MÓLECULA FLUOROCROMO EXPRESSÃO CELULAR FUNÇÃO
XII. Avaliação das citocinas presentes no microambiente tumoral
Para finalizar o estudo do microambiente tumoral, foi quantificado a expressão gênica (FIGURA 13) para as citocinas em especial a IL-10 (13A), IFN-γ (13B), TNF-α (13C), TFG-β (13D), IL-12 (13E), avaliados por Real Time-PCR. Observa-se uma diminuição das citocinas TNF-α, citocina pró-inflamatória, e IL-10, citocina anti-inflamatória em ambos os tratamentos. A citocina IL-12 apresenta diminuição no grupo tratado com MWCNTc e o IFN-γ não apresenta alterações. O TFG-β, uma proteína que afeta as células do sistemas imune, estimulando ou inibindo sua diferenciação e funções, tem papel na migração e diferenciação celular e na regulação do crescimento celular (TU, et al., 2014; PICKUP, et al., 2013), sugere um aumento em ambos os tratamentos. Foi quantificado, também, o fator de transcrição STAT3 (13G), um fator de transdução de sinal e ativador da transcrição 3 que está relacionando nos processos de apoptose celular, migração e ciclo celular e angiogênese, e quando ativado continuamente tem ação supressora, favorecendo a progressão tumoral (Ferguson, et al., 2015). Os resultados sugerem uma diminuição em ambos os tratamentos. E a granzima B (13H), citocina secretada pelas células T CD8 citotóxicas e células NK, no qual os resultados nos mostram uma tendência a diminuir em ambos os tratamentos.
Figura 13: Expressão de genes no tumor. Gráficos das citocinas a IL-10 (A), IFN-γ (B), TNF-α (C), TGF–β (D), IL-12 (E), para o fator de transcrição STAT3 (F) e para granzima B (G), através do Real Time-PCR quantitativo. Método comparativo utilizado 2-ΔCT.103.
DISCUSSÃO
A heterogeneidade do MT cria um ambiente favorável às células tumorais devido à presença de diferentes células juntamente com os mediadores químicos, como as citocinas e quimiocinas, produtos metabólicos, presença de oxigênio, estímulos às células supressoras da resposta imune, que por consequência inibem a ação das células efetoras e favorecem o desenvolvimento do tumor. Novos tratamentos contra o câncer foram desenvolvidos com base nas nanopartículas, como estruturas carreadoras de medicamentos, citocinas, proteínas e bloqueadores, entretanto, pouco se sabe sobre os efeitos da interação dessas nanopartículas com o sistema imune e o câncer. Nosso trabalho teve como objetivo analisar a influência do nanotubo de carbono de parede múltiplas no MT, uma vez que foi demonstrado através de estudos em nosso laboratório que o NTC estimula uma resposta imunológica contra o câncer. Observamos os tipos de respostas imunes que eram desencadeadas em animais portadores de carcinoma pulmonar de Lewis após a administração sistêmica de nanopartículas de carbono (MWCNT), bem como os mecanismos imunológicos efetores que atuam na presença deste tumor.
Inicialmente, observamos o crescimento da massa tumoral nos grupos tratados (FIGURA 2) tanto no MWCNT produzido na Unicamp quanto MWCNTc adquirido comercialmente da empresa HELIX Material Solutions, USA. Estas nanopartículas possuem similaridades com as anteriores quanto à média de tamanho (30 a 40nm), porém, o grau de pureza é maior do que o MWCNT produzido na FEEC. Sendo assim, observamos que após a administração sistêmica de uma única dose de 100µg de NWCNT/por animal em 100µl de PBS+ 0,01% de Pluronic 127, o crescimento da massa tumoral dos animais tratados com MWCNT e MWCNTc foi reduzido quando comparado ao controle. No entanto, quando comparado os tratamentos, o MWCNT produzido na Unicamp demonstrou ter a capacidade de conter melhor o crescimento tumoral.
Em seguida, avaliamos o perfil celular encontrado no MT e nos órgãos periféricos. Primeiramente, analisamos as células NK que causam a lise das células infectadas por vírus ou células tumorais, que não expressam moléculas de MHC Iem sua superfície e sem a sensibilização previa a antígenos (JI, et al., 2010; WALDHAUER, et al., 2008). A sua ação citolítica se dá pela liberação de proteínas que causam a abertura de poros na membrana da célula-alvo (perforina) seguida da liberação
de outra proteína que causa a degradação do DNA (granzima B), com consequência, a morte da célula por apoptose (ZAMAI, et al., 2007; WALDHAUER, et al., 2008). Além disso, as células NK não necessitam de estimulação antecedente como os linfócitos T citotóxicos permitindo uma resposta mais rápida (LARSEN, et al., 2014; COPPOLA, et al., 2015). Apesar de não observarmos diferenças significativas entre os grupos nos órgãos estudados, observamos uma tendência em aumentar este subtipo no MT do grupo MWCNT. Larsen, et al. (2014) encontrou grandes quantidades de células NK em tumores que sofreram regressão, estas células são essenciais para o estabelecimento da resposta imune adaptativa pela liberação da citocina IFNγ. Contudo, Sconocchia, et al. (2014) apresentaram que durante a progressão tumoral, as células NK podem promover o desenvolvimento do câncer de ovário e relaciona, ainda, com um pior prognóstico no câncer de colorretal, além de ajudar a adesão de células tumorais pancreáticas na matriz extracelular.
Em seguida, quantificamos as APCs e o seu padrão de ativação através da expressão de MHC I e II e moléculas co-estimulatórias como CD80 e CD86. Durante a resposta imune antitumoral as DCs e os macrófagos atuam em fases distintas da resposta imune, o primeiro é responsável por iniciar a resposta específica apresentando antígenos tumorais aos linfócitos CD8+ naives, estimulando a resposta citotóxica. Já os
macrófagos atuam na fase efetora da resposta imune estimulado por citocinas produzidas por linfócitos T CD4+. As DCs ativadas aumentam a expressão das
moléculas do MHC de Classe II, de moléculas co-estimulatórias como CD40, CD80 e CD86, além de produzirem citocinas inflamatórias que estimulam a diferenciação e proliferação dos linfócitos. Os subtipos estudados foram células que expressavam os seguintes marcadores: CD11b+, CD11c+ e as células duplo positivo CD11b+CD11c+.
Demonstramos a prevalência de células CD11b+ no MT mais do que outras APCs (FIGURA 4), quanto ao subtipo CD11c+, apesar de estarem em menor quantidade estas células apresentam maior frequência da expressão de MHCI+MHCII+ no baço e linfonodo, o que sugere a capacidade destas células em realizar apresentação cruzada de antígenos tumorais para os linfócitos T CD4+ quanto para CD8+. Este tipo de apresentação permite uma resposta antitumoral mais eficiente. As células dendríticas estão entre as células mais usadas para imunoterapias contra diversos tipos de tumores, devido à sua função como apresentadora de antígeno e a capacidade de estimular o sistema imune. Rodrigues, et al. (2011) demonstraram que o tratatamento com DCs com antígeno específico do tumor aumenta a expressão de IL-2 e INFγ pelas células T
herlper (PALUCKA, et al., 2012; RODRIGUES, et al., 2011). Por outro lado, o
aumento de outro subtipo de DCs, as células dendríticas imaturas (CD11b+CD11c+) que
secretam grandes quantidades de TFG-β e estimulam a diferenciação de células T efetoras em células Treg. A atuação das Treg no MT estimula a produção de citocinas
supressoras como a IL-10, CSF e IL-6 pelas células tumorais, ativando a via do STAT3 o que dificulta a diferenciação das DCs e apresentação de antígenos aos linfócitos T (GHIRINGHELLI, et al., 2005). Contudo, as células dendríticas têm a capacidade de reativar a apresentação cruzada ao longo da inflamação, dependendo do tipo de estímulo e da via de ativação. A maturação das DCs pode ser estimulada pela produção de interferons do tipo I. Estudos demonstram que partículas sintéticas podem estimular a produção destas citocinas estimulando também a maturação das DCs (XIA, et al., 2016; YANG, et al., 2014). Os dados apresentados sugerem que possivelmente o contato dos MWCNT com as APCs circulantes podem estimular sua maturação e maior expressão de moléculas do MHC.
Observamos a expressão de PDL-1 nas APCs, no qual, demostramos a diminuição de células CD11c+PDL-1+ e CD11b+CD11c+PDL-1+ no linfonodo. A ligação PD-1:PDL-1 regula a tolerância especifica nos órgão e tecidos, inibe a proliferação de linfócitos, e ainda, pode contribuir para evasão das células tumorais, a sua expressão é regulada por citocinas, como INF-γ, IL-12, GM-CSF e IL-4 (MALASPINA, et al., 2011). Visto sua importância na resposta contra o câncer, o PDL- 1 está sendo estudado para imunoterapias, as quais bloqueiam o PDL-1 e a sua via de ação (TAUBE, et al., 2014; OHAEGBULAM, et al., 2015), o bloqueio de PD-1/PDL-1 facilita a erradicação do tumor e suprimi a metástase tumoral em melanomas (HAMANISHI, et al., 2007). Entretanto, Spranger, et al., (2013) sugere que o bloqueio somente da via PDL-1 não é eficaz para inibir a ação reguladora das células imunes, como a Treg. Sugere também, que sua ação é estendida para inibição do IDO e ação
sobre a células CD25+, tendo efeito nas células Treg. Apesar de observamos a
diminuição da expressão de PDL-1, não observamos uma diminuição das células Treg, o
que sugere uma resposta supressora, juntamente com o aumento de TGF-β (ZHOU, et al., 2013). Segundo Dong, et al. (2002) o PDL-1 promove a apoptose das células T, e promove a disseminação do câncer de ovário (ABIKO, et al., 2013). Shi, et al. (2011) demostraram no carcinoma hepatocelular que a super expressão de PD-1 ou PDL-1 promove a apoptose de celulas T CD8+. A alta expressão de PDL-1 por células no MT reflete na resposta imune antitumoral (TAUBE, et al., 2014).
Para entender se os MWCNT influíam também na resposta imune adaptativa contra o tumor, analisamos o perfil regulatório das células T nos órgãos periféricos e no MT após a administração das nanopartículas. Não observamos diferenças quantitativas na população de células T, tanto para o fenótipo CD4+ quanto para CD8+ no baço e linfonodo dos grupos tratados ou não com os NTCs. Porém podemos observar no MT que a presença de linfócito T CD4+ é proeminente em relação ao linfócito T CD8+, e este inferior ao encontrado no baço e linfonodo. As células T CD4+ são importantes para a resposta imune, atuando como auxiliares para as células T CD8+ na resposta antitumoral e ajudam a manter a resposta antitumoral. Estudos relatam que a presença de grandes quantidades de CD8 no infiltrado tumoral favoreceria a um bom prognostico para o paciente (WAKABAYASHI, et al., 2003; SHAH, et al., 2011; JUNG, et al., 2014). Entretanto outros estudos mostram que, o aumento de CD4+ e a diminuição de CD8+ no MT, está relacionada a um mau prognóstico para estes pacientes (HAN, et al., 2014). As células T CD8+ controlam o crescimento tumoral através de mecanismos citotóxicos que reconhecem antígenos tumorais que são apresentados com MHC I. Esta observação foi comprovada em diferentes tipos de tumores como o de esôfago, de ovário, câncer endometrial, colo-retal e carcinoma urogenital, onde a presença dessas células no infiltrado tumoral foi relacionado a maior sobrevida destes pacientes. Entretanto, para o câncer de pulmão, carcinomas de células renais e espinocelular anal, a presença dessas células em fases mais adiantadas da doença está relacionada a um mau prognóstico, para o câncer cervical a presença em grandes quantidades de linfócito T CD8+ pode favorecer a metástase (SHAH, et al., 2011; PIERSMA, et al., 2007; LEE, et al., 2008; JUNG, et al., 2014).
No MT, fatores produzidos por células tumorais, como citocinas e a expressão de moléculas supressoras, durante a resposta imune podem influir na ativação e diferenciação dos linfócitos T. A migração de células T regulatórias para o sítio da inflamação faz parte dos mecanismos naturais de controle da resposta imune, no entanto a presença destas células durante a resposta imune antitumoral implica na supressão das células T efetoras, favorecendo assim a progressão tumoral. Sendo assim, quantificamos a presença de Treg nos órgão periféricos e MT pela expressão do fator de trancrição
FoxP3, pois o menor indice destas células poderia estar relacionado ao menor cresimento do tumor observado nos animais tratados com o NTCs.
Novamente não observamos diferença no número destas células que justificassem o menor crescimento da massa tumoral. A figura 8 nos mostra que a
presença de células T CD4+Foxp3+ são similares nos três grupos estudados, tanto no
baço, linfonodo e MT. No entanto, a quantificação dos linfócitos T CD8+FoxP3+ nos
mesmos órgão mostraram diferenças entre os grupos tratados. No linfonodo encontramos um número menor destas células no grupo que recebeu o MWCNT, quando comparado ao grupo controle, por outro lado observa-se um aumento deste mesmo subtipo no grupo MWCNTc. Ao avaliar o MT, observamos uma tendência em aumentar os linfócitos T CD8+FoxP3+ no grupo MWCNT, quando comparado ao grupo controle. Estes resultados nos mostram que mesmo com esta tendência ao aumento destas células supressoras no MT dos animais tratados como o MWCNT, ainda observamos um menor crescimento da massa tumoral neste grupo. Sato, et al. (2005) relataram que subtipos de células T CD4+ com propriedades imunossupressoras influenciam as ações das células T CD8+ efetoras na resposta antitumoral.
Inúmeros estudos apresentam as células T CD4+ regulatórias como as principais células supressoras da resposta imune, estando relacionada a piora do câncer de ovário (CURIEL, et al., 2004; WINKLER, et al., 2015), do câncer de pâncreas (HIRAOKA, et al., 2006), do melanoma cutâneo (MIRACCO, et al., 2007), do carcinoma de células renais (ASMA, et al., 2015) e do carcinoma hepatocelular (Kobayashi, et al., 2007; HUANG, et al., 2012). Miracco, et al. (2007) relatam que o aumento da proporção entre as células Tregs e as células T efetoras indica um tumor mais
agressivo, e, como resultado uma diminuição na sobrevida do paciente. As Tregs podem
ser naturais ou induzidas por citocinas e fatores locais. No caso do MT, a presença de células supressoras mielóides, a expressão do fator de indução de hipóxia (HIF1α) e o TGF-β, são fatores que induzem a transformação das células imunes, de célula T CD4+ em célula regulatória FoxP3+ suprimindo as células efetoras (ASMA, et al., 2015). Entretanto, Frey, et al. (2010) sugere que a influência das Tregs varia de acordo com o
estágio clínico e a genética do tumor, em estágio de progressão, a redução destas células favorece a resposta imune, sendo eficaz na erradicação do tumor.
Recentemente, o reconhecimento de linfócitos T CD8 que expressam FoxP3+ tem despertado a atenção de pesquisadores quanto a sua atuação no desenvolvimento e progressão tumoral. A maioria dos trabalhos identificam estas células em diversos tumores em progressão, no entanto pouco ainda se sabe dos mecanismos de atuação destas células em relação a resposta imune antitumoral, se é similar ou não as Tregs CD4+. Li et al., (2011) demonstraram a presença de células T
periférico desses pacientes, e ainda mostra dois subtipos de células regulatórias, as Tregs
naturais e as Tregs induzidas pelo microambiente. Essas células também foram
encontradas no câncer de próstata (KINIWA, et al., 2007) e de ovário (WEI, et al., 2005). Mahic, et al. (2008) demonstraram que a célula T CD8+FoxP3+ é capaz de induzir as células T CD8+CD25- em células Treg CD8+, através da estimulação contínua
de antígeno, e que bloqueios do CTLA-4, CD80 e CD86 não reverte essas células em células T CD8+.
Ainda caracterizando as Tregs analisamos a expressão da molécula de adesão
L-selectina (CD62L) nos linfócitos T CD4+CD25+ e CD8+CD25+. O CD62L é um importante receptor de migração das células T e um marcador de desenvolvimento dessas células. Observamos a predominância dessas células T CD25+CD62L+ no linfonodo e no baço, em menor quantidade, porém no MT, encontramos a menor expressão dessas células. Fu, et al. (2004) demostraram que as celulas T CD25+CD62L+ são mais imunossupressoras que as células CD62L-. E segundo Koyama, et al. (2008) essas células T CD4+CD25+CD62L+ encontradas em pacientes com câncer de pulmão inibem a secreção INF-γ por linfócitos presentes no tumor favorecendo o desenvolvimento tumoral.
Observamos, também, a expressão do receptor de quimiocina 7 (CCR7) ligante de CCL19/21, que está relacionado à função de migração celular (LEGLER, et
al., 2014). Os dados sugerem o aumento de células T CD4+ e CD8+ expressando CCR7+
no tumor. O CCR7 está relacionado com a metástase tumoral e a hipóxia, pois regiões de hipóxia no MT liberam fatores que estimulam a angiogênese e a migração celular, tanto para evasão das células tumorais quanto para entrada de células imunes que promove ou facilita o escape das células tumorais (LEGLER, et al., 2014; CHENG, et
al., 2014).
Analisamos, também, as citocinas presentes no MT, observamos a tendência em diminuir a IL-10, uma citocina anti-inflamatória que tem efeito direto tanto para a promoção do crescimento quanto para a inibição das células, também, capaz de aumentar a resistência das células tumorais a apoptose e facilitar a metástase, favorecendo, por fim, a progressão tumoral. Não observamos alterações nas citocinas TNF-α e IL-12, e são descritas como citocinas essenciais para a resposta antitumoral, participando da ativação das células NK e células T, contudo o MT e a presença de outras citocinas como IL-23, podem inibir o efeito da IL-12 e, então, favorecer a progressão tumoral. O INF-γ também faz parte das citocinas essenciais, contudo o INF-
γ é capaz de induzir a expressão de PDL- 1 no câncer de ovário (ABIKO, et al., 2015), e no carcinoma de células escamosas oral pela via PKD2 em carcinoma de células escamosas oral, favorecendo a progressão tumoral (CHEN, et al., 2002).
Outra citocina quantificada foi o TFG-β, no qual observamos a tendência em aumentar, é uma citocina envolvida em vários processos celulares, como proliferação e diferenciação celular. Ma et al. (2013) relaciona o TGF-β com a expressão de CCR7 como um fator que favorece a metástase para o linfonodo. Estudos mostram a relação do CCR7 com a metástase tumoral e a hipóxia, pois regiões de hipóxia no MT liberam fatores que estimulam a angiogênese e a migração celular, tanto para evasão das células tumorais quanto para entrada de células imunes que promove ou facilita o escape das células tumorais (LEGLER, et al., 2014; CHENG, et al., 2014).
Demonstramos também a diminuição do fator de transcrição STAT3, este fator promove a sobrevivência da célula, induz a expressão de citocinas, fatores de crescimento e angiogênicos, entretanto, devido a uma relação entre as células tumorais e imunes no MT. A ativação persistente do STAT3 favorece a progressão tumoral, a evasão de células tumorais e suprime a resposta anti-tumoral, através da polarização dos macrófagos para fenótipo M2, da inibição das células dendríticas e estímulos para células Treg, TH17 e MDSCs (YU, et al., 2009; YUE, et al., 2009; FERGUSON, et al.,
2015).
Em suma, os resultados aqui apresentados nos permitiram inferir que o MWCNT produzido na Unicamp demonstra ser melhor em controlar o crescimento da massa tumoral que o MWCNT adquirido comercialmente (Helix). Possivelmente seja devido ao caráter mais solúvel (menos hidrofóbico) que diminui a formação de agregados dos MWCNT podendo assim, ativar os macrófagos de forma mais controlada. Embora diversos aspectos da resposta imune antitumoral tenham sido avaliados, com o objetivo de desvendar o motivo pelo qual a administração sistêmica dos NTCs diminui crescimento do carcinoma pulmonar de Lewis in vivo, não foi possível identificar um tipo celular ou mecanismo diretamente responsável por este fenômeno. Acreditamos que o estímulo inflamatório dos NTCs não funcionalizados, estimulem macrófagos que podem melhorar a apresentação de antígenos tumorais e consequentemente estimulando uma resposta imune antitumoral. A menor produção de RNAm para IL-10 e TNF-α também pode contribuir como modulador da resposta imune inflamatória que posteriormente levaria a ativação de mecanismos supressores da
resposta imune. A diminuição da expressão do STAT3 também corrobora com esta hipótese.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho mostram a importância do estudo sobre a interação do nanotubo de carbono com o organismo, uma vez que essa nanopartícula pode ser utilizada como carreador de moléculas e medicamentos em tratamentos de diversas doenças, como doenças cardiovasculares e câncer. Neste caso, observamos a interação do nanotubo de carbono não funcionalizado com o microambiente tumoral quanto a resposta imune. A partir dos resultados obtidos durante a realização deste trabalho e discutidos, podemos concluir que:
A administração sistêmica de uma única dose de 100µg de MWCNT diminuiu a massa tumoral de camundongos com carcinoma de Lewis.
Não se observou diferenças significativas sobre a resposta imune quando comparamos o MWCNT (UNICAMP) e MWCNTc (Helix).
O tratamento com nanotubo de carbono não funcionalizado aumentou a expressão de células apresentadoras de antígenos (APCs) que expressão MHC I e MHC II.
A administração do nanotubo de carbono altera a expressão do gene STAT3 e IL-10 no microambiente tumoral.
A administração do nanotubo de carbono provoca a diminuição da expressão de PDL-1 nas células apresentadoras de antígenos.
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