INGRID ALVES ROSA
EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO SISTÊMICA DE NANOTUBO DE CARBONO DE PAREDES MÚLTIPLAS (MWCNT) SOBRE A RESPOSTA IMUNE NO MICROAMBIENTE TUMORAL DE CAMUNDONGOS PORTADORES DE
CARCINOMA PULMONAR DE LEWIS
CAMPINAS 2015
EFFECT OF SYSTEMIC ADMINISTRATION OF MULTI-WALL CARBON NANOTUBES (MWCNT) ON THE IMMUNE RESPONSE IN TUMOR MICROENVIRONMENT IN MOUSE WITH LEWIS LUNG CARCINOMA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA ELÉTRICA E DE COMPUTAÇÃO
CAMPINAS 2015
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica da Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de Mestra em Engenharia Elétrica, na área de Eletrônica, Microeletrônica e Optoeletrônica.
Master dissertation presented to the Electrical Engineering Post-graduation Program of the School of Engineering Electrical of the University of Campinas to obtain the M.Sc grade in
Engineering Electrical, in field of electronics, microelectronics and optoelectronics.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÃO DEFENDIDA PELA ALUNA INGRID ALVES ROSA
E ORIENTADO PELO PROF. DR. VITOR BARANAUSKAS (IN MEMORIAM)
Assinatura do Orientador
_______________________________________________________________________
INGRID ALVES ROSA
EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO SISTÊMICA DE NANOTUBO DE CARBONO DE PAREDES MÚLTIPLAS (MWCNT) SOBRE A RESPOSTA IMUNE NO
MICROAMBIENTE TUMORAL DE CAMUNDONGOS PORTADORES DE CARCINOMA PULMONAR DE LEWIS
Orientador: Prof. Dr. Vitor Baranauskas (in memoriam) Co- Orientador: Prof. Dr. Yaro Burian
Co- Orientador: Prof. Dra
.
Elaine Conceição de OliveiraEFFECT OF SYSTEMIC ADMINISTRATION OF MULTI-WALL CARBON NANOTUBES (MWCNT) ON THE IMMUNE RESPONSE IN TUMOR MICROENVIRONMENT IN
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, 162096/2014-3 Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura Elizangela Aparecida dos Santos Souza - CRB 8/8098
Título em outro idioma: Effect of systemic administration of multi-wall carbon nanotubes ( MWCNT) on the immune response in tumor microenvironment in mouse with Lewis lung carcinoma
Palavras-chave em inglês: Tumor microenvironment Multi-wall carbon nanotube Immune response
Cancer - Treatment
Cancer - Treatment - Therapeutic
Área de concentração: Eletrônica, Microeletrônica e Optoeletrônica Titulação: Mestra em Engenharia Elétrica
Banca examinadora:
Elaine Conceição de Oliveira [Coorientador] Rodolfo Thomé
Helder José Ceragiole Data de defesa: 18-12-2015
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Elétrica Rosa, Ingrid Alves, 1990-
R71e Efeito da administração sistêmica de nanotubo de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) sobre a resposta imune no microambiente tumoral de camundongos portadores de carcinoma pulmonar de Lewis / Ingrid Alves Rosa. – Campinas, SP: [s.n.], 2015.
Orientador: Vitor Baranauskas.
Coorientador: Elaine Conceição de Oliveira.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação.
Ros1. Microambiente tumoral. 2. Nanotubo de carbono de paredes múltiplas. 3. Resposta imune. 4. Câncer - Tratamento. 5. Câncer - Tratamento - Terapeutica. I. Baranaukas, Vitor,1952-. II. Oliveira, Elaine Conceição de. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação. IV. Título.
COMISSÃO JULGADORA - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Candidato: Ingrid Alves Rosa RA: 144555
Data da Defesa: 18 de dezembro de 2015
Título da Tese: "Efeito da administração sistêmica de nanotubo de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) sobre a resposta imune no microambiente tumoral de camundongos portadores de carcinoma pulmonar de Lewis”
Prof. Dra. Elaine Conceição de Oliveira (Presidente, FATEC-SO) Prof. Dr. Rodolfo Thomé (IB/UNICAMP)
Prof. Dr. Helder José Ceragiole (FEEC/UNICAMP)
A ata de defesa, com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão Julgadora, encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Essa dissertação é dedicada à minha família e em especial ao Dr. Vitor Baranauskas.
Agradecimentos
Agradeço primeiramente à Deus, por estar presente em todos os momentos da minha vida, e permitir a realização desse trabalho.
Aos meus pais, Mauri e Eva, os grandes responsáveis pela minha formação, pelos
conselhos, por me apoiarem e não terem julgado as minhas decisões, e por estarem sempre
comigo me incentivando a ser melhor.
A minha irmã, Maria Fernanda, pelo apoio e pelos momentos de descontração nos
momentos mais difíceis.
Ao meu namorado, Guilherme, por ter me aguentado nas crises, me apoiado na
minha trajetória, pelas palavras de carinho, pela compreensão e incentivo, por permanecer ao
meu lado em todos os momentos.
À minha família pelo apoio e compreensão, em especial ao meu tio Antônio
Carlos pelo apoio e auxílio nas minhas dificuldades.
Ao meu orientador Dr. Vitor Baranauskas pela oportunidade e por acreditar em
mim, que infelizmente faleceu em outubro de 2015. Agradeço pelas palavras de incentivo e
por ter me aceitado como aluna. Foi um privilégio conhecê-lo.
À minha co-orientadora Dra. Elaine Conceição de Oliveira que sabiamente me
orientou nesse trabalho e na vida, e pela amizade, por ter compreendido as minhas
dificuldades e me exigido sempre o melhor.
Ao Dr. Yaro Burian, por ter assumido a co-orientação juntamente com a Profª
Elaine, após o falecimento do Dr. Vitor, por ter apoiado e confiado nas diretrizes já
estabelecidas para este trabalho e por toda assistência dispensada.
À Profª Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos que permitiu o desenvolvimento
Ao laboratório de NanoEngenharia e Diamantes pela ajuda nos momentos que
precisei.
Aos funcionários da FEEC, em especial a Jaqueline e Noêmia e ao coordenador
do DSIF Profº Leandro Maneira, que me ajudaram em todos os momentos.
Aos alunos e membros do laboratório de Neuroimunologia que me acolheram
como membro da equipe e me ajudaram nas muitas dificuldades, pela paciência e
ensinamentos: Alliny, Daniela, Paula, Aléxia, Adriel, Fernando, Amanda, Mariana, Marília e
Guilherme.
Ao Dr. Alessandro Farias pela ajuda, colaboração e sugestões.
À bióloga Rosemeire de Paula pela ajuda, colaboração e paciência.
À minha amiga Suzy, que mesmo distante me incentivou e me ajudou, pela
amizade e por estar sempre ao meu lado.
As minhas amigas de faculdade que me incentivaram ao longo da minha formação
Débora, Grace, Lislaine, Rafaela e Thaís.
Aos órgãos financiadores CAPES, CNPq e FAPESP.
“Há um caminho a ser percorrido, há uma carreira para você chegar à vitória.” (Mons. Jonas Abib)
Resumo
O câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento e proliferação desordenado de células com alterações genéticas, capaz de formar uma massa anormal ou tumoral. A massa tumoral compreende um microambiente complexo, composto, além das células tumorais, por células da resposta imune, fibroblastos, células endoteliais, citocinas e quimiocinas que proporcionam um ambiente supressor para o sistema imune e que beneficia a progressão tumoral. Nos últimos anos, a medicina tem se desenvolvido de maneira a incorporar novas tecnologias para o diagnóstico e tratamento do câncer. A possibilidade de empregar a nanotecnologia na área médica permitirá o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, como a terapias-alvo através do carreamento de substâncias e medicamentos para um sítio alvo. Dentre as inúmeras nanopartículas de interesse da medicina, o nanotubo de carbono oferece algumas vantagens devido ao seu tamanho reduzido, propriedades mecânicas, químicas, físicas e uma grande área de superfície. Estudos realizados por nosso grupo de trabalho revelaram que a administração sistêmica de nanotubos de carbono de parede múltipla (MWCNT) não funcionalizados estimulavam a resposta imune antitumoral em camundongos com carcinoma pulmonar de Lewis. O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil de células imunes no microambiente tumoral de camundongos portadores de tumor tratados sistemicamente com MWCNT, bem como o seu padrão de ativação. Os resultados mostraram que a administração sistêmica da nanopartícula diminui a massa tumoral dos grupos tratados, quando comparado ao grupo controle. Apesar deste resultado, não foram observadas diferenças significativas no número de linfócitos T CD4+, CD8+, células Natural Killer (NK) e de células apresentadoras de antígeno no microambiente tumoral nos grupos tratados com MWCNT. Porém, no linfonodo dos grupos tratados encontramos uma menor expressão da molécula PDL-1 pelas células dendríticas (CD11c+). Demonstrou-se também, através da quantificação de RNAm (Real
Time-PCR) da massa tumoral, que há uma tendência nos grupos tratados em diminuir a
expressão de genes para as citocinas TNF-α, IL-10 e o fator de transcrição STAT3.
Palavras-chave: Microambiente tumoral, nanotubo de carbono de paredes múltiplas, resposta imune, terapia do câncer
Abstract
Cancer is a disease characterized by disordered growth and proliferation of cells with genetic abnormalities, capable of forming an abnormal mass or tumor. The mass of tumor comprehend a complex microenvironment, comprising, in addition to the tumor cells, by the immune response cells, fibroblasts, endothelial cells, cytokines and chemokines, which provide a suppressor environment to immune system and that benefits the tumor progress. In the last years, the medicine has developed in the way to incorporate new technologies for the diagnosis and treatment of cancer. The possibility of using nanotechnology in the medical field will enable the development of new therapeutic strategies, such as targeted therapies through the entrainment of chemicals and drugs to a target site. Among the many nanoparticles of interest of medicine, the carbon nanotube has some advantages due its small size, mechanical properties, chemical, physical, and a large surface area. Studies by our group showed that systemic administration of multi-wall carbon nanotubes (MWCNT) not functionalized stimulated anti-tumor immune response in mice with pulmonary carcinoma Lewis. The objective of this study was to evaluate the profile of immune cells in the tumor microenvironment of mouse with tumor, which was treated systemically with MWCNT, and its pattern of activation of the immune cells. The results showed that the systemic administration of nanoparticles decreased the mass of tumor of the treated group when compared to the control group. Despite this result, there were not significant differences in the number of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, Natural Killer cells (NK) and antigen presenting cells in the tumor microenvironment in groups treated with MWCNT. However, in the lymph node of treated group we found a lower expression of PDL-1molecules by dendritic cells (CD11c+). It was also demonstrated by quantifying RNAm (Real Time-PCR) of the tumor mass, there is a tendency in the groups treated by decreasing the expression of genes for TNF-α, IL-10 cytokines and STAT3 transcription factor.
Keywords: Tumor microenvironment, multi-wall carbon nanotube, immune response, therapy
Lista de figuras
Figura 1: Imagem de TEM do nanotubo de carbono. ... 45
Figura 2: Volume do tumor. ... 47
Figura 3: Identificação das células NK ... 49
Figura 4: Perfil das células apresentadoras de antígenos (APCs) ... 51
Figura 5: Quantificação da expressão das moléculas co-estimulatórias CD80, CD86 em células apresentadoras de antígeno ... 53
Figura 6: Avaliação da expressão do PDL-1 nas APCs ... 55
Figura 7: Porcentagem de células T CD4+ e CD8+ nos órgãos linfoides, sangue e tumor... 57
Figura 8: Identificação dos linfócitos T, em função do perfil regulatório, por meio da expressão de FOXP3+ nas células TCD4+ e CD8+ ... 59
Figura 9: Expressão da molécula CD62L nas células T CD4+ CD25+ e CD8+ CD25+ ... 61
Figura 10: Análise de migração das células T CD4+ e CD8+ através da expressão de CCR7+ ... 63
Figura 11: Identificação de células B por citometria de fluxo pela marcação anti-CD19 FITC. . 65
Figura 12: Teste de Elisa ... 67
Figura 13: Expressão de genes no tumor ... 69
Lista de tabelas
Lista de abreviaturas e siglas
3LL Carcinoma Pulmonar de Lewis
ANG Angiopoietin
APC Allophycocyanin
APCs Células Apresentadoras de Antígeno ATP Adenosina Trifosfato
CCL Chemokine (C-C Motif) Ligand
CCR Chemokine (C-C Motif) Receptor
CD Cluster of Differenttiation
cDNA Ácido Desoxirribonucleico Complementar (Complementary
Desoxyribonucleic Acid)
CEUA Comitê de Ética de Uso Animal CFS Fator de Crescimento do Macrófago
ConA Concanavalina A
CVD Deposição Químico em Fase Vapor CXCL Chemokine (C-X-C Motif) Ligand
DC Célula Dendrítica (Dendritic Cell) DEPC Diethylpyrocarbonate
Dept. Departamento
DN Duplo Negativo
DNA Ácido Desoxirribonucleico (Desoxyribonucleic Acid) DNAM-1 DNAX Acessory Molecule-1
DP Duplo Positivo
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ETBR Receptor De Endotélio B FITC Isocianato De Fluorescepina FOXP3 Forkhead Box P3
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
G-CFS Fator de Crescimento do Macrófago-Granulócito GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
G-MDSC Célula Supressora Mieloide-Granulócito
(Granulocytes-Myeloid-Derived Suppressor Cells)
IDO Indoleamina 2,3-Dioxigenase Ig Imunoglobulina IgG Imunoglobulina G IL Interleucina INF Interferon LT Linfotoxina M1/2 Macrófago Tipo 1 Ou 2 mDC Célula Dendrítica Mieloide
MDSC Myeloid-Derived Suppressor Cells
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade (Major Hiscompatibility
Complex)
M-MDSC Célula Supressora Mieloide-Monócito (Monocytes-Myeloid-Derived
Suppressor Cells)
MMP Matrix Metallopeptidase
MRD Multidrug Resistence
MT Microambiente Tumoral
MWCNT Nanotubo de Carbono de Paredes Múltiplas (Multi Wall Carbon
Nanotubes)
MWCNTc Nanotubo de Carbono de Paredes Múltiplas Comercial (Multi Wall
Carbon Nanotubes Commercial)
NanoEng Nano Engenharia
NCR Natural Cytoxicity Receptors
NK Célula Natural Killer
NKG2D Natural Killer Group 2 Member D
NKT Natural Killer T Cell
NO Óxido Nítrico
NTC Nanotubo de Carbono
NTCf Nanotubo de Carbono Funcionalizado
OPD O-Phenylenediamini Tablets Dihydrocloride
PBS Tamão Salino-Fosfato
PCR Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction)
PD-1 Programmed Death 1
pDC Célula Dendrítica Plasmocitóide PDGF Platelet-Derived Growth Factor
PDL-1 Programmed Death-Ligand 1
PE-CY7 Ficoeritrina Ciania 7
PEG Polyethylene Glycol
pH Potencial Hidrogeniônico
RANTES Regular upon Activation, Normal T cell, Expressed And Secreted
RNAm Ácido Ribonucleico Mensageiro (Messenger Ribonucleic Acid) RORγT Related Orphan Receptor Gamma T
STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3
SWCNT Nanotubo de Carbono de Parede Simples (Single Wall Carbon
Nanotube)
TAM Macrófago Associado ao Tumor
TAN Neutrófilo Associado ao Tumor (Tumour-Associated Neutrophils) TCR Receptor de Antígeno da Célula T
TGF-Β Fator de Crescimento Tumoral Beta (Tumor Growth Factor Beta) Th Célula T Auxiliar (Helper)
TIL Linfócito Infiltrado no Tumor TNF Fator de Necrose Tecidual Treg Célula T Regulatória
Unicamp Universidade de Campinas
USA Estados Unidos da América (United State of America)
VEGF Fator de Crescimento Endotelial Vascular (Vascular Endothelial
Lista de símbolos
°C Graus Celsius µg Microgramas µl Microlitro µm Micrometro cm Centímetro hs Horas mg Miligramas Min Minuto ml Mililitro nm NanômetroSUMÁRIO
Introdução ... 18 1.1. Câncer ... 18 2.1. Microambiente tumoral (MT) ... 20 3.1. Nanotecnologia ... 31 Objetivo ... 37 Objetivos específicos ... 37 Metodologia ... 38 Resultados ... 44 Discussão ... 70 Conclusão ... 78 Referência ... 79 Anexo ... 88 -INTRODUÇÃO
1.1. Câncer
O câncer ou neoplasia é a segunda doença com o maior índice de mortalidade no mundo, atrás apenas das doenças cardiovasculares. Dados de instituições de pesquisa em câncer mostram que em 2012 houve 14,1 milhões de casos novos de câncer e 8,2 milhões de óbitos no mundo (WHO, 2015; INCA, 2014). O câncer é considerado uma doença de crescimento e proliferação desordenados de células anormais, cujo desenvolvimento inicia na primeira alteração genética de uma célula normal, seguido de acúmulos de modificações genéticas que proporcionarão à célula: proliferação desordenada e autônoma, imortalidade celular e a evasão do sistema imune, assim formando uma massa anormal de tecido ou tumor (BLAYLOCK, 2015).
Classicamente os tumores são classificadas como benignos quando raramente colocam a vida do paciente em risco e não invadem os tecidos subjacentes, no entanto, os tumores malignos apresentam crescimento descontrolado que ultrapassa seus limites e invade tecidos vizinhos (metastatização), se espalhando para órgãos mais distantes (WHO, 2015; PARSONS, 2003; COSTA JUNIOR, et al., 2009).
As células tumorais apresentam características diferentes das células normais na questão de proliferação, diferenciação e morte celular, nas quais as células neoplásicas possuem autossuficiência em proliferação, crescimento, evasão da morte celular e invasão tecidual, sustentam o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos, são capazes de ignorar sinais inibidores para replicação e de evadir da ação do sistema imune, todas as características das células cancerosas são adquiridas durante o processo de desenvolvimento da doença (ONUCHIC, et al., 2010; ZITVOGEL, et al., 2006).
A carcinogênese é o processo de desenvolvimento do câncer, um processo lento e complexo, composto por várias etapas, as quais se caracterizam por inúmeras alterações genéticas e das vias de sinalização que favorecem a neoplasia, dividida em fases denominadas de iniciação, promoção, progressão e metástase. A fase inicial da carcinogênese é caracterizada pela exposição da célula normal aos carcinógenos que podem ser agentes ambientais, químicos (radiação) e infecciosos como os vírus; agentes físicos; alterações hormonais; produtos tóxicos da própria célula; herança genética que causarão a alteração permanente no DNA, tendo como resultado a mutação celular e
criação de clones dessa célula alterada. A fase seguinte é a promoção, nesta fase ocorre a proliferação dos clones celulares e acúmulo de novas alterações gênicas. Na fase de progressão, as células neoplásicas já possuem característica de imortalidade, autonomia para proliferação e capacidade de produzir fatores que estimulam a formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese) e linfáticos (linfoneogênese). E a metástase caracteriza o fim do processo da carcinogênese, este processo dá a célula tumoral a capacidade de invadir outros tecidos afastados do tumor de origem através desta nova vascularização, promovendo a disseminação de novos tumores mais resistentes aos tratamentos usuais (PARSONS, 2003; SILVA, et al., 2004; WEIS, et al., 2011). Inicialmente o sistema imune tem dificuldade na identificação destas células, principalmente pelo fato das mesmas fazerem parte dos tecidos normais do hospedeiro. No entanto, à medida que novas mutações genéticas vão se acumulando, o sistema imune passa reconhecer estes novos antígenos estabelecendo uma resposta onde estão envolvidos componentes do sistema inato e adaptativo.
As células tumorais são consideradas instáveis geneticamente, devido às frequentes mutações genéticas adquiridas ao longo do processo, nem todas as modificações estão presentes em todas as células, existindo, então, subpopulações de células neoplásicas. Algumas dessas células tumorais são incapazes de se reproduzirem, apenas determinadas células têm essa disposição, essa proporção de células proliferativas é conhecida como fração de crescimento. A fração de crescimento está relacionada a taxa de crescimento do tumor, juntamente com apoptose e perda celular que compreende na metástase (ONUCHIC, et al., 2010).
Estudos iniciais feitos com o objetivo de conhecer o interior de um tumor revelaram que a massa tumoral em progressão apresentava um grande infiltrado de células inflamatórias que não suprimiam o crescimento do tumor, pelo contrário, criavam um ambiente propício ao seu desenvolvimento. Sendo assim, entendeu-se que um tumor não era apenas uma massa de células com crescimento desordenado, mas sim um ambiente composto de células inflamatórias, moléculas e mediadores químicos que são determinantes na progressão tumoral, definido agora como microambiente tumoral (SHIAO, et al., 2011; GANGULY, et al., 2014; FERNANDES, et al., 2015).
2.1. Microambiente tumoral (MT)
O microambiente tumoral (MT) tem propriedades que o diferem dos tecidos normais, a diversidade celular e de citocinas presentes no estroma permitem que o tumor tenha autossuficiência no seu desenvolvimento. Isto é propiciado pelas interações entre células geneticamente alteradas, células do sistema imune, fibroblastos, células endoteliais, citocinas produzidas por essas células ou provenientes da periferia através dos novos vasos (WEIS, et al., 2011). Devido a sua singularidade, o microambiente tumoral está sendo estudado para melhor compreensão do desenvolvimento tumoral e para desenvolvimento de terapias contra o câncer (WICKI, et al., 2015; EDIRIWICKREMA, et al., 2015). Este microambiente, através da angiogênese e cooptação de células normais junto com as células neoplásicas permitem ao tumor o desenvolvimento e a transformação maligna. Características como pH ácido, regiões de hipóxia e homeostase diferente aos tecidos normais, são encontradas no microambiente tumoral
O pH ácido presente no microambiente tumoral é consequência da glicólise, processo de conversão da glicose em piruvato, que na ausência de oxigênio converte o piruvato em lactato, para produção de ATP (adenosina trifosfato). Entretanto, as células tumorais, também metabolizam glicose em ácido lático na presença de oxigênio, realizando a glicólise aeróbica, conhecida como efeito Warburg. A alta taxa de ácido lático cria um ambiente ácido, o que beneficia a seleção de células mais agressivas e invasivas. As células tumorais, portanto, são capazes de produzir energia tanto na presença quanto na ausência de oxigênio (GATENBY, et al., 2004; ALFAROUK, et al., 2004).
A presença de oxigênio no microambiente tumoral é irregular, devido à má irrigação dos vasos sanguíneos, as regiões mais afastadas do centro do tumor sofrem mais com a ausência de oxigênio, resultando em regiões de hipóxia. Além da carência de oxigênio nessas regiões, há, também, défice de nutrientes. Contudo, as células tumorais são capazes de se adaptarem a hipóxia, aumentando a capacidade de invasão e metástases, consequentemente aumenta a dificuldade de tratamento desses tumores. Um fator que influencia na regulação da resposta celular a hipóxia é o HIF (fator indutor de hipóxia-hipoxia inducible factor), um fator de transcrição que ativa o processo de disponibilidade de oxigênio e permite a adaptação metabólica na ausência do mesmo. O
HIF age também no controle dos processos de angiogênese, eritropoiese, glicólise, apoptose, regulação do pH e homeostase. Portanto, a hipóxia se constitui em um fator importante que atua diretamente nos processos de invasão, metástase e na regulação da angiogênese (FRAGA, et al., 2009; MCINTYRE, et al., 2015).
A angiogênese é outro fator que influencia o MT, é vital para a sustentabilidade da célula tumoral e envolve a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes. A angiogênese é um processo normal do organismo durante a fase fetal e adulta, que atua na recuperação tecidual e na formação dos vasos. No câncer, a angiogênese é desregulada, apresenta estímulos que podem durar meses ou anos, permitindo uma formação contínua de vasos. Esse processo origina uma rede vascular para o tumor, consequentemente facilita a chegada de nutrientes e oxigênio e a saída de metabólitos, e, permite o crescimento tumoral e a metástase. O crescimento tumoral e a necessidade de nutriente e oxigênio estimulam a neoangiogênese através de citocinas e fatores de crescimento presentes no microambiente tumoral, onde encontram-se os estimuladores e inibidores da angiogênese, como VEGF (fator de crescimento endotelial vascular- vascular endothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor) e ANG (angiopoietin) que, além de regular a angiogênese afetam o funcionamento e o reparo dos vasos (OLIVEIRA, et al., 2010; 2007; MCINTYRE, et al., 2015).
Outros fatores que influenciam o microambiente tumoral são os diferentes tipos celulares presentes, como as células tumorais e do sistema imune, vasculares e fibroblastos, que produzem e secretam citocinas, fatores de crescimento e hormônios que alteram a homeostase e o desenvolvimento tumoral (DUDAS, 2015; DING, et al., 2012). Essas células presentes no estroma tumoral estão expostas a mudanças fenotípicas durante a progressão tumoral e é crescente o número de trabalhos que demonstram diferentes comportamentos em fases específicas da tumorigênese, em um momento combatendo o tumor e em outro promovendo o crescimento tumoral. Como em todo organismo doente, seja uma infeção bacteriana, viral ou mesmo uma doença autoimune, o sistema imune combate os invasores através da resposta imune. No caso do câncer não é diferente, o sistema imune utiliza mecanismos celulares, sinalizadores químicos, como citocinas e quimiocinas na resposta antitumoral (ABBAS, et al., 2005). No processo de combate ao câncer, as células do sistema imune estão em constante atividade, desde células da resposta inata até as células da resposta adaptativa, que irão combater as células tumorais. Estudos mostram que num certo momento as células imunes eliminam as células tumorais, sendo um momento de equilíbrio, neste
período o tumor está dormente (SCHREIBER, et al., 2015). Contudo, estudos sugerem que nesta fase ocorre uma seleção das células tumorais, permitindo que células mais agressivas e menos imunogênicas permaneçam. Assim, ocorre então, o escape dessas células tumorais e juntamente com um MT propício pela produção de mediadores imunossupressores da resposta imune como VEGF, IDO, TGF-β, IL-10, se dá o desenvolvimento e a progressão tumoral. Esse processo de desenvolvimento tumoral que envolve a fase de equilíbrio e dormência do tumor, a fase de eliminação das células tumorais mais imunogênicas e a progressão tumoral é conhecido como imunoedição do câncer. Entretanto, em todos os momentos o sistema imune tenta eliminar as células tumorais, porém, diversos fatores, como o MT e a dificuldade de acesso ao tumor dificultam a ação das células imunes (CHEW, et al., 2012; WOLF, et al., 2014; SCHREIBER, et al., 2015).
Dentre os vários subtipos celulares que compõe sistema imune, algumas células se destacam, como os macrófagos que são células fagocitárias, participam da resposta imune inata e da resposta adaptativa como efetores. Estas células estão presentes nos tecidos e no sangue, neste caso, como monócitos (ABBAS, et al., 2005). No MT os macrófagos também estão presentes e são classificados como macrófagos infiltrados no tumor, conhecidos pela sigla TAM (macrófagos associados a tumor-
Tumor-asssociated macrophages). Estes TAMs são provenientes do baço, da medula
óssea ou residentes nos tecidos, que migram para o tumor, sendo que diversos autores demonstram que estas células podem ser polarizadas para fenótipos distintos dependendo do estímulo recebido dentro do MT (BISWAS, et al., 2010; MANTOVANI, et al., 2015). Estudos mostram que estas células podem assumir diferentes formas de ação quando em contato com o MT, atuando como células efetoras estimulando a resposta imune antitumoral (macrófagos do tipo M1), ou o contrário, atuando como célula supressora com ação pró-tumoral e facilitam a invasão celular (macrófagos do tipo M2), resultando em pior prognóstico, agressividade e progressão do tumor (OSTUNI, et al., 2015; SICA, et al., 2008; HAO, et al., 2012). Os macrófagos tipo M1, polarização clássica, recebem estímulos do IFN-γ e microbianos, e, atuam na ação contra células tumorais e patógenos, promovendo resposta pró-inflamatória através da secreção de citocinas como IL-12, IL-18, IL-23, INF-γ e TNF-α (BISWAS, et al., 2010; SIVEEN, et al., 2009; SICA, et al., 2008). Os M2, polarização alternativa, atuam na reparação e remodelação tecidual, na angiogênese, e promovem resposta anti-inflamatória. São capazes de atenuar as atividades dos macrófagos M1, recebem
estímulos das citocinas IL-4, IL-10 e IL-13, sendo que a IL-4 e IL-10, são, também, produzidas pelo tumor, portanto, a ação destas células favorecem as atividades tumorais. Os M2 secretam fatores de crescimento, mediadores lipídicos e prostaglandinas que atuam tanto para anti ou pró-angiogênese (SICA, et al., 2008; BISWAS, et al., 2010; SICA, et al., 2006; CHAVEZ-GALAN, et al., 2015). Os fenótipos podem ser alterados, ou seja, pode ocorrer a reversão do macrófago tipo M1 para M2 e M2 para M1. Estudos mostram que a progressão tumoral é influenciada pelo M2 por meio das citocinas secretadas, principalmente IL-10, M-CSF e TFG-β que bloqueiam a atividade dos macrófagos M1 e atraem células T reguladoras ou estimulam sua diferenciação (GAJEWSKI, et al., 2013; SICA, et al., 2006; SOLINAS, et al., 2009).
Os TAMs são atraídos para o sitio do tumor através da expressão de quimiocinas, como CCL2 (produzida pelos macrófagos, células tumorais e fibroblastos), CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CXCL12, e as citocinas VEGF, PDGF e IL-10. Monócitos presentes no sangue, também são atraídos para o tumor onde sofrem diferenciação em macrófagos devido ao aumento do fator de crescimento do macrófago (CSF-1) que atrai estas células para o local. Os TAMs são encontrados em maior quantidade no tumor em regiões de hipóxia, o que justifica a promoção da angiogênese pelos macrófagos, os quais são atraídos para essas regiões pelo VEGF e
endothelin-2 (QUALI, et al., 2013; HAO, et al., 2012; GAJEWSKI, et al., 2013). Por
fim, a presença destas células no MT pode proporcionar progressão tumoral, angiogênese, crescimento tumoral, metástase, imunossupressão e remodelação da matriz (HAO, et al., 2012).
Outra célula presente no MT é a célula supressora mieloide derivada (MDSC- myeloid-derived suppressor cells), essas são células imaturas com funções imunossupressoras e de manutenção da homeostase tecidual (QUALI, et al., 2013; JOYCE, et al., 2009). Este tipo celular, como outros, favorecem o crescimento tumoral suprimindo a resposta antitumoral. As MDSC possuem duas subpopulações, um tipo monócito (M-MDSC), e o outro tipo granulócito (G-MDSC) presente em maior quantidade, entretanto, pouco se sabe sobre esses subtipos e sua função especifica no tumor (LINDAU, et al., 2012). Contudo, no MT, ambos os tipos de MDSC são imunossupressoras, e interferem na apresentação de antígeno pelas células dendríticas (DC), na polarização dos macrófagos tipo 1 e ativação de células T, bloqueando os linfócitos T CD4+ e CD8+, promovendo a diferenciação das células T reguladoras (QUALI, et al., 2013; JOYCE, et al., 2009). Estudos mostram que as células mieloides
no MT tornam-se imunossupressoras quando em presença de células dendríticas tolerogênicas, TAMs, e de neutrófilos associados ao tumor (TAN- tumour-associated
neutrophils). Outro fato importante é que o acúmulo de MDSC no MT pode causar uma
inflamação crônica, no qual há liberação de citocinas pró-inflamatórias como 1 e IL-6, e a liberação de óxido nítrico (NO), aliados disso, regiões de hipóxia e um ambiente rico em ácido láctico e adenosina, que irão interferir na maturação das células apresentadoras de antígenos (APCs) (LINDAU, et al., 2012; GABRILOVICH, et al., 2012).
Além dos macrófagos, as células dendríticas fazem parte do sistema imune, são as principais células apresentadoras de antígenos cuja função é iniciar a resposta imune adaptativa através da apresentação de antígenos aos linfócitos T CD4+ e CD8+. As DCs compreendem menos de 1% do total de células no sangue periférico e está presente em órgãos linfoides como linfonodos, baço, sistema linfoide associado às mucosas e na superfície do epitélio da maioria dos órgãos. Dentre as propriedades funcionais destas células estão a captura do antígeno, por meio da fagocitose ou macropinocitose, neste momento a DC ainda está imatura e apresenta baixo nível de proteínas do MHC (Major histocompatibility complex) e sem expressão de moléculas coestimuladoras como B71 e B72. O processo de maturação das DCs ocorre durante a sua migração para os órgãos linfoides, onde irá secretar a quimiocina CCL18, que irá atrair às células T, e então, a DC apresentará o antígeno para as células T através do MHC (ABBAS, et al., 2005; JANEWAY JR, et al., 2007).
Vários subtipos de DCs têm sido identificados no sangue e órgãos linfoides, sendo relacionadas com a sua origem. As DCs provenientes de um progenitor linfoide são classificadas como célula dendrítica plasmocitóide (pDC) sendo negativa para o marcador CD11c, enquanto que aquelas provenientes do progenitor mielóide são CD11c+ e classificadas como célula dendrítica mielóide (mCD), elas estão presente em maior quantidade no organismo e sua função dentro da resposta imune são mais conhecidas que as pDC (JANEWAY JR, et al., 2007; ABBAS, et al., 2005).
As DCs têm grande importância na resposta imune antitumoral, podendo ativar uma resposta imune efetora contra o tumor ou induzir tolerância. O aumento de DCs maduras no MT está relacionado com um melhor prognóstico, pois estas células apresentam antígenos para os linfócitos T CD8+ que são células citotóxicas. A ativação dos linfócitos T citotóxicos, que são as células capazes de destruir células tumorais e infectadas com vírus. A ativação dessa célula depende de um tipo de apresentação de
antígeno, denominada “apresentação cruzada”. Neste caso as DCs têm contato com células tumorais mortas, e o processamento destes antígenos permite que ao mesmo tempo ele seja mostrado para os linfócitos T CD8+ através do MHC I e para os linfócitos T CD4+ pelo MHC II, esta função resultará em um reconhecimento completo do antígeno gerando uma resposta imune antitumoral eficaz. Estudos demonstram que as DCs que são CD8α+ realizam uma apresentação mais efetivas aos linfócitos. A
apresentação cruzada, neste caso, sofre influência do INF-α que promove a apresentação cruzada, e como consequência estimula os linfócitos citotóxicos favorecendo a resposta antitumoral (MELIEF, 2008; GAJEWSKI, et al., 2013).
No entanto, estudos demonstram que dentro do MT as DCs têm a sua capacidade de apresentação diminuída devido a presença de células e citocinas com função supressora. Estudos mostram que as MDSCs e os TAMs influenciam nas funções das DCs no MT impedindo sua maturação e consequentemente impossibilitando a apresentação de antígenos tumorais aos linfócitos T. O acúmulo destas DCs imaturas está relacionado com o aumento de células T regulatórias (Treg),
pelo fato destas células imaturas, quando drenadas para os linfonodos produzirem uma apresentação de antígeno defeituosa aos linfócitos T levando ao desenvolvimento de células regulatórias. Outra observação importante em relação a estas células é a expressão do fator de transcrição STAT3 pelas DCs associadas ao tumor, o qual aumenta a produção de TGF-β (tumor growth factor beta) e diminui expressão da molécula de MHC II, por consequência atenua a apresentação cruzada de antígenos relacionados ao tumor favorecendo a sua progressão (MELIEF, 2008; GABRILOVICH, 2004; GABRILOVICH, et al., 2012; SHARMA, et al., 2007).
Após a apresentação de antígeno por meio das DCs nos órgãos linfoides secundários, os linfócitos T ativados migram para o local de inflamação, no caso, migram para o tumor. Portanto, os linfócitos também são encontrados no microambiente tumoral, e são chamados de linfócitos infiltrados no tumor (TIL). A porcentagem e os subtipos de TIL no MT são extremamente importantes no prognóstico da doença. Os linfócitos são células responsáveis pelo estabelecimento da resposta imune adaptativa no nosso organismo contra diversos estímulos nocivos, e há dois tipos básicos: os linfócitos B e os linfócitos T (JANEWAY JR, et al., 2007; CHEW, et al., 2012; COSTA JUNIOR, et al., 2009).
Os linfócitos B são células que secretam imunoglobulinas (Ig), conhecidas, também, como anticorpos, secretam algumas citocinas como IL-6, TNF-α, GM-CSF e
linfotoxina (LT) e mais conhecidos pela participação na resposta humoral. Além da neutralização microbiana, as células B, promovem a opsonização, quimiotaxia, e ativação e desativação de células mieloides pró-inflamatórias (JANEWAY JR, et al., 2007; GUNDERSON, et al., 2013). As células B também atuam na apresentação de antígenos para os linfócitos T CD4+, na resposta imune humoral (ABBAS, et al., 2005). As células B se desenvolvem e sofrem maturação na medula óssea e, então, migram para os órgãos linfoides periféricos onde aguardam a ativação, através do reconhecimento de antígeno, e, a sua diferenciação em célula plasmática. Gunderson et
al. (2013) demonstram que as células B, no tumor, atuam na regulação de células T,
principalmente T CD4+ Th2, interferem na ação das células T CD8+, e baseado nas doenças autoimunes e inflamatórias, os linfócitos B influenciam nas ações das células Th17 e Th9 (GUNDERSON, et al., 2013).
Já os linfócitos T fazem parte da resposta imune adaptativa contra os microrganismos. As células T possuem receptores de antígenos, conhecido como TCR (receptor de antígeno da célula T) que reconhecem antígenos específicos nos órgãos linfoides periféricos, como o linfonodo, que é apresentado à célula T através das APCs. Após a ativação, a célula T passa pelo processo de proliferação e diferenciação em células efetoras, nessa fase há produção e liberação da citocina IL-2 pelas células T, que estimulará a proliferação e diferenciação das mesmas. As células T, são classicamente subdividas em duas classes de acordo com as moléculas de superfície que expressam: linfócitos T CD4+ e CD8+ (JANEWAY JR, et al., 2007; ABBAS, et al., 2005).
Os linfócitos T CD8+, conhecidos como célula T citotóxica, reconhecem células infectadas, como por exemplo, por vírus ou bactérias que se multiplicam no citosol, e eliminam a célula. As células T CD8+ reconhecem o antígeno através da molécula de MHC de classe I, no qual o antígeno é derivado de proteínas sintetizadas do citosol. As células T CD8+ produzem e secretam citocinas como INF-γ, TNF-β e TNF-α, e as citotoxinas, como perforina, granzima, granulisinas e ligantes de Fas (CD178), essas citotoxinas podem atuar em qualquer célula, pois são capazes de penetrar na bicamada lipídica e iniciar a morte celular programada. As células T CD8+ podem ser ativadas por células apresentadoras de antígenos, célula dendrítica, e pelas células T CD4+, que atuam em alguns casos como co-estimulação (JANEWAY JR, et
al., 2007; ABBAS, et al., 2005).
No MT, a presença de célula T CD8+ ativada mostra um bom prognostico para o paciente, principalmente se acompanhado com uma diminuição de células Treg
(HADRUP, et al., 2013). Contudo, grande parte do problema encontrado pelas células T CD8+, é a regulação negativa por meio das células T
reg ou por meio do bloqueio através
das citocinas imunossupressoras presentes no MT (CHEW, et al., 2012; GAJEWSKI, et
al., 2013; HADRUP, et al., 2013).
Já, os linfócitos T CD4+ participam da resposta contra infecção por bactérias, diferente das células T CD8+, as células T CD4+, reconhecem o antígeno através do MHC II, cujo antígeno é originário das proteínas das vesículas intracelulares, e atuam na ativação de macrófagos, células B e célula T CD8+. Os linfócitos T CD4+ são divididos em subpopulações de acordo com as suas funções. Uma das subpopulações é a célula T helper 1 (TH1), também conhecido como célula T
inflamatória, cuja função é a ativação dos macrófagos para morte das bactérias contidas nas vesículas da célula apresentadora de antígeno através da fusão com o lisossomo, estimula mecanismos antibacterianos dos fagócitos e liberam citocinas, como IL-3, TNF-β, IL-2, CXCL2, e que atuarão na ativação dos macrófagos, INF-γ, GM-CSF e TNF-α (JANEWAY JR, et al., 2007; ABBAS, et al., 2005; SIMONSON, et al., 2010). As células TH2, outra subpopulação dos linfócitos T CD4+, auxiliam a ativação dos
linfócitos B para ação contra patógenos extracelulares, produzem e secretam citocinas, como IL-3, GM-CSF, IL-10, IL-9, IL-13, IL-15, TGF-β, CCL11 e CCL17, e, moléculas que irão atuar na ativação das células B, como IL-4 e IL-5 (JANEWAY JR, et al., 2007; ABBAS, et al., 2005).
No MT, a presença de célula T CD4+ facilita o acúmulo de células T CD8+ no local (RAHIR, et al., 2012). As células T CD4+ encontradas são principalmente as células TH1, que juntamente com as células T CD8+ mostram um prognóstico muito
bom para o paciente (SIMONSON, et al., 2010). As células T CD4+ contribuem para um ambiente inflamatório, e a liberação de INF-γ no MT ajuda na produção de quimiocinas CXCL 9, CXCL 10, CCL2, CCL 3 e CCL 5, que atraem células T para o MT (RAHIR, et al., 2012).
Outra subpopulação dos linfócitos T CD4+, é a célula TH17, célula da
resposta imune adaptativa, é relacionada com a manutenção e promoção de processos inflamatórios, estimula o recrutamento de neutrófilos e macrófagos, e doenças autoimunes. Produz e secreta citocinas como IL-17A, IL-17F, IL-23, IL-6, IL-22, TNF-α e CCR20 e expressa o fator de transcrição RORγT e STAT3. A IL-17 induz a produção de outras citocinas como IL-6, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, CXCL8, fatores de remodelação tecidual (MMP1, MMP3, MMP9, MMP13, TIMP2) e produtos
anti-microbianos, como β-defencinas, mucinas e calgranulinas (ZOU, et al., 2010; GONZÁLEZ-GARCÍA, et al., 2009; BAILEY , et al., 2014; GNERLICH, et al., 2013).
Estudos mostram que as células TH17 são estimuladas na presença de
TGB-β e IL-6, enquanto que as citocinas IL-1 e IL-23, ajudam na sobrevivência e diferenciação desta célula por longos períodos (BAILEY, et al., 2014), estimulando e aumentado a ação desta célula. Entretanto, a ação das células TH17 pode ser inibida na
presença de TGF-β pela ação das células Treg ou de outras citocinas como IL-10 e IL-27
que também estão envolvidas na regulação negativa deste subtipo (GONZÁLEZ-GARCÍA, et al., 2009; GNERLICH, et al., 2013). Os efeitos destas células sobre o câncer são controversos, alguns estudos mostram que as células TH17 podem atuar na
resposta antitumoral, outros asseguram que a sua atuação favorece o crescimento e desenvolvimento tumoral. No entanto, sabe-se que vários fatores, incluindo os estímulos para ativação da célula e o tipo de câncer, influenciam na ação dessas células frente ao tumor (ZOU, et al., 2010).
Estudos mostram que TH17 tem uma atividade antitumoral, na qual produz,
no MT, CCL2 e CCL20, favorecendo a migração de leucócitos para o tumor, principalmente as células dendríticas CD8α+, que atua na apresentação cruzada de
antígeno (RAHIR, et al., 2012; BELLONE, et al., 2013). Apesar disso, outros estudos mostram uma ação pro-tumoral, na qual há liberação da citocina pró-inflamatória IL-17 favorece a angiogênese e o crescimento tumoral. No entanto, outros estudos mostram que o aumento de células TH17 em tumores no ovário, aumenta a sobrevida do paciente
(BAILEY , et al., 2014; GNERLICH, et al., 2013; BELLONE, et al., 2013).
Outro tipo celular importante envolvida na regulação da resposta imune antitumoral são as células T regulatórias. Estas células são um subtipo da célula T CD4+, que expressam a molécula CD25+ e o fator de transcrição FOXP3+, e têm função de regular a atividade de outras células T, ou seja, tem a função de modular a resposta imune através da regulação da expansão e atividade dos linfócitos B e da manutenção da homeostase dos linfócitos citotóxicos e auxiliares e, também, atuam na prevenção de doenças autoimunes. A presença de TGF-β e CCL22, ou IL-10, no MT, converte as células T naive em células Treg induzidas (iTreg), ou Treg adaptativa, e ainda pode haver
a presença de células Treg naturais (nTreg), as quais sofreram maturação no timo e
migram para o local de inflamação, no caso o tumor (SHIAO, et al., 2011). No tumor, a Treg atua no recrutamento periférico, proliferação celular e diferenciação de progenitores
imunossupressoras como IL-10 e TGF-β. Além disso, as células Treg atuam sobre as
células dendríticas, células citotóxicas e as células NK, como consequência atuando a favor da progressão tumoral.
Outra célula importante encontrada no MT é a célula Natural Killer (NK). A NK é um linfócito granular com funções efetoras na resposta imune inata e regulatórias na adaptativa, além de possuir atividades citotóxicas importantes e atuar na regulação da resposta das células T e diferente de um linfócito T, a célula NK não apresenta receptor de antígeno (JIN, 2014). As células NK estão presentes na circulação sanguínea e alguns órgãos como linfonodo, baço e fígado, são capazes de responder rapidamente a mudanças bruscas no ambiente, e podem sofrer maturação ou ativação por várias citocinas como IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-12, IL-18, e IL-15. Outro estímulo é através da sinalização do nível de MHC I expresso nas células, que irão inibir ou ativar as células NK. O exemplo disso são células que apresentam baixo nível ou deficiência na expressão de MHC I, isto acontece geralmente com células infectadas por vírus e cancerígenas, o que permite serem identificadas e atacadas pelas células NK. A ação das NK se dá através da liberação de grânulos contendo perforina e granzima, que irão causar apoptose da célula (SCHLEYPEN, 2006; CROUSE, et al., 2015; WALDHAUER, et al., 2013). Além da ativação pela ausência de MHC I e algumas citocinas, as células NK podem ser ativadas por receptores específicos, como NKG2D, NK1.1, 2B4, DNAM-1, e NCRs (natural cytotoxicity receptors) (KIM, et al., 2014).
Junto com ação efetora, as células NK secretam várias citocinas, como INF-γ, GM-CSF, TNFα e RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and
secreted). O IFN-γ produzido por estas células estimula a ativação e maturação das DCs
que por sua vez produzirão IL-12, por consequência promove uma resposta antitumoral via linfócito T CD8+ (WALDHAUER, et al., 2013). Estudos mostram que a presença de célula NK contribui para o controle de tumores sólidos e para resposta antitumoral (GAJEWSKI, et al., 2013).
Um subtipo da célula NK, é a célula T NK (natural killer T cell), conhecida como célula NKT, é uma célula da linhagem linfoide que pode atuar tanto na estimulação quanto na supressão da resposta imune inata ou adaptativa, capaz de estimular simultaneamente as duas respostas imunes. Umas das características das células NKT é a resposta a um antígeno lipídico através de um TCR singular, capaz de responder a vários antígenos de origem própria e desconhecida, esse TCR irá se ligar à uma molécula não convencional de MHC, sendo CD1 de uma APCs. A célula NKT
produz IFN-γ, TNF-α, GM-CSF (fator de estimulação de macrófagos-granulócitos), citocinas IL-4, IL-10, IL-13, IL-17, IL-21 e IL-22. A população de células NTK possui subtipos que apresentam características de acordo com o tecido local, as funções, os tipos de TCR apresentado, que se referem ao tipo de antígeno reconhecido, os marcadores de superfície, sendo CD4+, CD8αβ, CD8αα, CD4-CD8- -double negative (DN), e é dividida em NK 1.1+ ou NK 1.1- (ROBERTSON, et al., 2014; FUJII, et al., 2013). As células NKT podem destruir células tumorais diretamente, através do mecanismo dependente de perforina ou granzima B, ou pela via indireta através de outras células imunes. Ao mesmo tempo, após a estimulação das células NKT, inicia-se uma resposta antitumoral, através da produção de INF-γ que irá atuar nas células dendríticas, células NK, neutrófilos, células TH1 e células T CD8, por meio da
eliminação de células tumorais MHC positivo e negativo ( FUJII, et al., 2013).
Além das células do sistema imune, o MT, contêm outros componentes como células tumorais, fibroblastos, matriz extracelular, colágeno, células e receptores endoteliais, que de alguma forma contribuirão para o crescimento tumoral. Por exemplo, a deposição de colágeno no estroma tumoral dificulta a entrada de células imunes, formando uma barreira (GAJEWSKI, et al., 2013). Estudos mostram que no MT de muitos tipos de câncer, como melanoma, câncer de ovário e carcinomas nos estágios mais avançados, apresentam a predominância de células com perfil regulatório que expressam receptores ou secretam citocinas imunossupressoras. A exemplo disso, temos as células Treg, macrófagos que expressam B7-H4 (KRYCZEK, et al., 2007) e células
tumorais que expressam PD-L1 ou receptor de endotélio B (ETBR), a ação destas células ou receptores suprimem a resposta imune antitumoral diminuindo a quantidade de células T efetoras infiltradas no tumor (HADRUP, et al., 2013; HAMANISHI, et al., 2007).
Como visto, as células tumorais apresentam diversos mecanismos de escape do sistema imune, seja por alterações genéticas, como a expressão de moléculas anti-apoptóticas (CHEW, et al., 2012); pela secreção de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-β ou pelo aumento de citocinas e de células com fenótipo imunossupressor. Este conjunto de fatores prejudica diretamente no sucesso ou na eficácia dos diferentes tipos de tratamentos contra o câncer ( DUNN, et al., 2002; KIM,
et al., 2007).
Apesar dos avanços tecnológicos e do melhor entendimento da genética molecular que permitiu o desenvolvimento de novos fármacos para alvos específicos em
tumores distintos, ainda hoje, se um paciente é diagnosticado com câncer ele ainda será submetido a quimioterapia ou radioterapia. O principal objetivo deste tipo de terapia é eliminar as células cancerosas, no entanto ambos os tratamentos apresentam diversos efeitos colaterais ao paciente. O principal deles é que sua forma de ação atinge também células normais, e a necessidade de combinar as duas terapias acaba levando o paciente a uma condição de debilidade que só favorece a progressão do tumor. Outro técnica utilizada é a remoção cirúrgica da massa tumoral, contudo, nem sempre é viável, pois a massa pode estar ligada à um órgão e ter difícil acesso.
Novas formas de terapia foram e continuam sendo desenvolvidas na busca de melhorar a eficácia dos tratamentos e diminuir os efeitos colaterais. Neste contexto, vários estudos tem se baseado na terapia com células imune específicas, objetivando estimular o sistema imune contra o tumor. A exemplo disso, temos as terapias que utilizam a injeção de células TH17 (KØLLGAARD, et al., 2015), os tratamentos com
anticorpos monoclonais que bloqueiam receptores que estimulam células imunossupressoras ( IKEDA, et al., 2015) e também, vacinas com células dendríticas (SMITS, et al., 2009).
Entretanto, entender o funcionamento e conhecer as propriedades do MT promoveria o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer. Algumas das novas terapias desenvolvidas utilizam nanopartículas como carreador de remédios, quimioterápicos e moléculas que irão atuar contra o câncer, esse tipo de aplicação das nanopartículas é conhecido como drugs delivery (CUENCA et al., 2006).
3.1. Nanotecnologia
A nanotecnologia é o ramo da ciência que envolve a síntese e manipulação de materiais ou sistemas em que pelo menos uma dimensão está na escala manométrica, ou seja, na ordem de bilionésimos (10-9) de metro (PARBOOSING et al, 2012). Para a
pesquisa nanotecnológica, tem-se considerado uma vasta gama de materiais como:
quantum dots (JAMIESON et al, 2007), dendrímeros (BARRET et al, 2009),
lipossomos (TAN et al, 2010), micelas (CHANG et al, 2001), partículas de ouro (LEE
et al, 2012) e prata (de LIMA et al, 2012), nanotubos de carbono (NTC) (IIJIMA, 1991)
e do grafeno, cujas propriedades físico-químicas são investigadas para se constatar ou não a possibilidade de emprego nas mais diversas áreas do conhecimento. Destacam-se na utilização de NTC, principalmente, as áreas de engenharia de materiais (MADANI et
al, 2011). Devido a interdisciplinaridade que envolve a nanotecnologia, a sua possível
aplicação na área médica e biotecnológica tem sido amplamente explorada nos últimos anos (YANG et al, 2012).
No ramo industrial, por exemplo, tem-se verificado a utilização destes materiais tanto em dispositivos eletrônicos como em nanocompostos de grande resistência e baixo peso (ELHISSI et al, 2012). Atualmente, a nanotecnologia está ao alcance da população nos produtos, como processadores de computadores, transistor, mochilas a prova de bala, na produção de pás eólicas, em cremes para estéticas, materiais para construção, armazenamento de alimentos, produtos esportivos, filtros e adsorventes. Porém, na área médica muitos estudos ainda são necessários para conhecer os seus efeitos sobre os organismos vivos e o meio ambiente (DIANZANI, et al., 2014; BHASKAR, et al., 2010; LIU, et al., 2012; ONG, et al., 2014).
Na área da biológica, a aplicação dos nanomateriais, nanocompósitos e nanopartículas trouxe um novo campo de estudo, a nanomedicina, objetivando o seu emprego em novas terapias, novos métodos de diagnósticos e monitoramento de doenças, ou mesmo para aprimorar as técnicas existentes (LACERDA, et al., 2006). O foco principal foi o campo terapêutico para tratamento de doenças degenerativas, inflamatórias, genéticas e câncer. Estas terapias envolvem o transporte de genes (gene
delivery), drogas para células (drugs delivery), detecção de patógenos e proteínas,
reconstrução e estruturação tecidual, separação e purificação de células e moléculas biológicas, estudo da fagocinética, sinalizadores e contraste para imagem de ressonância (MALLAPRAGADA, et al., 2015; BHASKAR, et al., 2010). Tais abordagens seriam principalmente empregadas em terapias contra o câncer e doenças auto-imunes (IANCU & MOCAN, 2011; MADANI et al, 2011; ELHISSI et al, 2012; ZHANG et al, 2012). Entre os nanomateriais os nanotubos de carbono tem sido os mais estudados na última década.
A descoberta dos NTC foi atribuída a Iijima, em 1991, entretanto, a estrutura foi citada por Oberlin em 1976. Porém somente após alguns anos da descoberta do fulereno, em 1985, por Kroto, Smalley e Curl, Iijima observou que na presença de vapor de carbono em altas temperatura e atmosfera de hélio, ocorreria a formação de tubos de carbono. Os nanotubos observados eram formados por múltiplas camadas de folhas de grafeno, possuía diâmetros na ordem de nanômetros e comprimentos maiores que 1μm ( SOUZA FILHO, et al., 2007).
Segundo Paradise et al. (2007) o grafeno é uma camada única de átomos de carbono dispostos em uma rede hexagonal, sendo um material bi-dimensional, pode formar uma esfera, fulereno, ou um tubo, o nanotubo. Os nanotubos são materiais compostos por folhas de grafeno enroladas na forma de um cilindro fechado, com estrutura de pentágonos e hexágonos ligados entre si com hibridização do tipo sp2. A forma como a folha de grafeno é enrolada determina a estrutura e característica física do nanotubo de carbono, sendo importante o ângulo quiral ou ângulo de helicidade, que determina a direção de enrolamento da folha, e o diâmetro do tubo, conhecidos como parâmetros de Hamada (SOUZA FILHO, et al., 2007; EATEMADI, et al., 2014; POPOV, 2004). O NTC possui particularidades que o permite ser aplicado a uma gama de produtos com finalidades diversas. Devido as suas características mecânicas, elétricas, eletrônicas, óticas e físicas, sua versatilidade e biocompatibilidade para aplicações no campo biomédico ( RASTOGI, et al., 2014; DAHM, et al., 2015).
Estruturalmente, os nanotubos de carbono podem ser classificados de acordo com o número de camadas que possuem. Os NTCs podem apresentar estrutura de parede simples ou single wall carbon nanotubes (SWCNT), uma única folha de grafeno enrolada em si própria, com diâmetro de 0,4 a 3nm, e comprimento de 20 a 1000nm, e a estrutura com paredes múltiplas ou multi-wall carbon nanotubes (MWCNT), compreende um conjunto de folhas de grafeno que formam várias camadas com diâmetro interno de 1,0 a 3,0nm e externo de 2,0 a 100nm e a distância entre as folhas de 0,34nm (MALLAPRAGADA, et al., 2015; RASTOGI, et al., 2014; KLUMPP, et al., 2006; SOUZA FILHO, et al., 2007).
O NTC pode ser produzido pelas técnicas de descarga arco elétrica, ablação a laser, conversão de alta pressão de monóxido de carbono e deposição química em fase vapor (CVD-chemical vapour deposition) ou térmica potencializada por plasma (NADERI, et al., 2013). Cada técnica é capaz de produzir o NTC com algumas características específicas, como o diâmetro e o número de camadas. Por exemplo, o método CVD produz nanotubo de carbono de paredes múltiplas com diâmetro de acordo com o catalizador utilizado no processo, sendo proporcional ao mesmo, já o método de descarga arco elétrica produz o NTC com o diâmetro interno menor (GATELY, et al., 2015; SOTO, et al., 2015). As propriedades do nanotubo de carbono como a elevada resistência mecânica e condutividade elétrica e térmica, flexibilidade e alta área específica, baixo peso molecular, estrutura ordenada, alta frequência de ressonância, são características que podem ser modificadas durante sua síntese de
acordo com seu emprego, possibilitando uma variada gama de aplicações desde o armazenamento de energia e de hidrogênio até aplicações médicas (DAHM, et al., 2015; SOTO, et al., 2015; GATELY, et al., 2015; JI, et al., 2010).
O nanotubo de carbono já é aplicado na indústria mecânica, aeroespacial, eletrônica, computacional, e na área biomédica. Devido ao aumento do uso do NTC, estudos mostram o potencial tóxico do material ao organismo. Poland et al. (2008), mostram essa toxicidade ao organismo, considerando similar às fibras de asbesto, contudo, outros estudos mostram que a toxicidade do NTC depende do comprimento, tipo de funcionalização, dispersante usado para solubilizar, quantidade, tempo e método de exposição (LIU, et al., 2012; RASTOGI, et al., 2014).
Os NTCs são hidrofóbicos, o contato com a água induz a formação de grandes agregados que acrescentam a estas nanopartículas algumas características como aumento da toxicidade, dificuldade de circulação no organismo com possível citotoxicidade para as células vivas. Para as aplicações in vitro e in vivo, este é o principal obstáculo para utilização destes materiais para o tratamento de doenças. Porém, muitos pesquisadores trabalharam no sentido de modificar esta condição através do desenvolvimento de novos processos de tratamento com ácidos, para retirada de resíduos tóxicos como ferro, níquel entre outros, bem como o aprimoramento dos processos de funcionalização. A funcionalização visa diminuir ou eliminar a possibilidade de agregação dos NTCs, isto levará a uma menor captação pelos macrófagos (fagocitose), diminuirá a toxicidade e aumentará o tempo de circulação (clearence). A funcionalização do NTC, pode ocorrer através da ligação de moléculas à superfície ou à extremidade do NTC. Em relação a solubilização, ela ocorrerá de acordo com o tipo de ligação química. As ligações covalentes podem ser feitas através da oxidação do NTC com ácidos ou reações de adição, que permite a ligação de diversas moléculas como os aminoácidos, proteínas e DNA. Outro método bastante utilizado é a dispersão em solução de surfactante, bio-polímeros e polímeros que através de ligações não-covalentes, mantêm as características eletrônicas e a estrutura aromática das moléculas que serão adsorvidas (RASTOGI, et al., 2014; KLUMPP, et al., 2006). Outros tipos de variações podem ser feitas através de modificações químicas como, por exemplo, adesão da cadeia simples de DNA ou com o fosfolipídio contendo PEG (polyethylene glycol), que permite aumentar a capacidade de ligações, no sentido de adsorver moléculas de proteínas ou mesmo DNA e RNA em sua superfície, de maneira que essas moléculas possam alterar o desenvolvimento e função celular, ou ligação de
medicamentos ao NTC (LAM et al., 2006). Além da funcionalização, o NTC pode passar pelo processo de purificação que irá retirar as impurezas através da centrifugação, filtração, cromatografia e técnicas de derivação química ( KLUMPP, et
al., 2006). É a partir da funcionalização que é possível de utilizar o NTC como veículo
para o transporte terapêutico, agente de tratamento de radioterapia e hipertermia, estrutura para tecido e biosensores (ONG, et al., 2014).
As possíveis aplicações do NTC concentram-se, principalmente, em duas áreas: diagnóstico e terapia. No campo de diagnóstico, os NTCs são usados para biomarcadores em tomografias por emissão de prótons, devido a sua capacidade de penetrar a membrana celular e permanecer intracelular, essa técnica apresenta melhores resultados que o tradicional uso de fluoro-desoxi-glicose como contraste, podem ser utilizados marcadores específicos para alguns tipos de câncer, como antígeno específico de próstata, α-fetoproteína. Essa aplicação favorece o precoce diagnóstico de câncer (NADERI, et al., 2013).
No campo terapêutico, os nanotubos funcionalizados são capazes de produzir sistemas nano-estruturados altamente específicos, como o sistema imobilizador de proteínas, onde o nanotubo de carbono é dopado com nitrogênio e utilizado para imobilizar as proteínas ferritina e albumina, ou como biosensor, sendo um sensor biológico que pode monitorar de modo contínuo o nível de glicose, o NTC pode, ainda, ser usado como bloqueador de canal iônico ou suporte para adesão de polissacarídeos para imitar a membrana celular, em tratamentos de fototérmica e fotodinâmica, entre outras aplicações ( RASTOGI, et al., 2014; NADERI, et al., 2013; SOUZA FILHO, et
al., 2007; KLUMPP, et al., 2006).
O NTC pode levar o medicamento ligado na sua estrutura externa ou interna, como já mencionado, assim, ele não precisa penetrar na célula mas pode funcionar como um mecanismo de entrega apenas o medicamento ser internalizado ou ser internalizado junto com o medicamento pela célula, sendo mais eficiente, pois os agentes farmacológicos serão liberados somente no interior da célula, após a degradação do sistema medicamento-nanotubo de carbono funcionalizado (NTCF), e no caso do
conjunto NTCF-medicamento não ser internalizado, o fármaco pode ser degradado,
antes de ser internalizado, nos fluidos fisiológicos ( LAMBERTI, et al., 2015). Esse sistema de terapia, vem sendo estudado para aplicações em tratamento para doenças infecciosas com uso de antibióticos ligados ao NTCF, carreamento de fármacos para o
