from captive and live specimens for methodological consistency (e.g. Raphel and Pramuk 2007, Churgin et al. 2013).
Bd detection
Retrospective sampling of museum specimens has been used widely to determine Bd-historical dynamics across space and time (Weldon et al. 2004, Ouellet et al. 2005, Soto-Azat et al. 2010, Cheng et al. 2011, Vredenburg et al. 2013, Rodriguez et al. 2014, Becker et al. 2015, Courtois et al. 2015, Talley et al. 2015). We swabbed individual specimens on their head, anal disc, dorsal, and ventral surfaces with a single swab per individual, following Rendle et al (2015), and stored each sample in a 1.5 mL dry sterile tube. We extracted DNA from each swab using 50 µL de PrepMan ULTRA®, and proceeded with the molecular detection with TaqMan® qPCR assay (Life Technologies), using the strain CLFT 023 as a quantitative standard for the reactions diluted from 103 to 10-1zoospore genomic equivalents (g.e.) (Boyle et al. 2004, Lambertini et al. 2013). We considered Bd-positive samples with g.e. ≥ 1 (Kriger et al. 2007).
Statistical Analyses
We described patterns of Bd infection in Caecilians from Brazil and Uruguay (proportion of Bd-infected individuals ± binomial 95% CI). We classified species based on their predominant life history (aquatic or fossorial) and reported the proportion (± binomial 95% CI) of infected individuals for each life-history category and ecoregion. We also reported on spatiotemporal patterns of Bd infections from 1905-2014; 28 specimens lacking information of collection year were excluded from these calculations.
Furthermore, we conducted a multi-model inference using Autologistic regressions to test the effect of bioclimatic variables, vegetation density, and elevation on the likelihood of Bd infection while accounting for the effects of spatial autocorrelation (Rangel et al. 2010). For each sampling location we extracted 19 bioclimatic variables of temperature and precipitation averaged over a period of 50 years (Hijmans et al. 2005), vegetation density (FAO 2010) and elevation, using Arc Map v.10.1 (ESRI 2012). We used a model averaging procedure, including Bd as the response variable (presence vs. absence) and the aforementioned environmental factors as explanatory variables. Our model averaging ranked all possible models based on AIC and averaged beta coefficients of variables present in 90% of models within ΔAIC < 2. We reported the strength and the direction that each environmental variable influenced Bd. We used SAM v4.0 to perform statistical analyses (Rangel et al. 2010).
Results
Our qPCR reactions detected Bd in 24 out of 193 screened specimens (12.4%, 95% CI = 0.08-0.17; Fig. 1). Infected individuals belonged to the families Siphonopidae (eight individuals) and Typhlonectidae (16 individuals) distributed across the Uruguayan savanna (proportion of infected individuals = 12.1%, 95% CI = 0.03 - 0.28, n = 33), the Amazon Basin (16%, 95% CI = 0.08 - 0.26, n = 75), and Brazilian Atlantic Forest (13.5%, 95% CI = 0.06 - 0.24, n = 59). We did not detect Bd in individuals of Caeciliidae and also in samples from the Brazilian Cerrado, Caatinga, and Pantanal, though our sampling size in these ecoregions was small (n = 2, n = 22 and n = 2, respectively). We detected a proportion of infected individuals of 11.7% in aquatic species (95% CI = 0.06 - 0.18, n = 136) and 14% in terrestrial (typically fossorial) species (95% CI = 0.06 - 0.25, n = 57).
Although our sampling spanned 109 years, most of our Bd positive specimens (n = 16) were collected after 1994. Only five samples before this period tested positive for Bd, and were collected from the wild between 1965 and 1994. Twenty-one samples collected prior to 1971 were screened, and they all tested negative for Bd.
Our spatial regression models indicated a significant effect of macroclimate on the likelihood of Bd occurrence (Table 2). Our Autologistic model averaging showed a negative effect of maximum temperature of warmest month and precipitation of wettest quarter, and a positive effect of annual precipitation on Bd infection likelihood;
full set of significant variables found on Table 2. Vegetation density had a weak negative effect on Bd occurrence, and elevation was not a significant variable in our models (Table 2; Table S2).
Discussion
Seasonal variations in temperature and precipitation strongly mediate Bd infections by changing optimal physiological conditions of hosts and pathogen (Piotrowski et al. 2004, Becker & Zamudio 2011, Ruggeri et al. 2015). These environmental constraints are revealed in several environmental niche models, indicating that much of South America is unsuitable for Bd during at least for part of the year (Rödder et al. 2009, Liu et al. 2013, Becker et al. 2015, James et al. 2015). Although most of the Bd-positive records overlapped with reported areas of high climatic suitability for the fungus in the Neotropics (Rödder et al. 2009, Liu et al. 2013, Becker et al. 2015, James et al. 2015), many new Bd-positive records extend far into areas of poor suitability for Bd in anurans (e.g., central Amazon: see Becker et al. 2015). Our data points to widespread Bd infections in Neotropical caecilians, and that this taxon may serve as an environmental reservoir, perhaps because hosts are able to avoid harsh seasonal extremes where Bd would otherwise not persist year-round. These results, combined with the recent report of lethal chytridiomycosis in wild-caught caecilians (Gower et al. 2013), indicate that Gymnophiona are potentially experiencing silent population declines in the wild due to Bd.
Spatial regressions are also consistent with the observed associations between macroclimate and Bd infection in anuran species (Becker & Zamudio 2011, Becker et al. 2015, James et al. 2015). Specifically, we detected a positive effect of precipitation and a negative effect of temperature variables on the likelihood of Bd infection in caecilian hosts. Vegetation density, which is often positively associated with Bd infection in anurans (Raffel et al. 2010, Becker & Zamudio 2011, Becker et al. 2012), showed a weak negative effect on Bd in caecilians. This finding might be due to the high degree of fossoriality of terrestrial caecilian species, which spares them from the direct or indirect effects of habitat quality, with downstream shifts in both macro- and micro-climates. Elevation, which is often positively associated with Bd infection in anurans (Walker et al. 2010, Piovia-Scott et al. 2011, Gründler et al. 2012) due to optimal growth conditions in highlands (Piotrowski et al. 2004), showed no effect on Bd in Caecilians. Although our sampling spanned 1000 meters in elevation, most of our
samples were collected at lower altitudes. This uneven sampling across the elevation gradient may have thus impacted our ability to detect a significant effect of elevation in our analyses. Although large-scale climate may play a role in Bd epizootiology of caecilians, these results indicate that infection dynamics in caecilians and anurans might be different.
Although results suggest that caecilians could act as pathogen reservoirs in environments or periods of harsh microclimatic conditions, there is limited natural history information for most caecilian species (Gower & Wilkinson 2005, Vitt & Caldwell 2014). Basic information on foraging behavior, population densities, and breeding habits that would be key to quantify transmission dynamics between Gymnophiona and Anura are typically lacking. It is known that five out of 10 families of caecilians are found in South America (Wilkinson et al. 2011, Frost 2016), and that these five families span from completely fossorial to aquatic (Haddad et al. 2013, Vitt & Caldwell 2014). We predict that fossorial and fully aquatic species will be less likely exposed to environmental and climatic fluctuation than terrestrial anurans because they spend longer periods of time underground or underwater; future studies of caecilians’ foraging behavior and habitat use may help test the link between habitat use and temperature variability. Lower temperature extremes and variability are linked to higher Bd growth and persistence in amphibian hosts both in the wild and in the laboratory (Pounds et al. 2006, Raffel et al. 2013, 2015). Because Bd is a waterborne fungus (Longcore et al. 1999, Kilpatrick et al. 2009), we also expect fully aquatic caecilians to be exposed to the pathogen not only during early life stages. Therefore, fossorial and aquatic life styles observed in caecilians are two life history traits that likely make an efficient host reservoir, especially in areas where Bd does not persist in anuran hosts year-round.
In areas of low predicted suitability for Bd such as the Amazon basin (Ron et al. 2005, Becker et al. 2015, James et al. 2015), we detected an infection prevalence of 16%, which is surprisingly high compared to the observed ~3% in museum-preserved anurans in this region (Becker et al. 2015). In contrast, the proportion of infected caecilians in the Atlantic Forest was slightly lower than what has been observed for preserved anurans (~23%) in this ecoregion (Rodriguez et al. 2014). Nonetheless, limited sample size for caecilians prior to the 1970s precludes us from making any concrete spatio-temporal comparison between Bd in caecilians and in anurans from both the Atlantic Forest (Rodriguez et al. 2014) and the Amazon basin (Becker et al. 2015).
Although most aquatic caecilians included in this study were sampled from the Amazon basin and most terrestrial caecilians from the Atlantic Forest, we did not detect a significant effect of host life style (aquatic vs. terrestrial) on the likelihood of Bd infection. These results further indicate that Bd infection dynamics in Gymnophiona might experience a lower pressure from macroclimate than Anura.
Our results highlight an important gap in the study of amphibian chytridiomycosis: the possible impact of Bd on Neotropical caecilians and the hypothetical role of caecilians as Bd reservoirs. To date, information on susceptibility of caecilian hosts to Bd infection is still lacking. Therefore, Bd genotypes detected in caecilians may present different adaptations to host histophysiology or microclimates, which provides a key opportunity to isolate and genotype new Bd isolates from live caecilians and test the virulence of these new isolates in anurans. Because Bd has a disproportionately higher impact in tropical amphibians, a better understanding of Bd infection dynamics in Gymnophiona may increase our knowledge about the chytridiomycosis pandemic and advance our conservation efforts in the wild.
Acknowledgements
We thank Adriano O. Maciel, Alexandre F.R. Missassi, Manoela Woitovicz Cardoso, Nadya C. Pupin and Tamilie Carvalho for help with swabbing and providing museum specimens. Ana L.C. Prudente (MPEG), Célio F.B. Haddad (CFBH), José P. Pombal Jr. (MNRJ) and Raúl Maneyro (ZVCB) allowed access to museum specimens. David J. Gower and two anonymous reviewers for constructive feedback on our manuscript. Our work was funded by Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) and the National Council of Technological and Scientific Development (CNPq #405285/2013-2; #312895/2014-3) and Sao Paulo Research Foundation (FAPESP #2014/23388-7).
Table 1. Families, species, sample size, environment and country where individual
caecilians were captured, and prevalence (as the number of positives/total screened).
Family n Habit Habitat Country Prevalence
Caeciliidae
Caecilia gracilis 01 Fossorial Rainforest Brazil 0/1
Siphonopidae
Luetkenotyphlus brasiliensis 09 Fossorial Rainforest Brazil 3/9
Siphonops annulatus 12 Fossorial Rainforest Brazil 1/12
Siphonops cf. annulatus 01 Fossorial Rainforest Brazil 1/1
Siphonops paulensis 08 Fossorial Rainforest Brazil 2/8
Siphonops cf. paulensis 15 Fossorial Rainforest Grassland
Brazil 0/15
Siphonops sp. (aff. paulensis) 02 Fossorial Grassland Brazil 0/2
Siphonops hardyi 02 Fossorial Rainforest Brazil 0/2
Siphonops sp. 07 Fossorial Rainforest
Grassland
Brazil 1/7
Typhlonectidae
Atretochoana eiselti 04 Aquatic Rainforest Brazil 0/4
Chthonerpeton braestrupi 06 Aquatic Rainforest Brazil 0/6
Chthonerpeton indistinctum 33 Aquatic Grassland Uruguay 4/33
Chthonerpeton indistinctum 01 Aquatic Rainforest Brazil 0/1
Chthonerpeton noctinetes 08 Aquatic Rainforest Brazil 0/8
Chthonerpeton sp. 01 Aquatic Rainforest Brazil 0/1
Chthonerpeton tremembe 04 Aquatic Grassland Brazil 0/4
Chthonerpeton viviparum 08 Aquatic Rainforest Brazil 0/8
Potamotyphlus kaupii 39 Aquatic Rainforest Brazil 9/39
