FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
RODRIGO DE ANDRADE NATAL
APLICAÇÃO DA MICROSCOPIA POR GERAÇÃO DE SEGUNDO-HARMÔNICO NA AVALIAÇÃO DO CÂNCER DE MAMA
EVALUATION OF BREAST CANCER BY SECOND-HARMONIC GENERATION MICROSCOPY
CAMPINAS 2019
RODRIGO DE ANDRADE NATAL
APLICAÇÃO DA MICROSCOPIA POR GERAÇÃO DE SEGUNDO-HARMÔNICO NA AVALIAÇÃO DO CÂNCER DE MAMA
EVALUATION OF BREAST CANCER BY SECOND-HARMONIC GENERATION MICROSCOPY
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências, na área de concentração de Clínica Médica.
Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences of State University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for Doctoral degree in Sciences, Medical clinic area.
ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ VASSALLO
COORIENTADOR: PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA PROF. DR. LUÍS OTÁVIO ZANATTA SARIAN
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO RODRIGO DE ANDRADE NATAL, E
ORIENTADO PELO PROF. DR. JOSÉ VASSALLO.
CAMPINAS 2019
e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (nº: 08/57906-3 e nº: 11/51959-0).
ORCID: http://orcid.org/0000-0001-7843-3314
Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Natal, Rodrigo de Andrade,
N191a NatAplicação da microscopia por geração de segundo-harmônico na avaliação do câncer de mama / Rodrigo de Andrade Natal. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
NatOrientador: José Vassallo.
NatCoorientador: Carmen Silvia Passos Lima.
NatTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Nat1. Neoplasias da mama. 2. Matriz extracelular. 3. Microscopia óptica não
linear. 4. Prognóstico. I. Vassallo, José, 1957-. II. Lima, Carmen Silvia Passos, 1957-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of breast cancer by second-harmonic generation microscopy
Palavras-chave em inglês:
Breast neoplasms Extracellular matrix Nonlinear optical microscopy Prognosis
Área de concentração: Clínica Médica
Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora:
José Vassallo [Orientador] Fernando Augusto Soares César Cabello dos Santos Mônica Maria Agata Stiepcich José Barreto Campello Carvalheira
Data de defesa: 29-11-2019
Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: http://orcid.org/0000-0001-7843-3314 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/2109143054530599
ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ VASSALLO
MEMBROS:
1. PROF. DR. JOSÉ VASSALLO
2. PROF. DR. FERNANDO AUGUSTO SOARES
3. PROF. DR. CÉSAR CABELLO DOS SANTOS
4. PROFA. DRA. MÔNICA MARIA AGATA STIEPCICH
5. PROF. DR. JOSÉ BARRETO CAMPELLO CARVALHEIRA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
O presente trabalho foi realizado com bolsa auxílio através do Programa Pesquisador em Medicicina da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – nº: 62/2014.
O câncer de mama é a neoplasia não-cutânea mais frequente em mulheres acima dos 50 anos de idade. Apesar dos esforços em se diagnosticar a doença precocemente, ainda há atraso considerável no diagnóstico, causando prejuízo as pacientes. Os marcadores prognósticos podem auxiliar na estratificação de risco para eventos danosos e clarear a fisiopatologia da doença. Em paralelo, sabe-se que o colágeno possui importante papel na carcinogênese e progressão da neoplasia, porém seu valor prognóstico continua subestimado. Notavelmente, a microscopia não-linear, mais especificamente, a microscopia por geração de segundo-harmônico (SHG), permite a identificação e a avaliação quantitativa não-destrutiva do colágeno depositado nos tecidos. Nesse sentido, os objetivos desse trabalho foram avaliar os parâmetros do colágeno baseado nas imagens geradas a partir da microscopia por SHG para: (1) descrever as imagens nos diversos subtipos histológicos de câncer de mama e (2) avaliar seu papel prognóstico. Para o primeiro objetivo, as imagens produzidas a partir da SHG dos cortes histológicos de tecidos fixados e parafinados foram avaliados de acordo com sua classificação: subtipo histológico especial de mama (n= 99) e carcinoma ductal invasivo de mama (n= 21). O microarray tecidual dessas amostras foi realizado para categorizar o subtipo molecular, baseado na avaliação imunoistoquímica. Para o segundo objetivo, propusemos a mesma avaliação, partindo, entretanto, do estroma tumoral selecionado de 60 pacientes com diagnóstico de carcinoma ductal invasivo de mama. Para a avaliação das imagens utilizamos o software ImageJ, em associação com o plug-in OrientationJ. As análises estatísticas foram elaboradas no software R, sendo significativos valores de p< 0.05. Nossos resultados permitiram agrupar os diversos subtipos histológicos de câncer de mama em 3 grandes grupos baseados nos parâmetros do colágeno obtidos das imagens. Ademais, identificamos que a maior deposição de colágeno, bem como a deposição de fibras mais espessas são fatores associados a pior prognóstico. Em conclusão, nossos dados permitem inferir que pode haver padrões estereotipados de deposição de colágeno dentre os diversos subtipos histológicos de câncer de mama e este pode refletir no prognóstico da paciente.
Palavras-chave: câncer de mama; matriz extracelular tumoral; microscopia
Abstract
Breast cancer (BC) is the most common non-cutaneous neoplasm in women over 50 years of age. Despite efforts for early diagnosis, there is still considerable delay, causing poor prognosis to patients. Prognostic markers can aid in the stratification of risk for harmful events and clarify the pathophysiology of the disease. In parallel, it is known that collagen plays an important role in carcinogenesis and in tumor progression, but its prognostic value remains undervalued. Notably, nonlinear microscopy, more specifically, second-harmonic generation microscopy (SHG), allows the identification and non-destructive quantitative evaluation of the collagen deposited in tissues. In this sense, the objectives of the present study were to evaluate collagen parameters based on images generated by SHG to: (1) describe the images in the various histological subtypes of BC and (2) asses the prognostic value of collagen features. For the first objective, images obtained from the SHG of histological sections of fixed and paraffin-embedded tissues were evaluated according to their classification: special histological subtype of BC (n = 99) and invasive ductal carcinoma of the breast (n= 21). Tissue microarray of these samples was performed to categorize the molecular subtype, based on immunohistochemical evaluation. For the second objective, we proposed the same evaluation, starting, however, from selected stromal tumor areas of 60 patients with the diagnosis of invasive ductal carcinoma of the breast. For image evaluation we used the ImageJ software in association with the OrientationJ plug-in. Statistical analyzes were performed in R software, with significance levels at p< 0.05. Our results allowed grouping the various histological subtypes of breast cancer in three large groups based on collagen parameters obtained from the images. In addition, we have identified that the greater deposition of collagen, as well as the deposition of thicker fibers, were associated to unfavorable prognosis. In conclusion, our data support the existence of stereotyped patterns of collagen deposition across the various histological subtypes of breast cancer. Such patterns might be related to patients’ outcomes.
Key words: breast cancer; tumor extracellular matrix; non-linear microscopy;
Abreviaturas
Akt (protein kinase B): proteína quinase tipo B
AUF1 (AU-rich element RNA-binding protein 1): proteína ligadora de RNA ricos em AU tipo 1
b-FGF (basic fibroblast growth factor): fator de crescimento de fibroblasto básico CAV-1, CAV-2 e CAV-3 (caveolin 1, 2 and 3): caveolina tipo 1, tipo 2 e tipo 3
CCL-5 e CCL-18 (C-C motif chemokine ligand 5 and 18): ligante de quimiocina motivo C-C tipo 5 e tipo 18
CD-4, CD-8, CD-11b, CD-34 e CD-44 (cluster of differentiation 4, 8, 11b, 34 and 44): cluster de diferenciação 4, 8, 11b, 34 e 44.
CK5 e CK6 (cytokeratin 5 and 6): ceratina tipo 5 e tipo 6 COX-2 (cyclooxygenase 2): ciclooxigenase tipo 2
CSF1 (colony stimulating factor 1): fator estimulador de colônia tipo 1
CSF1R (colony stimulating factor 1 receptor): receptor do fator estimulador de colônia tipo 1
CXCL-1 e CXCL-2 (chemokine (C-X-C motif) ligand 1 and 2): ligante de quimiocina (motivo C-X-C) tipo 1 e tipo 2
CXCR-2 (C-X-C motif chemokine receptor 2): receptor de quimiocina (motivo C-X-C) tipo 2
CXCL-12/SDF-1 (stromal cell-derived factor 1): fator derivado de células estromais tipo 1
DDR-2 (discoidin domain-containing receptor 2): receptor contendo domínio de discoidina tipo 2
EGFR (epidermal growth factor receptor): receptor do fator de crescimento epitelial ER (estrogen receptor): receptor de estrógeno
ERK (extracellular signal–regulated kinase): quinase regulada por sinal extracelular FAK (focal adhesion kinase): quinase de adesão focal
HER-2/neu ou C-Erb-B2 (human epidermal growth factor receptor 2): receptor do fator de crescimento epitelial humano tipo 2
HR (hormonal receptors): receptores hormonais
IGFBP2 (insulin-like growth factor binding protein 2): proteína ligadora ao fator de crescimento insulina-símile tipo 2
IL-6, IL-8, IL-12 e IL-34 (interleukin 6, 8, 12 and 34): interleucina-6, 8, 12 e 34 LM111, LM-332 e LM-511 (laminin 111, 332 and 511): laminina tipo 111, 332 e 511 MAPK (mitogen-activated protein kinases): proteína quinase ativada pela mitose MEC: matriz extracelular
MMP-2, MMP-3 MMP-9, MMP-13 e MMP-14 (matrix metallopeptidase 2, 3, 9, 13 and 14): metaloproteinase tipo 2, tipo 3, tipo 9, tipo 13 e tipo 14
NF-κB (nuclear factor NF-κB): fator nuclear NF-κB
p21 (cyclin-dependent kinase inhibitor 1): inibidor da quinase dependente de ciclina tipo 1
p53 (tumor protein p53): proteína tumoral p53
PDGF-α e PDGF-β: (platelet derived growth fator alpha and beta) fator de crescimento derivado de plaquetas tipo alfa e tipo beta
PI3K (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase): fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinase
PR (progesteron receptor): receptor de progesterona
PTEN (phosphatase and tensin homolog): fosfatase e homólogo de tensinas
RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand): ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa-B
ROCK (Rho-associated protein kinase):proteína quinase associada a Rho
S100A8 e S100A9 (S100 calcium-binding protein A8 and A9): proteína ligadora de cálcio S100 tipo A8 e tipo A9
Snail-1 (zinc finger protein): proteína de dedo de zinco
STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3): transdutor de sinal e ativador de transcrição tipo 3
TGF-β: (tumor growth fator beta) fator de crescimento transformador beta TNF-α (tumor necrosis factor-α): fator de necrose tumoral α
Sumário
1. Introdução ... 14
2. Câncer de mama ... 16
2.1. Epidemiologia do câncer de mama ... 16
2.2. Marcadores prognósticos do câncer de mama ... 17
2.3. Fisiopatologia do câncer de mama ... 20
3. Microambiente tumoral mamário ... 25
3.1. Aspectos gerais ... 25
3.2. Microambiente tumoral celular ... 27
3.2.1. Células mioepiteliais ... 27 3.2.2. Fibroblastos ... 27 3.2.3. Linfócitos ... 29 3.2.4. Macrófagos ... 30 3.2.5. Células endoteliais ... 30 3.2.6. Células adiposas... 31
3.3. Microambiente tumoral extracelular ou acelular ... 31
3.3.1. Fibronectina ... 32 3.3.2. Laminina ... 33 3.3.3. Ácido hialurônico... 34 3.3.4. Enzimas matriciais ... 34 3.3.5. Proteínas matricelulares ... 36 3.3.6. Colágeno ... 37 4. Microscopia não-linear ... 40 4.1. Aspectos gerais ... 40
4.2.Teoria da microscopia por geração de segundo-harmônico ... 43
4.3. Microscopia por geração de segundo-harmônico na patologia ... 46
4.3.1. Microscopia por geração de segundo-harmônico no câncer de mama... 48
5. Justificativa ... 52
6. Objetivos ... 53
6.1. Objetivo geral ... 53
6.2. Objetivos específicos ... 53
8. Artigo 1: Exploring collagen fiber parameters in pure special types of invasive
breast cancer ... 55
9. Artigo 2: Collagen analysis by second-harmonic generation microscopy predicts outcome of luminal breast cancer ... 67
10. Discussão geral ... 80 11. Considerações finais ... 83 12. Referências ... 84 13. Outras produções ... 105 11.1. Artigos ... 105 11.2. Participação em congressos ... 105 11.2.1. Apresentação oral ... 105 11.2.2. Apresentação em pôster ... 106 Anexo 01 ... 107 Anexo 02 ... 108 Anexo 03 ... 110 Anexo 04 ... 111 Anexo 05 ... 112
1. Introdução
O câncer de mama é a neoplasia não-cutânea mais frequente em mulheres acima dos 50 anos e responde por cerca de 3 mil mortes/ano, no Brasil. Apesar dos esforços em se diagnosticar a doença precocemente, quando suas chances de cura são satisfatórias, ainda há atraso considerável no diagnóstico, o que impacta no prognóstico do paciente.
Em neoplasias, os fatores prognóstico são capazes de estimar a sobrevida livre de doença e a sobrevida global do paciente. O câncer de mama apresenta fatores prognóstico reconhecidos, que, não obstante, são indicadores de resposta terapêutica (fatores preditivos), como os receptores hormonais (HR), incluindo o receptor de estrógeno (ER) e de progesterona (PR), e a amplificação do gene do receptor do fator de crescimento epitelial humano tipo 2 (HER-2 ou C-Erb-B2). Em 2000, um estudo molecular permitiu classificar as neoplasias mamárias de acordo com sua expressão gênica, determinando valores prognóstico e preditivo, em: luminais A e B, superexpressão de HER-2, e triplo negativo. Numa tentativa de ampliar a utilização dessa classificação molecular para a prática clínica, um sucedâneo imunoistoquímico foi aventado, com a utilização de quatro imunomarcadores: ER, PR, marcador de proliferação celular Ki67 e marcador para a proteína HER-2. No entanto, observações clínicas mostram que, mesmo dentro do mesmo subtipo molecular, alguns pacientes apresentam comportamento clínico divergente, o que torna necessária não só a busca por novos marcadores prognósticos, como também aqueles que permitam uma melhor compreensão da fisiopatologia da doença.
Dessa forma, tem-se dado crescente atenção ao microambiente tumoral, tanto no seu componente celular-imune, quanto no seu componente de matriz extracelular (MEC), pelo seu extenso impacto no comportamento celular. Para tanto, normalmente são utilizadas colorações especiais (e.g. tricrômico de Masson e picrossirius) ou colorações imunoistoquímicas para componentes da matriz extracelular (e.g. colágeno, fibronectina e laminina). Entretanto, avanços nas técnicas de microscopia não-linear têm proporcionado novas ferramentas para estudos em biologia, em particular, envolvendo um dos componentes mais importantes da MEC, o colágeno. As imagens obtidas através da técnica de
microscopia por geração de segundo-harmônico tem mostrado que parâmetros como quantidade, uniformidade e organização da estrutura colágena permitem avançar na compreensão da fisiopatologia da progressão tumoral, bem como apresentam valor clínico prognóstico.
Portanto, o objetivo dos estudos apresentados nesta dissertação foi o de explorar e avaliar o impacto clínico dos parâmetros de colágeno extraídos das imagens geradas a partir da microscopia por geração de segundo-harmônico em casos de câncer de mama. Nossos resultados mostraram que esses parâmetros se correlacionam de forma interessante nos subtipos especiais de câncer de mama e apresentam valor prognóstico nos casos de carcinomas ductais invasivos1 subtipo
molecular luminal.
1 A terminologia para o tipo mais comum de câncer de mama mudou de carcinoma ductal invasivo
não especificado para carcinoma invasivo de nenhum tipo especial. Porém, pela literatura revisada e
por comodidade manteremos a terminologia carcinoma ductal invasivo para nos remetermos a essa entidade histológica.
2. Câncer de mama
2.1. Epidemiologia do câncer de mama
O câncer de mama é a neoplasia maligna não-cutânea mais frequentemente diagnosticada entre as mulheres. Em 2012, no mundo, representou 12% de todos os casos de câncer e 25% de todos os casos de câncer feminino [1]. As taxas de incidência variam globalmente e são mais baixas nos países desenvolvidos [2]. Estima-se que, em 2020, o câncer de mama seja diagnosticado em mais de 1,9 milhões de mulheres, correspondendo ao aumento de 18,4% em relação a 2012 [1]. Não obstante, esta é a 5a maior causa de morte em pacientes com câncer em todo
mundo, matando mais de 522 mil mulheres todos os anos [1]. No cenário brasileiro, em 2016, aproximadamente 84 mil novos casos de câncer de mama foram diagnosticados. Além disso, houve um aumento em 15% no número de novos casos entre 2012 e 2016, passando de 49 mil para 58 mil [3,4]. Além disso, são esperadas mais de 3 mil mortes provocadas pela doença [3].
Acomete preferencialmente mulheres a partir da sexta década de vida, sendo raro em mulheres abaixo de 30 anos. Além disso, Steinberg et. al. demonstraram que o maior período menopausal está diretamente associado com o aumento do risco [5]. Não obstante, fatores como histórico familiar de câncer de mama e uso de hormônios podem elevar o risco para o desenvolvimento dessa neoplasia [5]. Em um estudo recente, Mørcho et. al. observaram que o uso de contraceptivos hormonais, principalmente os progestágenos, durante o período fértil também está associado com o aumento de risco [6].
Portanto, hábitos de vida e fatores ambientais estão intrinsicamente relacionados com a carcinogênese mamária, e são, na medida do possível, modificáveis [7]. Entretanto, atualmente, por conta da mudança do padrão de tais fatores, tem-se observado um aumento do acometimento em mulheres mais jovens [8]. Dessa forma, essa neoplasia está responsável pela morte de 5% a 7% das mulheres com câncer abaixo de 30 anos de idade [9]. Outros elementos promotores da carcinogênese mamária também merecem destaque: idade, localização geográfica, idade à menarca e à menopausa, idade da primeira gestação, histórico
familiar, presença de doença benigna da mama, contato com radiação, hábitos de vida (dieta, etilismo e tabagismo) e terapia de reposição hormonal [10].
Uma questão que potencialmente afeta os desfechos clínicos das pacientes com câncer de mama é a demora entre a suspeita inicial e o diagnóstico e, posteriormente, o tempo para início de tratamento. Acredita-se que os atrasos com mais de 12 semanas afetam o estádio da doença e, consequentemente, a resposta à terapêutica e a sobrevida [11]. Estudos observacionais brasileiros sugerem que o tempo médio da apresentação do quadro ao diagnóstico é de 10 a 26 semanas [12,13]. Os atrasos entre mamografia e interpretação de imagens duram até 30 dias para 66% das mamografias de triagem e 67% das mamografias diagnósticas [14]. Dessa forma, infere-se que mais da metade dos casos de câncer de mama não é diagnosticada em estádios iniciais, prejudicando substancialmente o desfecho da paciente.
2.2. Marcadores prognósticos do câncer de mama
A princípio um marcador prognóstico pode ser caracterizado como um parâmetro mensurável, dado no momento do diagnóstico, que serve para estimar a sobrevida livre de doença e a sobrevida global do paciente. No câncer de mama, vários marcadores têm sido consagrados e especulados, não só como prognósticos, mas também como preditivos, isto é, como indicadores da resposta terapêutica [14]. Não obstante, esses marcadores são utilizados em rotinas laboratoriais para fornecer dados prospectivos e indicar a melhor conduta terapêutica individualizada.
O primeiro marcador prognóstico foi a classificação histológica. As neoplasias mamárias podem ser histologicamente subdivididas em: carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma tubular, carcinoma medular, carcinoma apócrino, carcinoma mucinoso, entre outros de menor incidência (Anexo 01). Diante disso, Katterhagen et. al. observaram que o carcinoma ductal invasivo possui um pior prognóstico quando comparado a outros subtipos histológicos, uma vez que o envolvimento linfático é muito mais precoce e intenso. Em contrapartida, o carcinoma tubular e o carcinoma medular foram os que apresentaram melhores prognósticos, embora menos incidentes [15,16] (Figura 01).
Além disso, é considerado que o grau histológico, isto é, a característica das células tumorais, também possui efeito prognóstico. Elston et. al. e Bloom et. al. observaram que neoplasias mamárias com grau histológico I possuem melhor sobrevida quando comparados àqueles com graus histológicos II e III [17,18] (Anexo
02). Entretanto, apesar do grau histológico ter impacto no prognóstico, há baixa
reprodutibilidade em sua aplicação, com consequente redução de sua sensibilidade e especificidade [19]. Nesse sentido, seria necessário desenvolver outros marcadores prognósticos que atingissem maior reprodutibilidade.
Figura 01: Subtipos histológicos de câncer de mama: (A) carcinoma ductal invasivo,
(B) carcinoma lobular invasivo clássico, (C) carcinoma micropapilífero, (D) carcinoma mucinoso variante hipercelular, (E) carcinoma tubular, e (F) carcinoma metaplásico variante fusocelular. [Coloração hematoxilina e eosina; aumento de 200×].
No ano de 2000, Perou et. al., incitados pela diversidade histológica, graduação histológica e diferentes respostas às mesmas medidas terapêuticas, avaliaram as possíveis diferenças de expressão gênica tecidual. Demonstraram que carcinomas mamários histologicamente semelhantes podem se distinguir na
A B
C D
expressão gênica, possibilitando seu uso para a avaliação prognóstica [20]. Com o refinamento do estudo, observaram que os carcinomas mamários podem ser agrupadas de acordo com seu padrão molecular em: luminal A (alta expressão de genes como ESR1, GATA-3, X-box-1, TFF-3, HNF-3 e LIV-1), luminal B (média a baixa expressão de ESR1, GATA-3, X-box-1, TFF-3, HNF-3 e LIV-1), superexpressão de HER-2 (amplificação da expressão do gene localizado na porção 17q22.24, associado ao HER-2 e GRB-7) e triplo-negativo (ausência de expressão de genes associados aos receptores hormonais e expressão aumentada de HER-2, CK5, CK17, LMNA e FABP-7) [21]. Entretanto, seu alto custo não permitiu sua utilização na prática clínica. Estudos posteriores demostraram que a expressão de poucos marcadores imunoistoquímicos, utilizados amplamente nos laboratórios de patologia, poderiam substituir parcialmente, a um menor custo, essa classificação molecular. Dessa forma, a imunoistoquímica está baseada principalmente na expressão de ER, PR, HER-2 e marcador de proliferação celular Ki-67, em destaque no Anexo 03.
Deve-se ressaltar que o padrão luminal A possui o melhor prognóstico, seguido, em ordem, pelo luminal B, superexpressão de HER-2 e triplo-negativo [21]. Além do valor prognóstico, os subtipos moleculares podem ser preditivos, uma vez que influenciam no tratamento: os subtipos luminal A e B possuem maior sensibilidade ao tratamento com tamoxifeno, enquanto os subtipos superexpressão de HER-2 e triplo-negativo tendem a ser mais sensíveis ao paclitaxel e dexorrubicina como quimioterápicos neoadjuvantes [22] (Anexo 04).
2.3. Fisiopatologia do câncer de mama
O estudo da patogênese do câncer de mama traz importantes contribuições para a prática clínica. Historicamente, a progressão do câncer de mama foi vista como um processo de várias etapas, semelhante ao modelo proposto por Volgenstein et. al. [23] para a carcinogênese colônica, abrangendo mudanças progressivas no tecido normal, hiperplasia com e sem atipias, carcinoma in situ, carcinoma invasivo e metástase [24]. Dessa forma, Wellings et. al. aventaram a hipótese de que lesões ductais não-malignas seriam precursoras diretas do carcinoma de mama invasivo [25], com base na evidência de continuidade histológica gradual observada em tecidos mamários normais e alterados. Esta teoria
é apoiada pela semelhança em nível molecular (genético e proteico) entre o carcinoma in situ e o invasivo [26–29].
O exame cuidadoso dos lóbulos da mama indica que a maioria dos tumores mamários ocorrem na junção entre o ducto terminal e o lóbulo, em uma área descrita por Wellings et. al. como unidade ducto-lobular terminal [30]. Nesse sentido, os lóbulos atípicos [30], também nomeados como unidades lobulares hiperplásicas ampliadas [31], foram cogitados como sítio para o surgimento das lesões precursoras. A análise histológica identificou um aumento de seis vezes no número de células com expressão de ER ou proliferantes nessas unidades, em comparação com as demais unidades lobulares do canal terminal [31].
Estudos clínicos observacionais corroboram ainda mais para essa hipótese, sendo a evidência mais persuasiva o acometimento do mesmo sítio anatômico. Além disso, estudos longitudinais relevaram que 20 a 50% das mulheres acometidas por carcinoma ductal in situ desenvolvem, mais tarde, o carcinoma invasivo no mesmo local [32–34].
Reforçando os achados anteriores, o carcinoma ductal in situ é encontrado, na maioria dos casos, adjacente à doença invasiva, no momento do diagnóstico [32,35]. Porém, vale ressaltar que a coexistência de ambas as entidades (in situ vs invasivo) varia de acordo com o subtipo histológico envolvido [36]. Ademais, no aspecto molecular, o carcinoma ductal in situ também pode ser classificado em subtipos moleculares similares ao invasivo, com base, principalmente, nos padrões de expressão de ER, PR, HER-2, receptor do fator de crescimento epitelial tipo 1 (EGFR) e ceratina 5/6 (CK 5/6) [37–39].
Outro dado importante é que as taxas de recorrência após tratamento para carcinoma ductal in situ puro variam de 5% a 20%, e aproximadamente 50% dessas recorrências são invasivas [40,41]. Uma porcentagem ainda menor de pacientes desenvolve metástases distantes, com ou sem recorrência locorregional. Por isso, a maioria dos pacientes ainda são submetidos a tratamento cirúrgico seguido de radioterapia ou tratamento profilático (e.g., tamoxifeno).
Apesar dos intensos esforços para desvendar os fundamentos biológicos do fenômeno da progressão da doença e desenvolver biomarcadores preditivos da probabilidade de progressão, vários aspectos biológicos da transição de carcinoma in situ para invasivo ainda não foram elucidados. Dessa forma, ainda não há marcadores histopatológicos ou moleculares capazes de prever com precisão essa progressão.
Contrariando a teoria descrita (teoria canônica), uma pequena parcela das pacientes com carcinoma ductal in situ puro desenvolvem metástases distantes [42]. Diante disso, estudos recentes, que analisaram outras possíveis vias de progressão de lesões pré-malignas, carcinoma in situ e carcinoma invasivo, resultaram na identificação de múltiplas vias para explicar a fisiopatologia do carcinoma mamário, demonstrando uma teoria não-canônica.
Do ponto de vista molecular, há um grupo que compreende ao carcinoma ductal ou lobular in situ bem diferenciado, que progrediria para carcinoma invasivo de baixo grau histológico. Em geral, possuem as seguintes características: baixa pontuação no pleomorfismo nuclear, geralmente expressam ER e PR, com ausência de expressão de HER-2, geneticamente estáveis e, muitas vezes, têm perda do braço longo do cromossomo 16. O segundo grupo compreende ao carcinoma ductal ou lobular in situ pouco diferenciado, que progrediria para carcinoma invasivo de alto grau histológico. Em oposição, apresentariam como características: alta concentração de núcleos atípicos, geralmente não expressam ER e PR, e expressam HER-2, geneticamente instáveis e com uma combinação de ganhos e perdas genômicas recorrentes [43].
Essas teoria é apoiada por Kronenwett et. al., que dividiram os carcinomas invasivos em duas categorias – genomicamente estáveis (grau histológico I) e instáveis (grau histológico II ou III), através de uma medida de instabilidade genômica, chamada de stemline scatter index. Estas categorias são independentes de alterações no conteúdo de DNA do tumor [44]. A análise transcriptômica das amostras pareadas de carcinoma ductal in situ e invasivo também mostrou conservação da expressão gênica [45] (Figura 02).
Ademais, estudos adicionais usaram abordagens de hibridação genômica comparativa para reforçar a teoria não-canônica [46–48]. A perda de material genômico no cromossomo 16q foi proposta como evento inicial em uma via de progressão da neoplasia de mama de baixo grau histológico e associada com melhor prognóstico. Roylance et. al. compararam carcinomas ductais invasivos de baixo grau histológico, que predominantemente expressavam ER, com aqueles de alto grau histológico, os quais não expressavam ER. Observaram que 65% dos tumores de baixo grau histológico haviam perdido 16q, enquanto apenas 16% dos tumores de alto grau histológico apresentavam essa perda. Esse padrão de perda cromossômica levou os pesquisadores a apoiar a hipótese de que a maioria dos tumores de baixo grau não progridem para os tumores de alto grau [47].
Em relação à classificação molecular do câncer de mama, uma distinção clara de perfis foi observada entre o subtipo luminal A e os outros descritos por Perou et. al. [20]. Embora a perda de 16q seja mais comum em carcinoma ductal ou lobular invasivo de baixo grau histológico, nem todos pertencem ao subtipo luminal A, como era de se esperar.
Em outro estudo, mostrou-se que o principal subtipo molecular do carcinoma lobular invasivo é o luminal A, embora esse resultado possa ter sido artefatual, decorrente de contaminação por células estromais [49]. No entanto, essa associação não foi evidente, havendo casos de carcinoma lobular invasivo sem expressão de ER e PR. Este resultado revela uma heterogeneidade tumoral mais ampla do que a sugerida pela teoria canônica [50]. Um ganho de material genômico no cromossomo 6 (6p21-p25) foi particularmente associado a subtipos moleculares sem expressão de ER e com expressão de marcadores para o subtipo triplo-negativo, com vários oncogenes candidatos, tais como DEK, E2F3, NOTCH4, PIM1, e CCND3 [46].
Figura 02: Representação das duas teorias para fisiopatologia do câncer de mama.
Na teoria canônica, há progressão das lesões de forma linear, com acúmulo, ao longo do tempo, de características de pior prognóstico. Na teoria não-canônica, sugere-se haver algum processo biológico que interfere na diferenciação celular, subdividindo-se em dois grupos: aqueles com características menos agressivas, que originarão os carcinomas invasivos de baixo grau histológico, e aqueles mais agressivos, que originarão os carcinomas invasivos de alto grau histológico. [Coloração hematoxilina e eosina; aumento de 200×]
Sjöblom et. al. demonstraram que há alterações genéticas adicionais além das supracitadas que determinam as características do câncer de mama. Câncer de mama que apresentam mutação do gene BRCA1 são frequentemente triplo-negativo, enquanto aqueles com mutação do gene BRCA2 são principalmente luminais [51], indicando que perfis genéticos adicionais podem estar associados a um subtipo molecular particular.
Em resumo, apesar do avanço no estudo genético não se sabe com exatidão quais são os eventos chaves no processo fisiopatológico da carcinogênese mamária. Vale ressaltar que alguns subtipos moleculares podem ter sua origem de acordo com a expressão gênica da lesão precursora, podendo elucidar em parte esse processo. Entretanto, se tivermos em mente que este processo pode ser influenciado pelo o microambiente tecidual, informações adicionais devem ser pesquisadas e avaliadas. Lóbulo mamário Hiperplasia ductal pica Hiperplasia ductal a pica Carcinoma ductal in situ Carcinoma ductal invasivo Carcinoma ductal in situ (G I) Carcinoma ductal in situ (G III) Carcinoma ductal invasivo (G I) Carcinoma ductal invasivo (G III) Teoria canônica Teoria não-canônica Perda do cromossomo 16q
3. Microambiente tumoral mamário
3.1. Aspectos gerais
Acreditava-se que a carcinogênese ocorria devido à mutação em determinados genes de células específicas, resultando na proliferação celular exacerbada e na resistência à apoptose, independente do ambiente extracelular. Esta teoria teve como suporte o estudo elaborado por Rous, em 1911, no qual o autor demonstra que o sarcoma das aves domésticas poderia ser transmitido a aves saudáveis através de um filtrado livre de células neoplásicas. Observou-se que esse efeito se devia ao RSV (Rous sarcoma virus) [52]. Portanto, os genes responsáveis pelo desenvolvimento desse sarcoma seriam provenientes do RSV.
Entretanto, em 1984, Dolberg demonstrou que ao se transfectar uma ave saudável com células neoplásicas, derivadas da infecção por RSV, observava uma proliferação dessas. Por outro lado, se procedimento ocorresse em embriões dessas aves, não observava proliferação neoplásica. Interessante notar que se estas células neoplásicas fossem removidas dos embriões e cultivadas em placas, elas readquiririam sua potencialidade proliferativa [53–56]. Dessa forma, notou-se uma intrínseca relação entre as células neoplásicas e o microambiente. Esta teoria coincide com a proposta de Paget, em 1889, para explicar o processo metastático, conhecida como teoria da “semente e solo”. Nela, Paget propôs que a metástase seria derivada das características especificas das células neoplásicas associadas com características dos órgãos ou tecidos afetados [57].
Na mama, a interação entre a célula mamária e o microambiente é derivada do estudo proposto por Emerman, em 1977. Nele, o autor demonstrou que as células mamárias perdiam sua capacidade de produção de leite, bem como sua morfologia, ao serem cultivadas sob o plástico das placas de cultivo. Entretanto, as mesmas células poderiam se reorganizar e reexpressar genes associados à lactogênese ao serem cultivadas em fracos contendo camadas de colágeno [58]. Mais tarde, notou-se que a laminina-1, presente na matriz extracelular, seria uma das responsáveis pela transdução de sinal para lactogênese, e essa proteína só seria expressa em uma matriz com colágeno [59].
Em conclusão, tanto as células mamárias como as neoplásicas sofrem influência do microambiente extracelular [60]. Portanto, estabelecer e descrever esta relação é importante para a melhor compreensão da fisiopatologia e comportamento neoplásico.
Nesse contexto, Weaver et. al. demonstraram, em cultura de células, que o fenótipo das células mamárias neoplásicas poderia ser revertido utilizando anticorpo contra integrina β1, de forma a restabelecer o complexo de E-caderina-catenina. Nesse sentido, o tratamento prévio dessas células com o anticorpo acarretou uma redução significativa no número e tamanho dos tumores mamários [61]. Portanto, o microambiente extracelular influencia o fenótipo das neoplásicas, determinando características mais agressivas em determinadas composições.
Porém, é importante ressaltar que o significado de microambiente (extracelular) tumoral é mais amplo e está relacionado a todo o microambiente no qual a neoplasia está envolta. Sendo assim, inclui vasos sanguíneos, células imunes, fibroblastos, células inflamatórias, linfócitos, moléculas de sinalização e a própria matriz extracelular, todos em uma complexa interação [62,63]. Se por um lado os estudos in vitro abordando o microambiente tumoral mimetizam apenas uma fração da realidade, o que representa uma grande limitação; por outro, os estudos em animais e humanos são complexos, devido a uma grande quantidade de fatores que podem influenciar a interação das células neoplásicas com o microambiente tumoral. Portanto, além da complexa interação existente, há um grande desafio metodológico de avaliação. Para contornar esta complexidade, os estudos se limitam a avaliar um ou poucos fatores, permanecendo a limitação para a compreensão integrada do fenômeno.
Outro importante impacto do microambiente tumoral é o desenvolvimento da quimiorresistência [64]. Embora esta característica seja geralmente atribuída à heterogeneidade intrínseca da população de células neoplásicas, sabe-se que mutações e alterações epigenéticas que influenciam o metabolismo e a retenção de drogas pelas células podem ser relacionadas ao microambiente tumoral. Diante disso, destaca-se a diversidade dentro do microambiente tumoral em termos das células estromais presentes, a quantidade de oxigênio disponível e a acidez do meio como características que influenciam essa característica [65–70]. Outra diferença
importante é a quantidade de proteínas da matriz extracelular em torno das células neoplásicas [71–73]. Em analogia, as proteínas da matriz extracelular podem criar uma barreira através da qual as drogas devem passar para atingir as células neoplásicas além de disparar sinalizações para processos metastáticos [74–79]. Todos esses fatores podem ter uma enorme influência sobre sua responsividade às drogas utilizadas.
3.2. Microambiente tumoral celular
Mudanças substanciais ocorrem em vários tipos celulares do microambiente tumoral (e.g., fibroblastos, células mioepiteliais e leucócitos) durante a progressão do carcinoma ductal in situ para o invasivo [80,81]. Os mecanismos não são bem esclarecidos, contudo aberrações genéticas nessas células não são detectadas [81,82]. Consequentemente, sugere-se que alterações epigenéticas podem estar envolvidas nesse processo [83].
3.2.1. Células mioepiteliais
Histologicamente, a maior diferença entre o carcinoma ductal in situ e o carcinoma invasivo é que os primeiros retêm uma camada externa de células mioepiteliais e uma membrana basal intacta. Portanto, a teoria canônica da progressão é que o mioepitélio normal atua como uma contensão, exercendo efeitos tumorais supressivos na lesão in situ. Diante disso, a perda desse ambiente supressor desencadearia a progressão para a doença invasiva [84–86]. Outrossim, as células mioepiteliais também secretam vários componentes da matriz extracelular e inibidores de protease, como a maspina, que inibem a capacidade invasiva do carcinoma ductal in situ [86]. Hu et. al. sustentam essa teoria ao observar que a co-transfecção de células neoplásicas com células miepiteliais normais impediu a ocorrência de doença invasiva em modelo animal, enquanto a co-transfecção com fibroblastos aumentou o crescimento e a invasão [87].
3.2.2. Fibroblastos
Há evidências crescentes que sugerem que os fibroblastos associados ao câncer desempenham papel proeminente na carcinogênese. Embora os mecanismo de ativação dos fibroblastos não sejam totalmente claros, considera-se o TGF-β e
CXCL-12/SDF-1 como os principais fatores derivados de células neoplásicas que afetam esse circuito de sinalização autócrino [88,89]. Outros fatores profibróticos também podem atuar sobre os fibroblastos e induzir respostas, incluindo o PDGF-α, PDGF-β, b-FGF ou IL-6. Por outro lado, a hipoexpressão de genes supressores tumorais, tais quais p53, p21, PTEN e CAV-1, é importante na ativação dos fibroblastos e na modulação dos seus efeitos carcinogênicos no estroma mamário [90–96]. Curiosamente, os resultados que identificaram CAV-1 como mediador da ativação dos fibroblastos também demonstraram que este pode ser um bom marcador de transformação oncogênica em fibroblastos [97].
A transformação de fibroblastos por vários oncogenes acarreta a redução de caveolinas (CAV-1, CAV-2 e CAV-3), o que se correlaciona diretamente com o maior tamanho de colônia [97]. Em comparação com os fibroblastos sem alterações, os fibroblastos associados ao câncer de mama têm menor expressão de CAV-1, provocando um crescimento mais rápido da neoplasia [98,99]. No entanto, o motivo da perda da expressão de CAV-1 continua sendo um enigma. Nesse sentido, as possibilidades para essa hipoexpressão pode ser devido a degradação lisossômica [98] e autofagia [100].
Mais recentemente, outro gene supressor de tumor, p16INK4A, foi encontrado
hipoexpresso em fibroblastos associados ao câncer de mama [101], desempenhando papel crítico na inibição da progressão do ciclo celular [102] e na indução da senescência [103]. Foi proposto que a redução do nível de p16INK4A era
devido a uma redução da estabilidade do RNAm de CDKN2A, o que resultaria do aumento na expressão proteica desestabilizadora de RNA, AUF1 [101,104]. Importante notar que sua hipoexpressão induz CXCL-12/SDF-1, Akt, COX-2 , MMP-2 e MMP-9 ativos. Diante disso, há uma maior predisposição à migração e invasão de células neoplásicas [101].
Os fibroblastos associados ao câncer de mama também promovem invasão e metástase [105–109]. Verificou-se que estes induzem a capacidade invasiva das células epiteliais do carcinoma ductal in situ [83,87], estando intimamente associado com a hiperexpressão de MMP-9 e MMP-14, as quais fragmentam elementos da matriz extracelular e possibilitam a mobilidade e invasão das células neoplásicas.
Dessa forma, a compreensão dos eventos moleculares pelos quais os fibroblastos estromais reativos afetam as células neoplásicas é útil para oferecer o melhor efeito terapêutico no tratamento do câncer de mama. Esse processo é evidente na medida em que a terapia gênica capaz de reduzir a expressão dessas proteínas nos fibroblastos associados ao câncer de mama produziu um efeito benéfico, reduzindo o tamanho tumoral e a capacidade de invasão e metástase [110].
3.2.3. Linfócitos
Os leucócitos infiltrados promovem a progressão do câncer de mama. Histologicamente demonstrou-se que quantidades elevadas de leucócitos foram encontradas infiltrando carcinoma ductal in situ, com alterações focais da camada de células mioepiteliais [111], o que indica seu papel na fisiopatologia da invasão neoplásica. Dessa forma, o número de linfócitos T CD8+ infiltrados se correlacionou diretamente com a sobrevida do paciente [112]. Além disso, a elevação da população de linfócitos T CD8+ aliada à redução de linfócitos T reguladores no microambiente neoplásico após a quimioterapia neoadjuvante esteve significativamente associada a melhor prognóstico.
Em um modelo animal de câncer de mama, a depleção dos linfócitos T reguladores pela proteína de fusão de imunotoxina de IL-12 inibiu o crescimento tumoral [113]. Verificou-se que a disseminação metastática de células neoplásicas requeria a secreção de RANKL por estes linfócitos [114]. Estes dados sugerem que o uso terapêutico de um inibidor de RANKL, como o denosumabe, pode representar uma estratégia efetiva para prevenir a metástase do câncer de mama.
Além dos linfócitos, mostrou-se que outros leucócitos desempenham diferentes papéis no câncer de mama. Observou-se que, enquanto os linfócitos T ativados predominam no tecido neoplásico, as células da linhagem mielóide predominam no parênquima mamário não alterado. Dessa forma, em comparação com os tecidos de pacientes tratados inicialmente com cirurgia, os tecidos de pacientes que receberam quimioterapia neoadjuvante continham porcentagens aumentadas de células mielóides infiltradas, acompanhada de uma maior proporção de linfócitos T CD8+, T CD4+ e de células natural killer. Este estudo indica que a
quimioterapia pode afetar o ambiente imune do tumor [115], além de oferecer um novo potencial prognóstico para ele.
3.2.4. Macrófagos
Os macrófagos são derivados de progenitores CD34+ da medula óssea, que proliferam e liberam continuamente sua progênie na corrente sanguínea como pró-monócitos. Eles estão se desenvolvem em monócitos e extravasam em tecidos onde se diferenciam em um tipo específico de macrófagos “residentes” em tecidos. Os macrófagos também são proeminentes no compartimento do estroma de praticamente todos os tipos de malignidade [116].
Os macrófagos associados ao câncer são principalmente considerados como tendo fenótipo M2, que secretam fatores de crescimento, os quais promovem a angiogênese, crescimento, invasão, migração, disseminação metastática, e imunossupressão [116–122]. No câncer de mama, os macrófagos infiltrados se correlacionam com pior prognóstico [121,122] e grau histológico mais alto [123]. Inicialmente, imputou-se à hiperexpressão de CCL-18 nos macrófagos um maior potencial invasivo, uma vez que este desencadeia uma resposta via PITPNM3 (receptor presente nas células neoplásicas) e promove o influxo de cálcio e a quimiotaxia [124].
De fato, manipular as células imunes pode ser uma estratégia promissora para o tratamento do câncer. Um bom exemplo disto é o bloqueio do recrutamento de células mielomonocíticas com antagonista de CSF1R [125]. Os agentes citotóxicos padrões induzem células neoplásicas a sintetizar CSF-1 e IL-34, e a recrutar monócitos de maneira dependente de CSF1R. Diante disso, o uso combinado de antagonista de CSF1R com paclitaxel em modelos animais melhorou a sobrevida dos indivíduos ao diminuir o tamanho do tumor primário e o número de metástases [125].
3.2.5. Células endoteliais
As células endoteliais também desempenham papel importante no crescimento e invasão do câncer. As células endoteliais umbilicais humanas (HUVECs) induzem maior proliferação de células pré-neoplásicas mamárias [107]. A
produção de TNF-α por células endoteliais induzida por agentes quimioterápicos aumenta a expressão de CXCL-1 e CXCL-2 em células neoplásicas via NF-κB e, em seguida, estas citocinas atraem células mielóides com expressão de CD11b e granzima. Estas células mieloides produzem quimiocinas, incluindo S100A8 e S100A9, que aumentam a sobrevida das células neoplásicas. Esta rede de interações de sinalização de célula neoplásica-célula endotelial-célula mielóide sugere um possível mecanismo de intervenção na quimiorresistência e processo de metastatização com bloqueador de CXCR2 [126]. Esta rede também reforça a noção de que a interação dos componentes do estroma tumoral tem papel na promoção e progressão dos processos malignos.
3.2.6. Células adiposas
O tecido adiposo, composto principalmente de adipócitos maduros e progenitores (pré-adipócitos), é o componente mais abundante que envolve as células neoplásicas mamárias. Há evidências cumulativas que sustentam que o tecido adiposo associado ao câncer é um componente importante da carcinogênese e da progressão do câncer de mama. Demonstrou-se que o colágeno VI é abundantemente expresso em adipócitos associados ao câncer e está envolvido na progressão tumoral mamária in vivo [127,128]. Além disso, há evidências de que os pré-adipócitos promovem o crescimento e a sobrevivência das células neoplásicas mamárias, bem como sua capacidade invasiva e migratória, pela secreção de citocinas (IL-6, IL-8, CCL-5 e CXCL-12/SDF-1). Associado a isso, foi evidenciada expansão das células tronco neoplásicas e indução da transição epitélio-mesenquimal mediadas pelo PDGF [129–134]. A exemplo dos fibroblastos associados ao câncer, os adipócitos associados ao câncer também podem contribuir para a radiorresistência no câncer de mama [135]. O papel dos adipócitos pode explicar ainda a associação entre obesidade e o pior prognóstico das pacientes com câncer de mama, independentemente do status menopausal [136,137].
3.3. Microambiente tumoral extracelular ou acelular
A matriz extracelular tem composição altamente variável e dinâmica que regula o comportamento das células. A composição proteica e as propriedades físicas da matriz extracelular modulam o comportamento celular através de
mecanismos bioquímicos e biomecânicos. Isso requer uma regulação cuidadosamente orquestrada e minuciosa, considerando que uma matriz extracelular perturbada pode ter séricas consequências, incluindo o processo carcinogênico. No câncer de mama, muitas proteínas da matriz extracelular são significativamente desregularas, podendo promover a progressão do tumor e a disseminação metastática. Curiosamente, várias proteínas da matriz extracelular que estão associadas ao desenvolvimento do câncer de mama, se sobrepõem substancialmente com o grupo de proteínas da matriz extracelular induzidas durante o estado de remodelação do tecido, como na involução das glândulas mamárias após a lactação. Os colágenos fibrilares, a fibronectina, as proteínas hialurônicas e matricelulares são componentes da matriz que são comuns à involução mamária e ao câncer de mama. Além disso, algumas dessas proteínas, nos últimos anos, foram identificadas como constituintes importantes de nichos metastáticos.
A matriz extracelular isolada das glândulas mamárias em involução abriga fragmentos de matriz tumorigênica que facilitam o crescimento de células neoplásicas e aumentam o aparecimento de metástases em modelo animal [138,139]. Isto foi sugerido como uma explicação para o aumento do risco de câncer de mama associado à gravidez [140]. A matriz extracelular pode ter um efeito profundo nas células epiteliais durante o remodelamento tecidual e neoplásico. No entanto, além de afetar diretamente as células neoplásicas, a matriz extracelular também pode promover mudanças significativas no estroma (e.g. quimiotáxia de macrófagos) [141,142].
No câncer de mama, observa-se um aumento na deposição de matriz estromal fibrótica. Estas são moléculas como colágeno tipo I, III e V, elastina, vitronectina, proteínas matricelulares e fibronectina oncofetal [143]. Além disso, os glicosaminoglicanos, como sulfato de hialuronato e condroitina, também são hiperexpressos, enquanto o colágeno tipo IV e LM-111 são reduzidos [144,145]. 3.3.1. Fibronectina
A fibronectina é uma glicoproteína formadora de fibrilas que é, como o colágeno, hiperexpresso durante a resposta fibrótica. Alguns estudos indicam que a fibronectina é necessária para a incorporação do colágeno na matriz extracelular
[146]. No câncer demonstrou-se que a fibronectina é expressa tanto por fibroblastos associados ao câncer como pelas próprias células neoplásicas. Curiosamente, o aumento de expressão do microRNA let7g mostrou regular a fibronectina em células neoplásicas não metastáticas, e, consequentemente, uma maior motilidade e invasividade [147]. A expressão de fibronectina induzida em órgãos secundários, por citocinas secretadas pelas células neoplásicas, gerou um nicho estromal que promove metástases, ou seja, desenvolvimento de um nicho pró-metastático [148].
Geralmente, a expressão de fibronectina pelas células neoplásicas mamárias está associada a um pior prognóstico [149,150], considerando sua expressão em células tumorais circulantes em pacientes com câncer de mama [151]. A evidência de amostras de pacientes indica que as células tumorais circulantes podem mostrar atributos de transição epitélio-mesenquimal, onde as células perdem a polaridade e a adesão celular no epitélio e adquirem um fenótipo mesenquimatoso com alta motilidade. A fibronectina é um marcador mesenquimatoso estabelecido e demonstrou promover o processo de mudança da matriz extracelular via TGF-β [152].
A fibronectina pode ter efeitos moduladores nas vias de sinalização das células neoplásicas. Por exemplo, demonstrou-se que a fibronectina induz a ativação da via MAPK-STAT-3 nas células neoplásicas de mama, promovendo invasão e metástases [147,153]. Pode ainda direcionar as respostas em células neoplásicas combinando IGFBP-2 e EGF [154]. Em conjunto, há evidências que indicam que a fibronectina pode modular a sinalização celular do câncer de mama de forma distinta e é um importante promotor da progressão do câncer de mama. 3.3.2. Laminina
As lamininas desempenham um papel importante durante a carcinogênese mamária, principalmente a LM-111 e LM-332 [144]. O carcinoma invasivo induz a produção de LM-332 em miofibroblastos para promover a sobrevivência da célula neoplásica através do PI3K-AKT [155]. A LM-332 também induz migração e invasão de células neoplásicas através da integrina α3 e está fortemente associada ao câncer de mama triplo negativo [156,157]. Além disso, embora alvo de pouca atenção, a isoforma de laminina LM-511 surgiu como significativo modulador no
câncer de mama. Esta regula a migração, invasão e metástase tumoral, correlaciona-se com o grau histológico e está associada a um maior potencial metastático [158,159].
3.3.3. Ácido hialurônico
O ácido hialurônico é um oligossacarídeo altamente abundante e forma uma parte significativa da matriz extracelular. O ácido hialurônico regula uma variedade de comportamentos celulares, como a adesão, motilidade, crescimento e diferenciação e atua através de receptores de superfície, como CD44 [160]. No câncer de mama observa-se que o aumento de deposição do ácido hialurônico leva a um pior prognóstico [161]. Ademais, a enzima chave na biossíntese do ácido hialurônico é a hialuronan-sintetase. Dessa forma, em modelos animais, demonstrou-se que a supressão de expressão da hialuronan-sintetase tipo 2 reduz significativamente a progressão do câncer, sugerindo seu papel importante neste processo [162,163]. O ácido hialurônico pode ser um fator importante que associa a matriz extracelular acelular e o câncer de mama. Provoca aumento da hidratação e pressão intersticial, promovendo a penetração de fibroblastos, bem como a atividade migratória e invasiva via CD44 [160]. Além disso, o ácido hialurônico também induz o comportamento invasivo nas próprias células neoplásicas, sem os mecanismos ainda reconhecidos [164].
3.3.4. Enzimas matriciais
As enzimas modificadoras da matriz extracelular estão intrinsecamente associadas ao câncer de mama e sua progressão metastática. As MMPs (metaloproteinases da matriz), uPA (ativador do plasminogênio tipo urocinase), catepsinas e as enzimas de reticulação da família lisil-oxidase são altamente expressas em câncer e atuam de forma versátil. Essencialmente, essas enzimas também são conhecidas por desempenhar um papel importante na involução das glândulas mamárias.
As MMPs são as proteases mais proeminentes durante a remodelação do tecido. As MMPs principais expressas durante a involução são MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-14 (MT1-MMP) [140]. Vale ressaltar que as mesmas desempenham
papel significativo na progressão da neoplasia. MMP-2 e MMP-9 são eficientes na degradação do colágeno tipo IV, principal componente da membrana basal que é invadida durante a progressão do tumor. Além disso, a MMP-14 ligada à membrana promove a sobrevivência de células neoplásicas incorporadas à matriz rica em colágeno [165]. Curiosamente, os experimentos mostraram que, mesmo na ausência de transformação oncogênica, a hiperexpressão de enzimas de remodelação da matriz extracelular, como MMP-3 e MMP-14, por si só pode levar à malignidade [166,167]. Isso ressalta como a sinalização mediada pelo remodelamento da matriz extracelular pode ditar profundamente o comportamento celular e é um forte indicio de que a remodelação da matriz extracelular pode ser de fato uma força motriz na progressão do câncer.
Outra proteína envolvida é a uPA, que consiste numa serina protease que promove a degradação da matriz extracelular. Níveis elevados de uPA são indutor significativo da progressão do câncer e predizem um pior prognóstico [168]. Além disso, as catepsinas, família de proteases lisossômicas, também são contribuintes significativos para a progressão do câncer de mama. A catepsina B promove a degradação do colágeno tipo I, invasão das células neoplásicas e metástases [169– 171]. Outro membro dessa família, a catepsina K, é altamente expressa por osteoclastos que promovem a reabsorção da matriz óssea. Sabe-se que sua expressão por células neoplásicas é necessária para invasão e colonização do osso [172].
No contexto da matriz rica em colágeno, a enzima de reticulação da família lisil-oxidase surgiu como importante mediador no câncer. Essa enzima facilita a reticulação do colágeno levando a maior rigidez da matriz extracelular e comportamento invasivo das células neoplásicas de mama [173,174]. Sob alta rigidez, as forças de tração agrupam integrinas, levando a ativação de FAK e invasão induzida por PI3K e progressão tumoral [173]. Esta enzima está frequentemente expressa no câncer de mama, e sua hiperexpressão está associada com pior prognóstico [174].
3.3.5. Proteínas matricelulares
As proteínas matricelulares são glicoproteínas da matriz extracelular altamente expressas durante o desenvolvimento embrionário [175]. No entanto, durante a remodelação do tecido, como a involução das glândulas mamárias, e em condições patológicas, como o câncer, essas proteínas são hiperexpressas [176]. A hiperexpressão de proteínas matricelulares está associada com disseminação metastática e pior prognóstico. Curiosamente, essas proteínas da matriz não contribuem significativamente para a estrutura mecânica da matriz extracelular, mas são importantes reguladores celulares e modulam as vias de sinalização [175].
Tenascina C é uma proteína da família matricelular que se reúne em uma estrutura hexamérica. Forma um constituinte significativo da matriz provisória e é altamente regulada durante a regeneração tecidual [177]. É observada uma expressão baixa nas glândulas mamárias saudáveis, enquanto é altamente expressa no câncer de mama, especialmente em locais de invasão [178,179]. A tenascina C mostrou ser um dos seis genes em uma assinatura regulada pelo microRNA-335 no câncer de mama metastático [180]. A tenascina C e MMPs muitas vezes colocalizam-se em áreas de remodelação do tecido, sendo que a 9 e a MMP-13 são induzidas por tal proteína, acarretando o comportamento invasivo de células neoplásicas [181,182]. Além disso, promove a metástase via Notch e Wnt [178]. A hiperexpressão de tenascina C se correlaciona a maior grau histológico, tamanho tumoral e pior prognóstico [178,183].
A osteopontina, também conhecida como fosfoproteína-1-secretada, é outro membro da família matricelular. É uma glicoproteína fosforilada que interage com receptores de superfícies, incluindo várias integrinas e CD44 [184]. A integrina αVβ3 é o receptor de interação melhor caracterizado para a osteopontina e induz sinalização de sobrevivência nas células neoplásicas [185]. A hiperexpressão de osteopontina promove a carcinogênese mamária e desenvolvimento de metástases em modelo animal [186]. As células neoplásicas de mama transfectadas com osteopontina demonstraram aumento da migração e invasão [187]. Embora a maioria dos casos mostre expressão de osteopontina em células do estroma, esta proteína também é expressa diretamente pelas células neoplásicas. Curiosamente, como várias outras proteínas da matriz extracelular, a osteopontina existe tanto
como uma parte imobilizada na matriz extracelular como um fator solúvel que circula no sangue. A hiperexpressão de osteopontina no tecido tumoral, bem como sua alta concentração sérica, predizem um pior prognóstico [188–191].
Periostina é uma proteína matricelular cuja função significativa em tecidos saudáveis tem sido associada ao desenvolvimento ósseo e cardíaco [192]. Expressa em vários tipos de câncer, mostrou-se afetar a rigidez da matriz extracelular, um fenômeno fortemente associado à progressão do câncer [173]. A periostina ligada à BMP-1 promove a ativação de enzimas de reticulação da família lisil-oxidase, pelo qual promove a reticulação do colágeno e a rigidez dos tecidos [193]. Em modelo animal, a secreção de periostina é induzida pelo TGF-β e mostrou-se necessária para a colonização metastática do pulmão [194]. Adicionalmente, as altas concentrações séricas de periostina estão associadas às metástases ósseas [194]. 3.3.6. Colágeno
Uma característica comum da fibrose e do câncer de mama é a produção excessiva de colágeno, sendo este o principal componente da matriz extracelular acelular [195,196]. Existem 28 tipos de colágeno encontrados em formas fibrilares e não fibrilares. O colágeno mais comum em mamíferos é o colágeno tipo I. O colágeno tipo IV é não fibrilar e constituinte essencial da membrana basal, um tipo especializado de matriz extracelular localizado no lado basal das células epiteliais e endoteliais, sendo necessário para a manutenção da polaridade dessas estruturas [195].
Alterações significativas na composição do colágeno são observadas no câncer de mama, onde o acúmulo de colágenos do tipo I, III e V ocorre concomitante à redução do colágeno tipo IV [195,197,198]. A notável redução deste colágeno no câncer de mama deve-se principalmente à degradação da membrana basal [197,198]. Além disso, certos colágenos estão presentes em assinaturas de genes em amostras de câncer primário de mama e estão associados ao aumento do risco de recorrência metastática [199,200]. O aumento da expressão de colágenos fibrilares, como os colágenos tipo I e III no câncer de mama, são associados á invasão tumoral e comportamento agressivo [201].
Dessa forma, uma reação fibrótica associada às neoplasias malignas, denominada desmoplasia, se correlacionaria com um pior prognóstico em pacientes com câncer de mama. Na prática, estudos atuais demonstraram que o aumento da intensidade da fibrose está associado a um prognóstico desfavorável e pior resposta à terapêutica do câncer de mama [202–204]. No entanto, essa associação já se esboçava em estudos de 1998 por Kauppila et. al. [205]. Vale ressaltar que todos os dados se basearam somente nas observações e associações e não detalhando o papel fisiopatológico do colágeno. Estudos deste tipo são escassos.
A associação entre mudanças na produção de colágeno e progressão do câncer de mama pode ser funcionalmente importante e conjecturado por diferentes evidências. O colágeno pode atuar como “via expressa”, facilitando a migração de células neoplásicas ou de células estromais [206]. Além disso, o aumento da deposição de colágeno e a modificação da organização de fibrilas estão associados a mudanças importantes nas propriedades biomecânicas dos tecidos. Este aumento pode ser afetado por outras proteínas da matriz extracelular, como a fibronectina, que forma fibrilas dentro da matriz, e que foi sugerida como promotor da formação de fibrilas de colágeno [207]. Além disso, a organização e a rigidez do colágeno são significativamente afetadas pela modificação enzimática, como no caso da reticulação [208,209].
Nesse contexto, em 2005, Paszek et. al. elucidaram a forma como a deposição do colágeno pode precipitar a carcinogênese devido à alteração da morfologia epitelial. Segundos os autores, o aumento de deposição das fibras de colágeno no estroma acarretaria no aumento de sua tensão, modulando os sinais dos mecanorreceptores, tais como as integrinas. Nesse sentido, há aumento da ativação da via ERK/ROCK, com aumento da proliferação, contratilidade celular e desarranjo da morfologia, que em última instância seria o início do processo neoplásico [210]. Esse estudo foi complementado com os resultados obtidos por Provenzano et. al., que demonstraram que a deposição de colágeno no tecido mamário promove a carcinogênese, além de incrementar a frequência de metástases precoces, portanto, associa-se a um pior prognóstico [211].
Retornando ao modelo de Lyons et. al., onde a involução da glândula mamária após a gravidez é a força motriz para a progressão do carcinoma ductal in
situ [212], podemos observar que no modelo animal os autores observaram que as células MCF10A submetidas ao microambiente de involução mamária formaram grandes tumores, com aumento da deposição de colágeno intratumoral e expressão de COX-2. Neste modelo, tanto o colágeno fibrilar quanto o COX-2 foram necessários para a aquisição de um fenótipo invasivo, que pode ser parcialmente bloqueado por fármacos antiinflamatórios não-esteroides.
Por outro lado, demonstrou-se que o DDR-2, principal receptor das fibras de colágeno, quando ativado, está associado à manutenção e estabilização do fator de transcrição Snail1 no núcleo da célula tumoral, provocando a transição epitélio-mesenquimal através da ativação da via ERK/MAPK [213].
