UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE TECNOLOGIA
MESTRADO EM TECNOLOGIA
Francine Inforçato Vacchi
Eco/genotoxicidade do corante comercial CI Disperse Red 1
e seus subprodutos clorados
Limeira
2012
i
Francine Inforçato Vacchi
Eco/genotoxicidade do corante comercial CI Disperse Red 1
e seus subprodutos clorados
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
da Faculdade de Tecnologia da Universidade
Estadual de Campinas, como requisito para a
obtenção do título de Mestre em Tecnologia.
Área de concentração: Tecnologia para o
Ambiente
Orientadora: Profª Drª Gisela de Aragão
Umbuzeiro
Limeira
2012
iv
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais Erico e Silvia, ao meu irmão Randal
e ao meu marido Marcos,
v
Agradecimentos
À Profª Drª Gisela de Aragão Umbuzeiro, pela orientação e pelos valiosos ensinamentos, mas acima de tudo pela amizade e confiança.
Aos colegas do curso de pós-graduação da FT, especialmente Mariana C. Artal, Alyson R. Ribeiro, Jaqueline G. Honório, Daniel A. Morales e Luis A. Visani de Luna.
À toda equipe do LEAL, especialmente Josiane Vendemiatti, Adria C. de Oliveira e Gilberto de Almeida.
À Anjaína F. Albuquerque, pela amizade, por todos os ensinamentos e auxílios nos procedimentos químicos.
Ao Dr. Harold Freeman do College of Textiles – North Carolina State University – USA, pelo auxílio na caracterização química.
À Profª Drª Regina Monteiro do CENA/USP, pelos ensaios com Daphnia magna.
À Profª Drª Maria Valnice Boldrin Zanoni e pós-doutorando Guilherme Julião Zocolo do Instituto de Química da UNESP de Araraquara, pelo auxílio na caracterização química.
vi
“Somos o que fazemos, mas somos, principalmente, o que fazemos para mudar o que somos.”
vii
Resumo
Cerca de 70% dos corantes utilizados em indústrias têxteis são corantes do tipo azo, que se caracterizam pelo grupo -N=N- ligado a sistemas aromáticos, sendo que a função azo inclui os principais tipos de corantes. A eliminação da cor no efluente é um grande desafio para o setor têxtil, já que, aproximadamente, 15% da produção mundial de corantes são descartados para o meio ambiente durante sua produção, processamento e aplicação. O corante comercial Disperse Red 1 utilizado neste trabalho é composto por seis corantes diferentes e surfactante, porém o corante principal em sua composição é o Disperse Red 1 (N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-4-(4-nitrophenylazo) aniline; CAS number 2872-52-8) com 60% em massa. O corante comercial foi submetido ao processo de cloração com gás cloro, simulando as condições utilizadas em Estações de Tratamento de Efluentes. A toxicidade do corante comercial CI Disperse Red 1 e do subproduto clorado foi avaliada em testes agudos com Ceriodapnhia dubia, Ceriodaphnia
silvestrii, Daphnia similis, Daphnia magna, Hydra attenuata, e em testes crônicos com Pseudokirchneriella subcapitata, Ceriodapnhia dubia, e Hydra attenuata. A mutagenicidade foi
avaliada com ensaio Salmonella/microssoma com as linhagens TA98, TA100 e YG1041. D.
similis foi o organismo mais sensível ao corante comercial; e H. attenuata foi mais sensível ao
subproduto clorado. A CE50 obtida para D. similis para o corante comercial é similar ao corante puro, mostrando que a toxicidade do corante comercial é devido ao Disperse Red 1. O subproduto clorado foi menos tóxico do que o corante para todos os organismos testados, com exceção de H.
attenuata. Porém, o subproduto clorado foi mais mutagênico do que o corante para todas as
linhagens testadas. Mais estudos são necessários para compreender os mecanismos envolvidos na toxicidade destes corantes, considerando sua alta toxicidade para organismos aquáticos, a fim de fornecer informações para a elaboração de corantes ambientalmente corretos. Os resultados obtidos neste trabalho podem fornecer informações úteis para a derivação de critérios para qualidade da água para esse corante.
viii
Abstract
About 70% of dyes used in textiles industries are of type azo. These days 15% of the dye world production is discharged into the environment during its production, processing and application. Effluent that contains dyes must have their color removed in order to be in compliance with environmental regulations, but sometimes the treatment can lead to more toxic compounds. The commercial azo dye Disperse Red 1 used in this study is composed of six different dye constituents and surfactant; however the main dye of the commercial product is the Disperse Red 1 (N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-4-(4-nitrophenylazo) aniline; CAS number 2872-52-8). Commercial dye samples were treated with chlorine gas, in order to simulate the conditions used in effluent treatment plant. The ecotoxicity of the commercial dye and chlorinated byproduct was evaluated in acute tests with Ceriodaphnia dubia, Ceriodaphnia silvestrii, Daphnia similis,
Daphnia magna, and Hydra attenuata as well as in chronic toxicity tests with Pseudokirchneriella subcapitata, Ceriodapnhia dubia and Hydra attenuata. Mutagenicity was
evaluated using Salmonella/microsome assay with TA98, TA100 and YG1041 strains. The commercial dye Disperse Red 1 was similarly toxic to P. subcapitata, C. dubia and D. similis, even with different endpoints. The chlorinated byproduct was less toxic to all organisms tested than the dye, except for H. attenuata. The toxicity of the commercial dye is due to Disperse Red 1 itself and the surfactant does not seem to contribute to the toxicity, at least to D. similis. The chlorinated byproduct was more mutagenic than the commercial dye. More studies are necessary to address the mechanisms involved in the toxicity of this azo dye considering its high toxicity to aquatic organisms in order to provide information for the design of more environmental friendly dye products. The results obtained in this work can provide useful information for the derivation of water quality criteria for this dye.
ix
Lista de Figuras
Figura 1. Sistema utilizado na cloração do corante comercial Disperse Red 1. ... 13
Figura 2. Pseudokirchneriella subcapitata. ... 15
Figura 3. Daphnia similis ... 17
Figura 4. Daphnia magna ... 17
Figura 5. Ceriodaphnia silvestrii ... 17
Figura 6. Ceriodaphnia dubia ... 17
Figura 7. Hydra attenuata ... 19
Figura 8. Esquema do ensaio de mutagenicidade Salmonella/microssoma segundo a norma ISO 16240:2005. ... 21
Figura 9. Separação dos componentes do corante comercial Disperse Red 1. ... 23
Figura 10. Frações do corante comercial Disperse Red 1. ... 23
Figura 11. Cromatografia de Camada Delgada (CCD) das frações do corante comercial Disperse Red 1. ... 24
Figura 12. Espectro de massa e estrutura química da Fração 1 do corante comercial. ... 25
Figura 13. Espectro de massa e estrutura química da Fração 2 do corante comercial. ... 26
Figura 14. Espectro de massa e estrutura química da Fração 3 do corante comercial. ... 26
Figura 15. Espectro de massa e estrutura química da Fração 4 do corante comercial. ... 27
Figura 16. Espectro de massa e estrutura química da Fração 6 do corante comercial. ... 27
Figura 17. Espectro de massa e estrutura química da Fração 8 do corante comercial. ... 28
Figura 18. Resultado da remoção de cor após a cloração do corante comercial. ... 30
Figura 19. Espectros de absorção no visível (400 – 700 nm) do corante comercial (50 mg/L) e do subproduto clorado (4, 8, 12, 16, 20 e 30 minutos de cloração)... 30
Figura 20. Cromatograma obtido em EMS no modo TIC. ... 32
Figura 21. Espectros de massas (EPI) obtidos em estágio MS/MS dos produtos de degradação. 32 Figura 22. Esquema representativo da degradação do corante Disperse Red 1 via cloração baseado em estruturas identificadas por LC-ESI-MS/MS. ... 34
Figura 23. Toxicidade aguda do corante comercial e dos seus componentes para D. similis. ... 36
Figura 24. Toxicidade aguda do corante comercial e do surfactante para D. similis. ... 37 Figura 25. Potências mutagênicas do corante comercial, da fração F4 e do corante puro (95%) (Oliveira et al., 2010) para a linhagem YG1041 na presença e ausência de ativação metabólica. 40
x
Lista de Tabelas
Tabela 1. Classificação dos corantes têxteis de acordo com o uso e o método de aplicação à fibra têxtil (HUNGER, 2003). ... 3 Tabela 2. Classificação dos principais grupos cromóforos de corantes têxteis e suas estruturas químicas (HUNGER, 2003). ... 4 Tabela 3. Valores de Rf das frações do corante comercial Disperse Red 1 obtidos na CCD. ... 24
Tabela 4. Valores dos picos de massa obtidos em versus a massa exata de cada fração. ... 25 Tabela 5. Estruturas químicas das frações, suas respectivas quantidades recuperadas e porcentagens em massa do corante comercial. ... 29 Tabela 6. Massa molecular (MM), tempos de retenção (tR), íons produto e estruturas propostas
para os produtos de degradação do corante Disperse Red 1. ... 33 Tabela 7. Valores de CE50 e CL50 obtidos nos testes de toxicidade aguda com o corante comercial e o subproduto clorado. ... 35 Tabela 8. Valores de CI50 obtidos nos testes de toxicidade crônica com o corante comercial e o subproduto clorado. ... 35 Tabela 9. Potências mutagênicas (rev./µ g) do corante comercial e subproduto clorado testados com as linhagens YG1041, TA98 e TA100. ... 39 Tabela 10. Potências mutagênicas (rev./µg) dos componentes do corante comercial testadas com a linhagem YG1041 na presença e ausência de ativação metabólica. ... 39 Tabela 11. Dados do teste de toxicidade crônica com P. subcapitata para o corante comercial Disperse Red 1. ... 49 Tabela 12. Dados do teste de toxicidade crônica com P. subcapitata para o subproduto clorado. 49 Tabela 13. Dados dos testes de toxicidade aguda com D. similis, D. magna, C. dubia e C.
silvestrii para o corante comercial Disperse Red 1... 50
Tabela 14. Dados dos testes de toxicidade aguda com D. similis, D. magna, C. dubia e C.
silvestrii para o subproduto clorado. ... 50
Tabela 15. Dados do teste de toxicidade crônica com C. dubia para o corante comercial Disperse Red 1. ... 51 Tabela 16. Dados do teste de toxicidade crônica com C. dubia para o subproduto clorado. ... 51 Tabela 17. Dados do teste de toxicidade aguda com H. attenuata para o corante comercial Disperse Red 1. ... 52 Tabela 18. Dados do teste de toxicidade aguda com H. attenuata para o subproduto clorado. .... 52 Tabela 19. Dados do teste de toxicidade crônica com H. attenuata para o corante comercial Disperse Red 1. ... 53 Tabela 20. Dados do teste de toxicidade crônica com H. attenuata para o subproduto clorado. .. 53
xi
Tabela 21. Dados dos testes de mutagenicidade com a linhagem TA98 para o corante comercial Disperse Red 1, com e sem ativação metabólica (S9). ... 54 Tabela 22. Dados dos testes de mutagenicidade com a linhagem TA98 para o subproduto clorado, com e sem ativação metabólica (S9). ... 54 Tabela 23. Dados dos testes de mutagenicidade com a linhagem TA100 para o corante comercial Disperse Red 1, com e sem ativação metabólica (S9). ... 55 Tabela 24. Dados dos testes de mutagenicidade com a linhagem TA100 para o subproduto clorado, com e sem ativação metabólica (S9). ... 55 Tabela 25. Dados dos testes de mutagenicidade com a linhagem YG1041 para o corante comercial Disperse Red 1, com e sem ativação metabólica (S9). ... 56 Tabela 26. Dados dos testes de mutagenicidade com a linhagem YG1041 para o subproduto clorado, com e sem ativação metabólica (S9). ... 56
xii
Lista de Siglas e Abreviaturas
ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas CCD – Cromatografia de Camada Delgada
CE50 – Concentração de efeito em 50% dos organismos CH2Cl2 – Diclorometano
CI25 – Concentração de inibição em 25% dos organismos CI50 – Concentração de inibição em 50% dos organismos CID – Dissociação Induzida por Colisão
CL50 – Concentração letal em 50% dos organismos cm – Centímetros
CONAMA – Conselho Nacional de Meio Ambiente Da – Daltons
DPD – N,N’-dietil-p-fenildiamina EMS – Enhanced Mass Spectrometry EPI – Enhanced Product Ion
ER – Enhanced Resolution ESI – Electrospray
H20 – Água
HPLC – High Performance Liquid Chromatography ISO – International Organization for Standardization KMnO4 – Permanganato de Potássio
kV – Quilovolts L – Litros LC – Liquid Chromatography MeOH – Metanol mg – Miligramas min – Minutos mL – Mililitros
xiii MM – Massa Molecular
MS/MS – Mass Spectrometry N2 – Gás Nitrogênio
NaCl – Cloreto de Sódio nm – Nanômetros rev – Revertentes
Rf – Distância percorrida pela amostra em relação à distância percorrida pelo solvente rpm – Rotações por minuto
TIC – Cromatograma de Íons Totais tR – Tempo de Retenção
UFC – Unidades Formadoras de Colônias V – Volts
λmax – Comprimento de onda máximo
°C – Grau Celsius µg - Micrograma µ L – Microlitros µm – Micrômetros 2aa – 2-aminoantraceno 4nop – 4-nitro-o-diamino-fenilina 4nqo – 4-nitroquinolina
xiv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 3
2.1 CORANTES TÊXTEIS ... 3
2.2 TRATAMENTO DOS EFLUENTES TÊXTEIS... 6
2.3 TOXICIDADE DOS CORANTES ... 7
3 OBJETIVOS ... 10
4 MÉTODOS ... 11
4.1 AMOSTRA ... 11
4.1.1 Corante Comercial CI Disperse Red 1 ... 11
4.1.2 Caracterização Química do Corante Comercial CI Disperse Red 1 ... 11
4.1.3 Cloração do Corante Comercial CI Disperse Red 1 ... 12
4.1.4 Caracterização Química do Subproduto Clorado ... 13
4.2 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE... 15
4.2.1 Teste de Toxicidade com Algas ... 15
4.2.2 Teste de Toxicidade com Cladoceras ... 16
4.2.3 Teste de Toxicidade com Cnidários... 18
4.3 AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE ... 20
4.4 CONTROLE DE QUALIDADE ... 22
4.5 GERENCIAMENTO DOS RESÍDUOS ... 22
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 23
5.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CORANTE COMERCIAL CIDISPERSE RED 1 ... 23
5.2 CLORAÇÃO DO CORANTE COMERCIAL CIDISPERSE RED 1 ... 30
5.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO SUBPRODUTO CLORADO ... 31
5.4 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE... 35
5.5 AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE ... 38
6 CONCLUSÕES ... 41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 42
APÊNDICE A – CARTA-CONTROLE DOS ORGANISMOS-TESTE ... 48
APÊNDICE B – DADOS DOS TESTES DE TOXICIDADE ... 49
1
1
INTRODUÇÃO
As indústrias têxteis caracterizam-se pelo alto consumo de água e consomem aproximadamente dois terços da produção total de corantes (MELGOZA et al., 2004). A água é utilizada, principalmente, para remoção de impurezas, aplicação de agentes finalizadores e de corantes. As classes químicas de corantes mais utilizados em escala industrial são do tipo Azo, Antraquinona, Enxofre, Trifenilmetil e derivados de Ftalocianinas, sendo que cada qual pode ser fixado às fibras têxteis por diferentes métodos (GUARATINI e ZANONI, 2000).
Cerca de 70% dos corantes utilizados em indústrias têxteis são corantes do tipo azo, que se caracterizam pela presença de um ou mais grupos azo (-N=N-) ligados a sistemas aromáticos; sendo que os corantes azo são considerados uma importante classe de corantes sintéticos (CATANHO et al., 2006).
Durante o processo têxtil, ineficiências no tingimento resultam em enormes quantidades de corantes sendo perdidos diretamente para os efluentes, o qual é lançado para o meio ambiente. A quantidade de corante perdido durante o processo depende do tipo de classe de corante utilizada, mas sabe-se que aproximadamente 15% da produção mundial de corantes são perdidos durante sua produção, processamento e aplicação nas indústrias têxteis (NAM e RENGATNATHAN, 2000).
Os efluentes domésticos e industriais são, usualmente, tratados no Brasil por tratamento biológico (lodos ativados) e podem ser clorados com o objetivo de atender os parâmetros de emissão descritos na Resolução CONAMA nº 430 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA, 2011).
Os corantes do tipo azo são compostos orgânicos que dificilmente são degradados, devido sua alta estabilidade à luz e ao ataque de microrganismos. São resistentes à biodegradação aeróbica nos tratamentos convencionais e sob condições anaeróbias foi observada a geração de compostos descoloridos. Na degradação anaeróbia, os corantes do tipo azo sofrem uma clivagem da ligação azo, originando aminas aromáticas consideradas como produtos potencialmente tóxicos, mutagênicos e carcinogênicos. No entanto, as aminas aromáticas são facilmente degradados em condições aeróbias (MELGOZA et al., 2004).
2
Os efeitos deletérios da presença de azo corantes nos corpos d’água vão muito além da poluição visual, pois a mudança da coloração da água causa alteração na penetração da luz interferindo nos ciclos biológicos da biota aquática, especialmente no processo de fotossíntese e na oxigenação do corpo d’água (PEREIRA e FREIRE, 2005).
Estudos relativos à toxicidade, genotoxicidade e carcinogenicidade de corantes ainda são escassos na literatura, especificamente estudos ecotoxicológicos com organismos aquáticos. Portanto, há uma grande necessidade de estudos para avaliar a ecotoxicidade destes compostos para organismos aquáticos.
A avaliação ecotoxicológica deve contemplar os diferentes níveis tróficos. Assim, os testes de ecotoxicidade aquática devem ser conduzidos em produtores, consumidores primários, consumidores secundários e decompositores, sempre que possível (AZEVEDO & CHASIN, 2004). Assim, a ecotoxicologia pode ser utilizada como uma importante ferramenta na avaliação dos efeitos adversos destes xenobióticos em organismos aquáticos, uma vez que estes tipos de corantes já se encontram em vários ambientes aquáticos.
Os dados obtidos nos testes ecotoxicológicos permitirão conhecer a toxicidade aguda e crônica do CI Disperse Red 1 e do seu subproduto clorado frente a diferentes organismos da cadeia trófica e poderão auxiliar na derivação de critérios para proteção da vida, como proposto pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (STEPHAN et al., 1985). Isso tem relevância, pois esse corante é comercializado e utilizado na indústria têxtil brasileira e pode estar presente nos corpos de água, especialmente do estado de São Paulo, onde esse ramo industrial é muito desenvolvido. Além disso, os resultados obtidos poderão dar subsídios para uma avaliação de risco no caso da detecção da sua presença no ambiente aquático e ainda reforçar a necessidade de novos métodos de tratamento/desinfecção de efluentes industriais que contém esse tipo de composto.
3
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1
Corantes Têxteis
Corantes orgânicos e inorgânicos têm sido usados desde a pré-história e, nos últimos 100 anos, milhões de compostos químicos coloridos diferentes foram sintetizados para atender a demanda dos consumidores por uma enorme variedade de cores e a exigência na qualidade da fixação da cor no tecido (GUARATINI e ZANONI, 2000).
Os corantes são caracterizados pela sua habilidade em absorver a luz visível (400 a 700 nm) e podem ser classificados de acordo com sua estrutura química ou de acordo com o método pelo qual ele é fixado à fibra têxtil. A Tabela 1 exemplifica a classificação dos corantes de acordo com o uso e o método de aplicação.
Tabela 1. Classificação dos corantes têxteis de acordo com o uso e o método de aplicação à fibra têxtil (HUNGER, 2003).
Classe Principal Uso Método de
Aplicação Estrutura Química
Ácido Nylon, lã, seda, papel, tintas e couro
Banhos neutros à ácidos
Azo, antraquinona, trifenilmetano, xanteno, nitro,
nitroso Azóicos Algodão, poliéster Solução de sal de
diazônio estabilizado Azo
Básicos Papel e poliéster Banhos ácidos
Cianina, difenilmetano, triarilmetano, azo, xanteno,
oxazina, antraquinona Diretos Algodão, papel, couro e
nylon
Banhos neutros ou
alcalinos Azo, ftalocianina, oxazina Dispersos Poliéster, poliamida, acetato, acrílico e plástico Alta temperatura/pressão
Azo, antraquinona, nitro, benzodifuranona Reativos Algodão, lã, seda e
nylon Calor e pH alcalino
Azo, antraquinona, ftalocianina, formazan, oxazina Sulfurosos Algodão Sulfureto de sódio e
oxidado com enxofre (estruturas indeterminadas)
Vat Algodão e lã
Redução com hidrogenossulfito de
sódio
A molécula do corante utilizada para tingimento da fibra têxtil pode ser dividida em duas partes principais, o grupo cromóforo e a estrutura responsável pela fixação à fibra. Existem vários grupos cromóforos utilizados atualmente na síntese
mais representativo e largamente empregado pertence à família dos azo corantes, que se caracterizam por apresentarem um ou mais grupamentos
(KUNZ et al., 2002).
Tabela 2. Classificação dos principais grupos cromóforos de corantes têxteis
Grupo Cromóforo
4
A molécula do corante utilizada para tingimento da fibra têxtil pode ser dividida em duas partes principais, o grupo cromóforo e a estrutura responsável pela fixação à fibra. Existem vários grupos cromóforos utilizados atualmente na síntese de corantes (Tabela 2). No entanto, o grupo mais representativo e largamente empregado pertence à família dos azo corantes, que se caracterizam por apresentarem um ou mais grupamentos -N=N- ligados a sistemas aromáticos
Classificação dos principais grupos cromóforos de corantes têxteis químicas (HUNGER, 2003).
Grupo Cromóforo Estrutura Química
Azo Antraquinona Indigóide Ftalocianina Nitro Nitroso Xanteno Oxazina Formazan Trifenilmetano
A molécula do corante utilizada para tingimento da fibra têxtil pode ser dividida em duas partes principais, o grupo cromóforo e a estrutura responsável pela fixação à fibra. Existem vários . No entanto, o grupo mais representativo e largamente empregado pertence à família dos azo corantes, que se ligados a sistemas aromáticos
5
Considerando número e volume produzidos, os corantes do tipo azo são o maior grupo de corantes e representam 70% de todos os corantes orgânicos produzidos no mundo. Essa grande utilização se deve ao fato desses corantes permitirem um método de tingimento de fibras celulósicas com alto padrão de fixação e alta resistência contra luz e umidade em relação às outras classes (BAFANA et al., 2011). Mais de 2000 diferentes corantes do tipo azo são usados para tingir vários materiais, sendo que a maior parte é empregada em tingimento de tecidos (STOLZ, 2001). Esses corantes podem ser aplicados em fibras celulósicas, seda, viscose e poliamida; e são corantes de difícil biodegradabilidade (ANDRADE, 2003).
As indústrias têxteis estão entre as indústrias que mais consomem água e o efluente gerado tem composição química variada, dependendo da etapa de processamento, sendo que sua composição é um dos maiores responsáveis pela grande dificuldade em tratá-los (ANDRADE, 2003). Durante o processo de tingimento, por exemplo, três etapas são consideradas importantes: a montagem, a fixação e o tratamento final. A fixação do corante à fibra é feita através de reações químicas, da simples insolubilização do corante ou de derivados gerados e ocorre usualmente em diferentes etapas durante a fase de montagem e fixação. Entretanto, todo processo de tintura envolve como operação final uma etapa de lavagem em banhos correntes para retirada do excesso de corante original ou corante hidrolisado não fixado à fibra nas etapas precedentes (GUARATINI e ZANONI, 2000).
A remoção de cor é uma das tarefas mais difíceis no processo de tratamento de efluentes têxteis e, como as descargas de efluente são lançadas no sistema de esgoto ou no meio ambiente, a remoção de cor é também essencial para minimizar os danos ecológicos e cumprir a legislação (ANDRADE, 2003). As principais técnicas disponíveis na literatura para descoloração dos efluentes de indústrias têxteis envolvem principalmente processos de adsorção, precipitação, degradação química, eletroquímica e fotoquímica, biodegradação e outros (GUARATINI e ZANONI, 2000).
A adequação de um método de tratamento para degradação do corante será muito mais efetiva se realizada na estação de tratamento da indústria, isto é, antes de atingir os mananciais. A diluição destes compostos nos mananciais e a presença de outras descargas de origem industrial e doméstica em sistemas de esgoto exigiriam procedimentos muito mais drásticos, sensíveis e caros para identificação e remoção específica dos corantes (GUARATINI e ZANONI, 2000).
6
2.2
Tratamento dos Efluentes Têxteis
O lançamento não controlado de efluentes contendo corantes em maior ou menor nível de concentração inevitavelmente interferirá na absorção da luz pelos habitantes vegetais e animais do ambiente aquático, na potencial acumulação e/ou ainda transportados para a estação de tratamento de água municipais (principalmente os corantes com alta solubilidade em água) contribuindo para a contaminação dos mananciais e da água distribuída à população (GUARATINI e ZANONI, 2000).
Os efluentes contendo corantes são geralmente tratados em sistemas de lodos ativados, e o efluente líquido resultante deste tratamento é liberado para as águas superficiais adjacentes (UMBUZEIRO et al., 2005). Porém, alguns estudos comprovam que corantes do tipo azo não são degradados pelo sistema de tratamento biológico convencional e que grande parte dos corantes permanecem no efluente final (US EPA, 1989). Alguns autores ainda destacam que quando são implantados sistemas anaeróbios antes do tratamento com lodos ativados, o corante pode sofrer clivagem da ligação azo e favorecer a formação de aminas aromáticas (US EPA, 1989; MELGOZA et al., 2004; UMBUZEIRO et al., 2005).
Para o tratamento de efluentes têxteis, a combinação de métodos físicos, químicos e biológicos mostra-se mais adequada, devido à presença de corantes que normalmente são resistentes a degradação nos sistemas convencionais de tratamento, como é o caso dos corantes do tipo azo. Kunz et al. (2002) afirmam que tem sido dado maior ênfase ao estabelecimento de metodologias que combinam os processos biológicos com outras alternativas físicas ou físico-químicas, tais como floculação, adsorção ou oxidação eletroquímica.
A degradação do corante é influenciada pela estrutura química da molécula e também pode ser correlacionada com o número de ligações azo. Os corantes com as maiores taxas de degradação são os que possuem a presença de grupos hidroxila, amina, acetamida ou nitro, ligados ao anel aromático. Corantes contendo grupos azo ou sulfonados são considerados mais resistentes à degradação. NIGAM et al. (1996) destacam que corantes azos contendo grupos amino e hidroxila são degradados em maior extensão que os corantes azos que contém os grupos metil, metoxi, sulfo e nitro.
7
2.3
Toxicidade dos Corantes
Os corantes sintéticos estão sendo descartados no ambiente através dos efluentes das indústrias têxteis e precisam ser removidos, pois alguns corantes e seus subprodutos da degradação podem ser tóxicos e afetar os processos biológicos nos corpos d’água. Assim sendo, os métodos para remoção da cor de efluentes têm recebido grande atenção nos últimos anos. Porém, a remoção da cor do efluente não garante a ausência de outras substâncias tóxicas que resultaram do processo de tratamento (IMMICH et al., 2009).
Os riscos toxicológicos de corantes sintéticos estão intrinsecamente relacionados ao modo e tempo de exposição. Os principais mecanismos de biotransformação envolvendo corantes do tipo azo são baseados principalmente em modificações devido aos processos de oxidação, hidrólise, conjugação e redução, cuja velocidade de degradação é acelerada através de processos catalíticos enzimáticos. Assim, reações, tais como clivagem da ligação azo e formação de aminas nos processos de redução, hidroxilação da molécula ou parte dela em processos de oxidação, podem ser geradas rapidamente, uma vez que estas enzimas contribuem na degradação, sendo incapazes de diferenciar se os produtos gerados são nocivos ou não ao organismo (HUNGER, 2003).
Walthall e Stark (1999) avaliaram a toxicidade aguda e crônica de dois corantes do tipo xanteno, fluoresceína e floxina B, para o microcrustáceo Daphnia pulex. Os valores encontrados para 48-h CL50 foram de 337 (278–403) mg/l para fluoresceína e 0,423 (0,376–0,477) mg/l para floxina B. A exposição aguda à combinação destes dois corantes resultou em um aumento sinérgico da mortalidade em relação à exposição a cada corante separadamente. Após 10 dias de exposição crônica, em condições estáticas, fluoresceína causou um declínio dependente da concentração do número médio de descendentes produzidos por D. pulex. Em contrapartida, a exposição crônica ao floxina B não parece resultar em importantes efeitos subletais que diz respeito ao potencial reprodutivo dos organismos expostos. Os autores destacam que embora tenham encontrado que os dois corantes testados foram tóxicos para D. pulex, o risco que os corantes representam para as populações no habitat natural parece ser mínimo, visto que após a exposição à luz solar ocorre uma rápida decomposição dos dois corantes.
Gottlieb et al. (2003) estudaram a toxicidade do corante C.I. Reactive Black 5, após hidrólise e descoloração, utilizando a bactéria luminescente Vibrio fischeri. O corante hidrolisado
8
apresentou toxicidade ligeiramente maior do que o corante na forma original (CE50 igual a 11,4 ±3,68 e 27,5 ±4,01 mg/L, respectivamente). A descoloração do corante hidrolisado resultou em um significativo aumento da toxicidade (CE50 igual a 0,2 ±0,03 mg/L).
Osugi et al. (2006) avaliaram a capacidade da oxidação fotoeletrocatalítica de degradar o corante ftalocianina de cobre, a atividade mutagênica e a toxicidade aguda para a bactéria Vibrio
fischeri. Tanto a solução original e o corante oxidado não apresentaram atividade mutagênica,
porém apresentou aumento da toxicidade aguda para V. fischeri, explicado pela liberação do cobre durante o tratamento.
Sponza (2006) avaliou a toxicidade aguda do efluente de uma indústria de corantes com diferentes organismos, incluindo bactéria (Zoogloea ramigera e Escherichia coli), alga (Chlorella vulgaris), peixe (Poecilia reticulate) e protozoário (Vorticella campanula) para representar quatro níveis tróficos. Os resultados dos testes de toxicidade foram comparados com análises químicas para identificar os poluentes responsáveis pela toxicidade das amostras de efluentes. Os resultados mostraram claramente que o uso de bioensaios pode fornecer informações adicionais sobre o potencial de toxicidade de despejos industriais e efluentes.
Novotný et al. (2006) avaliaram a toxicidade de dois corantes azo (Reactive Orange 16; Congo Red) e dois corantes antraquinona (Remazol Brilliant Blue R; Disperse Blue 3), utilizando bactéria luminescente Vibrio fischeri, alga Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella
subcapitata) e protozoário ciliado Tetrahymena pyriformis. O corante Disperse Blue 3 foi o mais
tóxico de todos os corantes nos testes com bactéria, algas e protozoários. De todos os métodos aplicados, o teste de algas foi a mais sensível para avaliar a toxicidade dos corantes testados.
Liu et al. (2007) estudaram os efeitos do corante HC Orange No. 1 (HCO1) nos organismos aquáticos, através de testes toxicológicos com Daphnia magna, Brachydanio rerio e Carassius
auratus, que são diferentes espécies, pertencentes a diferentes níveis tróficos. O corante estudado
foi tóxico para todas as espécies analisadas, com CL50 igual a 1,54 mg/L para D. magna (48h), 4,04 mg/L para B. rerio (96h) e 5,37 mg/L para C. auratus. Os resultados mostraram também que o corante tem potencial teratogênico para embriões de B. rerio.
Bae e Freeman (2007a) avaliaram a toxicidade aquática do corante comercial C.I. Direct Blue 218, um corante do tipo azo. Os resultados indicaram alta toxicidade para Daphnia magna, com 48-h CL50 entre 1,0 e 10,0 mg/L. O estudo também sugere que o ensaio com D. magna se
9
mostrou um excelente método de avaliação de corantes para toxicidade aquática. Em outro estudo, Bae e Freeman (2007b) avaliaram a toxicidade de 12 corantes com cobre complexado para o organismo D. magna. Os resultados mostraram que os corantes com cobre não apresentaram toxicidade aguda para D. magna e indicaram que a presença de metais pesados, como o cobre, dentro da estrutura do corante podem desempenhar um papel importante na avaliação da toxicidade aquática de soluções de corantes.
Immich et al. (2009) avaliaram a toxicidade de um material adsorvente usado no processo de adsorção para remoção de cor, bem como a toxicidade de soluções de corantes antes e após o processo de adsorção. Ensaios do processo de adsorção mostraram uma remoção de 90% do corante Remazol Blue RR em solução aquosa, indicando boa eficiência do material adsorvente na remoção de corantes. Os resultados dos testes de toxicidade com D. magna mostraram que os tratamentos de adsorção podem reduzir a toxicidade do efluente têxtil consideravelmente, embora ainda esteja acima do limite máximo permitido. Assim, o uso do material adsorvente pode ser aplicado como uma das etapas de processos de tratamento de efluentes têxteis.
Wang et al (2009) investigaram a toxicidade aguda fotoinduzida de quatorze derivados de corante do tipo antraquinona para o organismos D. magna. Embora no escuro, todos os corantes não apresentaram toxicidade observável na concentração máxima utilizada, na presença de luz visível, todos os corantes, com exceção de três nitroantraquinonas, foram altamente tóxicos para
D. magna. Em geral, a toxicidade aguda do corante foi maior na presença de espectro de radiação
solar simulada, em comparação com a luz visível, além disso, a toxicidade fotoinduzida dos corantes aumentou com o aumento da sua hidrofobicidade.
Recentemente, Ferraz et al. (2011) testaram os corantes C.I. Disperse Red 1 e C.I. Disperse Red 13 para mutagenicidade e toxicidade aquática. Foi observado que a presença de cloro na molécula do Disperse Red 13 diminuiu a mutagenicidade em 14 vezes, quando comparada com o Disperse Red 1, o qual apresenta a mesma estrutura molecular do Disperse Red 13 sem o cloro na molécula. Entretanto, a toxicidade aquática para Daphnia similis aumentou com a presença do cloro na molécula do corante. O trabalho sugere que a adição do cloro pode ser uma alternativa para reduzir a mutagenicidade de corantes, porém a ecotoxicidade deve ser cuidadosamente avaliada.
10
3
OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade e a mutagenicidade do corante comercial CI Disperse Red 1 e de seus subprodutos clorados.
Objetivos específicos:
- Cloração do corante comercial com gás cloro.
- Caracterização química do corante comercial e do subproduto clorado;
- Avaliação da toxicidade aguda e crônica do corante comercial e do subproduto clorado; - Avaliação da mutagenicidade do corante comercial e do subproduto clorado;
11
4
MÉTODOS
4.1
Amostra
4.1.1
Corante Comercial CI Disperse Red 1
O corante comercial utilizado tem como produto principal o corante CI Disperse Red 1 (N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-4-(4-nitrophenylazo) aniline; CAS number 2872-52-8) e foi adquirido da empresa PCIL – Produtos Químicos para Indústrias LTDA.
4.1.2
Caracterização Química do Corante Comercial CI Disperse Red 1
A caracterização química dos componentes do corante comercial foi realizada em parceria com o College of Textiles – North Caroline State University. Para caracterizar o corante comercial foi realizada a separação dos componentes por Cromatografia de Camada Delgada (CCD), em uma câmara de vidro com dimensões de 29 x 9.5 x 27 cm. As placas utilizadas na separação, com dimensões de 20 x 20 cm, foram preparadas com 1000 µm de espessura com Partisil® PLK5F e sílica gel 150 A. As placas utilizadas para calcular o Rf (distância percorrida pela amostra em relação à distância percorrida pelo solvente) foram preparadas com 250 µm de espessura com sílica gel. A câmara de CCD foi saturada com solventes na proporção de 2:1 tolueno:acetato de etila (210 mL) por 2 horas. Filtros de papel (18.5 cm) foram colocados dentro da câmara para ajudar na saturação. O corante comercial Disperse Red 1 (5-7 mg) foi totalmente dissolvido em CH2Cl2 (0.5 mL) e foi aplicado em forma de pontos ao longo de uma linha
horizontal no início da placa. Repetiu-se esta aplicação até que toda a amostra foi transferida para a placa, formando uma faixa contínua, mas não ultrapassando 3 mm de espessura. A placa ficou
12
em repouso para secar por 1 hora, e então foi colocada na câmara de vidro até o eluente atingir 1 cm do topo da placa. Depois que a placa foi retirada da câmara foi secada artificialmente por 30 min. As bandas nomeadas Frações 1, 2, 3, 4, 6 e 8 foram individualmente raspadas da placa com uma lâmina.O procedimento foi repetido 4 vezes. Cada um das frações numeradas retiradas de cada procedimento foram combinadas, diluídas em MeOH (20 mL), filtradas através de celite, e a mistura celite/sílica gel foi lavada com metanol até remover toda a cor. O solvente foi evaporado com vácuo e cada fração foi novamente diluída em MeOH (1 mL), filtrada através de um filtro de seringa para remover a sílica gel restante, e o solvente foi novamente evaporado. Os valores de Rf e os dados do MS foram obtidos para cada fração.
4.1.3
Cloração do Corante Comercial CI Disperse Red 1
Para efetuar análise comparativa da toxicidade do corante Disperse Red 1, antes e depois da cloração, foi realizada a cloração do corante com cloro gás, simulando as condições utilizadas em Estações de Tratamento de Efluentes. O gás foi gerado a partir da reação de 100 mL de ácido clorídrico concentrado, contidos no funil de separação, cuidadosamente gotejados em 500 mg de permanganato de potássio (KMnO4), contidos no kitassato. O gás formado foi conduzido por um
tubo e borbulhado em erlenmeyer contendo 500 mL da solução do corante a 50 mg/L em água ultra pura (Figura 1). Essas quantidades foram padronizadas para se obter 1,5 a 2 mg/L de cloro residual na solução, sendo essa a concentração de cloro livre exigida pela Legislação Brasileira. A remoção da cor do corante foi monitorada utilizando um espectrômetro UV-Vis (GBC, Cintra 6) com comprimento de onda de 200 a 800 nm a cada 2 minutos. O processo de cloração terminou com 20 minutos de reação. Foram feitas medidas de cloro residual no final do processo para garantir condições padronizadas da etapa de cloração e a redução do cloro livre ao longo do tempo. O cloro residual foi medido através do método espectrofotométrico, utilizando N,N’-dietil-p-fenildiamina (DPD) como reativo de cor. O produto clorado permaneceu em repouso por 48 horas para que o cloro livre fosse volatilizado e assim não interferir nos testes de toxicidade.
13
Figura 1. Sistema utilizado na cloração do corante comercial Disperse Red 1.
4.1.4
Caracterização Química do Subproduto Clorado
Para identificar os produtos de degradação do corante tratados pelo processo de cloração foram feitas análises por LC-ESI-MS-MS QTrap. Desenvolveu-se um método que consistiu primeiramente de uma varredura total (EMS - Enhanced Mass Spectrometry), utilizou-se também o enhanced resolution (ER) – para determinação das razões isotópicas – e enhanced product íon (EPI) – utilizado para fins de elucidação estrutural. Amostras foram diluídas com 50:50 MeOH:H2O, ácido fórmico 0,1 % antes da injeção. Os analitos foram separados em uma coluna
Agilent Zorbax C-18 (5 µm, 150 mm x 4.6 mm) usando um amostrador automático Agilent 1200 e uma bomba Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies). A eluição foi a modo gradiente utilizando como modificador de fase o ácido fórmico 0,1 % em ambos solventes H2O (solvente
14
80% B de 8-15 minutos, gradiente linear de 80-100% B de 15-18 minutos, 100% B de 18-25 minutos. A vazão foi de 500 µL min.-1.
Os experimentos foram realizados em um espectrômetro de massas ion trap linear (QTrap; Applied Biosystems) equipado com um TurboIonSpray conectado ao sistema de cromatografia líquida. Para obter os dados espectrais, foram aplicados 500 ºC na temperatura do vaporizador e uma voltagem de 4,5 kV no TurboIonSpray no modo de ionização positivo. O potencial de dessolvatação foi ajustado para 50 V e N2 ultra puro foi usado como gás de colisão.
Os experimentos de ER foram realizados com uma velocidade de varredura de 250 uma s-1 por um tempo de 50 ms. Para as análises de EPI, a velocidade de varredura foi de 4000 uma s-1, energia de colisão de 30 V e 400 ms para a captura de íon. Todos os experimentos foram realizados na faixa de 50 a 600 m/z com um potencial de entrada de 8 V e trapeamento em Q0
4.2
Avaliação da Toxicidade
4.2.1
Teste de Toxicidade
O teste de toxicidade crônica
realizado de acordo com o protocolo desenvolvido pelo Departamento de Governo do Canadá (Environment Canada, 2007),
expostos a diferentes concentrações da amostra,
resultados comparados com um controle negativo adequado. A microplaca condições controladas de luminosidade, temperatura e
Após este período, o número de algas
no microscópio e comparado com o controle. A inibição de crescimento para indicar toxicidade na amostra testada
Os resultados dos testes de toxicidade com ICp (versão 2.0)
(NORBERT-Figura
15
oxicidade
Teste de Toxicidade com Algas
de toxicidade crônica com a alga Pseudokirchneriella subcapitata om o protocolo desenvolvido pelo Departamento de
(Environment Canada, 2007), o qual determina que os organismos expostos a diferentes concentrações da amostra, utilizando microplacas de 96 orifícios
dos comparados com um controle negativo adequado. A microplaca
condições controladas de luminosidade, temperatura e agitação, por um período de 72 horas Após este período, o número de algas de cada concentração foi contado em Camara de Neub
e comparado com o controle. A inibição de crescimento foi o a amostra testada.
Os resultados dos testes de toxicidade com P. subcapitata foram avaliados -KING, 1993) para obter a concentração de inibição (CI50).
Figura 2. Pseudokirchneriella subcapitata.
Pseudokirchneriella subcapitata (Figura 2) foi
om o protocolo desenvolvido pelo Departamento de Meio Ambiente do organismos devem ser utilizando microplacas de 96 orifícios e os dos comparados com um controle negativo adequado. A microplaca permaneceu sob agitação, por um período de 72 horas. contado em Camara de Neubauer foi o endpoint utilizado
avaliados no programa KING, 1993) para obter a concentração de inibição (CI50).
16
4.2.2
Teste de Toxicidade com Cladoceras
4.2.2.1 Teste de Toxicidade Aguda com Cladoceras
Os testes de toxicidade aguda com Daphnia similis (Figura 3), Daphnia magna (Figura 4),
Ceriodaphnia silvestrii (Figura 5) e Ceriodaphnia dubia (Figura 6) foram realizados de acordo
com as condições padronizadas pela ABNT NBR 12713 (ABNT, 2009).
O teste foi realizado com a exposição de organismos jovens (entre 6 a 24 horas de idade) a diferentes concentrações da amostra, preparadas com água de cultivo. Para cada diluição, inclusive no controle negativo, foram adicionados 20 organismos, escolhidos e distribuídos aleatoriamente em quatro réplicas com volumes iguais a 10 mL. O ensaio foi mantido com temperatura controlada de 20 a 22ºC por 48 horas em ambiente escuro, com os recipientes cobertos e sem alimentação dos organismos.
Ao final do ensaio foi registrada a quantidade de organismos imóveis em cada concentração testada, para realizar o cálculo da porcentagem de imobilidade para cada concentração, em relação ao controle. Atentando-se que para a validação dos resultados no término do ensaio, a qual determina que a porcentagem de organismos imóveis no controle não deve ultrapassar os 10%.
Assim foi utilizado o número de organismos imóveis em cada concentração testada para calcular a concentração que causou efeito em 50% dos organismos (CE50), através da porcentagem de imobilidade de cada concentração em relação ao controle, utilizando o método estatístico “Trimmed Spearman-Karber Method for Estimating Median Lethal Concentrations in Toxicity Bioassays” (HAMILTON et al., 1977).
17
Figura 3. Daphnia similis Figura 4. Daphnia magna
Figura 5. Ceriodaphnia silvestrii Figura 6. Ceriodaphnia dubia
4.2.2.2 Teste de Toxicidade Crônica com Cladoceras
O método de ensaio para avaliação da toxicidade crônica para Ceriodaphnia dubia foi realizado seguindo a norma ABNT NBR 13373 (ABNT, 2010).
O ensaio consiste na exposição dos organismos jovens de C. dubia à diferentes concentrações da amostras, por um período de 8 dias. Para cada concentração, inclusive para o controle negativo (água de cultivo), foram preparadas 10 réplicas com 50 mL de amostra e um organismo por recipiente. O ensaio foi realizado em ambiente com temperatura controlada entre 23 e 25ºC, e com fotoperíodo de 16 horas de luz. Realizou-se, a cada dois dias, a alimentação com algas e vitormônio (ração de peixe e levedura) e a troca de alíquota de 10 mL.
No término do ensaio, foram somados os números de em cada concentração e no controle. Os dados foram analisados no programa ICp (versão 2.0) (NORBERT-KING, 1993) que compara a fecundidade das fêmeas de C. dubia do controle e das amostras, para obter a concentração de inibição (CI50).
18
4.2.3
Teste de Toxicidade com Cnidários
4.2.3.1 Teste de Toxicidade Aguda com Cnidários
No teste de toxicidade aguda com Hydra attenuata (Figura 7) podem ser observadas mudanças morfológicas no organismo devido a exposição à agentes tóxicos. São observados quatro estágios, os quais se sucedem com a intoxicação progressiva do animal, e se iniciam pela fase de aparecimento de bulbos nas extremidades dos tentáculos, seguido pelo encurtamento dos mesmos; depois ocorre total perda dos tentáculos, forma conhecida como tulipa e, finalmente, a desintegração. A fase tulipa sempre conduz de modo irreversível à morte.
De acordo com protocolo estabelecido por Trottier et al. (1997), o teste de toxicidade aguda com H. attenuata foi realizado em placas multi-escavadas de poliestireno contendo 12 orifícios, com capacidade de 5,0 mL de amostra em cada. Foram preparadas três réplicas para cada concentração e mais três para o controle negativo, com 3 organismos cada réplica. O teste teve a duração de 96 horas e foi mantido em temperatura constante de 21 ± 2 ºC e fotoperíodo de 16 horas de luz.
As mudanças morfológicas observadas no teste agudo com H. attenuata foram utilizadas para determinação da concentração que afeta 50% dos organismos. O estágio normal representa ausência de efeito, os estágios bulbo nos tentáculos e tentáculos encurtados representam efeitos subletais e, os estágios tulipa e desintegração representam efeito letal. Portanto, no cálculo para obtenção da CE50 devem-se somar todos os efeitos, exceto o estágio normal. Então, devem ser considerados neste cálculo os estágios bulbo nos tentáculos, tentáculos encurtados, tulipa e desintegração; ou seja, qualquer dano morfológico é considerado, constituindo, portanto, um
endpoint mais sensível. E, para o cálculo da CL50 deve-se somar apenas o número de indivíduos
que apresentaram os estágios tulipa e desintegração. Depois de realizadas as somas dos números de indivíduos pode-se calcular os valores de CE50 e CL50, com o auxílio do método estatístico “Trimmed Spearman-Karber Method for Estimating Median Lethal Concentrations in Toxicity Bioassays” (HAMILTON et al., 1977).
19
Figura 7. Hydra attenuata
4.2.3.2 Teste de Toxicidade Crônica com Cnidários
De acordo com procedimento estabelecido por Holdway (2005), o teste de toxicidade crônica com o cnidário Hydra attenuata deve ser realizado com hidras adultas contendo um broto jovem com tentáculos. Cada concentração foi testada em triplicata e cada réplica com 5 organismos. As placas de Petri utilizadas para o teste foram cobertas para prevenir evaporação, foram incubadas a 22 ± 2 ºC. As leituras do número de hidras em cada concentração foram realizadas diariamente durante 7 dias. Os organismos foram alimentados diariamente com
Artemia salina recém-eclodidas, colocadas para eclosão no dia anterior e mantidas durante 24
horas numa solução composta de 2 g de sal marinho em 100 mL de água destilada. Depois da alimentação, a solução teste foi trocada.
Ao final do teste crônico com H. attenuata o número total de hidras por concentração foi analisado no programa ICp (versão 2.0) (NORBERT-KING, 1993) para obter a concentração de inibição (CI50).
20
4.3
Avaliação da Mutagenicidade
Para avaliação da mutagenicidade do corante comercial, dos seus componentes e do subproduto clorado foi realizado o ensaio Salmonella/microssoma segundo a norma ISO 16240:2005, utilizando as linhagens TA98, TA100 e YG1041 da bactéria Salmonella
tiphimurium em ausência e presença de ativação metabólica exógena (Figura 8). A linhagem
YG1041 tem como característica a super produção das enzimas nitroredutase e O-acetiltransferase.
Para cada experimento, 0,1 mL da cultura foi inoculada em caldo nutriente a partir do estoque e colocada a 37º C pelo período de 12-16 horas overnight com agitação de 150-170 rpm (rotação por minuto), para crescimento até a densidade de 1-2 x 109 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL.
O ensaio consiste na exposição da bactéria a diferentes doses preparadas a partir da amostra testada, a fim de se obter uma dose resposta, todos os ensaios foram realizados em ausência e presença de ativação metabólica através do uso da fração S9, induzida com Aroclor 1254 (Moltox, USA). Os diferentes componentes foram adicionados aos tubos estéreis nos seguintes volumes, 1 mL de top ágar suplementado com histidina e biotina, 1 mL da amostra diluída em diferentes proporções, 0,5 mL de solução tampão fosfato e 0,1 mL da cultura, o conteúdo do tubo foi homogeneizado e vertido em placas contendo ágar mínimo. Para o teste com ativação metabólica os volumes utilizados foram de 1 mL de top ágar suplementado, 1 mL de amostra, 0,1 mL de cultura e 0,5 mL da solução de S9, seguindo então o mesmo procedimento de homogeneização e vertido na placa. As placas foram incubadas a 37ºC por 66 horas. Após o tempo de incubação procedeu-se então a contagem do número de colônias revertentes em todas as placas.
O controle negativo utilizado nos ensaios foi água estéril. O controle positivo utilizado para as linhagens TA98 e TA100 foi 2-aminoantraceno (2aa) com ativação metabólica, e óxido de 4-nitroquinolina (4nqo) em ausência de ativação metabólica. O controle positivo utilizado para a linhagem YG1041 foi 4-nitro-o-diamino-fenilina (4nop) sem ativação metabólica e 2-aminoantraceno (2aa) com ativação metabólica.
21
Figura 8. Esquema do ensaio de mutagenicidade Salmonella/microssoma segundo a norma ISO 16240:2005.
22
4.4
Controle de Qualidade
O Laboratório de Ecotoxicologia e Microbiologia Ambiental (LEAL) da Faculdade de Tecnologia – FT/UNICAMP participa constantemente de programas interlaboratoriais para garantir a qualidade dos organismos-teste e dos ensaios realizados. A sensibilidade dos organismos cultivados no LEAL é controlada através de testes rotineiros utilizando a substância de referência NaCl, com pureza de 99,9%. A carta-controle dos testes de sensibilidade para cada organismo-teste pode ser encontrada no APÊNDICE A.
4.5
Gerenciamento dos Resíduos
Os resíduos gerados durante o preparo das soluções e dos testes de toxicidade foram armazenados em local apropriado na Faculdade de Tecnologia e encaminhados para incineração na UNICAMP.
23
5
RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1
Caracterização Química do Corante Comercial CI Disperse Red 1
A separação e purificação dos componentes do corante comercial CI Disperse Red 1 foram realizadas como descritas na seção 4.1.2, e as estruturas químicas foram identificadas utilizando Espectrometria de Massas. Assim, foi possível identificar que o corante comercial é composto por diferentes corantes (Figuras 9 e 10), além do surfactante.
Figura 9. Separação dos componentes do corante comercial Disperse Red 1.
24
Após a separação das frações do corante comercial Disperse Red 1, cada fração foi analisada separadamente em Cromatografia de Camada Delgada (CCD), a fim de confirmar os componentes e calcular os valores de Rf para cada componente encontrado (Figura 11, Tabela 3).
Figura 11. Cromatografia de Camada Delgada (CCD) das frações do corante comercial Disperse Red 1.
Tabela 3. Valores de Rf das frações do corante comercial Disperse Red 1 obtidos na CCD.
Frações Rf 1 0.84 2 0.75 3 0.68 4 0.33 6 0.15 8 0.03
25
Os picos de massa (M+1) encontrados para cada fração estão expressos na Tabela 4 e são comparados com a massa exata calculada para cada fração do corante comercial. Os espectros de massas estão apresentados nas Figuras 12 – 17 e comprovam as estruturas propostas para cada corante.
Tabela 4. Valores dos picos de massa obtidos em versus a massa exata de cada fração.
Frações Massa exata Massa obtida [M+1]+ 1 298.14 299.15 2 270.11 271.12 3 356.15 357.15 4 314.14 315.14 6 286.11 287.11 8 330.13 331.14
Figura 12. Espectro de massa e estrutura química da Fração 1 do corante comercial. 5 x10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 O2N N N N CH2CH3 CH2CH3
+ESI Scan (11.4455-11.4961 min, 4 scans) Frag=110.0V 100446.d Subtract 299.1498
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
26
Figura 13. Espectro de massa e estrutura química da Fração 2 do corante comercial.
Figura 14. Espectro de massa e estrutura química da Fração 3 do corante comercial. 5 x10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 O2N N N N CH2CH3 CH2CH2OAc +ESI Scan (5.5485-5.5654 min, 2 scans) Frag=110.0V 100449.d Subtract
357.1552 421.2316 301.1409 Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 5 x10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 O2N N N N CH2CH3 H
+ESI Scan (5.2244-5.2580 min, 3 scans) Frag=110.0V 100448.d 271.1195 365.1356 922.0107 173.0784 Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
27
Figura 15. Espectro de massa e estrutura química da Fração 4 do corante comercial.
Figura 16. Espectro de massa e estrutura química da Fração 6 do corante comercial. 5 x10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 O2N N N N CH2CH2OH H
+ESI Scan (4.1199-4.1535 min, 3 scans) Frag=110.0V 100451.d Subtract 287.1131 Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 5 x10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 O2N N N N CH2CH2OH CH2CH3
+ESI Scan (5.6274-5.6443 min, 2 scans) Frag=130.0V 100404.d Subtract 315.1449
173.0807
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
28
Figura 17. Espectro de massa e estrutura química da Fração 8 do corante comercial.
Depois das análises em Espectrometria de Massas, as quantidades recuperadas na CCD para cada fração foi calculada. Sabendo-se que este corante comercial possui aproximadamente 20% de surfactante em sua massa, foi possível calcular também as quantidades de cada fração na massa total do produto comercial (Tabela 5). Como era esperado, o corante principal na formulação do produto comercial é o Disperse Red 1, o qual corresponde a Fração 4, e que representa a maior quantidade em massa. Os outros corantes, que correspondem às outras frações, representam poucas quantidades e podem ser impurezas resultantes do processo de síntese do corante principal. 4 x10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 O2N N N N CH2CH2OH CH2CH2OH
+ESI Scan (4.0030-4.0367 min, 3 scans) Frag=110.0V 100453.d Subtract 331.1394
259.0938
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
29
Tabela 5. Estruturas químicas das frações, suas respectivas quantidades recuperadas e porcentagens em massa do corante comercial.
Frações Estrutura Quantidade (mg) Massa (%)
1 O2N N N N CH2CH3 CH2CH3 1.9 5 2 O2N N N N CH2CH3 H 1.1 3 3 O2N N N N CH2CH3 CH2CH2OAc 1.8 5 4 O2N N N N CH2CH2OH CH2CH3 23.3 61 6 O2N N N N CH2CH2OH H 1.7 4 8 O2N N N N CH2CH2OH CH2CH2OH 0.9 2
30
5.2
Cloração do Corante Comercial CI Disperse Red 1
Durante o processo de cloração do corante comercial foi observada a remoção da cor do corante (Figura 18) em função do tempo de reação e a diminuiçao da absorbância em λmáx de 428 nm (Figura 19). O processo de cloração terminou com 30 minutos de reação. O cloro livre foi totalmente removido após 48 horas da cloração para não causar interferência nos testes de toxicidade.
Figura 18. Resultado da remoção de cor após a cloração do corante comercial.
400 500 600 700 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 A b s o rb â n c ia Comprimento de Onda (nm) Linha de base Corante comercial 4 minutos 8 minutos 12 minutos 16 minutos 20 minutos 30 minutos
Figura 19. Espectros de absorção no visível (400 – 700 nm) do corante comercial (50 mg/L) e do subproduto clorado (4, 8, 12, 16, 20 e 30 minutos de cloração).
31
5.3
Caracterização Química do Subproduto Clorado
LC-ESI-MS/MS foi utilizado para realizar a separação e identificação dos produtos de degradação do corante comercial com base nos tempos de retenção (tR) obtidos, massas
moleculares (MM) e produtos iônicos obtidos observados em MS/MS provenientes de importantes íons precursores propostos neste estudo. Os melhores resultados para as análises dos produtos de degradação foram obtidos utilizando o ESI com polaridade positiva.
O pico do íon protonado dos compostos nitro-aromáticos (m/z ímpar no caso de um átomo de nitrogênio) foi intenso. Sinais importantes resultantes da eliminação do radical NO2 [M+H –
NO2]+, NO [M+H – NO]+, [M+H – O]+ e [M+H – H2O]+ foram observados e estão de acordo
com dados da literatura (LEVSEN et al., 2007; DRON et al., 2008; TAI et al., 2006; THEVIS et al., 2008).
Os átomos de cloro são caracterizados pela presença de isótopos (35Cl: 37Cl = 3:1) os quais podem ser usados para determinar o número de átomos de cloro que estão presentes na molécula. Em geral o número de átomos de cloro em uma molécula pode ser determinado pelo número de picos alternados que surge cima do pico do íon protonado. Assim moléculas com três átomos de cloro terão picos M+2, M+4 e M+6. Neste estudo as contribuições isotópicas foram estudadas e experimentos específicos de ER (enhanced resolution) foram realizados objetivando ter a correta elucidação das estruturas (LEVSEN et al., 2007; TAI et al., 2006).
A amostra proveniente do processo de cloração foi submetida às análises de LC-ESI-MS-MS Qtrap com a finalidade de identificar os principais produtos de degradação gerados.
A Figura 20 mostra um cromatograma de íons totais (TIC). Pela separação cromatográfica dessa amostra, se pode verificar a formação de produtos de degradação que foram detectados pela varredura feita no intervalo de 50 a 600 Da.
Após a aquisição dos dados no modo TIC e da posterior etapa de otimização das condições de operação do sistema LC-ESI-MS/MS Qtrap, realizamos os estudos de fragmentação em fase gasosa dos principais produtos de degradação formados (Figura 21). Os estudos de fragmentação estão representados na Tabela 6, sendo que os produtos de degradação do corante foram realizados em estágio MS2 por meio do EPI utilizando N2 como gás de colisão por meio do CID
32
Figura 20. Cromatograma obtido em EMS no modo TIC.
33
Tabela 6. Massa molecular (MM), tempos de retenção (tR), íons produto e estruturas propostas
para os produtos de degradação do corante Disperse Red 1.
Substância MM (Da) tR (min) Íon protonado observado (m/z – estrutura) Produto iônico em MS/MS (m/z – estrutura) Estrutura proposta Corante inicial* MM = 314,33 10,66 315,14 – [M+H]+ 299 – [M+H – O]+ 285 – [M+H – NO]+ 269 – [M+H – NO2]+ 224 – [M+H – C6H5N]+ N N N CH3 OH O2N Produto A** MM = 157,55 14,01 158,00 – [M+H]+ 142 – [M+H – O]+ 128 – [M+H – NO]+ 112 – [M+H – NO2] + O2N Cl Produto B** MM = 199,67 10,40 200,00 – [M+H]+ 155 – [M+H – C2H4OH]+ 182 – [M+H – H2O] + 112– [M+H–N(C2H5)C2H4OH]+ Cl N CH3 OH Produto C** MM = 234,12 16,25 234,04 – [M+H]+ 189 – [M+H – C2H4OH]+ 216 – [M+H – H2O]+ 146 – [M+H –N(C2H5)C2H4OH] + Cl N CH3 OH Cl Produto D** MM = 268,56 26,83 268,00 – [M+H]+ 223 – [M+H – C2H4OH]+ 250 – [M+H – H2O] + 180 – [M+H –N(C2H5)C2H4OH]+ Cl N CH3 OH Cl Cl
*A amostra apresenta o mesmo espectro de massas do padrão. ** Produtos de degradação formados a partir da
cloração. MM = Massa molar, Da = Daltons. tR = tempo de retenção,
De acordo com os dados obtidos pode-se determinar a provável rota de degradação do corante Disperse Red 1 (Figura 22). É importante notar que, de acordo com os dados apresentados na Figura 20, o produto A é o mais abundante dentre os compostos estudados; portanto podemos supor que a atividade biológica pode estar fortemente relacionada a essa substância.
34
Figura 22. Esquema representativo da degradação do corante Disperse Red 1 via cloração baseado em estruturas identificadas por LC-ESI-MS/MS.
N N N CH3 OH O2N Cl N CH3 OH Cl Cl N CH3 OH Cl Cl + O2N Cl Cl N CH3 OH + Disperse red 1 Produto A Produto B Produto C Produto D HClO HClO
35
5.4
Avaliação da Toxicidade
Foram realizados testes agudos e crônicos com organismos de diferentes níveis tróficos, os resultados obtidos nos testes estão listados nas Tabelas 7 e 8, respectivamente; e os valores brutos dos testes de toxicidade podem ser encontrados no APÊNDICE B.
Tabela 7. Valores de CE50 e CL50 obtidos nos testes de toxicidade aguda com o corante comercial e o subproduto clorado.
Organismo Endpoint Corante Comercial
(mg/L) Corante Clorado (mg/L) D. similis CE50 0,13 4,32 D. magna CE50 0,58 4,03 C. silvestrii CE50 0,78 2,56 C. dubia CE50 0,48 1,92 H. attenuata CE50 1,9 0,73 H. attenuata CL50 47,9 3,86
Tabela 8. Valores de CI50 obtidos nos testes de toxicidade crônica com o corante comercial e o subproduto clorado.
Organismo Endpoint Corante Comercial
(mg/L) Corante Clorado (mg/L) P. subcapitata CI50 38,5 4,4 C. dubia CI50 0,22 2,3 H. attenuata CI50 31,6 2,8
Assim, pode-se observar que D. similis foi o organismo mais sensível ao corante comercial e H. attenuata foi mais sensível ao subproduto clorado. E o subproduto clorado foi menos tóxico do que o corante para a maioria dos organismos testados, com exceção de P. subcapitata e H.
36
A sensibilidade do organismo H. attenuata para compostos clorados, como foi observado nos testes com o subproduto clorado realizados com este organismo, já foi relatada anteriormente por Mayura et al. (1991) e Ake et al. (2003).
Os valores de CE50 obtidos para o corante comercial Disperse Red 1 para teste agudo com
D. similis foram similares aos obtidos por Ferraz et al. (2011) para o corante puro (Sigma, 95%
pureza), que foram de 0,13 mg/L.
Devido ao corante comercial possuir outros corantes em sua composição, seria interessante verificar se os outros componentes também estariam contribuindo para a toxicidade observada. Assim, para verificar esta hipótese, testes agudos com D. similis foram realizados com cada uma das seis frações e foi possível observar que a Fração 4, a qual corresponde ao corante principal Disperse Red 1, parece contribuir totalmente na toxicidade observada (Figura 23).
0 200 400 600 800 1000 0 5 10 15 20 N º o rg a n is m o s Concentração (ug/L) F1 F2 F3 F4 F6 F8 Corante Comercial
37
Foram realizados, também, testes agudos com D. similis com o surfactante separadamente (Figura 24). Observou-se que mesmo após as etapas de extração, uma pequena parcela de corante ainda permaneceu no surfactante, o que pode ter contribuído para a toxicidade encontrada. Essa dificuldade de separação pode ser atribuída à estrutura do surfactante, usualmente ligninas sulfonadas. Assim, pode-se notar que o surfactante pouco contribui para a toxicidade quando comparado com o corante.
10 100 1000 10000 100000 0 20 40 60 80 100 10 100 1000 10000 100000 0 20 40 60 80 100 Corante comercial E fe it o ( % ) Surfactante
Concentração (log) (ug/L)
