UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CHRISTIAN TIMICH BATTAGLIA
Comparação de Métodos para Determinação da Maciez
Instrumental e do Comprimento de Sarcômero de Carne Bovina
CAMPINAS 2016
CHRISTIAN TIMICH BATTAGLIA
Comparação de Métodos para Determinação da Maciez
Instrumental e do Comprimento de Sarcômero de Carne Bovina
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestre em Tecnologia em Alimentos.
Orientador: Dr. SÉRGIO BERTELLI PFLANZER JÚNIOR
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pelo aluno Christian Timich Battaglia e orientado pela Prof. Dr. Sérgio Bertelli Pflanzer Júnior
CAMPINAS 2016
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2013/0633-9
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Battaglia, Christian Timich, 1987-
B321c BatComparação de métodos para determinação da maciez instrumental e docomprimento do sarcômero de carne bovina / Christian Timich Battaglia. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
BatOrientador: Sergio Bertelli Pflanzer Junior.
BatDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas,
Faculdadede Engenharia de Alimentos.
Bat1. Qualidade da carne. 2. Maciez. 3. Comprimento de sarcômero. I. PflanzerJunior, Sergio Bertelli. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Comparison of methods for determination of instrumental tenderness and sarcomere lenght in beef
Palavras-chave em inglês: Meat quality
Tenderness Sarcomere lenght
Área de concentração: Tecnologia de Alimentos Titulação: Mestre em Tecnologia de Alimentos Banca examinadora:
Sergio Bertelli Pflanzer Junior [Orientador] Angélica Simone Cravo Pereira
Manuel Pinto Neto
Data de defesa: 29-06-2016
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________ Prof. Dr. Sérgio Bertelli Pflanzer Júnior
FEA/ Unicamp Orientador
___________________________________________ Prof. Dra. Angélica Simone Cravo Pereira
FMZV / Usp Membro Titular
___________________________________________ Prof. Dr. Manuel Pinto Neto
Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL) Membro Titular
___________________________________________ Prof. Dr. Pedro Eduardo de Felício
FEA / Unicamp Membro Suplente
___________________________________________ Prof. Dr. Tiago Zanett Albertini
USP / Esalq Membro Suplente
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
À UNICAMP, em especial à Faculdade de Engenharia de Alimentos e ao Departamento de Tecnologia de Alimentos pela acolhida e pela estrutura oferecida para o desenvolvimento dos trabalhos.
À CNPQ pela bolsa de pesquisa durante a execução do curso.
À FAPESP pelo auxílio financeiro cedido ao projeto de pesquisa.
Ao Professor e orientador Sérgio Bertelli Pflanzer Júnior pela orientação, pelos conselhos como professor, pesquisador e profissional, e pela experiência passada ao longo dos anos.
Aos meus colegas Gustavo Faria de Villela e Maristela Midori Ozaki e funcionários do DTA/FEA/UNICAMP pela amizade e companheirismo.
Ao técnico do Laboratório de Carnes José Roberto e aos estagiários, pela ajuda, sugestões e compreensão no momento da realização das análises.
Aos membros da banca examinadora, pelo tempo dedicado na avaliação deste trabalho e pelas valiosas sugestões, que enriqueceram o mesmo e que contribuíram imensamente para o aperfeiçoamento técnico do autor.
Ao curso de Medicina Veterinária da UNESP Araçatuba por propiciar minha graduação
E à todos aqueles que participaram, direta ou indiretamente, da realização deste trabalho.
Resumo
Pelas características da pecuária e das indústrias frigoríficas brasileiras, não é incomum nos depararmos com consumidores insatisfeitos em relação qualidade da carne, principalmente a maciez, que muitas vezes pode estar ligada ao grau de encolhimento dos sarcômeros. Objetivou-se comparar duas técnicas para determinação do comprimento de sarcômero, microscopia de contraste de fases (Sarcm) e difração de raio laser (Sarcl), e de dois protocolos para avaliação da maciez instrumental, Warner-Bratzler Shear Force (WBSF) e Slice Shear Force (SSF), da carne bovina em quatro coletas distintas. Um total de 74 amostras de carne (músculo Longissimus lumborum), divididas em quatro coletas, foram utilizados neste projeto. As amostras maturadas por 14 dias (2°C) foram cortadas em bifes (2,5 cm) e em seguidas congeladas (- 18°C) para análises de potencial hidrogeiônico (pH). Também foram avaliadas quanto ao comprimento de sarcômero, índice de fragmentação miofibrilar (IFM), análise de maciez instrumental (WBSF e SSF) e sensorial da maciez inicial, maciez sustentada, suculência inicial e suculência sustentada. As variáveis paramétricas foram analisadas quanto às medidas de posição e dispersão, bem como dados atípicos. Variáveis não paramétricas foram analisadas quanto à frequência. Um modelo linear misto (MLM) foi estruturado considerando as classes da coleta (frigoríficos em que os animais foram abatidos) e após ANOVA foi possível comparar as médias das variáveis em estudo. As variáveis descontínuas foram avaliadas e as classes da coleta foram avaliados por testes não-paramétricos. Resíduos estudentizados provenientes do MLM foram utilizados nas correlações das variáveis de interesse do estudo. Não foram identificadas amostras com pH superior a 5,9. Não foram verificadas diferenças (P > 0,05) entre as coletas, tanto para as análises de comprimento de sarcômero por microscopia (2,0 ± 0,02 µm), como laser (1,7 ± 0,03 µm), e os valores não indicam o fenômeno do encurtamento pelo frio. Quando todas as coletas foram agrupadas (n = 74) observou-se correlação positiva (r = 0,69; P < 0,01) entre SSF e WBSF. Entre Sarcl e Sarcm, quando as amostras foram agrupadas (n = 74), o coeficiente de correlação observado foi r = 0,57; P < 0,01. O IFM apresentou correlação negativa (P < 0,01) com WBSF (r = - 0,45) e SSF (r = -0,42), e correlação positiva com a maciez inicial (r = 0,42; P < 0,01) quando todas as amostras foram agrupadas (n = 74). Entre a avaliação sensorial da maciez inicial com as avaliações
instrumentais por SSF e WBSF foi encontrado um coeficiente de correlação negativo (r = - 0,61; P < 0,01) quando todas as amostras foram avaliadas em conjunto (n = 74). Conclui-se que os dois métodos de avaliação da maciez instrumental, SSF e WBSF, detectaram as diferenças entre amostras, contudo o SSF obteve melhores correlações com os resultados da sensorial. A utilização da difração de raio laser, para avaliação do sarcômero, é mais rápida e apresentou melhores correlações com os resultados da maciez instrumental e sensorial.
Palavras-Chave: qualidade da carne, força de cisalhamento, unidade funcional e maciez e suculência sensorial.
Abstract
According to the livestock production system and industries characteristics in Brazil, it is normal to find frustrated consumers regarding meat quality, especially tenderness, which can often be linked to the degree of sarcomere shortening. The aim of this study was to compare the efficiency of two techniques for determining the sarcomere length, phase contrast microscopy (MSarc) and laser diffraction (LSarc), and two protocols to evaluate the instrumental tenderness, Warner-Bratzler Shear Force (WBSF) and Slice Shear Force (SSF), of beef in 4 distinct samplings. A total of 74 samples (m. Longissimus lumborum), divided in four samplings, were used in this project. After 14 days aging (2 °C), all samples were cut into steaks (2.5 cm) and then frozen (- 18°C) for pH, sarcomere length, myofibrillar fragmentation index (MFI), instrumental and sensory analysis of tenderness. Parametric variables were analyzed for position measurements and dispersion, as well as outliers. Nonparametric variables were analyzed for frequency. A linear mixed model (MLM) was structured considering the sampling classes (slaughterhouses where the animals were slaughtered) and after ANOVA was possible to compare the averages of the variables under study. Discontinuous variables were evaluated and the sampling classes were evaluated by non-parametric tests. Studentized residues from MLM were used in the correlations of the variables of interest in the study. No samples were identified with a pH greater than 5.9. No differences were found (P > 0.05) between the samplings for both the values of sarcomere length analysis by microscopy (2.0 ± 0.02 μm) and laser (1.7 ± 0.03 μm), and values were not associated with cold-shortening phenomenon. Positive correlations were observed (r = 0.69 P < 0.01) between SSF and WBSF when grouping all data (n = 74) (P<0.01). Between LSarc and MSarc, when all data was pooled (n = 74), was observed a coefficient of 0.57 (P < 0.01). The MFI was negatively correlated (P < 0.01) with WBFS (r = - 0.45) and SSF (r = - 0.42), and positively correlated with the initial tenderness (r = 0.42; P < 0.01) when all data was evaluated together (n = 74). Sensory evaluation of the initial tenderness with instrumental evaluations by SSF and WBSF presented a correlation coefficient value of - 0.61 (P < 0.01) when all data was pooled (n = 74). It can be concluded that the two methods of instrumental evaluation of tenderness, WBSF and SSF, were able to detect differences between samples, in additional SSF showed better correlation results with sensory tenderness. The use of
laser diffraction to measure sarcomere length is faster and presented better results with sensory tenderness.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1. Fluxograma das atividades realizadas com todas as amostras...24 das coletas
Figura 2. Processo realizado em todas as amostras após o término do...24 período de maturação (14 dias após abate)
Figura 3. Fluxograma da análise de pH...25
Figura 4. Fluxograma da análise de medição do comprimento de...26 sarcômero por difração de raio laser (Sarcl)
Figura 5. Fluxograma da análise de medição do comprimento de...28 sarcômero por microscopia de contraste de fase (Sarcm)
Figura 6. Fluxograma da análise do Índice de fragmentação...30
miofibrilar (IFM).
Figura 7. Fluxograma do método de cocção utilizado para o preparo das...31 amostras para as análises de maciez instrumental e sensorial
Figura 8. Fluxograma da análise de avaliação da maciez instrumental...32 Slice Shear Force (SSF).
Figura 9. Fluxograma da análise de avaliação da maciez instrumental...33 Warner-Braztler Shear Force (WBSF)
Figura 10. Fluxograma da análise sensorial (perfil de textura)...35
Figura 11. Ficha sensorial adaptada de AMSA, 1995...36
Figura 12. Gráfico de correlação entre Sarcl e Sarcm com...50 linha de tendência e equação da reta (n = 74)
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Descrição das características dos bovinos (n = 74) nas quatro...22 coletas
Tabela 2. Padrões utilizados na análise sensorial com seus respectivos...34 cortes cárneos e modo de preparo.
Tabela 3. Valores de Médias ± erro padrão da média, desvio padrão,...39 mínimos e máximos de todas as análises com as amostras
agrupadas (n = 74)
Tabela 4. Valores de média ± erro padrão da média e valor de p...42 para cada análise por coleta
Tabela 5. Valore das médias ± erro padrão da média e mean...43 score dos atributos avaliados pela análise sensorial
(perfil de textura) por painel treinado.
Tabela 6. Coeficientes das correlações de Pearson entre maciez...47 instrumental, comprimento de sarcômero, índice de fragmentação
miofibrilar e atributos sensoriais nas coletas 1, 2, 3 e 4.
Tabela 7. Coeficientes das correlações de Pearson entre maciez...48 instrumental, comprimento de sarcômero, índice de fragmentação
LISTA DE ABREVIAÇÕES
Terminologias das análises físico-químicas PPC: Perda de peso após a cocção.
WBSF: Warner-Braztler Shear Force.
SSF: Slice Shear Force.
Sarcl: Comprimento de sarcômero obtido por difração de raio laser.
Sarcm: Comprimento de sarcômero obtido por microscopia de contraste de fases.
IFM: Índice de Fragmentação Miofibrilar.
Terminologias dos atributos da análise sensorial: Mi: Maciez inicial.
Ms: Maciez sustentada.
Si: Suculência inicial.
Sumário 1. Introdução ... 15 2. Objetivo ... 17 3. Revisão bibliográfica ... 17 3.1. Maciez da carne ... 17 3.1.1. Força de cisalhamento ... 18 3.1.2. Comprimento do sarcômero ... 19
3.1.3. Análise sensorial (perfil de textura) ... 20
3.1.4. Índice de fragmentação miofibrilar (IFM) ... 21
4. Material e Métodos ... 22
4.1. Animais ... 22
4.2. Amostras ... 23
4.3. Metodologia das análises ... 24
4.3.1. pH ... 25
4.3.2. Comprimento de sarcômero ... 25
4.3.2.1. Método indireto – difração de raio laser (Sarcl) ... 25
4.3.2.2. Método direto – microscopia de contraste de fases (Sarcm) ... 27
4.3.3. Índice de fragmentação miofibrilar (IFM) ... 29
4.3.4. Cocção das amostras para análises de maciez instrumental e análise sensorial ... 30
4.3.5. Maciez instrumental ... 31
4.3.5.1. Slice Shear Force (SSF) ... 31
4.3.5.2. Warner-Bratzler Shear Force (WBSF) ... 32
4.3.6. Análise sensorial (painel de perfil de textura) ... 33
4.4. Análise Estatística ... 37
5. Resultado e Discussão ... 39
5.2. Correlações ... 44
5.2.1. Correlações com a maciez instrumental ... 44
5.2.2. Correlações com o comprimento de sarcômero (Sarcl e Sarcm) ... 49
5.2.3. Correlações com o índice de fragmentação miofibrilar (IFM) ... 51
6. Conclusão ... 52
7. Referências bibliográficas ... 53
1. INTRODUÇ ÃO
O Brasil ocupa um lugar de destaque na pecuária bovina mundial. Possui o segundo maior rebanho, com cerca de 213 milhões de cabeças (USDA, 2015); e é o segundo maior produtor desta fonte proteica. O país oferece ao mercado aproximadamente 9,4 milhões de toneladas de carne; e destina para o exterior 1,4 milhão de toneladas, se colocando como segundo maior exportador (USDA, 2015).
Há alguns anos a atividade pecuária brasileira tem se destacado quando, comparada mundialmente, seja no âmbito dos fatores de produção, do perfil dos produtos ou dos volumes produzidos. Clima, solo, tecnologia e recursos humanos constituíram vantagens competitivas que, somadas à extensão territorial, ao tamanho do rebanho e ao parque industrial frigorífico, possibilitaram produzir carne bovina a preços competitivos, em quantidades crescentes e com a qualidade desejada pelos consumidores (FELÍCIO, 2001).
Mesmo com todos esses números positivos, o Brasil deixa a desejar em relação à qualidade sensorial da carne bovina produzida. Não é incomum encontrar consumidores insatisfeitos em relação a algumas dessas características, como a suculência, o sabor e principalmente a maciez dos produtos cárneos.
Vários estudos da área demonstram que a maciez é a característica sensorial que mais influencia na aceitação da carne, isso durante seu consumo, pois no momento da compra, a cor é o fator determinante (MORGAN et al., 1991; KOOHMARAIAE, 1996; ENFALT et al., 1997; KOOHMARAIAE et al., 2002; PLATTER et al., 2003; KOOHMARAIAE et al., 2006).
Vários fatores influenciam a maciez da carne. Esses fatores podem estar relacionados com a genética do bovino, com as condições de criação, com alguns procedimentos durante o abate e resfriamento das carcaças, com as condições de armazenamento da carne, e por fim, com o método de preparo para consumo (LAWRIE, 1985).
Quanto à genética, as principais diferenças são verificadas quando se comparam bovinos zebuínos com taurinos de origem britânica. Esse segundo grupo é caracterizado por animais que possuem maior habilidade para acumular gordura, seja subcutânea, intermuscular ou intramuscular, essa última diretamente
relacionada com a maciez (MILLER, 2004). Essa deposição maior de gordura intramuscular, juntamente com uma menor atividade das calpastatina (enzima que retarda o processo de maturação), propicia a produção de carne mais macia (KOOHMARAIAE, 1988, 1992; WHIPPLE et al., 1990; SHACKELFORD et al., 1994; WULF et al., 1996; O’CONNOR, et al., 1997).
Em relação ao sistema de criação, o abate de animais jovens, de preferência machos castrados e fêmeas, assim como um período de engorda e terminação intensivas podem proporcionar a produção de carne mais macia (WULF, et al., 1996; CHOAT, et al., 2006).
O principal fator, durante o abate, que melhora a maciez da carne é a utilização da estimulação elétrica de carcaças, a qual acelera a queda do pH muscular e evita o encurtamento demasiado dos sarcômeros (SAVELL, et al., 1977, 1978). Ainda nesta linha de raciocínio, um resfriamento mais lento das carcaças pode prevenir o fenômeno, também conhecido como “cold shortening”, encurtamento pelo frio (WHIPPLE, et al., 1990; SMITH, et al., 1979; HOSTETLER, et al., 1975; SAVELL, et al., 2005).
O armazenamento refrigerado da carne, após a desossa e acondicionamento, muitas vezes a vácuo, favorece a maciez, pois é neste período que acontece o processo conhecido como maturação. Na maturação ocorre a quebra de algumas proteínas estruturais do tecido muscular, as quais são alvos das enzimas calpaínas (SMITH et al., 1978; KOOHMARAIAE, 1988, 1992). O sistema enzimático calpaína causa uma fragmentação da linha-Z e da degradação de proteínas como titina, nebulina, desmina e troponina-T (KOOHMARAIE, 1988), o que leva a um aumento da maciez da carne. As enzimas calpaínas participam do processo de proteólise e consequente aumento da maciez da carne durante a maturação (KOOHMARAIE, 1992).
Grandes e importantes alterações ocorrem na carne imediatamente antes do consumo, no momento do preparo por aquecimento. As proteínas miofibrilares são desnaturadas e propiciam o endurecimento da carne, enquanto as proteínas do tecido conjuntivo (principalmente o colágeno) são gelatinizadas e favorecem a maciez. Esses dois processos, desnaturação e gelatinização, são dependentes do tempo e temperatura (OBUZ et al., 2003).
Frente a todos estes fatores que podem influenciar a maciez da carne, faz-se necessário à utilização de metodologias instrumentais de avaliação da maciez padronizadas e sensíveis, capazes de identificar diferenças que possam aparecer entre os diferentes sistemas de produção de bovinos e consequente processamentos da carcaça e da carne.
A importância da padronização e certificação de técnicas analíticas para determinar a maciez da carne pode ser demonstrada pelo trabalho desenvolvido e recentemente divulgado pelo Agricultural Marketing Service (AMS) do United States Department of Agriculture (USDA). O projeto possibilitou desenvolver uma certificação para garantir a maciez da carne bovina para os consumidores, o International Tenderness Marketing Claims, com certificação da American Society for Testing and Materials (ASTM; USDA, 2012a).
Com a certificação, um frigorífico pode avaliar a maciez da carne produzida e garantir, através de selos do USDA, a classe de maciez que o consumidor estará adquirindo. O sistema permite a utilização do Warner-Bratzler Shear Force (WBSF) e Slice Shear Force (SSF) para determinar a maciez, entretanto os protocolos devem seguir a metodologia oficial e devem ser previamente certificados e rotineiramente validados (USDA, 2012a).
2. OBJETIVO
Objetivou-se comparar duas técnicas para determinação do comprimento de sarcômero, microscopia de contraste de fases e difração de raio laser, e de dois protocolos para avaliação da maciez instrumental da carne bovina, Warner-Bratzler Shear Force e Slice Shear Force, com análise sensorial (perfil de textura), em quatro coletas distintas.
3. REVIS ÃO BIBLIOGR ÁFIC A
3.1. Maciez da carne
Para avaliar a maciez da carne podem ser utilizados ao menos dois tipos de metodologias, a primeira delas é a análise sensorial, seja com testes afetivos
(consumidores) ou analíticos (provadores treinados), e a segunda o uso de instrumentos mecânicos (método objetivos), mais rápidos e objetivos que a análise sensorial, que avaliam a maciez pela medida da força de cisalhamento.
3.1.1. Força de cisalha me nto
A força de cisalhamento pelo uso do equipamento Warner-Bratzler (WBSF) é o protocolo, específico para carne, mais antigo e difundido e ainda o mais aceito para determinar a maciez em vários laboratórios ao redor do mundo (BRATZLER, 1954). Entretanto, é uma técnica que leva muito tempo para ser realizada, pois as amostras devem permanecer sob refrigeração, por pelo menos 12 horas, após o processo de cocção, antes da força de cisalhamento ser determinada. Além disso, faz-se necessária a preparação de 6-8 corpos de prova, cilindros de 1,27 cm de diâmetro, retirados no sentido paralelo as fibras musculares, para cisalhamento (AMSA, 1995).
Portanto, pensando-se na otimização do tempo de preparação, principalmente para os casos em que se exige uma garantia da maciez em processo em linha (“on line”), um novo método foi desenvolvido e vem sendo proposto como mais eficiente que o Warner-Bratzler, conhecido como Slice Shear Force – SSF (SHACKELFORD et al., 1995; SHACKELFORD et al., 1999ab; WHEELER et al., 2002).
Neste método mais recente, o corpo de prova, apenas uma fatia de 1 cm de espessura por 5 cm de largura, retirada, também, no sentido paralelo as fibras musculares, é preparada imediatamente após o processo de cocção e a maciez é determinada em seguida. Desta maneira, o resultado é obtido com maior rapidez, e por se tratar de um corpo de prova com dimensões maiores que os cilindros do Warner Bratzler, a resposta é mais representativa para a amostra em questão (SHACKELFORD et al., 1995).
Os idealizadores do método Slice Shear Force demonstraram uma maior correlação deste método com os resultados de análise sensorial, do que os resultados de Warner Bratzer Shear Force (SHACKELFORD et al., 1999a).
No Brasil, a maioria dos laboratórios que estudam a carne bovina utilizam o equipamento de WBSF, entretanto existem variações no protocolo de preparação
das amostras. Tais variações ocorrem pelo uso de diferentes equipamentos e temperaturas de cocção, além de modificações no processo de coleta dos corpos de prova. Essas alterações no protocolo de análise podem afetar as comparações dos tratamentos nos experimentos realizados. Um protocolo padronizado, entre os institutos de pesquisa, beneficiaria as comparações, como por exemplo, a avaliação do efeito genético dos animais na maciez. (WHEELER et al, 1997).
3.1.2. Co mp rimento do sa rcô mero
De todos os fatores mencionados anteriormente que podem afetar a maciez da carne, alguns deles, tais como aqueles que antecedem ao abate e os que acontecem durante o abate e resfriamento das carcaças podem ser mal interpretadas, uma vez que durante o processo de transformação do músculo em carne pode ocorrer um resfriamento desigual das carcaças, ou ainda mais drasticamente, o “cold shortening”. Nestas situações o resultado de maciez poderia ser prejudicado por este fenômeno.
Para evitar ou controlar esse tipo de erro, na interpretação dos resultados de maciez, a avaliação do comprimento de sarcômero traz importantes vantagens para uma explicação mais precisa dos resultados obtidos no teste de maciez por WBSF ou SSF.
O sarcômero, menor unidade contrátil estrutural repetitiva da miofibrila, pode ser medido diretamente por microscopia de contraste de fases, ou indiretamente por difração de raio laser (KOOLMEES et al., 1986; CROSS et al., 1980; SILVA et al., 1999).
A primeira técnica, microscopia de contraste de fases, requer mais etapas de preparação e mais tempo para ser realizada. Entretanto, os resultados não são afetados por artefatos de técnica e o valor do comprimento do sarcômero é obtido diretamente por medidas na miofibrila (KOOLMEES et al., 1986; CROSS et al., 1980). Já a difração de raio laser, muito mais prática e rápida, é considerada tão precisa quanto à microscopia para medida do sarcômero (KOOLMEES et al., 1986; CROSS et al., 1980).
Entretanto, na difração de raio laser, segundo alguns autores (SWATLAND, 1995) pode haver falhas na determinação do comprimento do sarcômero. Esse fato se deve a técnica ser indireta, ou seja, o tamanho do
sarcômero é estimado por uma equação matemática e não pela real medida do sarcômero. Outra diferença é que nesta técnica apenas uma pequena região da amostra é avaliada, enquanto na microscopia um homogeneizado é preparado da amostra, e miofibrilas de várias áreas são analisadas (KOOLMEES et al., 1986).
Segundo Swatland (1995), outros problemas podem acontecer se a técnica de difração de raio laser não for bem aplicada: 1 – miofibrilas curvadas devido a diferentes taxas de resfriamento; 2 – miofibrilas fora de alinhamento podem gerar uma refração desordenada; 3 – amostras com pH muito baixo podem proporcionar muita dispersão da luz 4 – miofibrilas muito contraídas podem apresentar suas bandas sobrepostas. O mesmo autor relatou que todas estas fontes de erro podem ser evitadas quando as amostras são avaliadas por microscopia.
3.1.3. Análise senso ria l (perfil de textu ra )
Segundo a Associação Brasileira de Normas e Técnicas (1993), análise sensorial é uma disciplina científica usada para medir, analisar e interpretar reações das características dos alimentos e matéria por meio dos sentidos da visão, olfato, gosto, tato e audição. A análise sensorial, realizada geralmente com grupos de provadores, tem sido muito utilizada no desenvolvimento e produção de novos produtos na indústria de alimentos.
A análise sensorial pode ser dividida em dois grandes grupos, o primeiro é formado por métodos afetivos enquanto o segundo pelos métodos descritivos. No primeiro o provador responde de maneira subjetiva se o produto avaliado agrada ou desagrada, se é aceito ou recusado e se é preferido a outro (TEIXEIRA, 2009). Nos métodos descritivos um grupo de provadores é previamente selecionado, treinado e validado antes de iniciar a análise sensorial propriamente dita. Este segundo tipo de teste é muito utilizado em produtos cárneos, principalmente para avaliação da textura de alguns produtos e requer provadores experientes e treinados (ANZALDÚUA-MORALES, 1994). Tanto as análises com métodos afetivos quanto as que envolvem métodos descritivos envolvem uma série de cuidados, como preparo das amostras, como a elaboração das fichas de avaliação e estrutura para realização das análises. Estes cuidados são essenciais para evitar que os provadores sejam influenciados ou sofram algum efeito que possa prejudicar a avaliação das amostras. Quando se faz uso de métodos descritivos algumas outras
etapas são adicionadas ao processo da análise sensorial, elas são: recrutamento, treino e validação (AMSA, 1995).
3.1.4. Índice de frag mentação miofib rilar (IFM)
Durante o resfriamento diversas alterações bioquímicas ocorrem no músculo esquelético post-mortem e várias enzimas, presentes naturalmente no músculo, compõe um sistema enzimático envolvido na proteólise das proteínas musculares gerando tais alterações (TOLDRÁ et al.,1995). As enzimas envolvidas nesse processo são: as calpaínas (I e II), catepsínas lissosomais (LAMARE et al., 2002) e o complexo proteinase multicatalítico (MCP; KOOHMARAIE, 1994). Todas as enzimas citadas já foram estudadas em vários trabalhos publicados e como resultado o sistema enzimático que desempenha papel crucial nas alterações das proteínas miofibrilares durante a maturação envolve as enzimas: calpaína I e II, ambas as enzimas cálcio dependente.
O grau de proteólise causado pelas enzimas citadas acima, e consequentemente o grau de maciez da carne analisada, pode ser aferido por meio da análise denominada Índice de Fragmentação Miofibrilar (IFM), que consiste na quantificação do grau de quebra de proteínas estruturais a partir da análise da turbidez de determinada solução contendo uma concentração de proteínas pré-estabelecida. Estudos realizados por (OSLON & PARRISH, 1977) adaptaram a análise e comprovaram a alta correlação entre o IFM e WBSF e também com a análise de maciez por painel treinado, enquanto que em estudo realizado por Crouse et al., (1991) não foi verificado nenhuma correlação positiva entre IFM e WBSF(r = - 0,18) e ente IFM e maciez por painel treinado (r = - 0,31).
4. M ATERI AL E MÉTODOS
Não foi necessária nenhuma aprovação de comitê referente a bem-estar animal uma vez que as amostras foram obtidas de frigoríficos comerciais fiscalizados pelo serviço de inspeção federal (SIF). Para realização da análise sensorial (perfil de textura) foi obtida uma aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Unicamp – Campus Campinas número 50712615.7.0000.5404 (em anexo).
4.1. Animais
Para realização do projeto foram utilizadas 97 amostras de contrafilé (M.
Longissimus lumborum) bovino, provenientes de 4 coletas distintas. Cada coleta
envolveu grupos de animais com diferentes características, incluindo gênero, genótipo, peso médio ao abate, maturidade (Tabela 1). Desta forma foram obtidos resultados com maior variabilidade, aumentando a inferência e melhorando a comparação dos resultados com os encontrados nos cortes cárneos brasileiros. Todas as amostras utilizadas no estudo foram coletadas em frigoríficos comerciais, inspecionados pelo serviço de inspeção federal (SIF).
Tabela 1. Descrição das características dos bovinos de corte (n = 74) nas quatro coletas Coleta 1 (n = 15) Coleta 2 (n = 21) Coleta 3 (n = 26) Coleta 4 (n = 12)
Genótipo Nelore Nelore Nelore e
cruzado Nelore
Gênero Fêmeas Macho não
castrado Macho castrado e não castrado Macho não castrado Sistema de produção
Semi-confinamento Confinamento Confinamento NI
¹ Idade ao abate (meses) 27 ± 4 30 ± 4 20 a 30 NI Peso médio ao abate (kg) 425,8 ± 22,11 542,5 ± 43,51 520,6 ± 51,72 NI ¹
4.2. Amos tras
De todas as amostras obtidas, 74 foram avaliadas no estudo, pois as amostras que apresentaram elevado grau de dureza na análise Slice Shear Force (SSF; maior que 36 kgf) não foram computadas pelo equipamento, uma vez que este não registra força de cisalhamento acima deste valor. Somente as amostras que apresentaram resultados nas análises: Slice Shear Force (SSF), Warner-Bratzler Shear Force (WBSF), comprimento de sarcômero por microscopia (Sarcm), comprimento de sarcômero por difração de raio laser (Sarcl), Índice de fragmentação miofibrilar (IFM), suculência inical (Si), suculência sustentada (Ss), maciez inicial (Mi) e maciez sustentada (Ms) foram incluídas no presente estudo.
Durante a desossa nos frigoríficos foram retiradas peças de contrafilé medindo 10 cm de comprimento coletadas a partir da 12ª vertebra torácica até a 5ª vertebra lombar. As peças foram embaladas a vácuo, armazenadas em caixas térmicas com gelo e transportadas até o local das análises. Uma vez no laboratório, as amostras foram acondicionadas em câmara fria (2°C) e maturadas por 14 dias, a partir da data de abate (Figura 1). Ao término da maturação as amostras foram divididas em 3 bifes de 2,5 cm de espessura para as seguintes análises: o primeiro bife (mais cranial) foi usado para realizar SSF e WBSF, o segundo bife foi destinado a análise sensorial e o último foi utilizado para realizar pH, comprimento de sarcômero (nas duas metodologias) e Índice de Fragmentação Miofibrilar (Figura 2). Todos os bifes foram congelados (- 18°C) após o preparo. Para realização das análises os bifes foram descongelados com antecedência de 24 horas em câmara fria a 2°C.
4.3. Metodologia das a nálises
A seguir são apresentadas descrições resumidas das metodologias empregadas nesta pesquisa.
c
Análises
Figura 1. Fluxograma das atividades realizadas com todas as amostras das coletas. (a) início do processamento na recepção da amostra; (b) preparo dos bifes; (c) bifes porcionados; (d) bifes embalados a vácuo; (e) congelamento dos
bifes; (f) descongelamento. b
a
f e d
Figura 2. Processo realizado em todas as amostras após o término da maturação (14 dias após data de abate).
1) Bife para a nálise de textura. 2) Bife para a nálise sensoria l.
3) Bife para a nálise de pH, comprimento de sarcômero e IFM. 4) Bife reserva . Porção Cranial Porção Caudal 1 2 3 4
Amostra do corte do músculo L. lumborum
4.3.1. pH
Para a medição do potencial hidrogeniônico (pH), foi utilizado equipamento potenciômetro Mettler Toledo MP 125, calibrado previamente com as soluções de calibração 4,01 e 7,00 em temperatura ambiente. Em seguida parte do terceiro bife de cada amostra foi retirada da câmara de resfriamento e triturada com homogeneizador (livre de gordura e tecido conjuntivo). Foram pesados 10 g da amostra em um copo plástico descartável (50 ml) previamente identificado. As amostras foram diluídas em 10 ml de água destilada e homogeneizadas por 10 segundos. Ao fim deste processo foram realizadas 3 leituras aguardando a estabilização dos valores de pH, temperatura para terem suas médias calculadas (Figura 3).
4.3.2. Co mp rimento de sa rcô mero
4.3.2.1. Método ind ireto – difração de raio laser (Sarcl)
As amostras foram fixadas por aproximadamente 4 horas em solução de 5% de glutaraldeído contendo 0.1 M de Na2HP04 com pH 7,2 e temperatura
aproximadamente de 10°C. Após um período de 4 horas as amostras foram lavadas em solução de sacarose 0,2M em pH 7,2 a mesma temperatura de refrigeração (10°C).
Em seguida foi iniciado o preparo das amostras. Com o auxílio de pinça e bisturi, uma porção do terceiro bife de cada amostra, com dimensões de 2 x2x1 cm, foi seccionada no sentido das fibras musculares e colocada em um frasco de vidro
a b c d
Figura 3. Fluxograma da análise de pH. (a) amostra homogenizada; (b) pesagem de 10 g de amostra; (c) adiciona-se 10 ml de água destilada e
pequeno. A solução de glutaraldeído foi adicionada em cada frasco até cobrir a amostra e mantida em refrigeração por 4 horas. Após 4 horas, a solução de glutaraldeído foi descartada e foi substituída pela solução de sacarose até cobrir a amostra (Figura 4).
Com auxílio de pinças, foi removido um pequeno fragmento de fibras musculares e colocado em uma lâmina para microscopia de 26 x 76 mm. As fibras musculares foram separadas, com auxílio de pinças, até se obter 10 pequenos fragmentos. Adicionou-se uma gota da solução de sacarose a lâmina e uma lamínula de 22 x 22 mm foi colocada sobre a amostra (Figura 4).
As lâminas foram levadas ao equipamento de feixe de laser de hélio e neônio (Spectra Physics Inc., Modelo 117A, CA, EUA) com comprimento de onda de 632,8 nm e as miofibrilas foram posicionadas sob a luz do laser para a formação do padrão de difração. Foram medidos os padrões de difração de 10 miofibrilas por lâmina, com auxílio de um paquímetro digital e os valores em milímetros foram utilizados para calcular o comprimento dos sarcômero em micrômetros, conforme Equação 1:
Comprimento do sarcômero, µm =
𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟔𝟑𝟐𝟖 𝐱 𝐃 𝐱 √𝐓𝟐 𝐃𝟐+ 𝟏
𝐓 𝐱 𝟏𝟎𝟎𝟎,
(Eq. 1)
onde “D” é a distância (mm) entre a lâmina e o local de medição, e “T” é a distância medida entre 2 bandas de difração (mm).
Figura 4. Fluxograma da análise de medição do compimento do sarcômero por difração de raio laser (Sarcl). (a) amostras em solução de fixação; (b) preparo
das lâminas; (c) medição do padrão de difração com auxílio do paquímetro.
4.3.2.2. Método direto – microscopia de contraste de fases (Sarcm)
A análise direta envolveu o preparo de amostras para a observação por microscopia. Com esse método, os espaços entre linhas Z adjacentes foram avaliados. Foi utilizado um microscópio acoplado com câmera fotográfica (Figura 5). O protocolo do método utilizado foi o descrito por Culler et al. (1978) e envolveu 4 etapas: (i) preparo da solução de extração das miofibrilas; (ii) extração das miofibrilas; (iii) preparo de lâminas e (iv) captura das imagens das miofibrilas em microscopia de contraste de fases e medição do comprimento do sarcômero com NIS-Elements.
Para preparar dois litros da solução de extração foram utilizados 14,91g de KCl, 2,72g de KH2PO4, 3,5g de K2HPO4, 0,76g de EDTA, 0,41g de MgCl2. Os
reagentes foram dissolvidos em água destilada, ajustou-se o pH para 7,0, utilizando uma solução 1M de NaOH e foram transferidos para um balão volumétrico de dois litros, para ajuste do volume. O tampão depois de preparado foi mantido em refrigeração (2ºC).
Para a extração das miofibrilas partes do terceiro bife das amostras foram retiradas. Com auxílio de um bisturi, aproximadamente quatro gramas de tecido muscular, em duplicata, foram picadas, tomando-se o cuidado de desprezar partes contendo tecido conjuntivo e gorduras. Em seguida as amostras foram colocadas em tubo de centrífuga de polietileno e adicionou-se 40 ml de solução de extração a 2°C seguido de homogeneização com Ultra Turrax a 15 vol (v/w) por 30 segundos. O tubo com o volume homogenizado foi fechado e centrifugado no equipamento da marca Beckman Coulter, modelo Allegra 25R refrigerado, a 1000 G durante 15 minutos à temperatura de 4ºC. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi suspenso novamente com adicionais 40 ml de tampão (2ºC), com o auxílio de um bastão de vidro. O material foi novamente centrifugado a 1000 G, durante 15 minutos a 4ºC. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi mais uma vez suspenso com 10 ml de tampão (2ºC) e agitado no vortex até completa homogeneização. O conteúdo foi peneirado para remover fragmentos de tecido conjuntivo e pedaços maiores. Nos tubos de centrifuga foram novamente adicionados 10 ml de tampão (2ºC), agitados para lavar bem o conteúdo
do tubo e posteriormente passados pela peneira de polietileno. As análises foram realizadas em duplicatas (Figura 5).
Após o preparo das extrações, uma gota foi depositada sobre lâmina para microscopia de 26 x 76 mm e coberta com lamínula de 22 x 22 mm. As lâminas foram examinadas em microscópio da marca Nikon, modelo ECLIPSE Ci-L, por microscopia de contraste de fase, utilizando objetiva de aumento de 100x e ocular de 10x, em óleo de imersão. Foram selecionadas 10 miofibrilas que apresentavam as estruturas miofibrilares mais nítidas, e que apresentavam um número mínimo de aproximadamente 5 sarcômeros em sequência. As miofibrilas foram fotografadas e as imagens capturadas por câmera acoplada ao microscópio da marca Nikon e modelo DS-Fi2 (Figura 5).
As miofibrilas foram posteriormente analisadas por meio do software da marca Nikon, modelo NIS-Elements, e os comprimentos de no mínimo cinco sarcômeros de cada miofibrila foram mensurados. Os resultados para cada amostra foram expressos em micrômetros, com a média global de todos os sarcômeros de todas as miofibrilas fotografadas.
a b c d
g
f e
Figura 5. Fluxograma da análise de medição do comprimento do sarcômero por microscopia de contraste de fase (Sarcm). (a) Corte da amostra; (b) homogenização com Ultra Turrax (c) amostra homogenizada; (d) centrifugação (x2 / 4°C); (e) amostra pós-centrifugação; (f) observação da lâmina; (g) confecção
4.3.3. Índice de fra gmentação miofibrilar (IFM)
A análise de índice de fragmentação miofibrilar (IFM) foi realizada de acordo com o descrito por Culler et al. (1978) e foi composta por 3 etapas: (i) extração das proteínas miofibrilares, (ii) avaliação da concentração proteica e (iii) determinação do índice propriamente dito. Para a realização da análise foram utilizadas duas soluções: solução tampão (a mesma utilizada na análise de comprimento de sarcômero por microscopia de contraste de fase) e a solução de biureto.
Para o preparo da solução de biureto foi dissolvido 1,5 g de sulfato cúprico (CuSO4*5H2O) e 6 g de tartarato de potássio e sódio (Rochelle Salt,
NaKC4H4O6*4H2O) em 500ml de água destilada em um balão volumétrico de 1L.
Com agitação constante, foi adicionado 300 ml de NaOH a 10% livre de carbonato. O volume foi completado até 1L com água destilada e armazenado em um frasco de polietileno marrom.
A etapa de extração das proteínas miofibrilares seguiu o mesmo protocolo utilizado para a extração das miofibrilas, realizado na análise de comprimento de sarcômero por microscopia e contraste de fases (item 4.3.2.2).
A curva padrão foi realizada com as seguintes concentrações proteicas: 0 (branca), 2,5, 5,0, 7,5 e 10,0 mg/ml. O espectrofotômetro utilizado foi da marca BECKMAN, modelo DU-70 com absorbância lida a 540 nM em cuba de vidro. A curva padrão para ser aceita apresentou um “slope” acima de 0,98 e para cada troca de reagente (biureto) uma nova curva padrão foi elaborada (Figura 6).
A determinação da concentração proteica das amostras foi realizada colocando 0,25 ml de cada extração (em duplicata) em tubos de vidro 13 x 100 mm e adicionando 0,75 ml da solução tampão e 4 ml do reagente biureto. Em seguida, os tubos foram agitados no vortex e mantidos em local escuro por 30 minutos. Após 30 minutos os tubos foram levados para o espectrofotômetro e a leitura da absorbância foi lida a 540 nM com cuba de vidro. A partir da leitura das amostras e da curva padrão foi calculada a concentração proteica de cada amostra (Figura 6).
Para determinação do IFM foram feitas novas diluições dos extratos com a solução tampão para obter a concentração de 0.5 mg de proteína/ml em 8 ml (Figura 10). Essas novas soluções foram agitadas no vortex e analisadas pelo mesmo espectrofotômetro e condições anteriores e os resultados encontrados foram multiplicados por 200 para chegar ao resultado final da análise.
4.3.4. Cocção das a mostras para aná lises de ma cie z instru mental e análise senso ria l
Os procedimentos para cocção dos bifes destinados a avaliação sensorial e força de cisalhamento foram realizados utilizando-se adaptações do protocolo experimental descrito pela AMSA (1995).
Figura 6. Fluxograma da análise do índice de fragmentação miofibrilar (IFM). (a) Extração utilizada na análise de comprimento de sarcômero por microscopia de
contraste de fases; (b) tubos de Biureto (c) determinação da concentração proteica através da espectrofotometria; (d) padronização da concentração; (e)
leitura final da absorbância da solução.
a b c
Os bifes foram assados em forno elétrico convencional da marca Fritomaq, modelo 90 x 90 (série 6 - 6000 W) previamente aquecido a 170°C e com o ajuste de temperatura programado para manter esta temperatura durante toda a cocção. Cada bife foi pesado na balança da marca Ohaus, modelo ARD110, antes da cocção e depois colocado no conjunto bandeja de alumínio e grelha. Este procedimento permitiu calcular as perdas durante a cocção (Equação 2). Os conjuntos foram então colocados em forno pré-aquecido, e foram virados após atingir a temperatura de 40 - 50ºC internamente. A medição da temperatura interna nos bifes foi realizado com um termopar metálico, da marca TESTO, modelo 0602.5792 com cabo de 80 cm flexível para alta temperatura, inserido na região central do bife. Ao atingirem a temperatura interna de 71ºC os bifes foram retirados do forno (Figura 7).
𝑝𝑒𝑟𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑐𝑜𝑐çã𝑜, % =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑟𝑖𝑜 − 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑠𝑠𝑎𝑑𝑜
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑟𝑖𝑜 𝑥 100 (Eq. 2)
4.3.5. Macie z in stru menta l
4.3.5.1. Slice Shear Force (SSF)
Para a realização da análise deSlice Shear Force, uma porção de 5 cm da parte central de cada bife foi removida com auxílio da guia de corte específica após o término da cocção. Em seguida, a partir da porção retirada, foi confeccionado
Figura 7. Fluxograma do método de cocção utilizado para o preparo das amostras para as análises de maciez instrumental e sensorial. (a) Conjunto grelha e bandeja de alumínio; (b) forno elétrico convencional e termopares; (c)
amostra pós-cocção; (d) pesagem da amostra pós-cocção.
um fragmento de 1 cm x 5 cm, paralelo ao sentido das fibras musculares (LORENZEN et al., 2010) e analisado em texturômetro da marca TA-XT 2i (Texture Technologies Corp./Stable Micro Systems, UK) equipado, com lâmina de Slice Shear Force, de 1 mm de espessura (Figura 8). O equipamento foi previamente calibrado com um peso de 5kg com padrão rastreável. Cada corpo de prova foi analisado e seu resultado expresso em kgf.
4.3.5.2. W arner-Bratzle r Sh ear Fo rce (W BSF)
O restante do bife não utilizado na análise SSF foi refrigerado 0 – 4°C durante 24 horas e utilizado na análise de WBSF. Para isto foram removidos de 4 a 6 cilindros de 1,27 cm de diâmetros paralelos as fibras musculares com auxílio de um cortador manual (AMSA, 1995). A determinação da força de cisalhamento foi realizada por meio de um texturômetro marca TA-XT 2i (Texture Technologies Corp./ Stable Micro Systems, UK), equipado com lâmina de Warner-Bratzler, de 1 mm de espessura (Figura 9). O equipamento foi previamente calibrado com um peso de 5kg
Figura 8. Fluxograma da análise de avaliação da maciez instrumental Slice Shear Force (SSF). (a) Conjunto amostra e bandeja para cocção; (b) corte a 5
cm da lateral do bife; (c) preparo do corpo de prova para análise; (d) corpo de prova; (e) texturômetro acoplado com lâmina de SSF.
d
c
a b
com padrão rastreável. A velocidade de subida e descida da lâmina foi de 200 mm/min (AMSA, 1995) e a distância da mesma à plataforma de 25,0 mm. Cada cilindro foi cortado uma única vez e o resultado expresso em kgf, considerando as médias.
4.3.6. Análise senso ria l (painel de pe rfil de textura )
A análise sensorial do perfil de textura envolveu quatro etapas distintas: (i) recrutamento, (ii) treinamento, (iii) validação e (iv) teste propriamente dito. Todos os participantes foram recrutados do Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA) da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) da Universidade de Campinas (Unicamp) e possuíam de 20 a 30 anos de idade. Foram realizadas 9 sessões no laboratório de análise sensorial do Departamento de Tecnologia de Alimentos em cabines individuais, com controle de iluminação e de temperatura (Meilgaard, Civille & Carr (1999)) (Figura 10).
Recrutamento
Para o recrutamento da equipe foram convidados 20 indivíduos que frequentam diariamente o DTA os quais compareceram em todas as sessões de análise sensorial. Uma primeira sessão foi realizada para a apresentação da ficha de avaliação, assim como para a familiarização com os termos presentes na mesma. Outras 3 sessões foram realizadas a fim de definir quais seriam os padrões de muito macio ou suculento e pouco macio ou suculento (Tabela 2):
Figura 9. Fluxograma da análise de avaliação da maciez instrumental Warner-Bratzler Shear Force (WBSF). (a) Conjunto amostra e bandeja para cocção; (b) preparo dos 6 cilindros de cada bife; (c) realização da análise com texturômetro
equipado com lâmina de WBSF. b
Tabela 2. Padrões utilizados na análise sensoriail com seus respectivos cortes cárneos e modo de preparo.
Padrão Músculo/corte Modo de preparo
Extremamente
macio/suculento Infraspinatus/raquete
Bife de 2,5 cm assado em forno elétrico até atingir 65°C
Extremamente duro/seco
Bíceps femoris/coxão duro
Bife de 1,5 cm assado em forno elétrico até atingir 75°C
Foram utilizadas escalas de intensidade para avaliar os atributos maciez e suculência nas amostras de 1 a 8, sendo 8 extremamente macio, extremamente suculento e 1 extremamente duro, extremamente seco).
Treiname nto
O treinamento foi realizado em três sessões distintas. Para cada sessão foi preparado um bife de cada padrão (Tabela 2). As amostras foram disponibilizadas aos provadores em cubos (1 x1 cm) em copos descartáveis e ao final os participantes discutiam e entravam em consenso quanto a nota dado para cada amostra.
Validação
A etapa de validação envolveu três sessões nas quais cada provador recebeu cubos (1x1cm) de três cortes cárneos distintos: psoas major / filet mignon, biceps
femoris / coxão duro e semimembranosus / lagarto. Os participantes avaliaram cada
amostra e ao final as notas foram avaliadas através do software Statistica 7 (STATSOFT, 2005). Dos 20 indivíduos selecionados, 15 apresentaram bom poder discriminativo (p amostra < 0,30) e boa reprodutibilidade nos julgamentos (p repetições > 0,05) e foram selecionados para compor a equipe descritiva final (DAMÁSIO e COSTELL, 1991).
Teste propriame nte dito
Para a execução da análise sensorial propriamente dita foram realizadas duas sessões por dia por um período de duas semanas. Os resultados foram analisados de acordo com a descrição no item análise estatística.
Preparo das amos tras pa ra sensoria l
A cocção das amostras foi similar ao processo descrito anteriormente na análise de maciez instrumental (WBSF ou SSF). Ao término da cocção, os bifes foram cortados em cubos de 1,0 x 1,0cm e acondicionados no interior de uma estufa pré-aquecida (40 – 45°C) (Figura 10). Cada provador recebeu dois cubos de cada amostra para avaliação dos atributos.
Ficha d e avalia ção
A ficha de avaliação utilizada na análise sensorial continha 4 atributos a serem avaliados; maciez inicial e sustentada e suculência inicial e sustentada, por meio de uma escala de 1 a 8 pontos, sendo 1 extremamente seco ou duro e 8 extremamente suculento ou macio. O atributo maciez inicial foi considerado como a força necessária para o primeiro corte da amostra com os dentes incisivos, enquanto a maciez sustentada foi classificada como a força necessária durante a segunda mastigação até a deglutição. O atributo suculência inicial foi denominada como a
d c
Figura 10. Fluxograma da análise sensorial (perfil de textura). (a) Conjunto amostra bandeja cocção ao final da cocção; (b) corte dos bifes em cubos (1 cm x
1 cm) (c) estufa para manutenção das amostras; (d) cabines individuais para realização da análise.
quantidade de líquido liberado pela amostra na primeira mastigação, já a suculência sustentada foi classificada como a quantidade de líquido liberada pela amostra após a segunda mastigação até a deglutição.
O modelo de ficha escolhido foi uma adaptação a partir da ficha de análise sensorial preconizada pelo guia de avaliação de maciez (AMSA, 1995) (Figura 11).
4.4. Análise Es tatístic a
O banco de dados das quatro coletas (n = 97) foi importado utilizando o procedimento IMPORT do SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC). Foi realizada a remoção das 23 amostras que não foram avaliadas para SSF.
As variáveis paramétricas (e.g., pH e SSF) foram analisadas pelo procedimento MEANS para calcular o número de observações, soma, média, desvio e erro padrão, valores mínimo e máximo. Foi utilizado o procedimento UNIVARIATE para avaliar a presença de dados atípicos.
As variáveis não paramétricas (e.g., perfil de textura avaliada por painel sensorial) foram avaliadas pelo procedimento FREQ para analisar as estatísticas de frequência.
As variáveis paramétricas (PPC, SSF, WBSF, pH, Sarcm, Sarcl e IFM) foram avaliadas pelo procedimento MIXED do SAS. O efeito de frigorífico em que os animais foram abatidos foi contemplado no modelo linear misto (MLM, Eq. 3), como segue:
𝑦𝑖𝑗 = 𝜇 + 𝐸𝑖 + 𝑒𝑖𝑗 (Eq. 3)
em que: 𝑦𝑖𝑗 é a resposta da coleta da classe 𝑖; 𝜇 é média da população; 𝐸𝑖 é a classe da coleta 𝑖, onde 𝑖 = 1, 2, 3 e 4 e 𝑒𝑖𝑗 é o erro do modelo, onde 𝑒𝑖𝑗 ~ 𝑁𝐼𝐷 (0, 𝜎2).
Após ANOVA, foram estimadas as médias de quadrados mínimos, bem como os respectivos erros-padrão. O teste de Tukey foi utilizado para comparar as médias entre as coletas.
Os resíduos Studentizados foram testados para a normalidade utilizando o procedimento CAPABILITY, e sendo necessário, os dados foram transformados pelo método Box-Cox (PELTIER et al., 1998), por meio do procedimento TRANSREG do SAS.
As variáveis não paramétricas entre os respondentes foram avaliadas e comparadas utilizando o teste de múltiplas amostras Kruskal-Wallis utilizando o
procedimento NPAR1WAY. O teste de Chi-Square foi utilizado para comparar as classes das coletas.
Os resíduos Studentizados provenientes do MLM (Eq. 3) das variáveis paramétricas foram organizados para a formação de um novo banco de dados. Este banco de dados de resíduos contendo as amostras de todas as coletas foi estratificado em quatro novos bancos de dados (n = 5, uma para cada coleta e um com todas as coletas unificadas). Estes cinco bancos de dados residuais foram analisados pelo procedimento CORR, em que o valor da correlação e as respectivas probabilidades foram estimados.
5. RESULT ADO E DISCUSS ÃO
5.1. Análise es tatís tic a descritiva
As médias, erros padrão das médias e os valores máximos e mínimos das análises realizadas nas 74 amostras do estudo são apresentados na Tabela 3.
O valor de pH mais elevado encontrado foi 5,9, portanto, a alteração denominada Dark, Firm and Dry (DFD) não foi observada em nenhuma amostra do presente estudo (HONIKEL, 2004). Foi observado um menor valor de pH (P < 0,05) para a coleta 4 (5,58) quando comparado com as coletas 2 (5,71) e 3 (5,70) (Tabela 4). O valor de pH final foi um dos critérios utilizados para exclusão de amostras da coleta, quando os valores fossem maiores que 6.0. Entretanto, no presente estudo, não foram encontradas amostras com valores de pH igual ou superior a 6.0.
Tabela 3. Valores das médias ± erro padrão da média, desvio padrão, mínimos e máximos de todas as análises com as amostras agrupadas (n = 74)
* Escala estruturada de 8 pontos (1-extremamente seco e duro; 8-extremamente suculento e maciez.
Análise Média±EPM Desvio
Padrão Mínimo Máximo
pH 5,7 ± 0,01 0,13 5,4 5,9
Sarcômero difração de raio laser
(µm) 1,7 ± 0,03 0,22 1,3 2,8
Sarcômero microscopia (µm) 2,0 ± 0,02 0,16 1,7 2,8
Índice de Fragmentação
Miofibrilar 69,2 ± 1,70 14,63 41,73 107,1
Perda por cocção (%) 21,7 ± 0,41 3,57 13,6 31,3
SSF - Slice Shear Force (kgf) 21,8 ± 0,84 7,20 10,3 35,9
Warner Bratzler Shear Force
(kgf) 4,0 ± 0,14 1,16 2,0 8,2 Análise sensorial* Maciez inicial 5,9 ± 0,11 0,94 3,7 7,6 Maciez sustentada 5,9 ± 0,11 0,93 3,6 7,7 Suculência inicial 5,2 ± 0,09 0,76 3,0 6,7 Suculência sustentada 5,3 ± 0,09 0,78 3,1 6,8
Não foram verificadas diferenças nas coletas para as análises de comprimento de sarcômero via microscopia ou laser (P > 0,05) (Tabela 4), e segundo Honikel, (2004) os valores médios observados em ambas as análises não foram relacionados a ocorrência do encurtamento pelo frio (cold-shortening).
Para o índice de fragmentação miofibrilar a coleta 2 apresentou o menor valor (60,0) e diferiu das coletas 1 (73,3), 3 (72,7) e 4 (75,6); P < 0,05) (Tabela 4). O menor valor indicou que as amostras da coleta 2 sofreram uma proteólise menos intensa que os demais coletas e isto está de acordo com os valores encontrados na análise SSF e WBSF das coletas 3 e 4, os quais demonstram uma menor maciez instrumental para a coleta 2. Tal fato também foi observado por Olson and Parrish (1977), MacBride and Parrish (1977) e Moller et al. (1973) que afirmaram que maior parte da maciez da carne está relacionada ao índice de fragmentação miofibrilar. Contudo, apesar de apresentar um menor valor no índice de fragmentação miofibrilar, a coleta 2 não diferiu da coleta 1 quanto aos valores observado nas análises de SSF e WBSF.
Os valores de perda de peso por cocção apresentaram pouca variação entre as quatro coletas (20 a 25%). Entretanto, a coleta 2 apresentou menor valor (19,6%; P < 0,05) quando comparado com as coletas 3 (22,8%) e 4 (23,2%). A pequena variação nos valores de PPC pode ser explicada pela padronização do preparo das amostras, assim como padronização do método de cocção.
Em relação à maciez instrumental, as amostras das coletas 1 (26,8 kgf) e 2 (25,9 kgf) apresentaram maiores valores de SSF que as das coletas 3 (17,6 kgf) e 4 (17,8 kgf) (P < 0,05), não diferindo entre si (P > 0,05).
Quando avaliado por WBSF, foi observado que as amostras da coleta 2 apresentaram maior dureza (maiores valores de WBSF) (P < 0,05) que as das coletas 3 e 4, não diferindo das amostras da coleta 1 (P > 0,05). As amostras da coleta 1 apresentaram maiores valores de WBSF que as coletas 3 e 4 (P < 0,05), não diferindo entre si (P > 0,05).
Observa-se que as análises de WBSF e SSF possuíram um poder de discriminante diferente. Entretanto, de acordo com os padrões de maciez definidos pela American Society for Testing and Materials (ASTM) e utilizados pela USDA para
certificar produtos como macios ou muito macios, as amostras das coletas 1 e 2 não atingiram os valores mínimos para serem consideradas macias (menor que 4.4 kgf para WBSF e 20 kgf para SSF). Contudo as amostras das coletas 3 e 4 foram classificadas como muito macias na análise WBSF (valores menores que 3.9 kgf) e como macias na análise SSF (entre 15,4 e 20 kgf).
Os resultados obtidos na análise de perfil de textura realizada por painel treinado são apresentados na Tabela 11.
Para o atributo maciez inicial a coleta 3 apresentou valor mais elevado (6,32) (P < 0,05) que as coletas 1 e 2. Para maciez sustentada foi observado que a coleta 3 apresentou o maior valor (6,38) e diferiu das coletas 2 e 4 (P < 0,05). Também foi observado menor valor (5,14) na coleta 1, quando comparado como as coletas 2 (5,83) e 3 (6,38) (P < 0,05). Todavia os valores de análise sensorial de maciez condizem com os resultados encontrados pelas avaliações de maciez instrumental.
Para os atributos suculência inicial e sustentada não foram observadas diferenças entre as coletas.
Tabela 4. Valores de média ± erro padrão da média e valores de P para cada análise por coleta. Variáveis Coletas Valor de P 1 (n = 15) 2 (n = 21) 3 (n = 26) 4 (n = 12) 1 vs. 2 1 vs. 3 1 vs. 4 2 vs. 3 2 vs. 4 3 vs. 4 pH 5,7 ± 0,03 5,7 ± 0,03 5,7 ± 0,02 5,6 ± 0,04 0,40 0,64 0,46 0,96 0,02 0,04 Sarcl (µm) 1,7 ± 0,06 1,6 ± 0,05 1,8 ± 0,04 1,70 ± 0,06 0,53 0,98 0,94 0,19 0,91 0,75 Sarcm (µm) 2,0 ± 0,04 2,0 ± 0,03 1,9 ± 0,03 1,9 ± 0,05 1,00 0,68 0,71 0,45 0,53 1,00 IFM 73,3 ± 3,50 60,0 ± 2,98 72,7 ± 2,67 75,6 ± 3,93 0,03 1,00 1,00 0,01 0,06 1,000 PPC (%) 21,6 ± 0,86 19,6 ± 0,72 22,8 ± 0,65 23,2 ± 0,95 0,28 0,67 0,61 < 0,01 0,01 0,98 SSF (kgf) 26,8 ± 1,52 25,9 ± 1,29 17,6 ± 1,16 17,8 ± 1,71 0,97 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 1,00 WBSF(kgf) 4,5 ± 0,24 4,9 ± 0,20 3,2 ± 0,18 3,6 ± 0,27 0,62 < 0,01 0,04 < 0,01 < 0,01 0,73 SSF=Slice Shear Force, WBSF=Warner-Bratzler Shear Force, Sarcm=sarcômero microscopia, Sarcl=sarcômero difração de raio laser, IFM=Índice de fragmentação miofibrilar.
Col 1: Nelore, fêmeas, semi-confinamento, 27 ± 4 meses ao abate e peso médio ao abate 425,8 ± 22,11 kg;
Col 2: Nelore, machos não castrados, confinamento, 30 ± 4 meses ao abate e peso médio ao abate 542,5 ± 43,51 kg
Col 3: Nelore e cruzados, machos castrados e não castrados, confinamento, 20 a 30 meses ao abate e peso médio ao abate 520,6 ± 51,72 kg Col 4: Nelore, machos não castrados, NI, NI meses ao abate e peso médio ao abate NI kg
Tabela 5. Valore das médias ± erro padrão da média e mean score dos atributos avaliados pela análise sensorial (perfil de textura) por painel treinado.
*Escala estruturada de 8 pontos (1-extremamente seco e duro; 8-extremamente suculento e macio).
Col 1: Nelore, fêmeas, semi-confinamento, 27 ± 4 meses ao abate e peso médio ao abate 425,8 ± 22,11 kg;
Col 2: Nelore, machos não castrados, confinamento, 30 ± 4 meses ao abate e peso médio ao abate 542,5 ± 43,51 kg;
Col 3: Nelore e cruzados, machos castrados e não castrados, confinamento, 20 a 30 meses ao abate e peso médio ao abate 520,6 ± 51,72 kg; Col 4: Nelore, machos não castrados, NI, NI meses ao abate e peso médio ao abate NI kg.
Atributo*
Coletas Pr > Chi – Quadrado
1 2 3 4 1 vs. 2 1 vs. 3 1 vs. 4 2 vs. 3 2 vs. 4 3 vs. 4 Maciez inicial 5,38±0,23 (25,5) 5,71±0,21 (33,2) 6,32±0,17 (47,5) 5,93±0,24 (38,3) 0,28 < 0,01 0,08 0,02 0,49 0,16 Maciez sustentada 5,14±0,23 (21,5) 5,83±0,19 (36,8) 6,38±0,15 (49,7) 5,67±0,23 (32,3) 0,03 < 0,01 0,10 0,03 0,47 0,02 Suculência inicial 5,25±0,14 (36,6) 5,30±0,20 (39,5) 5,05±0,16 (32,9) 5,51±0,17 (45,0) 0,74 0,53 0,21 0,33 0,61 0,11 Suculência sustentada 5,14±0,14 (33,1) 5,58±0,18 (45,1) 5,16±0,18 (35,0) 5,25±0,18 (35,0) 0,09 0,86 0,75 0,12 0,20 0,95
5.2. Corre lações
Os resultados da análise de correlação simples, isoladamente para cada uma das coletas, estão apresentados na Tabela 6. Na Tabela 7 são apresentados os coeficientes de correlação, agrupando-se todos os resultados das quatro coletas (n = 74).
5.2.1. Correla ções co m a macie z in stru menta l
Foram observadas correlações positivas significativas (P < 0,05) entre SSF e WBSF em todas as coletas, sendo que as coletas 2 e 4 apresentaram os maiores valores 0,81 e 0,84 (P < 0,01), respectivamente. Na análise com todas as amostras (n = 74) observou-se correlação significativa (r = 0,69; P < 0,05) para SSF e WBSF. Os resultados observados condizem com estudos realizados por Shackelford et al. (1999b) (r = 0,80; P < 0,01). Derington et al. (2010) também encontraram coeficientes de correlações significantes para SSF vs WBSF (r = 0,64; P < 0,05), quando avaliaram amostras maturadas por 21 dias. A partir da correlação entre SSF e WBSF para as amostras agrupadas foi possível obter uma equação de conversão (Equação 3):
𝑦 = 4,9751𝑥 + 1,8263 (Eq. 3)
Onde y é o valor de SSF e x é o valor de WBSF.
Apenas a coleta 4 (r = - 0,70; P < 0,05) apresentou coeficiente de correlação negativa significativo entre SSF e Sarcl. Foi observada apenas uma tendência nas coletas 1 (r = - 0,48) e 2 (r = - 0,43).
A correlação entre SSF e Sarcm foi significativa apenas na coleta 2 (r = - 0,48; P < 0,05). Avaliando todas as amostras em conjunto foram observadas correlações baixas, mas significativas (P < 0,05), r = - 0,23 (SSF e Sacrl) e r = - 0,28 (SSF e Sarcm). Para WBSF e Sarcl foi observado um coeficiente de correlação negativo significativo (P < 0,05) na coleta 4 (r = - 0,73). Já entre o WBSF e Sarcm, não foram encontrados coeficientes de correlação significantes nas coletas. Para todas as amostras agrupadas (n = 74) foram encontrados coeficientes de correlação negativos significantes (P < 0,05) para WBSF e Sarcl (r = - 0,26). Smulders et al. (1990) encontraram coeficientes significantes para WBSF vs Sarcl (r = -0,50; P <
0,01), enquanto Culler et al. (1978) não encontrou correlação significativa para WBSF e Sarcm (P = - 0,20).
Vários autores encontraram uma alta correlação entre o comprimento de sarcômero e maciez quando é realizado algum tipo de estiramento ou encolhimento do tamanho do sarcômero (LOCKER & HAGYARD, 1963; HERRING et al., 1965; HOSTETLER et al., 1970). A não manipulação do comprimento dos sarcômeros no presente estudo pode ser o motivo pelo qual os valores dos coeficientes de correlações encontrados tenham sido limitados.
Avaliando-se a correlação entre SSF e os atributos da análise sensorial observou-se significância (P < 0,05) com a maciez inicial em todas as coletas. Para maciez sustentada as coletas 1, 2 e 4 apresentaram valores de correlações negativos significativos (P < 0,05). A coleta 3 não apresentou uma correlação estatisticamente significativa (P < 0,10), mas podemos inferir que isto demonstra uma tendência a significância. Os maiores coeficientes de correlação com a maciez inicial e sustentada foram observados as coletas 4 (r = - 0,92 para Mi; r = - 0,79 para Ms) e 1 (r = - 0,79 para Mi; r = - 0,79 para Ms). Para todas as amostras em conjunto observou-se coeficientes de correlação significantes (P < 0,05) entre SSF e os atributos de maciez inicial e sustentada (r = - 0,61 e r = - 0,55, respectivamente). Shackelford et al. (1999), ao avaliarem a correlação entre SSF e o painel sensorial treinado (maciez), encontraram coeficientes negativos de correlação semelhantes aos encontrados no presente estudo (r = -0,76; P < 0,01). Nenhuma correlação significativa foi encontrada quando comparamos os valores de SSF e da suculência inicial e sustentada.
Todas as coletas do estudo apresentaram coeficientes de correlação significativos e negativos (P < 0,05) para WBSF vs. maciez inicial, sendo que o valor mais elevado encontrado foi na coleta 4 (r = - 0,92). Essa coleta também foi a única a apresentar correlações negativas significativas (P < 0,05) entre WBSF e suculência inicial (r = - 0,73) e sustentada (r = - 0,66). A correlação entre WBSF e maciez inicial foi negativa e significativa (r = - 0,61). Os resultados encontrados estão de acordo com os resultados apresentados nos estudos de Culler et al. (1978) que também encontraram coeficientes de correlação negativos significantes para WBSF vs maciez sensorial (r = - 0,90 (aqui sim); P < 0,01) e para WBSF vs. suculência (r = - 0,23; P < 0,05). A partir dos coeficientes de correlação encontrados
