Ação do exercício físico e da atorvastatina na função cardíaca em modelo experimental de infarto agudo do miocárdio

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

Vanessa Cristina Baptista

Ação do exercício físico e da atorvastatina na

função cardíaca em modelo experimental

de infarto agudo do miocárdio

CAMPINAS

2019

VANESSA CRISTINA BAPTISTA

AÇÃO DO EXERCÍCIO FÍSICO E DA ATORVASTATINA NA

FUNÇÃO CARDÍACA EM MODELO EXPERIMENTAL

DE INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas, como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora

em Ciências

ORIENTADOR: Pedro Paulo Martins de Oliveira

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA

VANESSA CRISTINA BAPTISTA E ORIENTADA PELO

PROF. DR. PEDRO PAULO MARTINS DE OLIVEIRA

CAMPINAS

2019

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas

Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Action of physical exercise and atorvastatin in experimental

model cardiac function of acute myocardial infarction

Palavras-chave em inglês: Myocardial infarction Physical exercises Atorvastatin Ventricular remodeling Fibrosis Collagen

Área de concentração: Fisiopatologia Cirúrgica Titulação: Doutora em Ciências

Banca examinadora:

Pedro Paulo Martins de Oliveira [Orientador] Luciana Castilho de Figueiredo

Otávio Rizzi Coelho Filho Audrey Borghi Silva João Carlos Ferreira Leal

Data de defesa: 27-02-2019

Programa de Pós-Graduação: Ciências da Cirurgia

Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-3632-5312

- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/4608772427134715

Baptista, Vanessa Cristina, 1982-

B229a Ação do exercício físico e da atorvastatina na função cardíaca em modelo experimental de infarto agudo do miocárdio / Vanessa Cristina Baptista. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.

Orientador: Pedro Paulo Martins de Oliveira.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.

1. Infarto do miocárdio. 2. Exercícios físicos. 3. Atorvastatina. 4. Remodelação ventricular. 5. Fibrose. 6. Colágeno. I. Oliveira, Pedro Paulo Martins de, 1968-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.

COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE

MESTRADO/DOUTORADO

VANESSA CRISTINA BAPTISTA

ORIENTADOR: PEDRO PAULO MARTINS DE OLIVEIRA

MEMBROS:

1. PROF. DR. PEDRO PAULO MARTINS DE OLIVEIRA

2. PROF. DRA. LUCIANA CASTILHO DE FIGUEIREDO

3. PROF. DR. OTÁVIO RIZZI COELHO FILHO

4. PROF. DRA. AUDREY BORGHI SILVA

5. PROF. DR. JOÃO CARLOS FERREIRA LEAL

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a meus queridos pais que incondicionalmente iluminam

meus caminhos obscuros, me apoiaram e me incentivaram nesta trajetória. Sempre

presentes, batalhadores do qual me orgulho de ser filha.

Aos meus familiares, amigos, colegas e professores que contribuíram,

apoiaram e acreditaram na realização deste trabalho.

“Ninguém é tão sábio que não tenha algo para aprender E nem tão tolo que não tenha algo a ensinar” Blaise Pascal

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por me dar forças e coragem para vencer os obstáculos e

me proporcionar novos caminhos e possibilidades.

Ao meu orientador Dr Pedro Paulo professor e médico admirável, por ter me

acolhido e aceitar ser meu orientador, me incentivar e apoiar no final desta tese,

muito obrigada pela paciência, cuidado e presteza na correção deste trabalho.

Gratidão por tudo.

Agradeço especialmente a Professora Dra Denise Vaz de Macedo, minha

co-orientadora, pessoa admirável, que esteve presente em todos os momentos, não só

durante a execução deste trabalho, mas principalmente dando incentivo e estímulo,

das mais diferentes formas. Sua paciência, cobrança e, principalmente, o cuidado e

a presteza na correção e orientação do trabalho foram um dos principais

ingredientes para que esta tese tomasse corpo. Muito obrigada por tudo!

Agradeço ao orientador Prof. Dr. Orlando Petrucci por toda orientação,

estímulo e incentivo para que esse trabalho tomasse corpo. Muito obrigada pela

confiança.

A equipe da técnica cirúrgica do Núcleo de Medicina e Cirurgia Experimental,

Willian, Ana e o Miguel pelo auxilio e assistência durante a execução dos

procedimentos cirúrgicos experimentais.

Ao professor Karlos Vilarinho pelo apoio e auxílio e assistência durante os

procedimentos cirúrgicos.

Aos amigos e companheiros de laboratório Helison Rafael do Carmo, Karla

Reichert e Isabela Bonilha. Obrigada por todo apoio e colaboração durante este

A Daniela Diógenes bióloga, amiga e mentora, obrigada pela ajuda e apoio

científico durante a execução dos experimentos laboratoriais. Obrigada por toda

ajuda e por compartilhar seus conhecimentos.

A todos os meus familiares e amigos que me apoiaram e participaram das

minhas escolhas.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de

RESUMO

Introdução: O infarto do miocárdio (IM) é uma das causas mais frequentes

para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca. Estratégias terapêuticas que

modulem o remodelamento ventricular (RV) têm sido indicadas após o IM. O

exercício físico e a atorvastatina podem exercer efeitos na mecânica do miocárdio,

desempenho ventricular, e no metabolismo do colágeno e fibrose.Objetivos: Avaliar

os efeitos do exercício físico e da atorvastatina na melhora do remodelamento

ventricular pós-infarto do miocárdio induzido em ratos de forma experimental.

Materiais e métodos: Foram avaliados 108 ratos Wistar machos com 4 semanas de

vida, submetidos à ligadura permanente da artéria interventricular anterior ou sham.

Os animais foram divididos em 8 grupos: SHAM, (n=7), SHAM/TR (n=6), SHAM/AT

(n= 5), SHAM/TR/AT (n= 8) e IM (n=7), IM/TR (n=9), IM/AT (n=10), IM/TR/AT (n=13).

No 1°dia de pós-operatório, os grupos AT receberam atorvastatina (10mg/kg/dia); no

2°dia, foi iniciado o protocolo de treinamento na esteira durante 8 semanas. Análises

por cateter de pressão-volume e histológica do ventrículo esquerdo (VE) foram

realizadas, bem como o teste de exaustão nos períodos de 4 e 8 semanas pós

treinamento. Resultados: A razão entre peso do VE e o peso animal nos grupos

infartados foi maior nos grupos treinamento e atorvastatina. O treinamento em

associação com a atorvastatina reduziu a área transversal dos cardiomiócitos

quando comparamos aos animais dos grupos IM (IM/TR/AT 273.5 ± 66.9μm2 _{vs. IM} 293.4 ± 65.9μm2_{, IM/TR 299.2 ± 72.9μm}2_{, IM/AT 299.0 ± 58.6μm}2_{, P<0,01). A partir} dos dados hemodinâmicos a derivada de pressão/derivada de tempo mínima (dP/dt

mín) nos grupos IM tratados com atorvastatina, independente ou não de treinamento

0.0002mmHg/s vs. IM/TR 0,00343 ± 0,0008mmHg/s e IM/AT 0,00421 ±

0,0006mmHg/s; IM/TR/AT 0,00234 ± 0,0005mmHg/s vs. IM/AT; P<0,05). O conteúdo

de colágeno e fibrose no VE e observamos que o treinamento associado ou não com

a atorvastatina foi eficiente para diminuir principalmente a ocorrência de fibrose nos

grupos infartados (IM 12.4± 0.76%, IM/TR 4.9 ± 1.6%, IM/AT 12.3 ± 3.8% e

IM/TR/AT 7.0 ± 3.3%; P<0,05). A análise da distância percorrida nos mostra que os

animais treinados tiveram desempenho melhor em relação ao grupo IM (IM 265.5 ±

147.8m vs. IM/TR 673.4 ± 334.3m, IM/TR/AT 641.1 ± 341.0m, SHAM/TR 729.6 ±

184.6m e SHAM/TR/AT 604.3 ± 244.8m; P<0,01). Conclusão: Os dados obtidos nos

mostram que o exercício físico e a atorvastatina melhoraram a funcionalidade

ventricular, reduzindo o remodelamento desfavorável e a hipertrofia após o IM em

ratos.

Palavras-chave: Infarto do Miocárdio, Exercício físico, Atorvastatina,

ABSTRACT

Introduction: Myocardial infarction (MI) is one of the most frequent causes for

the development of heart failure. Therapeutic strategies that modulate ventricular

remodeling (VR) have been indicated after MI. Physical exercise and atorvastatin

may exert effects on myocardial mechanics, ventricular performance, and collagen

and fibrosis metabolism. Objectives: To evaluate the effects of physical exercise and

atorvastatin on the improvement of ventricular remodeling after myocardial infarction

induced in experimental rats. Materials and methods: We evaluated 108 male Wistar

rats at 4 weeks of age submitted to permanent ligation of the anterior interventricular

artery or sham. The animals were divided into 8 groups: SHAM (n=7), SHAM/TR

(n=6), SHAM/AT (n=5), SHAM/TR/AT (n=8), IM/TR (n=9), IM/AT (n=10), IM/TR/AT

(n=13). On the 1st postoperative day, AT groups received atorvastatin

(10mg/kg/day); on the 2nd day, the treadmill training protocol was started for 8

weeks. Left ventricular (LV) pressure-volume and histological catheter analyzes were

performed, as well as the exhaustion test at the 4 and 8 week post-training periods.

Results: The ratio of LV weight to animal weight in the infarcted groups was higher in

the training and atorvastatin groups. The training in association with atorvastatin

reduced the cross-sectional area of the cardiomyocytes when compared to the

animals of the IM groups (IM/TR/AT 273.5 ± 66.9μm2 vs. IM 293.4 ± 65.9μm2, IM/TR 299.2 ± 72.9μm2, IM/AT 299.0 ± 58.6μm2, P<0.01). From the hemodynamic data the minimum time pressure/derivative derivative (dP/dt min) in the IM groups treated with

atorvastatin, independent or non-training, showed higher values compared to the IM

animals (IM 0.00180 ± 0.0002mmHg/s vs. IM/TR/AT 0.00234 ± 0.0005mmHg/s vs.

the training associated or not with atorvastatin was efficient to decrease mainly the

occurrence of fibrosis in the infarcted groups (IM 12.4 ± 0.76%, IM/TR 4.9 ± 1.6%,

IM/AT 12.3 ± 3.8% and IM/TR/AT 7.0 ± 3.3%; P<0.05). The distance analysis

showed that the trained animals performed better than the IM group (IM 265.5 ±

147.8m vs. IM/TR 673.4 ± 334.3m, IM/TR/AT 641.1 ± 341.0m, SHAM/TR 729.6 ±

184.6 and SHAM/TR/AT 604.3 ± 244.8m; P<0.01). Conclusion: The data obtained

showed that physical exercise and atorvastatin improved ventricular function,

reducing unfavorable remodeling and hypertrophy after MI in rats.

Key words: Myocardial infarction, Physical exercise, Atorvastatin, Ventricular

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Protocolo de treinamento na esteira………... 33 Tabela 2: Pesos dos animais, Ventrículos esquerdos e Pulmões…..…... 45 Tabela 3: Avaliações hemodinâmicas………... 49

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Procedimento cirúrgico……….… 30

Figura 2: Esteira………..………... 35

Figura 3: Análise hemodinâmica………... 37

Figura 4: Cardiomiócitos………..……..………... 40

Figura 5: Fluxograma e Randomização ……….……… 42

Figura 6: Imagens histológicas dos cardiomiócitos……….. 46

Figura 7: Área Transversal de Cardiomiócitos………. 47

Figura 8: Análises histológicas da porção do músculo papilar…… 51

Figura 9: Quantificação de fibrose e colágeno do ventrículo esquerdo………... 52 Figura 10: Quantificação de fibrose e colágeno na parede contralateral do ventrículo esquerdo………... 53 Figura 11: Distância caminhada no teste de exaustão……….….. 54

LISTA DE EQUAÇÃO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AHA: American Heart Association

AT: Atorvastatina

CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais

D: Distância

DC: Doença Coronariana

dP/dtmáx: Derivada de Pressão/Derivada de Tempo máxima

dP/dtmin: Derivada de Pressão/Derivada de Tempo mínima

DP: Desvio padrão

DATASUS: Departamento de Informática do SUS

HMG-CoA redutase: 3-hidroxi-- 3-metilglutaril coenzima A redutase

IAM: Infarto Agudo do Miocárdio

IBAMA: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

LABEX: Laboratório de Bioquímica do Exercício

IM: Infarto do Miocárdio

IC: Insuficiência cardíaca

ICC: Insuficiência cardíaca crônica

IM: Infarto do Miocárdio

IM/AT: Infarto do miocárdio atorvastatina

IM/TR: Infarto do miocárdio treinamento

IM/TR/AT: Infarto do miocárdio treinamento atorvastatina

Kg/m: quilogramas/metros

NOS: Síntese de óxido nítrico

P: Probabilidade de Significância

PPARs: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor

Pr: Performance do rato

RV: Remodelamento Ventricular

SCA: Síndrome Coronariana Aguda

SD: Desvio padrão

SHAM: Sham

SHAM/AT: Sham atorvastatina

SHAM/TR: Sham treinamento

SHAM/TR/AT: Sham treinamento atorvastatina

T: Tempo

Tau: Constante de Relaxamento Isovolumétrico

TF: Treinamento físico

UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas

VE: Ventrículo Esquerdo

LISTA DE SÍMBOLOS

m/min: metros por minuto

mg: miligrama

min: minutos

mmHg/s: Milímetros de mercúrio/segundos

ms: Milissegundo

®: Marca registrada comercial

s: Segundos

μL: Microlitro μm: Micrômetro

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO... 19

1.1 Doenças Cardíacas………... 19

1.2 Composição Estrutural do Miocárdio e Remodelamento Ventricular 20 1.3 Exercício físico……… 22 1.4 Estatinas – Atorvastatina……….. 23 2. OBJETIVOS... 26 3. MATERIAIS E MÉTODOS... 27 3.1 Protocolo Experimental ...… 27 3.2 Desenho experimental ...… 27 3.3 Procedimento Cirúrgico ... 29

3.4 Protocolo de treinamento na esteira ... 33

3.5 Teste de Exaustão ... 34 3.6 Avaliações Hemodinâmicas ...… 36 3.7 Análises Histológicas ...… 38 3.8 Análises Estatística... 41 4. RESULTADOS... 43 5. DISCUSSÃO... 56 6. CONCLUSÕES... 62 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 63 8. ANEXOS

8.1 Parecer do comitê de ética ...…

71

19

1. INTRODUÇÃO

1.1. Doenças Cardíacas

As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte no

mundo. Estima-se que 17,7 milhões de pessoas morreram por doenças

cardiovasculares em 2015, representando 31% de todas as mortes em nível

global (1). Dados da American Heart Association (AHA) estimam prevalência de

5,1 milhões de indivíduos com insuficiência cardíaca (IC) somente nos Estados

Unidos, no período entre 2007 e 2012. Análises do DATASUS, demonstram que

no ano de 2012 houveram 26.694 óbitos por IC no Brasil (2).

Na insuficiência cardíaca crônica (ICC) o coração perde a capacidade de

bombear sangue para satisfazer as exigências metabólicas do corpo. É uma

síndrome clínica complexa, caracterizada por alterações cardiovasculares,

músculo esqueléticas e nas funções neuro-hormonais (3, 4).

O infarto do miocárdio (IM) representa uma das causas mais importantes

para o desenvolvimento de ICC. Após o evento isquêmico podem ocorrer

alterações na arquitetura ventricular que envolvem tanto a área infartada quanto a

não infartada, normalmente a parede contralateral (3, 5). O conjunto dessas

alterações morfológicas do ventrículo é chamado de remodelamento ventricular

(RV) (6-10).

No RV ocorre hipertrofia dos miócitos e fibrose intersticial do miocárdio

(11-13). A hipertrofia se traduz em alterações no tamanho e geometria da câmara

ventricular, alterando inicialmente a hemodinâmica, com o aumento no número de

20

parede, ou seja hipertrofia concêntrica e aumento do volume ejetado pelo

aumento do volume diastólico final, ou seja hipertrofia excêntrica (7, 14).

Por outro lado, a intensidade do RV parece estar diretamente associada à

deterioração da função ventricular e, consequentemente, a um pior prognóstico

(5, 7, 11). Nesse contexto, o modelo de infarto experimental no rato tem sido

muito utilizado para o estudo do RV devido à similaridade entre as alterações

fisiopatológicas que acontecem nesses animais e nos humanos após o infarto.

1.2. Composição Estrutural do Miocárdio e Remodelamento Ventricular

O tecido cardíaco é composto por um componente muscular constituído por

cardiomiócitos e um componente intersticial formado por uma matriz extracelular

(15). Os miócitos representam 30% do número total de células miocárdicas,

unidas com o suporte de uma rede de tecido conjuntivo, a matriz extracelular. A

matriz extracelular é composta basicamente de colágeno fibrilar, que é sintetizado

e degradado pelos fibroblastos no interstício. As fibras de colágeno encontradas

no interstício são predominantemente dos tipos I e III que representa 95% do

colágeno total. As principais funções dessa rede são regular a apoptose, resistir a

deformações patológicas, manter o alinhamento das estruturas e regular a

distensibilidade cardíaca e a transmissão de força durante o encurtamento da

fibra cardíaca. O colágeno é um importante modulador tanto da função cardíaca

diastólica quanto da função sistólica (6, 7, 16-18).

O RV possui duas fases, aguda e crônica. A fase aguda ocorre nas

primeiras 72 horas após o evento isquêmico. Neste momento ocorre o aumento

inicia-21

se após as 72 horas de isquemia e consiste na presença de processos

hipertróficos, além de alterações na geometria do ventrículo esquerdo (VE) (19,

20)

No RV após um evento isquêmico o coração se adapta às novas

condições de funcionamento. Ativam-se mediadores que incluem estresse

parietal, neuro-hormonais sistema simpático, renina-angiotensina, aldosterona e

endotelina; liberação de citocinas, estresse oxidativo e isquemia. Esses

mediadores se potencializam mutuamente, agindo de forma relacionada (7, 14).

Inicialmente, ocorrem modificações moleculares e celulares, entre elas

hipertrofia do miócito, degeneração do colágeno e deslizamento das fibras de

colágeno entre si, necrose e apoptose, proliferação e fibrose intersticial. Como

resultado, ocorre hipertrofia dos miócitos e aumento da massa ventricular, os

quais reduzem o estresse parietal dado pela Lei de Laplace, compensando a

demanda aumentada, permitindo uma estabilização inicial. Quando o RV for

insuficiente ou a sobrecarga ultrapassar a capacidade do coração hipertrofiar,

ocorre um desequilíbrio. A hipertrofia passa a ser insuficiente para normalizar o

estresse parietal, criando-se um círculo vicioso que leva à dilatação do coração, a

alterações da geometria, passando para um formato esférico, com alterações de

contratilidade e relaxamento e aumento dos volumes sistólico e diastólico final.

Essas alterações são progressivas, deletérias e podem levar ao desenvolvimento

22

1.3. Exercício físico

O exercício físico em pacientes após o IM é recomendado como um

complemento muito útil, associado ou não com a terapia medicamentosa. Existem

estudos mostrando que o exercício físico melhora a qualidade de vida dos

pacientes e atua no RV esquerdo (4, 21, 22). Parece também estar associado à

mudanças neuro-hormonais, possuir efeitos anti-inflamatórios cardiovasculares,

pulmonares e musculoesquelético (23-26). Além disso, aumenta as fibras

musculares do tipo 1 e melhora os parâmetros metabólicos associados com a

capacidade funcional (14, 18).

Os efeitos do exercício sobre o coração incluem melhora da perfusão

miocárdica, aumento do índice cardíaco e volume sistólico, diminuição da

frequência cardíaca de repouso, do estresse oxidativo e da inflamação; e pode

reduzir o tamanho do infarto do miocárdio e da fibrose (3, 27-29). Adaptações

celulares do miocárdio exercitado incluem o aumento do número de mitocôndrias,

aumento da contratilidade, espessura dos miócitos e da sensibilidade ao cálcio,

juntamente com o aumento da atividade e expressão de enzimas que contribuem

para a função cardíaca melhorada (21, 27, 30).

A hipertrofia fisiológica cardíaca em resposta ao exercício difere da

hipertrofia patológica. A hipertrofia patológica ocorre em resposta a uma série de

estímulos, como o infarto do miocárdio, doença valvar e cardiomiopatia dilatada.

Já a hipertrofia em resposta ao exercício físico (treinamento físico) é

caracterizada pela organização da estrutura cardíaca e função cardíaca normal ou

23

O exercício físico regular também demonstrou reduzir os fatores de risco

cardiovascular; por exemplo, hipertensão arterial e obesidade e está associado a

vários fatores benéficos cardiovasculares (31-33).

Estudos experimentais em ratos com IM indicam que os programas de

treinamento físico podem promover melhorias na morfologia e função cardíaca,

tolerância ao exercício e estado inflamatório, que são afetados pelo evento

isquêmico (3, 34). No entanto, o momento de quando iniciar o regime de exercício

ainda é controverso. Provavelmente devido aos diferentes desenhos

experimentais utilizados, incluindo diferentes tamanhos do IM, tamanho amostral

e programas de exercícios que variam em modo, tais como natação versus

corrida, intensidade e duração do treinamento. Todas essas diferenças entre os

experimentos podem contribuir para os diferentes achados (16).

1.4. Estatinas – Atorvastatina

As estatinas tem efeitos benéficos pleitrópicos no nível cardiovascular,

através da biodisponibilidade da síntese do óxido nítrico (NOS). Estão envolvidas

com ações anti-inflamatórias, antioxidantes, e anti-hipertróficas (15, 35-37). Sua

ação é proveniente da inibição da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A

redutase (HMG-CoA redutase). O efeitos das estatinas são mediados via bloqueio

da formação de mevalonato, que resulta na redução da síntese do colesterol (3,

24

Os efeitos benéficos das estatinas na doença arterial coronariana parecem

não ser limitados à sua capacidade de reduzir o colesterol plasmático. Vários

efeitos pleiotrópicos na aterosclerose, incluindo a redução da trombogenicidade

da placa, inibição da proliferação celular e migração, efeitos anti-inflamatórios e

melhora da função endotelial foram descritos (5, 42). Atualmente, existem sete

tipos de estatinas comercialmente disponíveis, tais como a lovastatina,

pravastatina, sinvastatina, fluvastatina, pitavastatina, rosuvastatina e atorvastatina

(43).

Estudos demonstraram que sinvastatina, um inibidor da HMG-CoA

redutase induziu a regressão da hipertrofia cardíaca e fibrose, reduziu os níveis

de ativação de quinases de sinalização sensíveis ao estresse (30, 44). Reverteu a

hipertrofia de cardiomiócitos e melhorou a função ventricular (9, 45). Descobertas

recentes mostraram que a atorvastatina pode melhorar a função cardíaca após o

IM, embora seu mecanismo de ação específico ainda precise ser determinado

(46, 47).

Apesar de desempenhar inúmeros efeitos benéficos sobre o sistema

cardiovascular, o tratamento clínico com a atorvastatina pode induzir alguns

reações adversas dose-dependentes como miopatias com índice estimado de 1 a

10%, e em casos mais raros podem evoluir para rabdomiólise (15, 43).

A atorvastatina é um fármaco membro da classe de drogas conhecidas

como estatinas, usadas para reduzir os níveis de colesterol sérico contribindo

para a redução de morbidade e mortalidade nas doenças cardiovasculares (15,

25

A combinação de exercício físico e da terapia com estatina também tem

sido utilizada para reduzir os riscos cardiovasculares, contribuindo para diminuir a

26

2. OBJETIVOS

Avaliar os efeitos do exercício físico e da atorvastatina na melhora do

remodelamento ventricular pós-infarto do miocárdio induzido em ratos de forma

experimental.

Objetivos específicos

Avaliar o remodelamento ventricular por meio da análise histológica do

conteúdo de fibrose, colágeno e dos cardiomiócitos.

Investigar os efeitos da administração da atorvastatina e da associação da

27

3. MATERIAIS E MÉTODO

3.1 . Protocolo Experimental

Este estudo foi realizado no laboratório de Isquemia e Reperfusão do

Miocárdio e laboratório de Técnica Cirúrgica, ambos localizados no Núcleo de

Medicina e Cirurgia Experimental da Faculdade de Ciências Médicas - UNICAMP,

e no laboratório de Bioquímica do Exercício – LABEX, localizado no Instituto de Biologia – UNICAMP, durante o período entre 2014 e 2018. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais- CEUA, sob o protocolo nº 3478-1

(Anexo I).

3.2. Desenho experimental

Foram estudados 108 ratos machos, da linhagem Wistar, com peso médio

de 197g e quatro semanas de idade. Os mesmos ficaram alojados em uma gaiola

no biotério com ciclo invertido de 12:12 horas claro-escuro, sendo das 18:00 ás

06:00 as luzes acesas, em temperatura ambiente de 22°C e com livre acesso a

ração e água. A esteira motorizada possui 12 pistas individuais e o treinamento foi

realizado em uma sala escura, com luz mínima.

Os animais foram submetidos à um protocolo de adaptação na esteira

durante duas semanas antes do procedimento cirúrgico para indução do infarto do

miocárdio ou Sham. Os animais correram na esteira sem inclinação, cinco dias na

semana de segunda-feira à sexta-feira, com velocidade de 10 metros/minutos

28

metros/minutos, durante 30 minutos. Os animais que não se adaptaram à corrida

na esteira foram excluídos do estudo.

Após a cirurgia, os animais descansaram por 1 dia, e no segundo dia de

pós-operatório foi iniciado o protocolo de treinamento durante oito semanas na

esteira para os animais do grupo treinado. O treinamento foi de três dias por

semana, intercalados com um dia de exercício e um dia de descanso). O

29

3.3 Procedimento Cirúrgico

Para realização da cirurgia para indução do IM ou Sham, os animais foram

conectados a um sistema de anestesia inalatória com isoflurano 2%, sem serem

entubados. Após realizarmos estímulos de reflexo para verificar a indução do

plano anestésico, foi realizada uma toracotomia esquerda seguida da dissecção

da musculatura. O tórax foi aberto no 4º espaço intercostal, e o coração ficou

exposto através da incisão torácica. Um fio de polipropileno 6.0 foi passado ao

redor da artéria interventricular anterior para ocluir a luz da artéria. O coração foi

inserido no tórax e a incisão fechada, figura 1. O procedimento durou cerca de

dois minutos.

A técnica foi descrita por Gao et al. (50), sendo feita rotineiramente no

laboratório de Isquemia e Reperfusão do Miocárdio e laboratório de Técnica

Cirúrgica com animais com 4 semanas de idade, com índice de mortalidade

operatória de aproximadamente 15% em virtude do IM, neste estudo os animais

foram submetidos à indução do IM com 6 semanas de idade e apresentou um

índice de mortalidade de 30%.

Os animais Sham foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico,

porém sem ligadura da artéria interventricular. O coração foi exposto e inserido no

30

A

B C

D E

Figura 1. Procedimento cirúrgico: Fotos em sequência do procedimento para indução do IM ou

Sham, observa-se na foto A- animal com sedação inalatória e realizada a antissepsia; B- toracotomia com dissecção da musculatura; C- coração exposto e passado o ponto na artéria interventricular anterior esquerda; D- incisão cirúrgica fechada e E- animal acordando da sedação, apenas com oxigenoterapia. Nos animais Sham não foi realizada a oclusão da artéria.

31

Após a adaptação na esteira os animais foram divididos aleatoriamente em

oito grupos e foram submetidos ao procedimento cirúrgico para indução do IM ou

Sham:

• Infarto do miocárdio (IM): Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico com ligadura da artéria interventricular

anterior. No primeiro dia após o procedimento cirúrgico foi

administrado 2 ml de placebo (solução fisiológica) por meio de

gavagem e mantido esse procedimento durante 8 semanas. Esses

animais eram colocados na esteira uma vez por semana durante 5

minutos a uma velocidade de 10 metros/minutos.

• Infarto do miocárdio treinamento (IM/TR): Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico com ligadura da artéria

interventricular anterior. No primeiro dia após o procedimento

cirúrgico foi administrado 2 ml de placebo (solução fisiológica)

diariamente por meio de gavagem. O protocolo de treinamento na

esteira foi de oito semanas e iniciou no segundo dia após o IM.

• Infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT): Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico com ligadura da artéria

interventricular anterior. No primeiro dia após o procedimento

cirúrgico foi administrado 10 mg/kg/dia de atorvastatina (Lipitor® – Pfizer), mascerada e diluída em 2 ml de solução fisiológica. Esse

procedimento foi feito diariamente por meio de gavagem durante 8

semanas. Esses animais eram colocados na esteira 1 vez por

32

• Infarto do miocárdio atorvastatina treinamento (IM/AT/TR): Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico com ligadura

da artéria interventricular anterior. No primeiro dia após o

procedimento cirúrgico foi administrado 10 mg/kg/dia de

atorvastatina (Lipitor® – Pfizer), mascerada e diluída em 2 ml de solução fisiológica 2 ml de placebo (solução fisiológica). Esse

procedimento foi feito diariamente por meio de gavagem. O

protocolo de treinamento na esteira iniciou no segundo dia e foi

realizado 3 dias por semana durante as 8 semanas.

• Sham (SHAM): Grupo Controle. Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico citado acima sem a ligadura da artéria

interventricular anterior. No primeiro dia após o procedimento

cirúrgico foi administrado 2 ml de placebo (solução fisiológica) por

meio de gavagem e mantido esse procedimento durante 8 semanas.

Esses animais eram colocados na esteira 1 vez por semana durante

5 minutos na velocidade de 10metros/minutos.

• Sham treinamento (SHAM/TR): Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico sem ligadura da artéria interventricular

anterior e foram submetidos aos mesmos procedimentos do grupo

IM/TR.

• Sham atorvastatina (SHAM/AT): No primeiro dia após o procedimento cirúrgico foi administrado 10 mg/kg/dia de

atorvastatina (Lipitor® – Pfizer), mascerada e diluída em 2 ml de solução fisiológica, diariamente por meio de gavagem e mantido

33

durante 8 semanas. Os animais treinaram na esteira 1 dia por

semana durante 5 minutos na velocidade de 10 m/minutos.

• Sham atorvastatina treinamento (SHAM/AT/TR): Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico sem ligadura da artéria

interventricular anterior e foram submetidos aos mesmos

procedimentos do grupo IM/AT/TR.

3.4 . Protocolo de treinamento na esteira

O protocolo de treinamento foi incremental (49) na esteira, sem inclinação e

está apresentado na Tabela 1.

Tabela 1: Protocolo de treinamento na esteira

Semanas Velocidade m/min Tempo de treinamento 1 12 20 2 12 30 3 15 45 4 15 60 5 20 60 6 20 60 7 22,5 60 8 22,5 60

m= metros, min= minutos

Os animais randomizados para os grupos não treinados (controle SHAM)

caminharam na esteira uma vez por semana durante 5 minutos a 10m/min com o

34

3.5 Teste de Exaustão

O teste de exaustão foi realizado em dois momentos. Após quatro semanas

de treinamento na esteira e após oito semanas de treinamento, figura 2.

Realizamos os dois testes com o objetivo de acompanhar longitudinalmente os

efeitos do treinamento. Antes da realização dos testes os animais foram pesados

em uma balança digital. Seguimos o seguinte protocolo de teste de performance:

• Esteira com 0º de inclinação e velocidade de 12 m/min durante 10 minutos, e a cada 2 minutos aumentamos a velocidade em 1 m/min até atingir 20

m/min. Depois disso a velocidade foi aumentada em 2 m/min a cada 3

minutos até atingir a exaustão. Foi considerado exaustão quando o rato for

35

A

B

Figura 2 Esteira: Fotos da esteira onde foi realizado o treinamento dos animais e o teste de

exaustão, figura A imagem lateral da esteira e imagem B animais correndo na esteira.

Para quantificar a performance animal utilizamos o modelo utilizado no artigo

de HOHL et al. (49), considerando todas as forças proporcionais ao peso corporal

e todas as velocidades proporcionais à velocidade de corrida; a potência

mecânica torna-se proporcional à massa x velocidade. Esta suposição permite

que a performance do rato seja medido através de uma quantificação proporcional

36

Pr = ƩPri = ƩmViTi= ƩmDi mD [equação 1]

Onde, Pr representa a performance (ou desempenho) do rato; Pri é a

performance em cada estágio, m é a massa corporal; Vi é a velocidade do

estágio; Ti é o tempo de execução no estágio; Di é a distância em cada estágio; e

D é a distância total percorrida pelo rato durante o teste. Para esta análise foi

utilizado o programa Matlab. A performance dos ratos (Pr) foi expresso em

quilograma/metros (kg/m).

3.6 Avaliações Hemodinâmicas

Após o teste de exaustão realizado na 8ª semana de

treinamento/tratamento, os animais foram levados ao laboratório de técnica

cirúrgica para realização do estudo hemodinâmico.

Os animais foram anestesiados com xilazina (5 mg/kg) e ketamina (75

mg/kg) através de injeção intraperitonial. Após um cateter de pressão/volume

(SPR- 838, Millar Instruments, Houston, USA) foi inserido na cavidade do VE

através da artéria carótida esquerda. Durante a inserção do cateter foi realizado o

monitoramento da pressão e volume para o correto posicionamento do mesmo. O

cateter foi acoplado em um conversor Power Lab 8/30 A/D (AD Instruments;

Mountain View, CA, USA), figura 3. Correções de condutância foram

determinadas pela injeção de 20-30μL de solução salina hipertônica (NaCl 30%). No final da obtenção dos dados para a análise hemodinâmica, foi realizado

a calibração da cubeta para correção do volume do VE. Foram analisadas as

variáveis: Volume Diastólico Final, Volume Sistólico Final, Constante de

37

Pressão/derivada de Tempo Máximo (dP/dT Máxima) e derivada de

Pressão/derivada de Tempo Mínimo (dP/dT Mínima).

No final do experimento os animais foram sacrificados com um plano

anestésico profundo, por meio de uma overdose de tiopental de sódio e o VE e os

pulmões foram isolados e separados das demais estruturas cardíacas e pesados,

a fim de identificar a presença de hipertrofia miocárdica através da relação com o

peso final dos animais.

38

3.7 Análises Histológicas

As amostras do VE dos animais foram armazenadas para verificar

conteúdo de fibrose, colágeno, e área transversal dos cardiomiócitos. Os cortes

histológicos apresentaram a espessura de 4μm e as imagens obtidas foram correspondentes à altura do músculo papilar.

Para obtenção do conteúdo de fibrose e colágeno foi avaliado o VE por

inteiro e também a região correspondente a parede contralateral do VE (região

não infartada). Para esta análise consideramos a região oposta do IM, de forma

excluir a região infartada e manter apenas a região remota para a análise.

Para análise do conteúdo de fibrose as lâminas foram coradas com

Tricrômio de Masson e para o estudo do conteúdo colágeno a coloração

Picrusirius Red,

Para a obtenção das imagens histológicas foi utilizado o microscópio de luz

óptica e luz polarizada (Imager A2 Axio Carl Zeiss, Germany), com lentes de

aumento de 2,5X e uma câmera acoplada no microscópio - AxioCam ICC 1 – Zeiss. A reconstrução dos fragmentos foi realizada com o uso do programa PTGui

(Rotterdam Netherlands, version 9.1.3). Para a quantificação de fibrose e

colágeno, foi utilizado um programa de análise quantitativa – Image ProPlus version 6.0 – USA.

A análise da área transversal de cardiomiócitos foi realizada para identificar

a presença de hipertrofia miocárdica, foi utilizada a técnica, descrita por Stefanon

et al. (14), medimos o tamanho da área transversal do cardiomiócito em

39

óptica utilizado para a obtenção das imagens para fibrose e colágeno, com lentes

de aumento de 40X. As lâminas foram coradas com colorações de hematoxilina e

eosina, e as imagens foram correspondentes à região não infartada. Para a

análise consideramos 12-15 campos, o que totalizou uma contagem de 74 células

por animal. A medição da área dos cardiomiócitos é dada em micrômetros, e foi

obtida através do contorno manual das células. As células que foram analisadas

apresentavam integridade estrutural em relação ao núcleo e citoplasma. O

programa usado para esta análise quantitativa foi o Image ProPlus: version 6.0 – USA.

40

A A1

B B1

Figura 4. Cardiomiócitos: Imagens representativas da análise do cardiomiócito, a figura A- animal

infarto do miocárdio (IM); A1- zoom da imagem A demonstrando o contorno da célula em micrômetros; B animal sham; B1 zoom da imagem B demonstrando o contorno da célula em micrômetros

41

3.5 Análises Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SAS

System for Windows (Statistical Analysis System), versão 9.4. SAS Institute Inc,

2002-2012, Cary, NC, USA. As variáveis contínuas foram expressas em média e

desvio padrão (DP ±). Além disso, para testar se as amostras apresentavam

distribuições normais, realizamos testes de D´Agostino-Pearson.

Análise descritiva com apresentação de medidas de posição e dispersão

para variáveis numéricas. Para comparação das medidas entre grupos foi

utilizado o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn para localização

das diferenças; e para comparação das medidas entre grupos. Para comparação

entre os grupos e tempos foi utilizada a ANOVA para medidas repetidas com

transformação por postos, seguida pelo teste de Tukey para localização das

diferenças, quando necessário. O nível de significância adotado para os testes

estatísticos foi considerado um valor de p< 0,05 (52, 53).

No fluxograma podemos observar o delineamento do estudo e a

42

Fluxograma e Randomização

Figura 5. Fluxograma da Randomização e total da amostra do estudo. Infarto do miocárdio (IM),

infarto do miocárdio treinado (IM/TR), infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT), infarto do miocárdio treinado atorvastatina (IM/TR/AT), sham (SHAM), sham treinado (SHAM/TR), sham atorvastatina (SHAM/AT) e sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT).

43

4. Resultados

Foram inclusos no estudo 108 animais, porém apenas 65 completaram

todo período de estudo. Foram excluídos seis animais por não se adaptaram a

esteira, 33 animais foram a óbito durante o procedimento cirúrgico (IM =6,

IM/TR=6, IM/AT=8, IAM/TR/AT=9, SHAM/AT=2 e SHAM/TR/AT=2). Três durante

o período de recuperação, até 48 horas após a cirurgia (IM/TR= 2 IM/AT=1) e um

após quatro semanas de treinamento (IM/AT=1), figura 5.

Para as avaliações morfométricas e hemodinâmicas foram estudados os

animais; IM (IM, n=7), IM treinamento (IM/TR, n=9), IM atorvastatina (IM/AT,

n=10), IM atorvastatina treinamento (IM/AT/TR, n=13), SHAM (SHAM, n=7),

SHAM treinamento (SHAM/TR, n=6), SHAM atorvastatina (SHAM/AT, n= 5),

SHAM atorvastatina treinamento (SHAM/AT/TR, n= 8).

A Tabela 2 apresenta os dados correspondentes ao peso dos animais,

peso do pulmão e peso do VE do grupo controle (SHAM) e do grupo infarto

experimental (IM) comparados com os grupos correspondentes em cada uma das

intervenções: treinamento, administração de atorvastatina e ambas as

intervenções.

Os dados mostram que nenhuma condição experimental, treinamento,

administração de AT, associação de ambas as condições e mesmo o IM

experimental afetou o peso do pulmão, e nem a relação peso pulmão/peso

corporal nos animais ou peso ventrículo/peso corporal dos animais SHAM.

Já o treinamento e a atorvastatina individualmente aumentaram

significativamente a razão entre PVE/peso dos grupos infartados comparado aos

44

peso do VE do grupo infartado. Por outro lado, quando administrados em conjunto

45

Tabela 2: Pesos dos animais, Ventrículos esquerdos e Pulmões

Pesos (g) Peso Inicial Peso Final Peso VE Peso Pulmão Peso VE/ Peso

Animal Peso Pulmão/ Peso Animal SHAM 253,3±28,01‡ 440,3±41,88 0,8882±0,2542 1,439±0,078 0,00212±0,0006† 0,003±0,0001 SHAM/TR 256,5±28,36‡ 413,0±50,60 0,7759±0,2252 1,543±0,144 0,00188±0,0005#† 0,003±0,0006 SHAM/AT 218,2±15,71 457,0±24,63 1,008±0,1260 1,452±0,126 0,00240±0,0005 0,003±0,0002 SHAM/TR/AT 242,3±21,04 475,4±54,58 1,096±0,2602 1,425±0,091 0,00248±0,0004 0,002±0,0002* IM 221,9±25,02 421,3±47,20 0,8024±0,0864 2,087±1,057 0,00180±0,0002 0,005±0,003 IM/TR 236,4±25,59 417,0±40,19 0,7892±0,0703 1,753±0.960 0,00343±0,0008* 0,004±0,002 IM/AT 224,3±22,84 448,0±32,17 1,162±0,3030# 1,889±0,765 0,00421 ±0,0006* 0,004±0,001 IM/TR/AT 216,5±25,79 447,9±44,79 1,068±0,2814 1,838±0,807 0,00234±0,0005† 0,004±0,002 Valor de P <0,01 0,08 <0,01 0,21 <0,05 <0,05

Tabela 2: Infarto do miocárdio (IM), infarto do miocárdio treinado (IM/TR), infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT), infarto do miocárdio treinado

atorvastatina (IM/TR/AT), sham (SHAM), sham treinado (SHAM/TR), sham atorvastatina (SHAM/AT) e sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT), g: microgramas. Os dados acima são expressos em média ± desvio padrão. *P<0,01 vs. IM, #P<0,01 vs. IM/TR, †P<0.01 vs. IM/AT e ‡P<0,01 vs. IM/TR/AT

46

Para a quantificação do conteúdo de fibrose, colágeno e a área

transversal dos cardiomiócitos, os animais foram divididos em grupo IM (IM, n=4),

IM treinamento (IM/TR, n=4), IM atorvastatina (IM/AT, n=6), IM atorvastatina

treinamento (IM/AT/TR, n=5), SHAM (SHAM, n=4), SHAM treinamento

(SHAM/TR, n=5), SHAM atorvastatina (SHAM/AT, n= 3), SHAM atorvastatina

treinamento (SHAM/AT/TR, n= 4).

A figura 6 representa as amostras histológicas dos processos hipertróficos

da parede contralateral do VE, realizada através da medição da área transversal

de cardiomiócitos.

Figura 6: Imagens histológicas dos cardiomiócitos. As imagens são representativas dos animais dos oito grupos respectivamente: A- sham (SHAM), B- sham treinado (SHAM/TR), C- sham atorvastatina (SHAM/AT), D- sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT), E- infarto do miocárdio (IM), F- infarto do miocárdio treinado (IM/TR), G- infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT) e H- infarto do miocárdio treinado atorvastatina (IM/TR/AT). As imagens estão coradas com colorações de hematoxilina e eosina. Escala de barras: 100μm

A figura 7 apresenta a quantificação da área transversal dos cardiomiócitos

nos grupos SHAM e IM nas diferentes intervenções.

A B C D E F G H ______ 100μm _____ 100μm ______ _100μm M 100μm ______ 100μm ______ 100μm ______ 100μm _____ 100μm _ 100μm _____ 100μm

47 SHA M SH AM /TR SH AM /AT SHA M/T R/A T _MI MI/T R MI/A T MI/A T/TR 0 100 200 300 400

# p<0.01

† p<0.01

‡

‡

_‡

_‡

* * p<0.05

p<0.01

Á

re

a

t

ra

n

s

v

e

rs

a

l

d

o

s

c

a

rd

io

m

ió

c

it

o

s

(

µ

m

)

Figura 7. O gráfico de barras representa a área transversal das células cardíacas nos grupos

estudados: grupo controle sham (SHAM), sham treinado (SHAM/TR), sham atorvastatina (SHAM/AT) sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT), Infarto do miocárdio (IM), infarto do miocárdio treinado (IM/TR), infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT) e infarto do miocárdio treinado atorvastatina (IM/TR/AT). **P<0.05 IM # P<0,01 vs. IM/TR, † P<0.01 vs. IM/AT, ‡ P<0,05 vs. grupos IM.

Observamos que os animais dos grupos SHAM apresentaram menor área

de cardiomiócitos quando comparados com os animais infartados. Nos grupos

infartados somente o treinamento em associação com a atorvastatina demonstrou

valores de áreas menores comparados aos animais que realizaram as

intervenções separadamente. Esse efeito não foi observado nos animais controle

(SHAM 217,1 ± 46,73 μm2_{, SHAM/TR 218,5 ± 40,63 μm}2_{, SHAM/AT 199,8 ± 30,82} μm2_{, SHAM/TR/AT 196,7 ± 35,35 μm}2 _{versus os grupos: IM 293,4 ± 65,90 μm2,} IM/TR 299,2 ± 72,99 μm2, IM/AT 299,0 ± 58,66 μm2 e IM/TR/AT 273,5 ± 66,97 μm2.

48

A Tabela 3 apresenta os dados hemodinâmicos dos animais. Avaliamos os

parâmetros de volumes e índices de relaxamento e contratilidade do VE após as

49

Tabela 3: Avaliações hemodinâmicas

Parâmetros Volume Sistólico

Final(uL) Volume Diastólico Final(uL) Frequência cardíaca (bpm) Tau (ms) dP/dt Máxima (mmHg/s) dP/dt Mínima (mmHg/s) SHAM 265,57±181,70 400,57±222,88 253,7±23,82 14,85±14,15 11100±5591 -10069±4178 SHAM/TR 141,67±167,90 *# 229,50±175,97 277,4±17,35 9,79±1,16 8940±3289 -9844±2379 SHAM/AT 452,82±165,88 486,22±207,51 273,4±44,46 21,86±25,59 17980±4665 -13732±3924 * SHAM/TR/AT 395,38±165,35 418,63±167,41 240,6±36,83 21,57±33,97 12972±7000 -11455±5803 IM 481,71±156,87 515,43±184,77 216,3±43,48 21,94±16,94 6111±2708 -4541±2352 IM/TR 491,89±191,56 564,33±233,98 255,2±69,31 16,51±6,57 9894±5914 -7975±5783 IM/AT 365,16±113,70 420,27±161,92 238,9±55,17 17,67±8,59 17001±10174 -12175±5650 * IM/TR/AT 376,79±116,04 407,38±112,45 240,3±51,57 16,76±10,51 22848±24044 -12594±5531 * Valor de P <0,01 0,12 0,06 0,31 0,07 <0,05

Tabela 3: Representa os dados hemodinâmicos obtidos após 8 semanas do IM. Infarto do miocárdio (IM), infarto do miocárdio treinado (IM/TR), infarto do

miocárdio atorvastatina (IM/AT), infarto do miocárdio treinado atorvastatina (IM/TR/AT), sham (SHAM), sham treinado (SHAM/TR), sham atorvastatina (SHAM/AT) e sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT), microlito (uL), batimentos por minuto (bpm), milissegundo (ms), milímetros de

50

Embora o infarto experimental (grupo IM) não tenha exibido valores com

diferença estatística significativa quando comparado ao grupo controle sham,

os volumes sistólico e diastólico final e a constante de relaxamento

isovolumétrico (Tau) foram maiores, enquanto as dP/dT Máxima e dP/dT

Mínima foram menores, indicando uma ligeira piora do quadro hemodinâmicos

com o IM experimental.

O treinamento diminuiu o volume sistólico final no grupo SHAM/TR,

efeito que não foi observado no grupo IM. A dP/dt mínima nos grupos

infartados tratados com atorvastatina, independente ou não de treinamento

demostraram valores maiores comparados aos animais IM. A frequência

cardíaca não demonstrou diferenças entre os grupos.

A Figura 8 apresenta os dados da análise histológica na porção do

músculo papilar para os percentuais correspondentes de colágeno

(A,B,C,D,I,J,L,M) e fibrose (E,F,G,H,N,O,P,Q) do VE nas diferentes situações

51

Figura 8: As imagens A e E são representativas dos animais do grupo controle sham A e E (SHAM), B e F sham treinado (SHAM/TR), C e G sham atorvastatina (SHAM/AT) D e H sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT). As imagens I e N são representativas do grupo infarto do miocárdio (IM), J e O infarto do miocárdio treinado (IM/TR), L e P infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT) e M e Q infarto do miocárdio treinado atorvastatina (IM/TR/AT). As imagens superiores estão coradas com coloração de Tricrômio de Masson para avaliar a porcentagem de fibrose, e as imagens inferiores estão coradas com coloração de Picrusirius Red para avaliar a porcentagem de colágeno.

A B C D 1000μm E F G H 1000μm I J L M 1000μm N O P Q 1000μm

52

A figura 9 apresenta a quantificação do percentual de fibrose (A) e deposição

de colágeno (B) no VE dos diferentes grupos experimentais.

(A) (B) SH AM SH AM /TR SH AM /AT SH AM /TR /AT IM IM/T R IM/A T IM/T R/A T 0 5 10 15

*

#

†

‡

‡

‡

‡

_‡

‡

‡

‡

‡

Figura 9. Os gráficos de barras representam a porcentagem Fibrose (A) e Colágeno (B) nos oito grupos estudados: grupo controle sham (SHAM), sham treinado (SHAM/TR), sham atorvastatina (SHAM/AT) sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT), Infarto do miocárdio (IM), infarto do miocárdio treinado (IM/TR), infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT) e infarto do miocárdio treinado atorvastatina (IM/TR/AT).. #P<0,01 vs. IM/TR, †P<0.01 vs. IM/AT e ‡P<0,01 vs. grupos IM.

Na figura 9 observamos que o grupo infarto experimental (IM)

apresentou maior percentual de fibrose e deposição de colágeno quando

comparado ao grupo SHAM. O grupo treinamento apresentou menor

porcentagem de fibrose comparado ao grupo infartado.

Nota-se que o treinamento associado ou não com a atorvastatina foi

eficiente para diminuir principalmente a ocorrência de fibrose no grupo

infartado.

Na avaliação do conteúdo de colágeno no VE (figura 9B) observou-se o

que os animais SHAM mostraram valores menores de conteúdo de colágeno

quando comparados aos infartados.

A figura 10 apresenta o percentual de fibrose (A) e deposição de colágeno

53 (A) (B) SH AM SH AM /TR SH AM /AT SH AM /AT /TR IM IM/T R IM/A T IM/A T/T R 0 2 4 6 8 * p<0.05 ‡ ‡ ‡ _‡ % F ib r o s e Co n t r a la t e r a l p<0.01 SH AM SH AM /TR SH AM /AT SH AM /TR /AT IM IM/T R IM/A T IM/T R/A T 0 1 2 3 * p<0.01 * % C o lá g e n o C o n tr a la te r a l

Figura 10. Os gráficos de barras representam a porcentagem de fibrose (Figura 9A) e colágeno (Figura 9B) na parede contralateral do VE nos oito grupos estudados: grupo controle sham (SHAM), sham treinado (SHAM/TR), sham atorvastatina (SHAM/AT) sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT), Infarto do miocárdio (IM), infarto do miocárdio treinado (IM/TR), infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT) e infarto do miocárdio treinado atorvastatina (IM/TR/AT). *P<0,05 vs. IM, **P<0,01 e ‡P<0,01 vs. grupos IM.

Avaliamos também o conteúdo de fibrose e colágeno na parede

contralateral do VE, e verificamos uma redução no conteúdo de fibrose nos

grupos sham quando comparamos com os grupos IM experimental. Nos grupos

IM experimental somente a associação entre a atorvastatina e o treinamento foi

efetiva em diminuir a fibrose do grupo infartado, figura 10A.

Quando avaliamos o conteúdo de colágeno na figura 10B, apenas o

grupo SHAM mostrou ter menor deposição de colágeno em relação aos

animais dos grupos IM, independente das intervenções.

O desempenho dos animais foi avaliado por meio de um teste

incremental até a exaustão, medido pela distância percorrida no teste. Foram

selecionados para esta análise todos animais incluídos no estudo, IM (IM, n=7),

IM treinamento (IM/TR, n=9), IM atorvastatina (IM/AT, n=10), IM atorvastatina

treinamento (IM/AT/TR, n=13), SHAM (SHAM, n=7), SHAM treinamento

54

treinamento (SHAM/AT/TR, n= 8). Utilizamos para estas análises o programa

Matlab.

Os dados da distância total percorrida pelos animais dos grupos SHAM e

IM nas diferentes intervenções estão apresentados na figura 11.

0 200 400 600 800 1000

IM

IM/TR

IM/TR/AT

IM/AT

SHAM/TR

SHAM

SHAM/AT

SHAM/TR/AT

D

is

tâ

n

c

ia

p

e

rc

o

rr

id

a

(

m

)

Figura 11. O gráfico representa a distância total percorrida no teste de exaustão realizado após 4 e 8 semanas de intervenções: (SHAM), sham treinado (SHAM/TR), sham atorvastatina (SHAM/AT) e sham treinado atorvastatina (SHAM/TR/AT), infarto do miocárdio (IM), infarto do miocárdio treinado (IM/TR), infarto do miocárdio atorvastatina (IM/AT), infarto do miocárdio treinado atorvastatina (IM/TR/AT). *P<0,01 vs. IM, #P<0,01 vs. IM/TR nas duas avaliações.

Observa-se que o grupo IM percorreu a menor distância nos dois testes

de exaustão (4ª e 8ª semanas). Esses resultados foram obtidos mesmo com a

caminhada semanal por 5 min a 10m/min para manter a adaptação com a

esteira rolante. Já o treinamento iniciado um dia após o IM experimental foi

eficiente para melhorar o desempenho dos animais, que exibiram uma

distância percorrida significativamente aumentada em relação ao grupo IM e

muito próxima da do grupo SHAM/TR. Nota-se que esse efeito foi significativo a

55

A administração de Atorvastatina não exerceu mesmo efeito, produzindo

56

5. DISCUSSÃO

Diversos grupos de pesquisa têm se dedicado a busca por alternativas

que auxiliem nas possíveis disfunções após IM analisando os efeitos de

diferentes intervenções, em um modelo de IM experimental em animais (21, 28,

39, 54-56). Dentre as possíveis intervenções, o exercício físico tem sido

considerado como estratégia não medicamentosa recomendada para pacientes

com doenças cardiovasculares (54, 57, 58). Estudos também demonstraram

que o treinamento físico e a administração de atorvastatina atuam na

prevenção das disfunções sistólicas e diastólicas da bomba cardíaca no RV (3,

9, 27, 56, 57, 59-61). A proposta deste estudo foi avaliar os efeitos do

treinamento físico e da atorvastatina, em conjunto e separadamente, na função

cardíaca e no RV após o IM. A originalidade do nosso estudo está na aplicação

de um protocolo de treinamento precoce, iniciado dois dias após o evento

isquêmico.

Após o IM, a presença de hipertrofia muscular está diretamente

relacionada com o desenvolvimento de insuficiência cardíaca (9, 62),

principalmente, quando ocorre hipertrofia desproporcional dos cardiomiócitos

devido a um aumento no comprimento da célula em regiões não infartadas

disfuncionais adjacente a um IM transmural crônico (63). Neste estudo foi

avaliado a hipertrofia cardíaca através de duas análises; do índice de massa

ventricular esquerda que é definido como a relação do peso ventricular

esquerdo ajustado pelo peso corporal do animal; e pela área transversal dos

57

O grupo IM não apresentou hiperfrofia do VE quando comparado com o

grupo SHAM controle após 8 semanas do procedimento experimental. No

entanto, os animais dos grupos IM/TR e IM/AT exibiram PVE/Peso animal

significativamente maiores quando comparado com o grupo IM. Esse efeito não

foi observado no grupo IM/TR/AT.

Na revisão de literatura os estudos são conflitantes. Existem aqueles

que mostraram que a atorvastatina (9), assim como o treinamento físico (63)

melhoraram a relação peso VE/peso corporal em modelo experimental de

animais infartados e também aqueles que não observam diferenças nesta

relação com o tratamento com a atorvastatina (64), ou com o treinamento físico

(23, 28, 65) . Estudos relataram que a atorvastatina diminui a área transversal

dos cardiomiócitos, quando administrado de uma a quatro semanas após a

indução do IM (9, 64), porém os autores avaliaram apenas o tratamento com a

atorvastatina e na presente pesquisa, o tratamento com a atorvastatina,

iniciada no segundo dia após a cirurgia, não mostrou efeito, só quando

associada ao treinamento.

Avaliando inicialmente os efeitos do IM no grupo experimental (IM) foi

observado que após oito semanas a função hemodinâmica nesse grupo se

apresentava ligeiramente diminuída, com uma tendência a um volume sistólico

e diastólico final maior e valores maiores no Tau e menores na dP/dT máxima,

mas sem diferenças significativas entre os grupos. Quando analisadas as

intervenções entre os grupos, a atorvastatina e a associação com o

treinamento houve uma melhora no relaxamento muscular e disfunção

58

Embora os dados sobre a hipertrofia cardíaca tenham mostrado

resultados modestos no grupo IM após 8 semanas do IM experimental, os

dados relacionados ao RV indicaram um aumento significativo no percentual de

fibrose e deposição de colágeno no grupo IM. O remodelamento da parede

contralateral do VE ocorreu, mas foi em menor magnitude. Esse dado era

esperado uma vez que estes animais não foram submetidos à ligadura da

artéria descendente anterior, sendo realizado apenas o procedimento cirúrgico.

Após o evento isquêmico o coração passa por mudanças na matriz extracelular

(3), desencadeada por uma reação inflamatória, perda de cardiomiócitos por

morte celular programada e proliferação dos tecidos fibrosos (12, 46, 66).

Nesse processo de RV pode ocorrer diminuição da função cardíaca, uma vez

que o colágeno está conectado a deficiências na complacência cardíaca,

função sistólica e diastólica, e no comportamento elétrico do coração. A fibrose

está relacionada com a degradação da função ventricular devido alterações

das funções contráteis e de relaxamento da câmara cardíaca. (20, 56, 67).

O efeito do treinamento levando a um menor depósito de fibrose quando

comparados aos grupos IM é claro. Já o uso da atorvastatina não teve efeito

sobre a fibrose, só quando associada ao treinamento. Tang et al. observaram

que a atorvastatina foi capaz de reduzir o conteúdo de fibrose e colágeno

quando administrada antes e depois do IM (5). No estudo de Li Mingyang et al.,

a atorvastatina foi capaz de reduzir o conteúdo de fibrose no VE mas não o

conteúdo de colágeno nos grupos IM (46). Os dados da presente pesquisa não

mostraram efeito da administração de 8 semanas de atorvastatina. Uma

provável explicação é que ela só tenha efeito em animais cujo IM induziu maior

59

Estudos com animais infartados mostram que o exercício físico tem

respostas favoráveis na deposição do colágeno intersticial e fibrose em

modelos animais e atua efetivamente na melhora do RV (11, 15, 18, 30, 57, 60,

63, 66, 68). É importante considerar que antes dos animais serem submetidos

a intervenção cirúrgica, eles realizaram uma adaptação na esteira.

Caminharam por duas semanas, apesar de ser por 15 -20 minutos, sem causar

estresse físico. Esse fato pode ter influenciado nos dados avaliados da função

hemodinâmica. Pesquisas anteriores relataram que o exercício aplicado antes

do IM atenua a disfunção do VE e remodelação cardíaca (21, 55).

Em uma minuciosa revisão literária, foram encontrados estudos com

treinamento físico em modelo de animais infartados (11, 15, 18, 20, 30, 57, 60,

63, 66, 68, 69). Nestes estudos, os autores aplicaram com um protocolo de

treinamento iniciado tardiamente à indução do IM. Outros estudos descrevem

protocolos com 1 semana até 4 semanas após o evento isquêmico, o que

diferencia da presente pesquisa que iniciou o protocolo de treinamento

precocemente, ou seja, no segundo dia após a indução do IM ou sham.

Xu et al. (11) mostraram que o exercício iniciado uma semana após a

indução do IM, cinco dias na semana durante oito semanas foi capaz de

diminuir o conteúdo de colágeno e atenuar a fibrose na matriz extracelular em

animais treinados comparados aos sedentários.

Alves et al. (60) demonstraram que o exercício físico iniciado após seis

semanas do IM melhorou a função cardíaca, os índices de dP/dt máx e dP/dt

min, atenuou a hipertrofia cardíaca e melhorou a deposição de colágeno no VE.

Nesta pesquisa observamos apenas diferenças no índice de DP/dt min, não