UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
LUCIANA FONTES DE OLIVEIRA
EMPREGO DE MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS EM ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE PARA
AVALIAÇÃO DE CACAU, SEUS DERIVADOS E ALFARROBA
CAMPINAS 2016
LUCIANA FONTES DE OLIVEIRA
EMPREGO DE MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS EM ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE PARA
AVALIAÇÃO DE CACAU, SEUS DERIVADOS E ALFARROBA
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA LUCIANA FONTES DE OLIVEIRA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. RONEI JESUS POPPI.
CAMPINAS 2016
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química Camila Barleta Fullin - CRB 8462
Oliveira, Luciana Fontes de,
OL4e OliEmprego de métodos quimiométricos em análises por cromatografia gasosa bidimensional abrangente para avaliação de cacau, seus derivados e alfarroba / Luciana Fontes de Oliveira. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
OliOrientador: Ronei Jesus Poppi.
OliTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Oli1. Quimiometria. 2. Cromatografia gasosa bidimensional abrangente. 3. Chocolate. 4. Razão de Fisher. I. Poppi, Ronei Jesus,1961-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Utilization of chemometrics methods in comprehensive two dimensional gas chromatography for evaluate cocoa, its derivatives and carob Palavras-chave em inglês:
Chemometrics
Comprehensive two dimensional gas chromatography Chocolate
Fisher ratio
Área de concentração: Química Analítica Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Ronei Jesus Poppi [Orientador] Edenir Rodrigues Pereira Filho Fabio Augusto
Juliana Azevedo Lima Pallone Marcio Pozzobon Pedroso Data de defesa: 06-12-2016
Programa de Pós-Graduação: Química
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi (orientador)
Prof. Dr. Edenir Rodrigues Pereira Filho (DQ - UFSCar)
Prof. Dr. Marcio Pozzobon Pedroso (DQ-UFLA)
Profa. Dra. Juliana Azevedo Lima Pallone (FEA – UNICAMP)
Prof. Dr. Fabio Augusto (IQ – UNICAMP)
A Ata de Defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Esse exemplar corresponde à redação final da Tese de doutorado defendida pela aluna LUCIANA FONTES DE OLIVEIRA, aprovada pela Comissão Julgadora em 06 de dezembro de 2016.
“Descoberta
Um dia descobri Que parar o tempo
Não era quebrar o relógio Ou segurar seus ponteiros Parar o tempo
Era deixar a vida Abraçar a morte
Mergulhar longe do alcance Dizendo Adeus
Afinal não se pode parar o tempo (não podemos)
Pelo contrário
O tempo é que nos pára E por assim ser
Deixo no tempo essa poesia Deixo no ar
Sem data de vencimento
Pois o homem não tem poder de ser eterno Mas a palavra pode parar no tempo!”
Agradecimentos
Agradeço primeiramente à Deus e minha família. À Deus pelo dom da vida e a minha família por sempre me apoiar em todas as decisões.
Ao Professor e orientador desse trabalho Ronei J. Poppi, pela paciência, confiança e por todos os ensinamentos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de Doutorado Concedida e pela Bolsa de Estágio Pesquisa no Exterior – Processos números: 2012/14695-8 e 2014/24724-0, respectivamente.
A Universidade Estadual de Campinas e ao Instituto de Química por toda infraestrutura disponibilizada.
Aos colegas do Laboratório de Quimiometria em Química Analítica (LAQQA) por todo apoio e proveitosas discussões em especial ao técnico Humberto por ser sempre muito prestativo e por toda ajuda.
Ao Prof. Dr. Fabio Augusto pela disponibilização da insfraestrutura do Laboratório de Cromatografia Gasosa e a Dra. Soraia C. G. N. Braga pela colaboração na realização do trabalho.
Ao Prof. Thomas Skov pela orientação e ensinamentos durante minha estadia na Dinamarca e a Universidade de Copenhagen pela oportunidade.
Aos professores da banca examinadora que disponibilizaram seu tempo para a avaliação do trabalho.
Ao meu namorado Daniel Miguel pelo amor, compreensão e paciência de sempre.
Às amigas de Campinas, Luciana Terra, Mariana, Raffaela, Michelly e Márcia por tornar tudo mais fácil e agradável.
Finalmente, agradeço a todos que contribuíram de alguma forma para realização desse trabalho.
Resumo
Nesta tese métodos quimiométricos foram aplicados em dados de cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC×GC) com microextração em fase sólida para estudos relacionados à qualidade de cacau, seus derivados e alfarroba. Neste sentido, quatro aplicações foram desenvolvidas. Na primeira aplicação planejamentos Plackett-Burman foram utilizados para avaliar as condições do cromatógrafo e do detector quando pequenas alterações eram realizadas em alguns parâmetros dos mesmos. Dentre as variáveis avaliadas, os efeitos calculados para a vazão da coluna e para a voltagem da fotomultiplicadora foram significativos para o cromatógrafo. Para a avaliação do detector o efeito da razão massa/carga (m/z) mínima foi significativo. A segunda aplicação, realizada em parceria com a Universidade de Copenhagen, versa sobre um novo desenvolvimento para alinhamento de cromatogramas GC×GC utilizando informações do espectro de massas, e paralelamente a isso foi realizada a análise exploratória de amostras de chocolates e alfarroba com a utilização de Análise de Componentes Principais (PCA). Foi possível verificar que quando se utiliza os espectros de massas durante o alinhamento mudanças da forma e áreas dos picos podem ser evitados o que é de extrema importância quando se aplica métodos de pré-processamento. Na terceira aplicação, a razão de Fisher foi aplicada para selecionar variáveis que são importantes para a diferenciação entre amostras de nibs (amêndoas de cacau) e amostras comerciais de chocolate. Em um primeiro momento foram avaliadas amostras de nibs advindas da Costa do Marfim e do Brasil e 15 compostos foram identificados como sendo importantes para separação. Em um segundo momento, a razão de Fisher foi utilizada para selecionar regiões importantes dos cromatogramas para diferenciação de amostras comerciais de chocolates, através da visualização do modo do espectro de massas do modelo PARAFAC (Análise de Fatores Paralelos), desenvolvido com as variáveis selecionadas pela razão de Fisher. Na quarta e última aplicação, também foram utilizadas as ferramentas razão de Fisher e PCA, com o intuito de estabelecer uma correlação entre dados de GC×GC e análise sensorial (Perfil Descritivo Otimizado) de amostras de chocolates comerciais com diferentes porcentagens de cacau. Neste sentido, os resultados do atributo amargor foram utilizados para definir as classes da razão de Fisher. Por fim, identificaram-se os compostos importantes que estavam relacionados a valores altos e baixos do atributo em questão.
Abstract
In this thesis chemometrics tools were applied in two-dimensional gas chromatography data for quality studies of cocoa, derivatives and carob. In this sense, four applications were developed. In the first one Plackett-Burman designs were used to evaluate the chromatograph and detector conditions after small variations in some chromatographic parameters. Among the evaluated variables, the calculated effects for the column flow and the voltage of photomultiplier were significant for the chromatography. For detector evaluation, the calculated effect of mass/charge (m/z) minimum ratio was significant. The second application, realized in partnership with the University of Copenhagen, refers to a new development to align GC×GC chromatograms using mass spectra information, and parallel to this was performed the exploratory analysis of chocolate and carob samples using Principal Component Analysis (PCA). In the third application, Fisher ratio was applied to select important variables for distinction of nibs (cocoa beans) and commercial chocolate samples. In a first moment, nibs samples from Ivory Coast and Brazil were evaluated and fifteen compound were important for the separation. In a second moment, the Fisher ratio was used to select important chromatogram regions to describe commercials chocolate samples, using the mass spectrum mode from the PARAFAC (Parallel Factor Analysis) model, developed with the selected variables using the Fisher ratios. In the fourth and final application Fisher ratio and PCA were used as chemometrics tools, in order to establish a correlation between GC×GC and sensory analysis (Optimized Descritive Profile) using chocolate samples with different cocoa percentages. In this sense, the bitter attribute results were used to define the Fisher ratio classes. Finally, the important compounds related with high and low values of the attribute in question were found.
Lista de Ilustrações
Figura 1.1 Etapas de processamento do cacau para obtenção de chocolate (adaptado de [5]). ... 20 Figura 1.2 Componentes principais básicos de um sistema de Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC). ... 25 Figura 1.3 Esquema geral simplificado para um modulador criogênico de quatro jatos. ... 27 Figura 1.4 Esquema de aquisição dos dados em GC×GC e transformação para gráficos de contorno (adaptado de [48]). ... 29 Figura 1.5 Estrutura de dados que podem ser obtidos em GC×GC e modos de desdobramento. ... 31 Figura 1.6 Modos de operação SPME: (a) extração direta e (b) SPME no headspace . ... 32 Figura 1.7 Esquema para elaboração de planejamentos Plackett-Burman – exemplo para um planejamento com 8 experimentos... 34 Figura 1.8 Mecanismo de funcionamento do algoritmo COW (adaptado de [77]). ... 38 Figura 1.9 Esquema geral para desdobramento dos dados e aplicação da Razão de Fisher em dados four-way. ... 43 Figura 1.10 Representação simplificada da Análise de Componentes Principais (PCA). ... 44 Figura 1.11 Representação de decomposição do modelo PARAFAC. ... 45 Figura 2.1 Cromatograma obtido para uma amostra de chocolate com as condições cromatográficas otimizadas e os respectivos compostos avaliados no planejamento Plackett-Burman. ... 52 Figura 2.2 Gráfico de meia curva normal para os efeitos principais do planejamento Plakett-Burmam para avaliação da robustez do sistema GC×GC-QMS (as variáveis “a” a “k” estão descritas na Tabela 2.3. ... 53 Figura 2.3 Resultados do teste de permutação para os fatores do planejamento. ... 55 Figura 2.4 Gráfico de meia curva normal para os efeitos principais do planejamento Plakett-Burmam para avaliação da robustez do detector (as variáveis “a” a “g” estão descritas na Tabela 2.4. ... 56 Figura 2.5 Resultados do teste de permutação para os fatores do planejamento para avaliação do detector. ... 57
Figura 3.1 Estratégia utilizada para o alinhamento de cromatogramas GC×GC. ... 63 Figura 3.2 Cromatogramas (a) GC×GC para uma amostra de chocolate proveniente da alfarroba e do cacau e (b) cromatogramas desdobrados para amostra de chocolate a partir de alfarroba e chocolate proveniente do cacau. ... 64 Figura 3.3 Intervalos e número de pontos movidos para uma amostra após o uso do algoritmo icoshift normal (a) e a versão modificada do algoritmo icoshift (b). ... 66 Figura 3.4 Cromatogramas GC×GC redobrados(a) dados originais, (b) depois do alinhamento usando o icoshift normal e (c) depois de alinhamento incluindo os espectros de massa. ... 67 Figura 3.5 (a) dados originais; (b) após o alinhamento com algoritmo icoshift normal; (c) após o alinhamento utilizando o algoritmo icoshift modificado (amostra 1 vermelho e amostra 2 azul). E espectros de massas para compostos identificados como 1 e 2. ... 68 Figura 3.6 Gráfico de escores da PCA (a) antes e (b) depois do alinhamento utilizando o algoritmo icoshift modificado. ... 69 Figura 3.7 Gráfico de pesos da primeira componente principal (a) pesos positivos sobrepostos em uma amostra de chocolate e (b) pesos negativos sobrepostos em uma amostra de alfarroba. ... 70 Figura 4.1 Esquema geral de alinhamento e utilização da razão de Fisher para dados desdobrados GC×GC-FID. ... 78 Figura 4.2 (a) Cromatograma típico de uma amostra de nibs proveniente da Costa do Marfim e (b) cromatograma típico de uma amostra de nibs proveniente do Brasil. ... 80 Figura 4.3 Região dos cromatogramas (a) dados brutos e (b) após a utilização do algoritmo COW já com os parâmetros otimizados. ... 81 Figura 4.4 Escores das PCAs com diferentes números de variáveis incluídas (a) Todas as variáveis incluídas no modelo, (b) corte em razão de Fisher igual a 3 (6137 variáveis incluídas), (c) corte em razão de Fisher igual a 7 (1778 variáveis incluídas) e (d) corte em razão de Fisher igual a 11 (959 variáveis incluídas). ○ representam amostras provenientes do Brasil e ● amostras da Costa do Marfim. ... 83 Figura 4.5 Razões de Fisher calculadas para todas as variáveis, a linha na horizontal mostra o corte em que houve uma boa separação na PCA (corte em 11). ... 84
Figura 4.6 Sobreposição das variáveis que foram significativas para a separação das classes (em vermelho) em um cromatograma típico. ... 84 Figura 4.7 Volumes dos picos normalizados para os compostos importantes para a separação entre as classes. Identificação dos compostos de acordo com a Tabela 4.2 ... 86 Figura 4.8 Gráfico das razões de Fisher em cada dimensão do tempo. ... 87 Figura 4.9 Amostra típica após a realização do corte estipulado com base nos valores de razão de Fisher. ... 88 Figura 4.10 Gráfico de consistência do núcleo para o modelo PARAFAC. ... 89 Figura 4.11 Escores dos componentes 1, 2 e 4 referente ao modo das amostras do modelo PARAFAC. ▼ % de cacau maior ou igual 70% e ӿ % de cacau menor que 70 %. ... 89 Figura 4.12 Espectros de massa recuperados pelo modelo PARAFAC. ... 90 Figura 5.1 Esquema geral de como as análises sensoriais de chocolates, a razão de Fisher e a PCA foram utilizadas para correlação com dados de GC×GC das mesmas amostras... 95 Figura 5.2 Gráficos de escores e pesos para a média dos valores obtidos para a análise sensorial. ... 98 Figura 5.3 (a) cromatograma típico de uma amostra importada (90% cacau) e (b) cromatograma típico de um chocolate brasileiro (45% cacau). ... 99 Figura 5.4 Gráfico das medias de todos os provadores para o atributo amargor. .. 100 Figura 5.5 Razões de Fisher 2D (em vermelho) inseridas sobre um cromatograma típico. ... 101 Figura 5.6 Escores das PCAs com diferentes valores de cortes (a) Todas as variáveis incluídas no modelo, (b) corte em 1x106 (c) corte em 0x5*107 e (d) corte
em 2x107. ▼ representam amostras com altos valores do atributo amargor e ●
amostras da com baixos valores do atributo amargor. ... 102 Figura 5.7 Gráfico de pesos redobrado para o modelo de PCA. ... 103 Figura 5.8 Gráfico de escores para PCA utilizando-se apenas as variáveis indicadas pela razão de Fisher. ▼ representam amostras com altos valores do atributo amargor ♦ valores intermediários do atributo amargor e ● amostras da com baixos valores do atributo amargor. ... 105
Lista de Tabelas
Tabela 1.1 Métodos para correção de desvios nos tempos de retenção em GC×GC. ... 40 Tabela 2.1 Variáveis avaliadas e níveis superiores e inferiores para avaliação do cromatográfo. ... 51 Tabela 2.2 Variáveis analisadas e níveis superiores e inferiores para avaliação do detector. ... 51 Tabela 2.3 Efeitos calculados (ordem crescente) para avaliação do cromatógrafo. . 53 Tabela 2.4 Efeitos calculados (ordem crescente) para avaliação da robustez do detector. ... 56 Tabela 2.5 Efeitos significativos para os experimentos considerando a forma de avaliação. ... 58 Tabela 3.1 Amostras utilizadas e quantidade de réplicas analisadas. ... 62 Tabela 3.2 Identificação tentativa dos pesos positivos e negativos da análise de componentes principais. ... 71 Tabela 4.1 Resultados da otimização dos parâmetros a serem inseridos no algoritmo COW. ... 81 Tabela 4.2 Compostos identificados como importantes para a separação das amostras do Brasil e da Costa do Marfim. ... 85 Tabela 5.1 Porcentagem de cacau das amostras de chocolates comerciais utilizadas. ... 94 Tabela 5.2 Média dos valores obtidos por todos os julgadores dos atributos avaliados. ... 97 Tabela 5.3 Compostos identificados como importantes para a separação das classes. ... 103
Lista de acrônimos
1D Primeira dimensão 1t
R Tempo de retenção na primeira dimensão
2D Segunda dimensão
2tR Tempo de retenção na segunda dimensão
CAR Carboxen
DI Diâmetro interno DVB Divinilbenzeno
EP Erro padrão
FID Detector por ionização na chama (flame ionization detector) GC Cromatografia Gasosa
GC×GC Cromatografia gasosa bidimensional abrangente HP5 Fase estacionária 5% fenil - 95% dimetilsiloxano
HS-SPME Microextração em fase sólida através da extração do headspace
Hz Hertz
LBG Goma de alfarroba (Locust Bean Gum) m/z Razão massa / carga
ME Margem de erro
PARAFAC Análise de Fatores Paralelos (Factor Parallel Analysis)
PCA Análise de Componentes Principais (Principal Component
Analysis)
PDMS Polidimetilsiloxano PM Período de modulação
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 19
1.1CACAU E SEUS DERIVADOS ... 19
1.1.1 Alternativas ao chocolate - alfarroba ... 23
1.2CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE ... 24
1.2.1 Estrutura dos dados em cromatografia gasosa bidimensional abrangente ... 29
1.2.2 Micro extração em fase sólida (SPME) ... 31
1.3FERRAMENTAS QUIMIOMÉTRICAS ... 33
1.3.1 Planejamentos Plackett-Burman ... 33
1.3.2 Métodos de Alinhamento ... 37
1.3.3 Métodos para seleção de variáveis ... 41
1.3.3.1 Razão de Fisher ... 41
1.3.3.1 Razão de Fisher para dados four-way ... 42
1.3.4 Métodos de Decomposição de dados ... 43
1.3.4.1 Análise de Componentes Principais (PCA) ... 43
1.3.4.2 Análise de Fatores Paralelos (PARAFAC) ... 45
1.4 Objetivos ... 46
CAPÍTULO 2. PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS PARA AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ DO CROMATÓGRAFO E DO DETECTOR EM CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE ... 48
2.1INTRODUÇÃO ... 48
2.2METODOLOGIA ... 49
2.2.1 Amostras e extração dos compostos voláteis ... 49
2.2.2 - Condições cromatográficas ... 50
2.2.3 Avaliação da robustez do cromatógrafo e do detector utilizando planejamentos Plackett-Burman ... 50
2.3RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 52
2.3.1 Avaliação da robustez do cromatógrafo e do detector utilizando planejamentos Plackett-Burman ... 52
CAPÍTULO 3. ALINHAMENTO EM GC×GC CONSIDERANDO OS ESPECTROS DE MASSAS E ANÁLISE EXPLORATÓRIA DE
AMOSTRAS DE CHOCOLATE E ALFARROBA ... 61
3.1INTRODUÇÃO ... 61
3.2METODOLOGIA ... 62
3.2.1 Amostras, condições de extração e condições cromatográficas ... 62
3.2.2 Organização dos dados para utilização do icoshift modificado . 63 3.2.3 Identificação tentativa dos compostos importantes ... 64
3.3RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 64
3.4CONCLUSÕES PARCIAIS ... 72
CAPÍTULO 4. USO DA RAZÃO DE FISHER EM DADOS DE CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE ... 75
4.1INTRODUÇÃO ... 75
4.2METODOLOGIA ... 76
4.2.1 Amostras de nibs e extração dos compostos voláteis ... 76
4.2.2 Amostras de chocolates e extração dos compostos voláteis .... 77
4.2.3 Alinhamento dos cromatogramas GC×GC-FID ... 77
4.2.4 Descrição geral do procedimento adotado para diferenciação de amostras de nibs de diferentes origens ... 78
4.2.5 Descrição geral do procedimento adotado para diferenciação de amostras de chocolates comerciais ... 78
4.2.6 Identificação dos compostos ... 79
4.3RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 79
4.3.1 - Uso da razão de Fisher e Análise de Componentes Principais em dados de GC×GC para diferenciação de nibs de diferentes origens ... 79
4.3.2 - Uso da razão de Fisher (four-way) e PARAFAC em dados de GC×GC-QMS para diferenciação de amostras de chocolates ... 86
4.4CONCLUSÕES PARCIAIS ... 91
CAPÍTULO 5. CORRELAÇÃO ENTRE DADOS GC×GC E ANÁLISE SENSORIAL DE CHOCOLATES ... 93
5.1INTRODUÇÃO ... 93
5.2METODOLOGIA ... 94
5.3RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 96
5.3.1 Testes sensoriais ... 96
5.3.2 Correlação entre dados GC×GC e análise sensorial de amostras de chocolates ... 99 5.4CONCLUSÕES PARCIAIS ... 105 CONCLUSÕES ... 108 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 111 ANEXOS ... 124 Anexo 1 ... 125 Anexo 2 ... 127 Anexo 3 ... 128
CAPÍTULO 1
Capítulo 1. Introdução e objetivos
1.1 Cacau e seus derivados
Apreciado e consumido mundialmente o chocolate é produzido após a realização do processamento da fruta original, o cacau, que contém os precursores do sabor e aroma únicos gerados nas diferentes etapas da cadeia produtiva. Os principais tipos de cacau são três: Criollo, Forasteiro e Trinitario, sendo este último um híbrido entre os dois primeiros [1].
Todas as árvores são do gênero Theobroma e espécie Theobroma cacao L., que possuem um porte relativamente pequeno, 12 – 15 m de altura, e crescem normalmente abrigadas por árvores intercaladas em regiões com temperaturas e precipitações pluviométricas elevadas [1]. O cacau tipo Forasteiro abrange a maior parte de todo cacau cultivado mundialmente, aproximadamente 95% [2].
O controle adequado das diferentes etapas de processamento do cacau é essencial para obtenção de um produto final de qualidade. Desde a fermentação, primeira etapa de processamento do cacau e responsável pela redução do amargor e adstringência [3], até a temperagem (última etapa do processo de produção do chocolate), quanto maior o controle das variações que podem estar presentes, melhor será a qualidade do produto obtido.
A Figura 1.1 mostra todas as etapas que estão envolvidas no processamento do cacau para obtenção do chocolate. Os frutos de cacau passam primeiramente pelo processo de fermentação, que podem ser realizados de diferentes formas (pilhas, caixas, plataformas e cestos) e duram normalmente de 2 a 8 dias dependendo do tipo de cacau [4].
Figura 1.1 Etapas de processamento do cacau para obtenção de chocolate (adaptado de [5]).
Em seguida, as amêndoas já fermentadas devem ser secas, limpas e torradas. Assim como o processo de fermentação, o processo de torra das amêndoas é primordial. É sabido que aminoácidos e açucares redutores na etapa de fermentação são convertidos a pirazinas via reação não enzimática de Maillardi durante a torra [2,6]. Além disso, as etapas de fermentação e torra são primordiais na geração dos sabores desejáveis do chocolate.
A próxima etapa normalmente envolve a separação da casca e gérmen e também a quebra das amêndoas para fragmentos menores, que neste estágio são denominados nibs de cacau. Os nibs passam então por um processo de moagem em que fragmentos ainda menores são gerados obtendo-se a massa de cacau. Por fim, a massa de cacau é prensada para obtenção de manteiga de cacau, cacau em pó ou chocolate.
Fermentação do cacau
Secagem, limpeza e torração das amêndoas
Quebra e separação da casca e gérmem para obtenção dos nibs Moagem para obtenção da massa de cacau
Prensa da massa de cacau para obter manteiga de cacau que é adicionada em dois processos Adição de açúcar e gordura com ou sem leite em pó Adição de solução de leite e açúcar e desidratação Refino Adição de gordura ou lectina - conchagem Chocolate
A grande fração de cacau produzido mundialmente é do tipo bulk (também chamado basic – básico ou comum), proveniente normalmente de árvores do tipo Forasteiro, utilizados para fabricação em geral de chocolates ao leite e amargos, massa de cacau e manteiga de cacau. Nesse momento, é importante ressaltar que o termo bulk não implica em um cacau de menor qualidade [1,5].
Cacaus do tipo fino, fine (também chamado flavour) são provenientes de árvores do tipo Trinitario ou Criollo e apresentam alguma diferenciação ao longo de sua cadeia de produção (que pode ser atestada pelo comprador): crescimento em uma região específica, métodos de cultivo ambientalmente corretos (por exemplo, cultivo orgânico), uma variedade específica de cacau, entre muitos outros [1,5]. E recebe esse nome por apresentar preços mais altos que o cacau do tipo bulk, normalmente atribuídos aos sabores e cores diferenciados.
Tanto o cacau quanto seu principal subproduto, chocolate, tem sido foco de intenso estudo e com os mais diversos objetivos. Neste sentido podem ser citados trabalhos que avaliam as diferentes etapas de processamento (fermentação, secagem e torra) e a variação da composição em relação a compostos voláteis e não voláteis [7–12].
O perfil de compostos voláteis foi estudado ao se variar o tempo de fermentação e a temperatura da secagem por Rodriguez-Campos et al. [4]. Os autores identificaram diversas classes de compostos importantes para qualidade do cacau, entre eles ésteres, pirazinas e cetonas. Com os resultados obtidos chegou-se a temperatura ótima de secagem de 70º C precedido por uma fermentação de 6 dias.
Os processos de fermentação e secagem do cacau também foram analisados em relação a compostos voláteis e não voláteis [13], concluindo-se que a oxidação do composto 3-metil-1-butanol para acetato de 3-metil-1butanol pode ser utilizado para avaliar o seu grau de fermentação. Além disso, os ácidos acético e isobutírico podem ser considerados como importantes na qualidade do aroma durante a etapa de secagem. Compostos voláteis e não voláteis também foram investigados por Albak & Tekin [14] em que cafeína, teobromina, polifenóis foram investigados nas etapas de conchagem de chocolates.
Ainda em relação às diferentes etapas de processamento o impacto da inoculação de leveduras nos processos de fermentação e a relação nos compostos voláteis gerados foram investigados, em comparação com processos sem
inoculação. Além disso, o chocolate obtido também foi avaliado de acordo com alguns atributos sensoriais. A inoculação tem influência no perfil microbiano, afeta a composição volátil e consequentemente afeta as características sensoriais, resultando atributos mais intensos em relação ao amargor e notas frutais [15].
Muitos trabalhos também buscam atribuir as diferentes características do cacau à suas distintas origens [16–19]. Sete países são considerados os maiores produtores de cacau (aproximadamente 90% cultivo mundial): Costa do Marfim, Gana, Indonésia, Nigéria, Camarões, Brasil e Equador, sendo que a Costa do Marfim cultiva 40% do total e é considerado o maior produtor [5]. Obviamente a origem do cacau envolve diversos fatores que contribuirão para a formação de cacaus e consequentemente chocolates com composições diferentes.
Neste sentido, a classificação de amêndoas de cacau, realizada com base em diversas características físico-químicas e químicas entre elas, peso da amêndoa, tamanho, porcentagem de gordura e proteína, além do conteúdo de polifenóis e capacidade antioxidante foram utilizadas em conjunto com ferramentas quimiométricas como a Análise de Componentes Principais (PCA – Principal
Component Analysis) para classificação de amostras oriundas de diferentes regiões
do México. As análises multivariadas permitiram encontrar a formação de 6 grupos de acordo com as características químicas das amostras [20].
Também em outro trabalho, a diferenciação de chocolates produzidos com cacau de diferentes origens foi realizada com base na fração volátil obtida por cromatografia gasosa e com auxílio de ferramentas quimiométricas [18], sendo possível identificar os compostos importantes relacionados com as diferentes origens. Além disso, também são encontrados trabalhos que avaliam etapas de processamento do cacau e diferentes origens concomitantemente [16,19]. Ainda podem ser encontrados trabalhos que abrangem a composição volátil do chocolate em função da origem botânica, origem geográfica, relação com a marca e processo de formulação; sendo indispensável o uso de ferramentas quimiométricas nesse caso [21]
Mais especificamente em relação à fração volátil de cacau e derivados, já foram descritos aproximadamente 600 compostos voláteis na composição do cacau e chocolate, incluindo as etapas de fermentação, secagem, torra e conchagem [5], e muitos estudos são descritos no sentido da avaliação, incluindo diferentes técnicas [22–24].
Recentemente, Qin et al. [25] avaliaram a composição da fração volátil de sementes de cacau dos tipo Criollo, Trinitario e Forasteiro. Através de análise de componentes principais foi possível identificar os compostos relacionados a cada tipo de cacau, embora poucos compostos são exclusivos de um grupo. Valdez e Gutiérrez[26] construíram um nariz eletrônico (homemade e-nose) que em conjunto com ferramentas quimiométricas foi capaz de identificar chocolates comerciais em barra com diferentes características como adição de açúcar ou não, chocolates amargos, ao leite, com diferentes aditivos entre outros.
Durme et al. [27] utilizaram um sistema on line para avaliação do processo de fermentação do cacau que foi hifenado com cromatografia gasosa. O objetivo dos autores foi verificar se as amêndoas iriam produzir um nível satisfatório de aromas organolépticos importantes (como pirazinas e aldeídos) de uma meneira rápida e objetiva.
Para avaliação do cacau de uma maneira mais abrangente Araújo et al. [28] propuseram um índice chamado Cocoa Quality Index que busca entender quais parâmetros podem afetar a qualidade do cacau. No sentido de traceabilidade, neste caso para chocolates, ainda pode ser citado o trabalho de Saltini & Akkerman [29].
Por fim é importante ressaltar que inúmeros outros estudos relacionadas a qualidade de cacau e derivados como um todo foram desenvolvidos [8,30–35] e devido a complexidade da cadeia de produção, desde a colheita do cacau até a produção do chocolate, estudos que contribuam para um melhor entendimento de umas das partes do processo são de grande importância.
1.1.1 Alfarroba
As duas maiores características que apresentam um diferencial para o chocolate são o sabor e a textura. Em relação a textura, o chocolate deve derreter rápido na boca e em relação ao sabor há apenas poucas chances de se encontrar compostos com sabor natural tão complexo, uma vez que cada aroma após a torra consiste em centenas de compostos que interagem e se aprimoram mutuamente [5]. Indústrias alimentícias têm buscado produtos alternativos que possuam características próximas as do cacau que devem por si só produzir o aroma e a
sensação do cacau ou chocolate e então serem utilizadas como potenciais substitutos [36].
A alfarroba (Ceratonia Siliqua L.) é considerada uma planta típica de países mediterrâneos, que cresce principalmente na Espanha, Itália, Portugal, entre outros [37]. Os dois constituintes principais da vagem de alfarroba são polpa (90%) e as sementes, sendo que a poupa de alfarroba possui um alto teor de açúcar (48-56%) incluindo sacarose, glicose, frutose e maltose [38,39].
A alfarroba pode ser utilizada como matéria prima para a indústria de cosméticos e alimentos, principalmente na produção da chamada goma de alfarroba (locust bean gum -LBG) que é um emulsificante/estabilizador. Além disso, a alfarroba possui um gosto doce próprio com sabor e aparência similares ao do chocolate e frequentemente é utilizada como substituto para cacau/chocolate. Cabe ressaltar que a alfarroba não possui cafeína ou teobromina em sua constituição [40,41].
A literatura apresenta alguns trabalhos sobre a caracterização dos compostos não voláteis de alfarroba [42–45], entretanto os trabalhos que avaliam a fração volátil [37,38,41,43] são escassos na literatura.
1.2 Cromatografia gasosa bidimensional abrangente
A cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC×GC) descrita originalmente por Liu e Philips [46] no ano de 1991 tem os princípios básicos e conceitos bem estabelecidos. Os componentes principais que formam um sistema GC×GC é descrito na Figura 1.2, sendo eles injetor, coluna primária, modulador, coluna secundária e detector. A interface, conhecida como modulador continuamente coleta o efluente da coluna primária e transfere para o início da coluna secundária como um pulso e o intervalo entre as transferências é conhecido como período de modulação (PM) [47].
Figura 1.2 Componentes principais de um sistema de Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC).
A amostra é inicialmente injetada na primeira coluna através de injetor padrão para Cromatografia Gasosa (GC). Na maioria das aplicações as amostras são primeiramente separadas em uma coluna de 15 - 30 m (comprimento) x 0,25 - 0,32 mm (diâmetro interno - DI) x 0,1 -1 µm (filme) contendo uma fase estacionária não polar. Após o período de modulação cada fração individual é injetada em uma coluna mais curta e estreita (fast GC) de dimensões tipicamente 0,5 – 2 m (comprimento) x 0,1 mm (diâmetro interno - DI) 0,1 µm (filme) contendo uma fase estacionária com polaridade média ou uma fase seletiva [48]. É desejável que as fases estacionárias das colunas sejam distintas, de forma que os mecanismos de separação sejam ortogonais e compostos co-eluídos na primeira podem ser separadas na segunda eluição [49].
Uma das vantagens da utilização de uma coluna não polar como fase estacionária para primeira dimensão é o fato de a separação nesse caso ser governada apenas pela volatilidade, ou seja, apenas a pressão de vapor interessa, e mais interessante ainda é o fato de que há muita informação disponível sobre o comportamento de um grande número de compostos em colunas não polares em cromatografia gasosa convencional (1D-GC), e isto pode ser utilizado para otimizar a separação na primeira dimensão [50].
Para a segunda dimensão uma variedade de fases pode ser utilizada dependendo da interação analito – fase estacionária desejada. Uma vez que na
Injetor Coluna Primária
Modulador
segunda dimensão ocorre uma separação isotérmica (por ser uma separação muito rápida), não haverá contribuição da pressão de vapor dos analitos nessa separação e, portanto apenas interações específicas com a fase estacionária conduzirão a separação e a ortogonalidade desejável será obtida [48]. Um dos principais benefícios da ortogonalidade entre as duas colunas é a estruturação dos cromatogramas para classes homólogas, congêneres e isômeros [47].
A seleção do jogo de colunas depende principalmente dos compostos a serem analisados e das condições cromatográficas desejáveis, como maior resolução ou maior uso do espaço cromatográfico e normalmente o que é feito é a avaliação da combinação de diferentes jogos de colunas e a escolha do mais adequado [51,52]. Como mencionado anteriormente, uma combinação muito utilizada é a combinação de 1D apolar ou pouco polar (polidimetilsiloxano ou 5% fenil-polimetilsiloxano) e uma 2D mais polar (seletiva) como polietilenoglicol ou 50% fenil-polidimetilsiloxano [53].
Os moduladores são componentes únicos em GC×GC sendo objeto de intenso desenvolvimento [47]. Sua principal função é reconcentrar e reinjetar estreitas frações do eluato da primeira para a segunda coluna. A separação na segunda dimensão deve ser finalizada antes da liberação e injeção da fração seguinte evitando o efeito conhecido como wraparound, fenômeno em que um pico da segunda dimensão é eluído em um período de modulação seguinte, causado pelo tempo de retenção do composto na segunda dimensão exceder o período de modulação [54,55]. O período de modulação (PM) pode ser entendido como a duração de um ciclo completo de modulação que é igual ao tempo entre duas injeções sucessivas na segunda coluna [48].
Para que a modulação seja eficaz esta deve ocorrer com frequência e em toda a análise. Cada composto eluido da primeira dimensão deve ser amostrado de 3 a 4 vezes para que a esta seja preservada [54].
Na literatura são descritos diversos tipos de moduladores e em geral estes são classificados de acordo com o princípio operacional. Uma descrição mais detalhada sobre moduladores que podem ser empregados em GC×GC está descrita nos trabalhos de Edwards et al [54] e Tranchida et al [56]. Nesta tese será discutido brevemente o modulador criogênico de quatro jatos apresentado de forma simplificado na Figura 1.3. Moduladores criogênicos de jato frio estão sendo cada vez mais empregados devido a robustez e eficiência no resfriamento, que nesse
caso é realizado com a utilização de CO2 ou N2 líquidos lançados diretamente na
coluna, outra vantagem é que estes moduladores não apresentam partes móveis[53].
Figura 1.3 Esquema geral simplificado para um modulador criogênico de quatro jatos.
Como pode ser observado na Figura 1.3, que representa um período de modulação completo, um primeiro jato frio aprisiona os compostos eluidos da primeira coluna, em seguida um jato quente faz com que estes compostos sejam liberados. Após isso, um segundo jato frio reconcentra os componentes e estes são reinjetados na segunda coluna através da aplicação de outro jato quente.
Após o período de modulação as bandas cromatográficas enviadas para segunda coluna são fatias da banda cromatográfica de eluição da primeira dimensão e são muito estreitas, usualmente da ordem de 10 – 150 ms de largura dependendo do tipo de modulador e do período de modulação [57]. Como consequência as bandas moduladas serão significativamente mais estreitas e a utilização de detectores com altas taxas de aquisição são desejáveis. Desta forma, detectores para cromatografia gasosa bidimensional abrangente devem apresentar um
1D 2D Aprisionamento Dessorção Dessorção Aprisionamento Aprisionamento Dessorção Aprisionamento Dessorção
pequeno volume interno e a taxa de aquisição deve ser de pelo menos 100 Hz (aquisições por segundo) [58].
Os detectores por ionização em chama (FID – flame ionization detector) apresentam taxas de aquisição entre 50 a 300 Hz e são muito utilizados em GC×GC [58]. Em um detector FID o efluente saindo da coluna é direcionado para uma pequena chama de ar/hidrogênio. A maioria dos compostos orgânicos produz íons e elétrons quando pirolizados à temperatura da chama. A detecção envolve o monitoramento da corrente produzida pela coleta desses portadores de carga. Uma vez que o detector responde ao número de átomos de carbono que entram no detector por unidade de tempo ele é um dispositivo sensível à massa e não à concentração. Além disso, detectores FID apresentam alta detectabilidade, larga faixa linear de resposta e baixo ruído [59].
Entretanto, detectores FID não fornecem informações estruturais dos compostos e para este propósito espectrômetro de massas são indispensáveis. Espectrômetros de massa por tempo de vôo (TOFMS - Time of Flight Mass
Spectrometry) apresentam uma elevada taxa de aquisição com até 500 espectros
adquiridos por segundo e têm sido amplamente utilizados para detecção em GC×GC [60–62]. Porém o alto custo os torna proibitivo para muitos laboratórios. Espectrômetros de massas com analisadores quadrupolares (QMS) podem ser uma alternativa interessante uma vez que estão disponíveis na maioria dos cromatógrafos.
Os analisadores QMS possuem quatro barras cilíndricas e paralelas que atuam como eletrodos. Para obter um espetro de massa o íon é acelerado para o espaço entre as barras por uma diferença de potencial. Apenas os íons que têm valores de m/z em um intervalo limitado alcançam o transdutor para que em seguida ocorra o processamento dos sinais [59]. Embora o número de espectros coletados por segundo em um QMS seja baixo, pode-se diminuir a faixa de massas analisadas e alcançar taxas de aquisições próximas a 20 Hz e sobre essas condições 3 a 4 pontos vão definir um pico oriundo da segunda dimensão o que pode ser considerado suficiente para identificação da maioria dos compostos [53,58].
Devido a todas as características as vantagens que podem ser listadas da GC×GC são: desempenho superior de separação de compostos voláteis, aumento da resolução global, capacidade máxima de pico (número máximo de compostos que podem ser separados em uma mesma análise), além do aumento da
detectabilidade uma vez que ao invés de eluir um pico largo e pouco intenso, cada analito vai apresentar uma série de picos estreitos e intensos [47].
1.2.1 Estrutura dos dados em cromatografia gasosa bidimensional abrangente
Uma característica peculiar da cromatografia gasosa bidimensional abrangente é a estruturação dos dados. A Figura 1.4 mostra de forma geral como os dados são adquiridos e como os gráficos de contorno são gerados. Neste caso não estão sendo considerados os espectros de massa se a detecção é realizada por q MS ou TOFMS.
Figura 1.4 Esquema de aquisição dos dados em GC×GC e transformação para gráficos de contorno (adaptado de [48]).
A princípio, como apenas um detector está disposto no final da corrida cromatográfica, a aquisição dos dados é obtida como para cromatografia gasosa unidimensional como mostrado na parte (B) da Figura 1.4. Para um melhor entendimento de como os gráficos de contorno (parte (C) da Figura 1.4) são gerados
gráfico de contorno 2D cromatograma 1D
final da primeira dimensão
cromatograma bruto 2D final da segunda dimensão
transformação gráfico 3D (A) (B) (C) (D) (E)
é preciso conhecer o período de modulação e a taxa de aquisição do detector utilizado.
Supondo uma corrida cromatográfica (GC×GC) de 40 minutos (2400 s) realizada à uma taxa de aquisição em um QMS, por exemplo, de 25 Hz e com período de modulação de 6s o cromatograma final obtido deve apresentar 60000 pontos (25Hz *2400s). Se o período de modulação é de 6s e a taxa de aquisição 25 Hz a dimensão da segunda separação será de 150 pontos (6s * 25 Hz) e para que o diagrama possa ser montado, a primeira dimensão terá então 400 pontos, ou seja, nessa corrida de 40 minutos o eluente da primeira coluna foi reinjetado 400 vezes para a segunda dimensão e 400 * 150 será igual ao numero de pontos total (60000). Isso sem considerar a dimensão do espectro de massas e consequentemente isso se aplica também quando a detecção é realizada por FID.
Quando a detecção é realizada por espectrômetros de massa como QMS ou TOFMS surge uma nova dimensão dos dados em função dos espectros de massas gerados em cada aquisição de sinal. A aquisição de cromatogramas GC×GC-QMS para diferentes amostras gera um conjunto de dados de quarta ordem (amostras x tr1D x tr2D x m/z). Esses dados podem ser desdobrados fazendo-se (tr1D * tr2D) e pode-se somar os espectros de massas para a utilização do chamado total íon. A Figura 1.5 mostra de forma geral como os dados podem ser adquiridos e desdobrados em GC×GC.
Figura 1.5 Estrutura de dados que podem ser obtidos em GC×GC e modos de desdobramento.
1.2.2 Microextração em fase sólida (SPME)
Dentre as diversas técnicas de extração de compostos voláteis disponíveis e já estabelecidas em diversas aplicações, a simplicidade e conveniência de operação fazem da micro extração em fase sólida (SPME) uma alternativa atrativa. Em alguns casos a técnica propicia investigações únicas e a extração é considerada completa quando é alcançado o equilíbrio entre a concentração do analito e a fibra [63].
Dois tipos básicos de extrações podem ser utilizados usando SPME: extração direta e configuração de amostragem no headspace (HS-SPME). A Figura 1.6 mostra as diferenças entre cada uma das estratégias. Normalmente é utiliza agitação para melhor transporte dos analitos da matriz para a fibra.
tr 1D (400) tr 2 D (1 5 0 ) Espectro de massas(300) GCxGC-qMS Four-way Amostras Amostras tr 1D(400) Equivalente a GCxGC-FID
Soma os espectro de massas
tr 1D*tr 2D (60000) Equivalente a GC-FID (matriz de dados) Amostras A mo st ra s Desdobra-se multiplicando (tr 1D*tr 2D)
•A segunda dimensão está relacionada com o período de modulação (PM) e a frequência de aquisição do detector,
•ex: PM de 6 s e taxa de aquisição do MS de 25 Hz resulta em dimensão da 2D = 150. Desdobra-se multiplicando tr 1D*tr 2D OU tr 1D*tr 2D (60000) Espectro de massas(300) tr 2 D (1 5 0 ) Equivalente a GC-MS
Figura 1.6 Modos de operação SPME: (a) extração direta, (b) SPME no headspace.
No caso da estratégia do headspace os analitos precisam ser transportados através da barreira de ar antes de alcançar a fibra. Esta forma de utilização serve para evitar danos na fibra por moléculas de alto peso molecular e interferentes não voláteis presentes na matriz [63].
Em geral, as frações voláteis do cacau e seus derivados são recuperadas por destilação a vapor ou extração com solvente e analisadas por cromatografia gasosa (GC) [64]. Considerando as limitações destas técnicas de amostragem, a microextração em fase sólida no headspace (HS-SPME) surge como uma alternativa atraente e plenamente viável para análise de voláteis em cacau e chocolate. A técnica tem uma série de vantagens por ser relativamente barata, não necessitar de grandes quantidades de solvente, além de ser rápida e reprodutível. A SPME também elimina os problemas associados com amostras quimicamente e termicamente instáveis em que a geração de produtos secundários pode ser problemática como no caso de chocolate e de cacau.
SPME, e HS-SPME em particular, em combinação com cromatografia gasosa, tem sido largamente utilizados em análises de alimentos [65,66]. Counet et
al.[17] utilizaram HS-SPME-GC-MS para analisar o sabor de 8 liquors de cacau e
identificaram 43 compostos, dos quais 5 nunca tinham sido associados com sabor chocolate. Pini et al. [67] avaliaram HS-SPME-GC-FID para a determinação do teor de alquilpirazina em liquor de cacau.
a b
amostra
Fibra
revestimento revestimento
1.3 Ferramentas Quimiométricas
No decorrer dessa tese foram utilizadas algumas ferramentas quimiométricas no tratamento de dados em cromatografia gasosa bidimensional abrangente, essas ferramentas serão discutidas nessa seção. Dentro do possível aplicações que envolvam GC×GC serão utilizadas para ilustrar ou facilitar o entendimento. As ferramentas envolvem planejamentos de experimentos, o qual o planejamento Plackett-Burman foi utilizado para avaliação da robustez e diferentes formas para avaliação desse tipo de planejamento. Também serão abordados conceitos sobre alinhamento em cromatografia gasosa e extrapolação para GC×GC. Em seguida será abordado um método para seleção de variáveis, baseado na razão de Fisher e por ultimo métodos de decomposição de dados, como o PCA e PARAFAC.
1.3.1 Planejamentos Plackett-Burman
Planejamentos Plackett-Burman são planejamentos saturados que permitem que um grande número de fatores seja avaliado com poucos experimentos. Isso significa que as colunas são todas ortogonais, e essa simetria permite que o efeito principal de cada fator seja determinado individualmente, assumindo que as interações são negligenciáveis [68]. O número de fatores que podem ser avaliados é igual a 𝑓 = 𝑁 − 1 fatores, onde N é o número de experimentos, sendo que esse número deve ser múltiplo de 4 (N= 8, 12, 16, 20) [69].
Para gerar planejamentos Plackett-Burman a primeira linha será sempre a mesma, e estas estão descritas dependendo do número de experimentos do planejamento. A segunda linha é obtida realizando-se uma permutação cíclica da primeira posição e as linhas subsequentes são obtidas seguindo o mesmo raciocínio. Isso significa que o primeiro sinal da segunda linha é igual ao último da primeira linha. Além disso, a última linha desses planejamentos deve conter todas as variáveis no nível inferior [70]. A Figura 1.7 mostra um exemplo de como montar um planejamento Plackett-Burman com sete variáveis.
Figura 1.7 Esquema para elaboração de planejamentos Plackett-Burman – exemplo para um planejamento com 8 experimentos.
Quando o número de variáveis a serem avaliadas é menor que a quantidade de fatores estudados deve-se utilizar variáveis inertes (dummy). Uma variável inerte é um fator imaginário que não tem nenhum significado físico quando se altera de um nível para o outro. Normalmente é necessário utilizar no mínimo três variáveis deste tipo quando se deseja estimar o erro padrão do planejamento [69,70].
Para cada fator o efeito é calculado de acordo com a Equação 1.
𝐸
𝑋= ∑ 𝑌(+) 𝑁/2 − ∑ 𝑌(−) 𝑁/2(Equação 1)
onde X pode representar um fator real ou um fator inerte, Ex é o efeito de
X na resposta Y; ∑ Y(+) e ∑ Y(-) são as somas das respostas em que X está nos níveis superiores e inferiores, respectivamente, e N é o número de experimentos do planejamento [71].
Para a interpretação dos efeitos, se o erro experimental puder ser calculado com um número de graus de liberdade apropriado, podem-se utilizar testes estatísticos. Porém, estratégias de interpretação gráfica também podem ser utilizadas. Dessa forma, é recomendado o uso de ambas táticas para uma melhor avaliação do planejamento.
Gráficos de curva normal ou meia curva normal de probabilidade podem ser aplicados e normalmente as considerações finais são as mesmas. Fatores não
Primeira linha do planejamento
significativos tendem a permanecer em uma linha em torno do zero e fatores significativos tendem a se desviar dessa linha [68].
Para uso de testes estatísticos primeiramente deve-se fazer uma estimativa do erro, uma vez que o tcrítico é calculado com o uso da Equação 2, onde é
empregado o erro padrão (SE). Essa equação pode ser rearranjada para obter a Equação 3 [72].
𝑡 =
|𝐸𝑋|(𝑆𝐸)𝑒
⇔ 𝑡
𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 (Equação 2)𝐸
𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜= 𝑡
𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜(𝑆𝐸)
𝑒 (Equação 3)Normalmente utiliza-se um nível de significância (α) de 0,05 e um efeito é considerado significante se |𝐸𝑥| > 𝐸𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜. Para planejamentos Plackett-Burman
frequentemente o erro padrão (SE) é estimado com o uso das variáveis inertes, mas também pode-se utilizar outras estratégias como algoritmo de Dong [73].
A Equação 4 é utilizada para estimar o erro através das variáveis inertes[74].
(𝑆𝐸)
𝑒= √
∑ 𝐸𝑁2𝑛𝑁
(Equação 4)
onde EN são os efeitos calculados para as variáveis inertes e nN é o
número de variáveis utilizadas.
Para aplicação do algoritmo de Dong [73] são utilizadas três equações para o cálculo da margem de erro (ME). Primeiramente estima-se o erro inicial (s0)
baseado em todos os efeitos através da Equação 5, e uma estimativa final (s1) é
obtida apenas com efeitos considerados não significativos (Equação 6).
𝑠0 = 1,5 × 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 |𝐸𝑖| (Equação 5)
onde Ei é o efeito do fator i, Ej um efeito no qual o valor absoluto é menor
que 2,5 x s0, e m é o número de tais efeitos. A margem de erro (ME) é então
calculada através da equação 7. Efeitos com valores acima do valor de ME são considerados significativos.
𝐸𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑀𝐸 = 𝑡(1−𝛼/2,𝐺𝐿) × 𝑠1 (Equação 7)
O algoritmo de Dong é interessante quando são aplicados planejamentos saturados, em que não há graus de liberdade para o cálculo do erro padrão através de variáveis inertes. Outra estratégia que também pode ser utilizada neste caso (onde não há graus de liberdade disponíveis) são os testes de permutação [75].
Em testes de permutação a significância de um determinado fator não é derivada de tabelas de valores estatísticos e sim da distribuição de um teste estatístico gerado pela randomização dos dados experimentais em diferentes condições. Uma das vantagens, neste caso, é que não é necessário assumir a normalidade dos dados [76].
Um teste estatístico t é calculado para cada fator X, através da Equação 8 (equação simplificada).
𝑡 = |𝑌 ̅ (𝑁
2)1− 𝑌 ̅ ( 𝑁
2)2| (Equação 8 )
onde 𝑌 ̅ (𝑁/2)1 é a média de metade das respostas e 𝑌 ̅ (𝑁/2)2 é a média da outra metade. Todas as combinações possíveis para dividir os dados em dois grupos iguais são consideradas [76].
Para identificar os efeitos significativos um p-valor é calculado e este é definido como a proporção de combinações de dados que obteve valores de teste estatístico maior ou igual ao valor examinado para cada fator. Quando um p-valor é menor que ou igual 0,01 ou 0,05, um efeito é considerado significativo em α = 0,01 ou 0,05, respectivamente [75,76].
1.3.2 Métodos de Alinhamento
O pré-processamento dos dados reduz variações quimicamente irrelevantes com o objetivo de aumentar a precisão e exatidão de análises qualitativas e quantitativas. Embora não seja a etapa mais importante em todo processo de análise de dados, é parte fundamental e pode significar a diferença entre o sucesso ou o fracasso em muitas aplicações.
Em medidas cromatográficas podem ocorrer problemas de desvios do tempo de retenção devido a fatores como pequenas alterações na coluna, mudança na composição da fase móvel (no caso de HPLC), interações entre os analitos, entre outras. Muitas vezes, dependendo do objetivo a ser atingido, pode-se detectar os picos de compostos de interesse e integrá-los. Porém, em análises de matrizes complexas esta estratégia pode se tornar subjetiva e laboriosa[77].
Com o intuito de evitar esse problema, algoritmos que permitem o alinhamento do cromatograma inteiro foram desenvolvidos e são amplamente utilizados. Dentre os diversos algoritmos podem ser citados: DTW (dinamic time
warping) [78], COW (correlation optimized warping) [77], icoshift [79], Fuzzy warping
[80], PAGA (peak alignment by means of genetic algorithm) [81], entre outros [82]. O algoritimo COW[77] é um dos mais utilizados e o mecanismo de funcionamento deste está descrito na Figura 1.9. Considerando-se um cromatograma alvo T, o cromatograma desalinhado P pode ser alinhado obtendo-se o perfil P’. O perfil desalinhado possui LP+1 pontos no eixo do tempo e então um
comprimento de intervalos LP é dividido em seções de comprimento m e o número
de seções N é dado por:
𝑁 =𝐿𝑃
𝑚 (Equação 9)
Geralmente interpolação linear é usada para o ajuste. Uma seção tendo um ponto inicial em xs e um ponto final em xe é ajustada para a posição inicial x’s e
posição final x’e. No caso do algoritmo COW os parâmetros a serem otimizados são
o tamanho do comprimento do segmento m e o parâmetro t, que consiste no número de pontos de cada seguimento que pode ser comprimido ou alongado [77,83].
Figura 1.8 Mecanismo de funcionamento do algoritmo COW (adaptado de [77]).
Uma estratégia que pode ser utilizada em dados de GC×GC é o uso do algoritmo COW desdobrando-se os cromatogramas para vetores como se fosse 1D-GC. Porém, cabe ressaltar que no caso de medidas realizadas em GC×GC os desvios nos tempos de retenção podem ocorrer em ambas as colunas e na literatura estão descritos alguns algoritmos desenvolvidos especificamente para GC×GC.
Em 2005, Pierce et al.[84] desenvolveram o algoritmo chamado
comprehensive 2D retention time aligment, que permite o alinhamento em ambas as
dimensões preservando todas as informações do conjunto de dados. Este algoritmo é uma adaptação do algoritmo desenvolvido pelos autores para separações em 1D (piecewise retention time alignment).
Zhang et al [85] desenvolveram o algoritmo conhecido como 2D COW baseado no princípio de funcionamento do 1D COW. Os perfis de cromatogramas são primeiramente divididos e então o ajuste dos pontos em uma grade é realizado com 1-D COW simultaneamente ao longo da primeira e segunda dimensão. Neste caso, dois pares de parâmetros (tamanho da janela e máximo warping) para a primeira e segunda dimensão devem ser otimizados.
Mais recentemente, Gros et al. [86] apresentaram um novo algoritmo para alinhamento simultâneo nas duas dimensões de GC×GC baseado em interpolação e deconvulação bicúbica e com a utilização de pontos indicados pelo usuário em um cromatograma alvo e em um cromatograma referência. Os resultados obtidos foram comparados com aqueles utilizando 2D-COW e pisewise alignment e os autores apresentaram algumas vantagens do método como, por exemplo; evitar distorções irreais dos cromatogramas alinhados, o que pode ser um desafio para outras técnicas que usam etapas de interpolação.
Perfil alvo T
Perfil desalinhado P
Perfil alinhado P’
0
0
L
Tx
NL
Px
N-1x
1x
0t
t
m
Δ
Entretanto, o que há de comum em todos os métodos descritos é que estes não foram desenvolvidos para utilizar a informação de espectro de massas disponíveis quando se usa detectores como TOF-MS ou q-MS. Devido a esta limitação e o grau dos desvios, certa homogeneidade entre as amostras é frequentemente requerida, caso contrário esses métodos podem introduzir alinhamentos falsos especialmente se diferentes compostos apresentarem tempos de retenções similares em GC×GC.
Para corrigir esse problema algoritmos que utilizam toda a informação disponível foram desenvolvidos[87,88]. O algoritmo DISCO (Distance and Spectrum
Correlation Optimization)[89], e mais recentemente DISCO2[90], são ferramentas de
alinhamento em dois estágios que usam a informação do espectro de massas. Resumidamente, o primeiro passo do algoritmo DISCO2 é a redução dos dados para lista de picos, encontrando picos dos mesmos compostos em todas as listas de picos e alinhando-os. E em seguida os picos remanescentes são alinhados com base nos parâmetros encontrados na primeira etapa.
Os métodos para alinhamento de cromatogramas são normalmente baseados em dois tipos de modelos: inserção/exclusão (I/D) ou compressão/expansão (C/E). O primeiro assume que as larguras dos picos podem estar correlacionadas com a intensidade do sinal. Já o último, ao contrário, assume que a largura do pico é invariante dentro de uma determinada faixa e permanece inalterada em caso de deslocamento [79]. Embora métodos baseados em C/E, que é utilizado no algoritimo COW, sejam normalmente aplicados para correção dos tempos de retenção em sinais cromatográficos, I/D métodos podem ser superiores em alguns casos [91].
Em GC×GC as bandas cromatográficas enviadas para a segunda coluna são frações da primeira dimensão e são muito estreitas, usualmente 10 -150ms [92]. Desta forma, detectores com altas taxas de aquisição (50 – 100 Hz) como tempo-de-vôo (TOFMS) são os mais efetivos para serem utilizados. Porém espectrômetros de massa quadrupolares (QMS) também tem sido utilizados, por apresentam um menor custo e geralmente estarem disponíveis em cromatógrafos [57]. Desta forma, é importante salientar que quando se alinha desvios nos tempos de retenção com um baixo número de pontos, usando modelos C/E, os passos de interpolação podem causar mudanças nas formas e nas áreas dos picos [83].
Neste sentido, o algoritmo icoshift (interval correlation optimized
shifting)[79,93] que é baseado em modelos I/D e foi primeiramente descrito para
dados de RMN pode produzir ótimos resultados em GC×GC-QMS. O algoritmo
icoshift otimiza a correlação cruzada por partes usando transformada de Fourier
rápida (Fast Fourier Transform FFT) e é adequado para utilização em cromatografia bidimensional abrangente uma vez que é muito rápido, não muda a forma dos picos e trabalha bem em alvos com formas não perfeitas[91]. Uma importante característica do algoritmo icoshift é que a definição dos intervalos deve ser realizada sempre na linha de base para evitar a introdução de artefatos nos cromatogramas.
A Tabela 1.1 resume alguns métodos de alinhamento utilizados em GC×GC e suas características principais.
Tabela 1.1 Métodos para correção de desvios nos tempos de retenção em GC×GC. Método Integração Passos de
interpolação
Espectro de
massa velocidade
DISCO2 Sim - sim -
2D-COW - sim - -
comprehensive 2D
- sim - -
DTW - sim - lento
COW - sim - lento
Icoshift - - - rápido
Icoshift/modified - - sim rápido
Em geral, o alinhamento de dados cromatográficos tem se tornado uma importante ferramenta como etapa de pré-processamento. Na literatura há um vasto número de trabalhos com diversas aplicações. Desta forma, critérios de seleção da melhor alternativa para o conjunto de dados em questão devem ser considerados para que esta etapa ocorra da melhor maneira e promova resultados satisfatórios nas subsequentes.
1.3.3 Métodos para seleção de variáveis
1.3.3.1 Razão de Fisher
A razão de Fisher é utilizada para inspecionar um conjunto de dados e selecionar variáveis que contém diferenças significativas entre duas classes definidas. A razão de Fisher é definida como a variação classe-a-classe da variável independente dividido pela soma das variações dentro da classe, que pode ser definida pelas equações a seguir [94,95]. Para se calcular a variação entre as classes:
𝜎𝑐𝑙2 = ∑(𝑥̅ −𝑥̅)𝑖 2𝑛𝑖
(𝑘−1) (Equação 10)
onde, ni é o número de amostras na enésima classe, 𝑥̅ é a média da 𝑖
enésima classe, 𝑥̅ é a média global e k o número de classes. A variação intra classe é dada por: 𝜎𝑒𝑟𝑟2 = ∑(∑(𝑥𝑖𝑗–𝑥̅) 2 )−(∑(𝑥̅ −𝑥̅)𝑖 2𝑛 𝑖) 𝑁−𝑘 (Equação 11)
onde 𝑥𝑖𝑗 é a enésima medida da enésima classe e N é o número total de amostras. Por fim pode-se calcular a F-razão:
𝐹 = 𝜎𝑐𝑙2
𝜎𝑒𝑟𝑟2 (Equação 12)
Da Equação 12 pode-se concluir que se uma variável possui um valor pequeno da razão F significa que a variação dentro da classe para aquela variável é maior que a variação entre as diferentes classes e essa variável não será importante para discriminar as classes. Por outro lado, se a variável em questão apresentar um alto valor de razão de Fisher significa que a variação dentro da classe é pequena em comparação com a variação calculada entre as duas classes e essa variável é importante para diferenciação entre as classes.
Esse conceito pode ser aplicado quando são analisados cromatogramas GC×GC-FID desdobrados em que se tem então uma matriz de dados onde as linhas serão as amostras e as colunas os diferentes pontos do cromatograma (tempos de retenção). Nesse sentido é necessária a correção dos desvios dos tempos de retenção antes da aplicação dessa ferramenta de seleção de variável.
1.3.3.1 Razão de Fisher para dados four-way
O conceito apresentado anteriormente para estudo da importância das variáveis para discriminação entre duas classes utilizando-se a razão de Fisher foi extrapolado para a utilização em dados de ordem maior. Quando se realiza medidas por GC×GC-QMS sabe-se que é possível somar os espectros de massa e desdobrar multiplicando-se tr1D x tr2D, porém a melhor opção é o tratamento dos dados no arranjo original sempre que possível.
Neste sentido o método chamado Tile-based Fisher ratio foi desenvolvido e permite que dados em 4 dimensões (GC×GC-TOFMS) sejam utilizados para encontrar variáveis importantes que diferenciam as classes definidas. Esse método beneficia-se das vantagens da análise em nível pixel-level (sem a integração dos picos), ou seja, obtêm a informação de uma forma mais rápida, assim como as vantagens das análises em nível peak-level (com a integração dos picos) porque o algoritmo é considerado robusto em relações a variações de tempos de retenção. A razão de Fisher para dados de ordem maior é uma análise abrangente e nontarget que vem sendo muito utilizada em dados de GC×GC [94,96].
A Figura 1.9 mostra o esquema para desdobramento dos dados e cálculo da razão de Fisher para cromatogramas GC×GC-QMS. Primeiramente é obtido um cubo de dados para cada razão m/z, que em seguida é desdobrado multiplicando-se os tempos de retenção. Desta forma, obtêm-se uma matriz onde as amostras estão nas linhas e os valores da primeira razão m/z em cada ponto do cromatograma nas colunas[97].
Calcula-se a variância dessa matriz dentro da classe e entre as classes definidas. Repete-se a análise para todas as razões m/z monitoradas. Por fim redobra-se as matrizes e formando um gráfico com os valores de razão de Fisher para cada ponto (JxK) de cada canal m/z. Pode-se por fim, somar as razões m/z e
