Adaptação de metodologias de cultura de tecidos visando o melhoramento através de indução de mutações em Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Pera

Texto

(1)ADAPTAÇÃO DE METODOLOGIAS DE CULTURA DE TECIDOS VISANDO O MELHORAMENTO ATRAVÉS DE INDUÇÃO DE MUTAÇÕES EM Citrus sinensis (L) OSBECK CV. PERA MARIANGELA CRISTOFANI Engenhei~o. O~ientado~:. Ag~Onomo. P~of.. D~.. Augusto Tulmann Neto. Dissertação apresentada à Escola Superio~ de Agricultu~a "Luiz de Queiroz" da Universidade de São Paulo, pa~a obtenção do titulo de Mest~e em Agronomia, Ã~ea de concent~ação: Genética e Melho~amen to de Plantas.. PIRACICABA Estado de São Paulo Junho - 1991. B~asil.

(2) Ficha catalogrãfica preparada pela Seção de Li�ros da Divisão de Biblioteca e Documentação - PCAP/USP C933a. Cristofani, Mariangela Adaptação de metodologias de cultura de tecidos vi�ando o melhoramento atrav�s de indução de mut! ções em Citrus sinensis (L.) osbeck cv. Pera. Pi racicaba, 1991. 185p. ilus. Diss. (Mestre) - ESALQ Bibliografia. 1. Laranja pera - Cultura de tecido - Metodolo gia 2. Laranja pera - Melhoramento 3. Laranja pera Mutação induzida I. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba CDD 634.31.

(3) ADAPTAÇÃO DE METODOLOGIAS DE CULTURA DE TECIDOS. VISANDO O MELHORAMENTO ATRAVÊS DE INDUÇÃO DE MUTAÇtíES EM Citrus sinensSs (L.) OSBECK cv. PERA. Mariângela Cristofani. Aprovada em: 27/06/1991 Comissão Julgadora:. Prof. Dr. Augusto Tulmann Neto Prof. Dr. Akihiko Ando. Dra. Beatriz M. Januzzi Mendes. CENA/USP. ESALQ/USP CENA/USP. /\ . "",u,-J:::, ��. Prof. Dr!Au,usto Tulmann Neto Orientador.

(4) ii. Aos meus pais VICENTE E AVANILDA e aos meus irm�os. NIVALDO, SILVIA e RODRIGO,. Ofereço..

(5) iii. AGRADECIMENTOS Ao Dr. Augusto Tulmann Neto,. pela. ami-. orientaç~oJ. zade e interesse por minha carreira científica. Ã Dra. Beatriz M.J. Mendes pela amizade e. mável ajuda na. elaboraç~o. inesti-. deste trabalho.. Ao Prof. Dr. Akihiko Ando pela amizade e ensinamentos transmitidos. Ã. Professora Beatriz Appezzato e a Magali Apareci-. da Rodrigues Machado pela amizade e. nos. orientaç~o. estudos. dos cortes histo16gicos realizados no presente trabalho. À Benedita. Inês F.P. Rodrigues e Wlamir de. Aguiar. Godoy pela amizade e auxilio nos trabalhos de laboratório. Aos companheiros do curso. de. Mestrado,. Aparecida da Silva e Antônio Fluminhan Junior. e. Benedita as. nheiras de "República", Edna Ten6rio Nunes, Elaine Bernades e Marilene Iamauti. pela. amizade. e. compaMendonça. valiosas. su-. gestões a este trabalho. Aos funcionários e estagiários da genética, Paulo. Cassieri,. José. Benedito. Seç~o. de. Alves,. RadioCristina. Falco, Edson Tobias Domingues, Rodrigo Latado e TeIma. Wata-. nabe pela amizade e valiosa ajuda. À FAPESP e CAPES,. tudos.. pela. concess~o. da bolsa. de. es-.

(6) iv. Aos Departamentos de Genética, Botânica e mica da Escola Superior de Agricultura "Luiz de. Bioqu!-. Queiroz". ESALG/USP. Ã. Seç~o. de. Rad~ogenética. do Centro de Energia Nu-. clear na Agricultura - CENA/USP. A todos que de forma direta ou indireta ram para a. realizaç~o. deste trabalho, agradeço.. colabora-.

(7) v. SUMÁRIO Página. . .. . . .. .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. .. . . .. . . . . . . .. . .. . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . .. .. LISTA DE TABELAS . .. LISTA DE FIGURAS RESUMO SUMMARY. x. xiv. ................................................................ .. ................................................... ». 8'. .................... ... xx xxiii. .................................................................... 01. 2. REV I SÃO DE L I TERATURA ....•.•.•..••.•..••.....•. 05. 2.1. Embriogénese somática..................... 05. 2.2.1. Embriogénese somática direta ••.••.. 06. 2.2.2. Embriogénese somática indireta •.•.. 13. 1. INTRODUÇÃO. 2.2.2.1. Obtenção de calos. embrio-. génicos ...•...•......•..•. 14. 2.2.2.2. Obtenção de embriões somáticos em calos nucelares .. 20. 2.2.3. Isolamento de protoplastos ......•.. 22. 2.2.4. Cultivo de protoplastos •.••.•.••... 26. 2.2.5. Fusão de protoplastos . . • . • . . . . . . . .. 30. 2.2.5.1. Obtenção de hibridos somáticos. ....................................... 30. 2.2.5.2. Obtenção de cibridos ...... 33. 2.3. Organogénese . . . . . . . . . . . . . . . • . . . ...•....... 34. 2.4.. Indução de mutações. . . • . . . . . . . . . . . . . . . . • .. 36. 2.4.1. Indução de mutações in vivo . . . . . . .. 38. 2.4.2. Indução de mutações in vitro ..•.... 41. 3. MATERIAIS E. •.....•.•....•.......•...... 47. 3.1. Procedimentos g e r a i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 47. 3.2. Procedimentos especificos ••••••.•....•.... 48. M~TODOS.

(8) vi. Página 3.2.1. Efeito de diferentes de CIN e. IAA na. concentrações. formaç~o. de calos e. embri6ides em tecido nucelar (Experimento 1). .... ., ........ ., ........... .,.,...... 3.2.2. Efeito de diferentes meios de tura na. formaç~o. de. calos. 48. cule. em-. bri6ides em tecido nucelar (Experimen to 2). ........................................... 49. 3.2.3. Indução de embriogênese somática em calos nucelares (Experimento 3) 3.2.4. Efeito de diferentes de CIN e. 50. concentrações. IAA no desenvolvimento. de. plantas a partir de embri6ides (Experimento 4). 51. 3.2.5. Efeito de diferentes meios de. cul-. tura na proliferação de calo e bri6ides em calos obtidos. em. emmeio. MT básico sem suplementação com reguladores de men to 5). crescimento. (Experi-. .............................................. 52. 3.2.6. Verificação do fen6meno da habituação em calos nucelares to 6). (Experimen-. ........................................................ 3.2.7. Efeito de diferentes. concentrações. de BAP e NAA na indução. de. brota-. ções adventicias (Experimento 7) 3.2.8. Efeito de diferentes. 53. 55. concentrações. de BAP na multiplicação. de. brota-. ções adventicias (Experimento 8). 56. 3.2.9. Efeito de diferentes reguladores de crescimento. no. enraizamento. brotações adventicias 9). das. (Experimento 57.

(9) vii. Página 3.2.10. Cortes 10 ). histol6gicos. (Experimento. ., . . . . . . . . . . . . . " • ., .... .,.,............. 3.2.11. Obtenção de. protoplastos. (Experi-. mento 11) 3.2.11.1.. 58. 59. Isolamento de tos. protoplas-. ., ... ., ...... .,.................. 3.2.11.2. Purificação plastos. 59. pro to-. dos. ........•.•...•... 59. 3.2.11.3. Verificação do rendimento de. protoplastos. durante. o processo de isolamento.. 63. 3.2.12. Verificação da viabilidade dos protoplastos (Experimento 12). 63 (Experi-. 3.2.13. Cultivo dos protoplastos mento 13). 64. 3.2.14. Radiossensitividade dos. diferentes. materiais. 66. 3.2.14.1. Radiossensitividade tecidos nucelares. dos (Expe-. rimento 14). 66. 3.2.14.2. Radiossensitividade calos nucelares rimento 15). dos (Expe-. .•............ 3.2.14.3. Radiossensitividade. 67. em. protoplastos (Experimento 16). 68. 3.2.14.4. Radiossensitividade cotilédones. de. em. embri~es. nucelares (Experimento 17). 69.

(10) vi i i. P"gina 4. RESUL TADOS E DI SCUSSln .••••••.•••••••••••••••• 4.1.. de calos e. Induç~o. embriões. somáticos. 71. a. partir de nucelos ••••••••.•••••••••••••••. 71. 4.1.1. Efeitos de diferentes concentrações de CIN e. IAA (Experimento 1). .•••••. 71. 4.1.2. Efeito de reguladores de crescimen-. to CIN, 4.2.. IAA e. BAP (Experimento 2). 76. de embriogênese somática a. partir. de calos nucelares (Experimento 3). ••.••••. Induç~o. 4.3. Desenvolvimento de. plantas. a. partir. 80. de. embriões somáticos em meios de cultura com diferentes concentrações de CIN e. IAA (Ex-. perimento 4). 84. 4.4. Efeito de diferentes meios de. cultura. desenvolvimento dos calos nucelares dução da embriogênese nestes calos rimento 5). .............................. no. e in(Expe-. 1ft................ 90. 4.5. Verificação da ocorrência da habituação em. calos embriogênicos (Experimento 6) 4.6.. Indução de brotações adventícias men to 7). 95. (Experi-. ............................ "......................... 4.7. Multiplicação. de. brotações. adventicias. (Experimento 8) 4.8.. 110. Indução de enraizamento em ventícias (Experimento 9). brotações. ad-. ............•.... 4.9. Análises histo16gicas (Experimento 10) 4.10. Obtenção de protoplastos (Experimento 11). 4.11. Viabilidade dos protoplastos 12). 1 08. 115 117 131. (Experimento. ....................................... 134. 4.12. Cultivo dos protoplastos (Experimento 13).. 137. 4.13. Radiossensitividade dos. diferentes. mate-. riais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 140.

(11) Ix Página 4.13.1. Radiossensitividade do tecido celar. (Experimento 14). nu-. •••••.••••. 140. 4.13.2. Radiossensitividade em calos nucelares (Experimento 15). ••••••..•.•. 4.13.3. Radiossensitividade em. protoplas-. tos (Experimento 16) ..•.••••.••.•. 145 151. 4.13.4. Radiossensitividade em cotilédones de embriões nucelares (Experimento 17). ............... t'.................. 4.14. Considerações gerais e perspectivas ras. 5.. REFER~CIAS. futu-. ...................•........•...•.•.... CONCLUSOCS. 155. 157. ...... .,........................................... 164. BIBLIOGRÁFICAS ...•.......•••.......... 167.

(12) x. LISTA DE TABELAS. TABELA No 01. Página Meios de. maceraç~o. e. purificaç~o. vagem) de protoplastos de. (la-. acordo. com. 4 diferentes protocolos ••••••••...... 02. Meios de cultura e densidade queamento utilizados no. de. pla-. cultivo. de. protoplastos isolados a partir de. ca-. los embriogênicos do cv. Pera ......•.. 03. Efeito das diferentes concentrações. de. CIN e. na. IAA adicionadas. ao. 60. meio MT,. 65. formação de calos e embrióides no tecido nucelar, 8 semanas após a inoculação dos nucelos 04. 73. Efeito dos reguladores CIN,. de. crescimento. IAA e BAP, adicionados ao meio. cultura MT,. na. porcentagem de. ção de calos. Avaliações após. de. forma8. e. 12. semanas de cultivo de nucelos 05. Efeito dos reguladores. de. crescimento. CIN, IAA e BAP sobre o número embrióides obtidos por nucelo. ções após 8. 78. médio de Avalia-. e 12 semanas de cultivo de. nuc e los ...................................... .. 78.

(13) xi. Página TABELA N06. Efeito de diferentes carboidratos sobre a embriogênese em calos nucelares obtidos em meio (10 mg/l).. MT. suplementado. com. BAP. Avaliação 40 dias ap6s cul-. ti vo ...................................................... .. 07. Observações sobre o desenvolvimento embri6ides em meios de cultura com ferentes concentrações de Avaliação 8 semanas ap6s cultivo. 08. o. inicio. do. ................................................. ... embriões por MT. calo. cultivado. com diferentes. da cultivo .......................... a. em o. de meio. inicio. ............. 11. ......... ... 92. Crescimento de calos nucelares em meios de cultura com e sem adição de dores de MT.. crescimento. Avaliação. ao. regula-. meio. básico. realizada 45 dias. ap6s. o inicio do cultivo • . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10. 87. suplementa-. ções. Avaliação 40 dias ap6s. 09. IAA.. Peso médio dos calos e número médio básico. de. di-. e. CIN. 82. Efeito de diferentes. concentrações. BAP e NAA na formação de brotações venticias na cultura de cotilédones. 96. de adde. embrieie-s nucelares ..................................... ... 111.

(14) xl i. TABELA N· 11. Página Efeito da plicaç~o liaç~o. de BAP na multi-. concentraç~o. de brotaçê5es adventicias. Ava-. realizada 8 semanas após o. ini-. cio do cultivo ....... ., . . . . . . . . . . . . . . . . .. 12. Porcentagem média de brotações em meio. enraizamento,. MT. 114. de. suplementado com. vários reguladores de crescimento. Avaliaç~o. 4 semanas após o inicio do. ti vo . . . . . . . . . . . . . . . . . .,.. 13. cul-. *' • • • • • • • • ., . . . . . . .. Rendimento médio de protoplastos isolados em diferentes tratamentos e. perio-. dos de digestão enzimática ....•.••.... 14. Viabilidade dos protoplastos. em. dife-. rentes diluições de diacetato de. fluo-. resceina em meio de lavagem . . . . . . . . . . . 15. Efeito da. radiação. de embrióides. em. gama nucelos.. 136. Avaliações trata-. mento mutagênico Desenvolvimento de. 132. na. realizadas 6 e 8 semanas após o. 16. 116. 142 embrióides. indivi-. dualizados oriundos de nucelos submetidos a diferentes doses de radiação ma. a. Avaliação realizada 60. dias. inoculação dos embrióides no. globular. gaapós. estádio. ................................ .. 144.

(15) xi! i. TABELA N17. PAgina Efeitos de diferentes doses de. radiaç~o. gama no crescimento de calos e. regene-. raç~o. de embri6ides. Avaliaç~o. t. i vo. 18. a. ......................................... .. embri6ides. dualizados oriundos de dos a. diferentes. Avaliaç~o eulaç~o. 19. destes.. 40 dias ap6s o inicio do cul-. Desenvolvimento de. bu 1 a r. partir. doses. indivi-. calos. de. submetiradiaç~o.. realizada 30 dias ap6s a ino-. dos embri6ides no estádio. glo-. ................................... .. Germinaç~o. 146. 148. de embri6ides desenvolvidos,. oriundos de calos submetidos rentes doses de radiação gama.. a. difeAvalia-. ção realizada 30 dias ap6s a inoculação dos embri6ides no estádio cotiledonar • 20. Viabilidade dos protoplastos submetidos a diferentes doses de radiação gama .... 21. 149. Efeito de diferentes doses de. radiação. gama na formação de brotações. adventi-. 153. eias em cotilédones de embriões nucelares.. Avaliaç~o. to mu t a g én i c o. 90 dias ap6s o tratamen................................. .. 155.

(16) xiv. LISTA DE FIGURAS Página. FIGURA N° 1. Representação gráfica do efeito diferentes concentrações de IAA,. CIN. e. MT,. na. embrióides. no. adicionadas ao. formação de calos e. de. meio. tecido nucelar •....•.••••.••.•.•.• 2. Proliferação. de. calo. em. 74. nucelo,. em meio de cultura suplementado com 10 mg/l de SAPo lo nucelar (xl0) 3. (a) nucelo,. (b) ca-. ••••••••••••••••••. 98. Proliferação de calos embriogénicos em meio suplementado com 10 mg/l de BAP. 4. Ii". ........................................ Proliferação de embrióides nucelos. 5. (a). ••. Proliferação de embrióides. (b). 98. em. (><10) . . . . . • . . . . . . . . . . .. calos nucelares (a). 6. (b). .,. 99. em. (x10). 99. Embrióides normais e maduros (a). e. embrióides cotiledonares normais. e. imaturos (b) obtidos em calos nucelares (c) cultivados em meio suplementado com 50 g/l de lactose e 500 mg/l de EM, 40 dias após o ( x 10 ). cultivo. ............................. .,....... 100.

(17) xv. Página. FIGURA N" 7. Calo embriogênico Ca). apresentando. embri6ides cotiledonares (b) e. em-. brióides no. (c). estádio. globular. após 60 dias de cultivo em meio com de lactose e 500 mg/l de. 50 g/l. ( x 10). 8. .................................. Formaç~o. 100. de embri6ides em calos em-. briogênicos 9. EM. . .. . .. . . .. . . . .. .. . . .. .. .. . . . . .. Embri6ides de Citrus Pera em processo de. sinensis. cv. Os. maturaç~o.. diferentes estádios de. 101. desenvolvi-. mento podem ser observados em calos nucelares inoculados em meio suplementado com lactose e bri6ide. globularj. com cotilédones em. EM (b). (a). em-. embri6ide. formaç~o,. (c). e. (d) embri6ides com dois cotilédones proeminentes (x10) 10. ....•............ 102. Plântula regenerada via embriogênese somática a partir de calos nucelares, apresentando raiz. e. parte. aérea normais . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . 11. Plântula. anormal com raiz e. sentando cotilédones fundidos,. 103. aprese-. melhantes a uma corneta . . . . . . . . . . .. 104.

(18) xvi. FIGURA NIlO 12. PAgina Plântula raiz e ciados. 13. em. roseta,. formaç~o. apresentando. de cotilédones fas-. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. 105. Plântula anormal enraizada apresen-. e. tando um único cotilédone (a). a. presença de um meristema apical rudimentar (b) 14. ... .. . . . . . . .. . . . . .. .. .. Plântulas apresentando. desenvolvi-. mento da parte aérea anormal apicais múltiplas) e raiz 15. Embri~o. nucelar. (gemas. .•.•••.•.. cotiledonar. Cotilédones utilizados. na. de gemas adventícias (b) 16. 107. (a).. indução. (x10). 122. Desenvolvimento de brotaç5es adventicias em cotilédones. de. embriões. nucelares (x10) 17. 106. 122. Multiplicação de brotações adventícias em meio suplementado com 3 mgl 1 de BAP. 18. (x8). •••••••••••••••••••••. Enraizamento de brotaç5es em rentes meios de cultura após o inicio do cultivo. 4. 123. difesemanas 124.

(19) xvii. FIGURA No 19. Página Corte transversal da folha danar, antes da. inoculaç~o. cotileno. meio. de cultura, revelando que a epiderme é constituída por. células. com-. pactas com núcleo grande; o mes6filo é homogêneo e se caracteriza por apresentar. células. arranjadas. maneira justaposta, os feixes culares são colaterais (a) 20. de vas-. ....•••.. 125. Corte transversal do explante, mantido por 4 semanas em meio de. cul-. tura (MT + 3 mg/l de BAP + 2,5 1 de. NAA).. mgl. Observa-se acúmulo. de. amido em algumas células subepidermicais (a) 21. 126. Corte transversal do explante, mantido por 4 semanas em meio de. cul-. tura (MT + 3 mg/l de BAP + 2,5 1 de. NAA).. mg/. Observa-se que, em. gumas áreas, a epiderme e as. alcama-. das subepidérmicas, eram substitu1das por um meristema semelhante um câmbio de 22. cicatrizaç~o. a. (a). 127. Observa-se no meristema neoformado, a ocorrência de meristem6ides (a b). e 128.

(20) xvi j i Página. FIGURA N" 23. Formaç~s. observadas. ao. longo. da. superficie do explante (a), após 60 dias em meio de cultura ••••.••.... 24. A análise dos cortes. 129. longitudinais. do explante após 60 dias de. culti-. vo revela a formação de gemas vegetativas caracterizadas por apresentarem. meristema. protegido. apical. por primórdios foliares (a),. glân-. dulas de óleo (b) 25. 130. Representação gráfica do efeito diferentes tratamentos. de. enzimáticos. no rendimento do processo de isolamento de protoplastos . . . . . . . . . . . . . 26. Protoplastos inoculados em. meio de. cultura contendo 0,45 M de. manitol. 132. e 0,15 M de sacarose e densidade de plaqueamento de 10. 5. protoplastos/ml. após 15 dias de cultivo . . . . . . . . • . . 27. Protoplastos inoculados em meio cultura contendo 0,25 M de. 138. de. manitol. e 0,15 M de sacarose e densidade de 10. 5. protoplastos/ml, após. 15. dias. de cultivo................................... 139.

(21) FIGURA N28. Página Representaç~o. gráfica da. porcenta-. gem de viabilidade de. protoplastos. em diferentes doses de. radiaç~o. ma, em. relaç~o. à. ga-. testemunha ..•..•.. 152.

(22) xx. LISTA DE ABREVIATURAS. No decorrer do presente trabalho. foram. usa-. das abreviaturas, cujo significado é dado a seguir:. MT. meio de cultura descrito por MURASHIGE & TUCKER (1969). EM. extrato de malte. CIN. cinetina. IAA. ácido indolacético. BA. benzil adenina. NAA. ácido naftalenoacético. 2,4-D-. ácido 2,4-diclorofenoxiacético. GAs. ácido giberélico. AG. 8-aza-guanina. CCC. 2-cloro-etiltrimetilamonia. ALAR. ácido 2,2-metilhidrazida. 2ip. 2-isopenteniladenina. IBA. ácido indolbutirico. ABA. ácido abscisico. BAP. benzil-aminopurina. 5HNB. 2-hidroxi-5-nitro benzilbromida. AZI. 7-aza-indol. FAA. Fixador (Formol, álcool, ácido acético e água).

(23) xxi. ADAPTAÇ~O. DE METODOLOGIAS DE CULTURA DE TECIDOS. VISANDO O MELHORAMENTO. ATRAV~S. INDUÇ~. DE. DE MUTAÇeES. EMCitrus sinensis (L.) OSBECK CV. PERA. Autora: Mariângela Cristofani Orientador: Prof. Dr. Augusto Tulmann Neto. RESUMO O melhoramento de citros através. de. métodos. convencionais tem sérias limitações devido à existência embriões nucelares nas sementes das. espécies. dos. poliembriôni-. cas, ao alto grau de heterozigose e ao longo ciclo. reprodu-. tivo, entre outros fatores. A cultura de tecidos surgiu cama uma auxiliar. no. melhoramento. das. transpor. as. dificuldades. encontradas na. métodos convencionais.. espécies. citricas. Esta técnica também tem sido. s61idos~quando. se. visando das. aplicaç~o. gada em trabalhas com induç~o de mutações,visando de mutantes. técnica. utilizam agentes. empre-. a obtenç~o mutagênicos. para aumentar a frequência das mutações. O presente trabalho teve como Objetivo tar diferentes metodologias de cultura. de. tecidos. adapno. cv.. Pera (Citrus sinensis Osbeck. ),visando futuros trabalhas com induç~o. de mutações..

(24) xxi. Nucelos foram extraídos de sementes de frutos somáticos. Embri~es. imaturos, 12 semanas após a antese.. fo-. ram produzidos diretamente a partir destes explantes em meio. o. MT, com diferentes concentrações de IAA e CIN. plementado com 1,0 mg/l de CIN favoreceu a brióides,. principalmente. através da. des a partir dos já existentes. produzidos diretamente a. partir. su-. de. em-. formaç~o. de. formaç~o. Calos. meio. embriói-. embriogênicos. dos. nucelos. em. foram. meio. MT. obtido. a. suplementado com BAP (10 mg/l). Um grande número de embri6ides foi partir dos calos, sendo que. o. meio MT suplementado com. g/l de lactose e 500 mg/l de extrato de eficiente.. Os embri6ides produzidos. malte. a. foi. partir dos. o. 50. mais. nucelos. ou a partir de calos nucelares foram capazes de se desenvolver e regenerar plantas, em sacarose e. meio. MT. contendo. 50. g/l. de. 500 mg/l de extrato de malte.. Protoplastos foram isolados a partir dos los embriogênicos e. sua. viabilidade. teste com diacetato de fluoresceina. mento foi de 1,03x10. 6. foi. ca-. verificada. pelo. O rendimento no is01a-. protoplastos por grama. viabilidade de 84% foi verificada logo após. de o. calo. e. processo. a de. purificação dos mesmos. Brotações adventícias foram induzidas a tir dos cotilédones extraídos de. embriões. brotações foram obtidas. MT. em meio. concentrações de NAA e BAP e suas. nucelares.. contendo. combinaç~es.. parAs. diferentes. Entretanto, o. j.

(25) xxi ii. meio contendo 0,5 mg/l de BAP e 1,0 mg/l de NAA apresentou maior número de brotaç5es. por. foi. explante. o. que. respon-. sivo. Ensaios de doses de radiação gama foram duzidos nos diferentes materiais: nucelos, calos cotilédones de. embri~es. con-. nucelares,. nucelares e protoplastos, visando. determinação de doses recomendáveis para. futuros. utilizando estes explantes na indução de. mutaç~es.. a. trabalhos.

(26) xxiv. ADAPTATION OF TISSUE CULTURE METHODOLOGIES AIMING AT MUTATION BREEDING IN Citrus sinensis (L.) OSBECK. cv. PERA. Author: Mariângela Cristofani Adviser: Prof. Dr. Augusto Tulmann Neto. SUMMARY. Citrus improvement via. conventional. methods. has encountered serious limitations due to the existence. of. nucellar embryos in the seeds of polyembryonic. as. well as to the high degree of heterozygosity. species, and. the. long. reproductive cycle, among other factors. Tissue culture has emerged. as. an. technique for improving citrus species in order the. difficulties. methods. involving. found. This technique. in has. applying also. the. been. to. surpass. conventional. used. mutation induction to obtain solid. auxiliary. in. studies. mutants. when. mutagenic agents are used to increase mutations frequency. The objective adapt different tissue culture. (Citrus sinensis Osbeck). to. of. the. present. methodologies future. mutation. work in. was to. cv.. breeding. Pera of. Citrus species. Nucelli were extracted from seeds of immature.

(27) xxv. fruit, 12. embryos. were. produced directly from these explants in the MT medium. with. different. weeks. after. anthesis.. concentrations. of. Somatic. IAA and CIN.. The. medium. supplemented with 1.JO mg/l of CIN favored the formation embryos, mainly via budding processo. Embryogenic. were produced directly from the nucelli. in. the. of. calluses MT. medium. supplemented with BAP (10 mg/l). A high number of embryos the calluses, of lactose and. where. obtained. from. the MT medium supplemented with 50 g/l. 500 mg/l of malt extract proved. The. most efficient. from. was. embryos produced. nucellar calluses were. able. to. from. the. nucelli. or. and. to. develop. to. be. regenera te plants in the MT medium containing 50 g/1 sucrose and 500 mg/l malt extract. from. Protoplasts were isolated. the. embryo-. genic calluses and their viability was verified by the with. fluorescein. diacetate.. isolation was 1.03 x 10. 6. The. yield. provided. protoplasts per 1. gram. test. in. the. of. callus. and the viability of 841. was verified soon after the. pro to-. plasts purification processo Adventitious buds were induced from the cotyledons extracted from nucellar embryos. in the MT and. BAP. containing. Suds were. obtained. medium containing different concentrations of NAA and 0.5. their mg/l. combinations, SAP. and. however. the. 1.0 mg/l NAA provided. highest number of buds per responsive explant.. medium the.

(28) xxvi. Gamma. irradiation. was. conducted. different materiaIs: nucelli, nucellar calluses, of. nucellar. embryos. and. protoplasts,. with. the. cotyledons the. determining the dosages to be recommended in future utilizing these explants in mutation induction.. to. aim. of. studies.

(29) 1. 1. INTRODUÇÃO. A citricultura brasileira detém a maior. pro-. dução de laranja e exportação de suco cítrico concentrado do mundo (FAO, 1990).. Em 1990, o suco de. laranja. concentrado. alcançou o segundo lugar como o principal produto pelo Brasil. exportado. (EXPORTAÇOES agroindustriais, 1991).. o. Estado de São Paulo é o principal. de laranja do pais e é o responsável 85% da safra nacional. por,. (LARANJA, 1988).. mais importante da citricultura. o. produtor. aproximadamente, cultivar Pera é. paulista e. também. cultivares mais preferidos pela indústria do. um. suco. o dos. ( TEóFILO. SOBRINHO, 1991). A muda selecionada fator de sucesso na instalação. de. representa um. pomar. o. principal. comercial. de. citros, devendo para isto, estar isenta de pragas e. doenças. (GREVE, 1991).. Neste sentido, clones nucelares têm. contri-. buido para a produção de porta-enxertos e borbulhas. isentos. de viroses (SALIBE, 1969). A citricultura brasileira é. considerada. tremamente vulnerável, devido ao limitado número. de. ex-. culti-.

(30) 2. vares de laranja e tangerina, e. ao. uso. abusivo. do. lim~o. cravo como porta-enxerto (GIACOMETTI, 1980). Segundo BARRET & RHODES (1976), o sistema monocultura. perene. empregado nos pomares. compostos por um pequeno número de. cultivares de citros. a. fim. de. comerciais,. genótipos. relacionados, faz necessário ampliar. a. de. estreitamente. base. contornar. genética o. dos. problema. da. vulnerabilidade genética do germoplasma. Entretanto, os trabalhos de genética e melhoramento pouco têm contribuido para a tivares.. Os problemas associados com o. ti co de Cjtrus. s~o. um reflexo do. reprodutivo deste gênero.. de. criaç~o. melhoramento. comportamento. Fatores tais. novos. como,. culgené-. genético. e. longo. ciclo. reprodutivo, apomixia, alto grau de heterozigosidade,. difi-. culdade de reconhecimento e sobrevivência. do. hibrido. ginado do cruzamento entre espécies e/ou cultivares briónicos e a complexidade da. determinaç~o. ori-. poliem-. das caracteristi-. cas genéticas têm impedido a transferência de genes dentro e entre os Citrus e os gêneros relacionados. 1. (Barret ,. cita-. do por GROSSER & GMITTER, 1990).. 1. BARRET, H.C. Intergeneric hybridization of citrus and other genera in citrus cultivar improvement. Proc. Intl. Soc. Citricult., 2: 586-9, 1977..

(31) 3. A maioria dos cultivares de importância dial foi obtida a partir de mutaçees (SOOST & CAMERON, 1975).. somáticas. mun-. espontâneas. Isto demonstra o grande. potencial. de resposta destas espécies aos tratamentos com agentes. mu-. tag~nicos.. o. tratamento mutagénico de tecidos multicelu-. lares, tais como. gemas e sementes,tem conduzido à. de plantas com quimerismo. gemas. t~m. Métodos de. formaç~o. recorrente de. seleç~o. sido utilizados para resolver este problema.. métodos entretanto, apesar de serem efetivos,. Tais. onerosos e. s~o. trabalhosos (BUTTON & KOCHBA, 1977). A cultura de tecidos e células, cultura de nucelos, calos protoplastos, apresenta-se. embriog~nicos, ent~o,. auxiliar o melhoramento genético. incluindo. gemas adventícias e. como uma técnica capaz das. a. espécies. de. de. principalmente quando se associa à técnica. lidade de se obter mutantes sólidos (plantas. citros,. induç~o. mutaçees, isto porque, dentre outras vantagens,. a. sem. de. de. probabiquimeris-. mo) pode ser maior neste caso. Levando-se em. consideraç~o. as dificuldades no. emprego de métodos convencionais no melhoramento cies cítricas e o. potencial. tecidos no melhoramento destas este trabalho, a. produç~o. lar,. (2). (1). estudar. das. técnicas. espécies, uma. de. a. metodologia. espé-. cultura. Objetivou-se. de com. metodologia para otimizar. de calos embriogénicos a partir do adaptar. das. de. tecido. cultivo. de. nuce-. proto-.

(32) 4. pIastos isolados a partir dos calos nucelares embriogênicos, (3) estabelecer. um. gemas adventicias e calos. protocolo de (4) estudar a. embriogê-nicos,. adventicias à indução de. radiaç~o. mutaç~es. nucelos,. induç~o. e. regeneraç~o. radiossensitividade protoplastos. gama, visando futuros. trabalhos. em Citrus sinensis cv. Pera.. de dos. gemas com.

(33) 5. 2. REVISaO DE LITERATURA 2.1. Eabriogênese somática. A embriogênese somática pode ser definida como o processo de desenvolvimento de células somáticas.. A. produç~o. de. embri~esJ. a. embriões. partir somáticos. partir da cultura de células,. tecidos e órgâos pode. direta ou indiretamente.. embriogênese. envolve a. formaç~o. A. de um embriâo. também. a. ocorrer. somática. somático,. de. direta denomi-. nado embrióide (WILLIAMS & MAHESWARAN, 1986), de origem unicelular ou de um grupo de células a partir do explante,. sem. passar por uma fase intermediária de calo. A embriogênese somática indireta consiste proliferação de calo a partir de. um explante e. na. subsequente. formaçâo de pr6-embri6ides a partir destes calos. Estes dois padrões de desenvolvimento de briões somáticos foram observados em cultura de. óvulos. em-. in-. teiros e/ou nucelos em citros. A embriogênese somática direta é de ocorrência notável em cultivares de. citros. poliem-. bri6nicos, onde células pré-existentes no tecido nucelar dâo origem aos embriões nucelares (in vivo ou. in. vitro).. Em.

(34) 6. vários casos, estes embrióides podem ser produzidos a partir da cultura de. ~mbri5es. vo de protoplastos. o. imaturos (TISSERAT, 1985).. provenientes. de. calos. culti-. embriogênicos. também tem resultado na diferenciação de embriões. somáticos. por via direta e indireta (KOBAYASHI et alii, 1985). Em. ambos. os. padrões. de. formação,. o. em-. brião somático segue a mesma sequência de desenvolvimento do embrião zigótico, ou seja, a passagem. pelos. estádios. glo-. bular, cordiforme e torpedo, seguido pela formação da planta (SCHULTHEIS et alii, 1990).. 2.2.1. Embriogénese somática direta. Vários trabalhos foram realizados com o tivo in. vi~ro. cul-. de nucelos e óvulos isolados das espécies. ci-. tricas,visando 'a obtenção de embriões somáticos para a. pro-. dução de porta-enxertos vigorosos e isentos de viroses. (NA-. VARRO & JUAREZ, 1977) e também, em trabalhos que indução. de. mutações. (KOCHBA et alii,. 1972;. visavam KOCHBA. ,. a. &. SPIEGEL-ROY, 1977a; STARRANTINO & RUSSO, 1976-1977). Embriões zigóticos e nucelares de muitos cultivares de citros foram cultivados com sucesso (OHTA & FURUSATO, 1957; RANGASWAMY, 1958; 1959, 1961; 1969).. RANGAN. et. alii,. A indução de embriogénese somática foi realizada. muitas espécies e cultivares de citros. foram produzidos de cultivares. Embriões. em. somáticos. poliembriónicos, com ou. sem.

(35) 7. sementes, através da cultura de tecido nucelar semente em desenvolvimento. excisado. & MURASHIGE,. (TISSERAT. óvulos abortivos (BITTERS et alii, 1970) e óvulos lizados (BUTTON & BORNMAN,. 1971;. assim como, através da cultura. de. et. 1977),. n~o. ferti-. alii,. 1972),. óvulos inteiros fertili-. (BUTTON & BORNMAN, 1971; KOCHBA et alii,. zados ou não e. KOCHBA. MITRA & CHATURVEDI,. 1972).. A. técnica. de. 1972. cultura. óvulos e nucelos. in vitro foi utilizada também, e. com. cesso, na. de embriogênese somática em uma. série. induç~o. (RANGAN. cultivares monoembriônicos. et. alii,. & JUAREZ,. BITTERS et alii, 1970; NAVARRO. de. 1968,. 1977;. de sude. 1969;. BUTTON. &. KOCHBA, 1977). Estudos revelaram a existência de células com citoplasma denso e núcleo grande no tecido tremidade micropilar do poliembriônicos.. saco. embrionário,. No cultivar Trovita (C.. 50. dias. Estas células foram denominadas de embri~o. nucelar e. n~o. nos. ou. após. células. logo a. na. ex-. cultivares. sinensis) ,. células inciaram a divisão ao mesmo tempo divisão do zigoto, cerca de. nucelar~. estas após. a. polinizaç~o.. primordiais. foram observadas nos cultivares. do. mono-. embri6nicos (KOBAYASHI et alii, 1981). Este tipo de estudo é lhos visando. a. induç~o. gênico dos explantes, propicia um método dos.. importante. em. de mutações, pois o tratamento antes. ideal. na. da. formaç~o. produç~o. de. dos. trabamuta-. embrióides,. mutantes. sóli-.

(36) 8. Neste sentido, KOCHBA et alii (1972), através Shamouti e. de estudos histológicos em três cultivares. lência. sinensis) e. (C~trus. Marsh. verificaram que 6vulos e nucelos. Seedless extraídos. 1-8 semanas de idade não apresentavam o. Va-. (C. paradisi) ,. de. frutos. com. desenvolvimento. de. embriões nucelares. A época de extração (6vulos inteiros. ou. e. o. tipo. de. explante. nucelos) têm variado bastante,de acor-. do com a espécie utilizada nos diferentes trabalhoste. pare-. cem ter influência na resposta quanto. e. porcentagem. à. ao. número médio de embriões por explante responsivo. BUTTON & KOCHBA. (1977). que. nos. cultivares monoembriónicos,somente nucelos extraídos de. se-. mentes em. desenvolvimento. produziram. Esta afirmação está de acordo com o (1977) observaram trabalhando com cos de Clementine (C. reticulada são auto-incompatíveis e 'Comuna'. ( C.. foram. sinensis) " com. formação de sementes.. observaram. embriões. que. NAVARRO. cultivares Blanco).. Estas variedades com. finalidade. Os autores obtiveram. tisfat6rios"utilizando frutos com. & JUAREZ. monoembrióni-. polinizadas a. somáticos.. de. p6len. de. induzir. resultados. 13 a 15 semanas. a sa-. ap ós. a. polinização. Entretanto, NAVARRO & JUAREZ. ( 1977) ,. lhando com cultivares poliembriônicos do grupo lizaram óvulos excisados de. ovários. de. traba-. Navel,. flores,. uti-. antes. antese e óvulos de frutos em desenvolvimento, obtidos uma. da a.

(37) 9. dez semanas após a antese.. Em todas as fontes eles observa-. ram uma taxa semelhante de. embriogénese,. indicando. idade do fruto,na época da excisão do óvulo,. que. a. aparentemente,. não determina o número de óvulos que vão produzir embrióides. Esta observação para o cv.. está de acordo com os resultados obtidos. n~o. Shamouti. por KOCHEA et alii (1972), no qual. mais altas porcentagens de óvulos, mostrando. de. formaç~o. brióides,foram verificadas em. óvulos. quatro semanas após a antese.. GOLDMAN (1988) encontrou. lhores respostas em óvulos,do. cultivar. Osbeck~. extraídos. Pera. de. as em-. frutos. me-. sinensis. (C.. excisados 10 semanas após a antese. (1972). KOCHEA et alii. verificaram. que. nucelos extraidos dos cultivares Valência e Marsh ram em maior porcentagem de Este. cultura de óvulos.. formaç~o. fato. resulta-. de embrióides do que. também. foi. verificado. GOLDMAN (1988), em cultura de óvulos e nucelos do. cv.. onde nucelos extraidos de frutos com 10-12 semanas ram as maiores porcentagens (27 - 69,47%) em todos os tratamentos, em. os. comparação. de com. a por. Pera,. produzi-. embriogênese, o. cultivo. de. óvulos, com a mesma idade, após 12 semanas de cultivo. Os. resultados. de. embriogênese,. para o cu 1 ti var Pera., variando de O a GOLDMAN (1988), estão. de. por KOCHBA et alii (1972), ( 1986) •. acordo com os. 25%. 9. nos. encontrados óvu los, por. resultados. MOORE (1985) e GMITTER. Por outro lado, resultados entre 50 a 70%. briogênese,em. óvulos,foram verificados. por. obtidos. & MOORE de. STARRANTINO. em-. &.

(38) 10 RUSSO (1980) e 80 a 100% para os cultivares do. grupo. Navel. (NAVARRO & JUAREZ, 1977). Os 6vulos em certos cultivares apresentam desenvolvimento mais lento in vitro que os nucelos.. & JUAREZ (1977) obtiveram embri6ides por. até. 15. semanas. sem. diferenciação, no cv. Navel.. de. óvulos. qualquer. NAVARRO. cultivados. sinal. GOLDMAN (1988). um. prévio. de. observou. que. os nucelos em cultivo formaram embrióides mais rapidamente e em maior porcentagem que os 6vulos, no cv. Pera. Outros fatores tais como. gen6tipo da. planta. doadora do explante e composição do meio de cultura têm sido observados influenciando na porcentagem. de. explantes. res-. ponsivos.. &. O meio de cultura idealizado por MURASHIGE SKOOG (1962) e sua modificação TUCKER. (1969). realizada. por. &. MURASHIGE. contribuíram muito para um maior sucesso. na. cultura e morfogênese de óvulos e outros órgãos de citros. O extrato de malte foi benéfico à cultura de 1972) •. Em. adicionada. vários ao. meio. óvulos. e. como. sendo. et. alii,. nucelos (KOCHBA. outros trabalhos, de. relatado. cultura,. mg/l, para estimular a indução da. esta substância. na concentração embriogênese. JUAREZ, 1977; STARRANTINO & RUSSO, 1980).. de. (NAVARRO. Um estudo. foi 500. &. reali-. zado por MODRE (1985), com o cv. Marsh (Ci trus paradis.i). de-. monstrou Que o extrato de malte favoreceu a formação de. em-. brióides neste cultivar e. Que. o. aumento. da. concentração.

(39) 11. desta substância para 1000 mg/l aumentou porcentagem de óvulos responsivos em. em. relaç~o. sete à. vezes. a. concentraç~o. de 500 mg/l. A caseina hidrolizada e a água de. coco. tam-. bém têm sido relatadas estimulando a embriogênese em tecidos nucelares de citros. (SABHARWAL,. BUTTON. 1963;. & BORNMAN,. 1971; MITRA & CHATURVEDI, 1972; PASQUAL, 1985).. Outros componentes importantes são os reguladores de crescimento, que são compostos da maior cia na cultura de tecidos de plantas. do por. PASQUAL et alii (1988),. a. Segundo. adiç~o. significân-. 2 Esan , cita-. das auxinas. IAA,. NAA e 2,4-D ao meio de cultura, suprimiu. significativamente. ou completamente a embriogênese nucelar.. Este. foi observado por MO ORE (1985) com e ABA. no. cv.. Marsh (C.. a. utili2aç~0. parasisi) e por. fato. também. de IAA,. PASQUAL. et. GA3 alii. (1988) com 2,4-D no cv. Valência.. Por outro lado, TISSERAT &. MURASHIGE. (1977). relataram que o IAA, em baixas concentrações, suprimiu levemente a embriogênese no cv. Ponkan (C.. reticulata Blanco) em. culturas nucelares. Um (1985), foi que a. 2. fato adiç~o. interessante, observado. por. MDDRE. de diferentes substâncias ao meio de. ESAN, E.B., 1973. A detailed study of adventive embryogenesis in the rutaceae. University of California, Riverside (dissertaç~o). 233p..

(40) 12. cultura,. influenciou. a. embriogênese. àquela relatada em trabalhos sobre. de. forma de. induç~o. semelhante embriogénese. somática a partir de calos nucelares. Assim, da mesma forma que ocorreu nas. cultu-. ras de calos nucelares (KOCHBA & SPIEGEL-ROY, 1977bj. KOCHBA. et alii, 1978), a presença de auxina IAA,no meio de ra suprimiu a embriogênese em 6vulos do. cv.. cultura. Marsh.. Assim. comoI a porcentagem máxima de 6vulos responsivos. foi. veri-. ficada com a. um. inibi-. adiç~o. de 0,01 mg/l de daminozida,. dor da sintese de GAs (MOORE, 1985). Em um trabalho. posterior,. & MOORE. GMITTER. Ci-. (1986) estudaram o comportamento de vários gen6tipos de trus em diferentes meios, contendo. mento.. substâncias. de. cresci-. Os 6vulos dos cultivares de laranja doce, cultivados. em meio de cultura com 2,4-0. e. daminozida. malte, na presença de luz, foram os mais. ou. extrato. efetivos. de. na. for-. examinando. três. mação de embri6ides. MITRA & CHATURVEOI. (1972),. gen6tipos, encontraram uma relação direta entre poliembrionia em um gen6tipo e seu potencial de embri6ides in vitro.. o. grau. para. formação. Outros pesquisadores relataram. ferenças na formação de embri6ides entre cultivares trus poliembriónicos e monoembriónicos,. nas respostas. devido ao examinadas 1977).. (BUTTON. grau. de. & BORNMAN,. mas. as. poliembrionia, 1971;. BUTTON. de. de. di-. Ci-. diferenças n~o. &. foram KOCHBA,.

(41) 13 MOORE (1985) observou,em seu trabalho,que cultivares de C.. e C. paradisi. sin~nsis. poliembrionia 9 em. relaç~o. t~m. os. um alto grau de. aos outros clones examinados.. cultivares destas duas espécies tiveram também a maior. Os por-. centagem de óvulos responsivos e a maior média de embri6ides por 6vulos responsivos que os outros. clones.. Entretanto,. houve várias exceções para esta caracterlstica, cultivares poliembriOnicos. poliembrionia,. parecem. dentro. dos. Outros fatores, além do grau de. influenciar o. produzidos a partir de 6vulos. n~o. número. de. desenvolvidos. embriões de. frutos. maduros (MOORE, 1985).. 2.2.2. Embriogênese somática indireta. A embriogênese somática pode ocorrer. indire-. tamente a partir de óvulos e nucelos, através do processo de formaç~o. tir. de calos e posterior. destes.. RANGASWAMY. calos em nucelos de 6vulos. formaç~o. (1958). de embrióides a. observou. fertilizados. a. em. par-. formaç~o. Citrus. de. micro-. carpa.. Posteriormente, outros. autores. relataram. o. aparecimento esporádico de pequenos calos em cultura de óvulos e nucelos, além de embri6ides diferenciados destes explantes (RANGASWAMY,. 1961; SABHARWAL, 1963:. & BORNMAN, 1971; MITRA & CHATURVEDI, 1972; KOCHBA 1972).. diretamente. et. BUTTON alii,.

(42) 14. KOCHBA et alii celos do cv. Shamouti,. (1972) cultivaram 6vulos e nu-. e Marsh. Valência. in. varam que enquanto os cultivares Valência e Marsh altas porcentagens de cultura originários dos 6vulos embri6ides. n~o. Em. um. embri6ides. de. pequeno. este cultivar. compensaç~o,. foram observados. produção,. nucelos,. mostraram. número. de. formou-se diretamente destes explantes no culti-. var Shamouti. que. e. formaç~o. com. e obser-. vi~ro. nos. diferenciação. outros dois dos. um método alternativo para indução de mutação. em. aplicaç~o. A. obtençã o. seria, em. calos. cultivares.. calos,. embri6ides e plantas a partir destes. formou. desta. de forma,. trabalhos~visando. cultivares ou espécies que. 'a. produzem. poucos embri6ides a partir do nucelo. A obtenção de calos nucelares. foi. estendida. para outros gen6tipos de Citrus com a finalidade de se obter protop1astos totipotentes a partir destes et. a1ii,. 1982;. KOBAYASHI. et. a1ii,. materiais 1984;. (VARDI. GROSSER. &. CHANDLER, 1987; VARDI & GALUN, 1988).. 2.2.2.1. Obtenção de calos embriogênicos. Os explantes utilizados nos trabalhos com indução de calos têm sido nucelos e. 6vulos.. sido observada a formação destes calos na. Entretanto, região. do. tem hipo-. c6tilo dos embri6ides obtidos a partir destes explantes (HIDAKA & KAJIURA, 1988; GOLDMAN, 1988)..

(43) 15 GOLDMAN (1988), 6vulos maç~o. do. cv. Pera CC.. sin~nsis. de calos embriogênicos. embri6ides produzidos meses ap6s a tura.. a. inoculaç~o. trabalhando. na. com. nucelos. OSbeck), verificou a do. regi~o. for-. hipoc6tilo. partir de nucelos,. cinco. de. a. sete. do explante nucelar em meio de. cul-. Após este periodo de cultura, os nucelos apresentaram. altas porcentagens. de. calos embriogênicos (34,52 a 71,12%). quando comparados com os 6vulos, ap6s o mesmo tempo de tivo.. e. Resultados semelhantes foram obtidos para. de nucelos surgiram. de. o. cul-. cultivo. cultivares monoembriônicos, porém, os. diretamente. da. micropilar. regi~o. dos. calos. nucelos,. ap6s 3-6 semanas de cultivo (JUAREZ et alii, 1976). Ainda ( 1988) ,. os. óvulos. baixas porcentagens Estes resultados. de acordo com. o trabalho. produziram,. de. de. uma. de. GOLDMAN. forma. geral,. calos embriogênicos (O. estão de acordo com. aqueles. a. 17,36%).. obtidos. por. VARDI et alii (1982) que observaram uma freqüência geralmente baixa na produção de calos ovulares (cerca de 24% para os cultivares de tangerina e 2% para. os. cultivares de "grape-. fruit"). SPIEGEL-ROY &. VARDI. para cada cultivar e/ou espécie, retirada dos explantes,. o. destinados. (1984) estágio ao. afirmaram ótimo. que,. para. desenvolvimento. a de. calos, deve ser determinado separadamente. Para o cultivar Shamouti, os melhores tados. na. obtenç~o. resul-. de calos foram obtidos através da cultu-.

(44) 16. ra de óvulos extraídos de frutos, 2 a 5 semanas após a antese (KOCHBA et alii, 1972).. Para o cultivar Pera, os. res resultados foram conseguidos. com. óvulos. melho-. extra1dos. frutos com 12 semanas após a antese (GOLDMAN, 1988).. de. Entre-. tanto, o que se observa nos trabalhos com sistemas de pro toplastos onde calos foram obtidos de várias espécies. de. Ci-. trus, é que óvulos extraidos de frutos com 2-6 semanas. após. a antese foram utilizados invariavelmente para qualquer. uma. das. espécies. estudadas. (VARDI et a1ii,. ZHANAO. 1982;. et. alii, 1989). Segundo SPIEGEL-ROY & VAROI. (1984),. as. lulas nuce1ares de Citrus são pré-determinadas como embriogênicas. cé-. células. a adição de reguladores de crescimento vege-. e. tais não é necessária para induzir a embriogênese Entretanto, segundo SAAO (1975), a adição de 2,4-0 cessária para indução de calas embriogênicos. em. somática. foi. ne-. cultivares. de Citrus limon. A adição de reguladores meias de cultura para indução de ser constatada em. várias. de. calos. pesquisas.. crescimento. aos. embriogênicos. pode. KOBAYASHI. alii. et. (1983), trabalhando com óvulos excisados de gemas florais da cv. Trovita (Citrus sinensis) , obtiveram calas em meia. MT. (MURASHIGE & TUCKER, 1969) suplementado com 100 mg/l de. ex-. trato de malte e 20 mg/l de sulfato de adenina, três meses, numerosos. embri6ides. obtidos.. a. Entretanto,. e. pequenas. onde, calas. após foram. frequência de indução de calos não.

(45) 17. foi suficientemente alta.. Estes calos. dos em meio MT suplementado. com. riormente, KOBAYASHI et alii. (1984) estudaram o. 10 mg/l de. reguladores de crescimento NAA, BAP e induç~o. um. BAP.. suas. Poste-. efeito. dos. combinaçees. na. com a finalidade de. de calos em 6vulos de cv. Bahia. estabelecer. propaga-. foram~ent~o~. meio de cultura mais eficiente. O. meio. de. cultura suplementado com 10 mg/l de BAP foi o mais eficiente na. produç~o. calos. de. embriogênicos,neste cultivar.. Calos. nucelares foram induzidos em onze cultivares estudados (oito cultivares de laranja doce, Citrus Junos, Citrus "Nova") neste mesmo meio. de. cultura. deliciosa,. (KOBAYASHI. et. alii,. 1984) . HIDAKA & KAJIURA (1988) obtiveram briogênicos a partir. de. embriões. imaturas de três espécies (Washington Navel), C.. de. lação,. calos. ~M. de cinetina.. friáveis. Ci trus:. yuko (Yuko) e. (Ponkan), em meio de cultura sacarose e 50. originados. foram. C. C.. calos de. em-. sementes. sinensis. Osbeck. reticuJata. Blanco. MS suplementado com 0,16 M. de. Um a três meses ap6s a inocuproduzidos. na. região. do. hipoc6tilo destes embri6ides. A utilização de reguladores de crescimento na indução de calos embriogênicos também pode ser verificada no trabalho realizado por ZHANAO et alii (1989), obtidos de frutos com 1-6 semanas cultivados em meio cinetina 1,0 mg/l.. MT. após. suplementado. com. o. com. 6vulos. florescimento IAA. 0,1. mg/l. e e.

(46) 18 Entretanto, obteve-se. a. formaç~o. em. vários. outros. cultivares,. de calos através do cultivo de 6vulos. e nucelos em meio de MURASHIGE & TUCKER (1969), com 500 mg/l de extrato de malte e 50 g/l adiç~o. de. suplementado sacarose. de reguladores de crescimento (KOCHBA et alii,. sem 1972;. VARDI et alii, 1982). KOCHBA & SPIEGEL-ROY (1973). verificaram. que. os 6vulos e nucelos do cv. Shamouti, quando mantidos em meio MT + 500 mg/l de EM, desenvolviam calos.. pequenas. Para induzir maior crescimento,. estes. subcultivados em meio MT suplementado com 1 tina e 1 mg/l de IAA. menta dos calos.. quantidades calos. mg/l. de. Este meio produziu um rápido. outros. meios de cultura suplementados com AD, EM,. finalidade de se estudar o crescimento dos calos e o. dos. com. cine-. neste. diferentes. IAA e CIN. volvimento de embriões,a partir destes,em meios. foram. cresci-. Depois que estes calos proliferaram. meio de cultura, foram transferidos para. de. com. a. desen-. suplementa-. diferentes substâncias e concentrações de. regula-. dores de crescimento. Um fato interessante observado por BUTTON (1974) e, posteriormente, GEL-ROY & KOCHBA, 1975; HIDAKA. &. por outros autores K AJIURA, 1988;. alii, 1989, GROSSER & GMITTER, 1990) é que vados em diferentes concentrações de IAA tornar-se habituados,em. relaç~o. cimento ap6s alguns subcultivos.. KOCHBA. calos e. &. (SPIE-. ZHANAO. et. subculti-. cinetina. podem. a estes reguladores de cres-.

(47) Segundo SKIRVIN (1978), a da da necessidade de. fornecimento. habituaç~o. exégeno. de. é a per-. fatores. de. crescimento, geralmente de auxinas, ao meio de cultura, para crescimento dos calos. A mudança na. provavelmente,. habituaç~o,. express~o. génica envolvendo o. dos reguladores de crescimento.. o. representa. sitio. da. uma. sintese. fato de MEINS (1974). observado que plantas provenientes de. células. ter. totipotentes. habituadas s6 produziram calos na presença de reguladores de crescimento, indica que a. não. habituação~provavelmente,. origem mutacional, mas representa uma resposta. tem. epigenética.. Porém, a verdadeira explicação permanece desconhecida (SKIRVIN, 1978).. 2.2.2.2.. Obtenção de embriões somáticos em calos nucelares. A embriogênese em cultura de calos de de origem nucelar é estimulada por uma. variedade. Citrus. de. subs-. tâncias e condições de cultivo (KOCHBA & BUTTON, 1974; SPIEGEL-ROY & KOCHBA, 1973; KOCHBA & SPIEGEL-ROY, 1977b;. KOCHBA. et alii, 1978). KOCHBA et alii dições que reduzem o nivel. (1978) assumiram que. end6geno. de. as. con-. auxinas, em. calos. habituados (independentes de auxinas e citocininas), levam ao aumento na embriogênese,. e isto está de acordo. com. o. que.

(48) 20 foi verificado por estudos. com. TISSERAT. cultivares. de. & MURASHIGE. ( 1977 >.,. Citrus. e. mono. em. seus. poliembri6ni-. COSo. Calos expostos à radiação. embriogênicos, do gama~mostraram. cultivar. um estimulo. Shamouti.,. na. formação. de embriões somáticos com doses de 12 a 20 kR, sendo. que. o. efeito máximo foi observado com a dose de 16 kR (SPIEGEL-ROY. & KOCHBA, 1973). KOCHBA & BUTTON (1974) verificaram que o "envelhecimento", isto é, o período de tempo em. que. os. calos. permanecem em um mesmo meio de cultura,entre um subcultivo e outro, estimulou a embriogênese em calos. do. cv.. Shamouti.. KOCHBA & SPIEGEL-ROY (1977c) também observaram este sendo que,. a maior produção. de. embriões. efeito,. somáticos ocorreu. quando os calos foram mantidos por dez a quinze. semanas. no. mesmo meio de cultura antes do subcultivo.. A. omissão. de. sacarose no meio de cultura, por. de. um. período. estimulou a embriogênese de modo semelhante. ao. subcultivo " enve lheci-. men to" (KOCHBA & BUTTON, 1974). Nos meios de cultura. onde. reguladores de crescimento para acelerar. foram o. utilizados. crescimento dos. calos, verificou-se que os baixos níveis de cinetina e separadamente,. induziram. uma. maior. diferenciação. IAA, de. embri6ides,que os niveis mais altos ou as combinações destes reguladores de crescimento (KOCHBA & SPIEGEL-ROY, 1973)..

(49) 21 A embriogênese é inibida por aplicações. ex6-. genas de lAA, NAA, ou citocininas tais como cinetina, BAP 2ip. (KOCHBA. & SPIEGEL-ROY,. 1977b;. KOBAYASHI. et. e. alii,. 1984). Por outro lado, a embriogênese somática é estimulada por inibidores da síntese de auxinas tais como 5HNB e AZI. (KOCHBA & SPIEGEL-ROY,. 1977b). e. por. inibidores. síntese de GAs (KOCHBA et alii, 1978), tais como CCC e. da. ALAR.. A aza-guanina (AG),que exerce um efeito antagônico sobre citocininas, estimulou a embriogênese em calos do mouti. cv.. Sha-. (KOCHBA & SPIEGEL-ROY, 1977b). O efeito de vários carboidratos na. embriogê-. nese e desenvolvimento de embri6ides foi estudado lhe nos cultivares Shamouti (C. sinensis) , limon) , King (C. nobilis),. Navei. as. (C.. lactose. sinensis). em. deta-. Villafranca. (C.. laranja azeda (C. aurantium). e. (KOCHBA et alii, 1982).. estimularam, consideravelmente, a. A galactose e a embriogênese. todos os cultivares estudados.. A glicose e a frutose. os carboidratos menos efetivos. no. estímulo. à. em. foram. embriogêne-. se. A traç~o. meio MT,. de. adiç~o. de galactose e lactose,. 50 g/l, quando comparada com outras tais como,. na. concen-. adiçÕES. extrato de malte, sulfato de. água de coco, extrato de levedura, ácido casamínico,. ao. adenina, BAP. e. NAA, produziu um notável aumento no número de embri6ides por cultura de calo (KOBAYASHI et alii, 1984)..

(50) 22. BEN-HAYYIN. & NEUMANN (1983). estudaram. efeito do glicerol no crescimento e embriogênese, nos. calos. obtidos da cultura de óvulos de várias espécies e/ou vares de. O glicerol. C~trus.. estimulou. a. para o crescimento.. O glicerol é. culti-. embriogênese. calos que foram capazes de utilizá-lo como fonte de. o. em. carbono. utilizado, eficientemente,. por algumas espécies de Citrus.. Segundo. conhecimento do comportamento dos calos de. os. autores,. C~trus. rol pode servir como um fator de seleção para os. em. o. glice-. experimen-. tos de fusão de protoplastos. A galactose tem se mostrado uma boa fonte carbono para o crescimento de todos os calos de tudados e calos derivados de protoplastos (KOCHBA. es-. C~trus. et. de. alii,. 1982; VARDI et alii, 1982).. 2.2.3. Isolamento de protoplastos. As pesquisas sobre protoplastos abriram ampIas. possibilidades. espécies cítricas.. para. o. melhoramento. genético. das. Vários trabaIhos,utilizando protoplastos,. foram desenvolvidos com indução de mutaçÕEs (VAROI et 1975; ZHANAO et alii, 1989), alii, 198b), GMITTER, 1990). in. vitro. (VAROI. alii,. 1988;. GROSSER. seleção. fusão (KOBAYASHI e transformação. et. alii,. et. &. (VAROI et alii, 1990).. BUTTON & BOTHA (1975) e VARDI et alii simultaneamente, desenvolveram um sistema de. (1975),. isolamento. de.

(51) 23 protoplastos a partir de calos embriogênicos. originados. 6vulos do cv. Shamouti (Citrus sinensis). (1975) conseguiram a. protoplastos. regeneraç~o. embri6ides,. de plantas a. et. a1ii. partir. dos. e estabeleceram a sequência completa de planta. + protoplastos + colônia +. VAROI. de. em. de. células + calos. embriogênicos. trabalho visando à induç~o de mutações em. protoplastos. Posteriormente, a embriogênese. somática~a. de plantas. regeneraç~o. partir de. protoplastos, foi. dida para vários outros genótipos de Citrus, verificar em excelentes. revisões. como. realizadas. estense. por. pode. VAROI. & GMITTER. GALUN (1988), GOLOMAN (1988) e GROSSER. via. &. (1990),. sendo que o maior sucesso foi obtido com cultivares. de. la-. ranja doce (Citrus sinensis). Em geral, as culturas de calos e culturas em suspensão dos. mesmos. embriogênicos. propiciaram. fontes de protoplastos totipotentes.. Tais. excelentes. culturas. ser mantidas em meio de cultivo sem reguladores. de. mento (VARDI, 1977; VARO! et alii, 1982; GROSSER &. podem cresci-. GMITTER,. 1990), ou em meio contendo altos níveis de BAP (KOBAYASHI. et. alii, 1988). GROSSER & CHANDLER protocolo. eficiente. para. (1987). isolamento. de. folhas e calos de diferentes cultivares e. desenvolveram. um. protoplastos. de. espécies. de. Ci-. pode. ser. trus. A obtenção de calos. embriogênicos.

(52) 24 difícil de se conseguir em muitos genótipos. trabalhos realizados,. protoplastos. de. Em. diferentes. folhas eram. fundi-. dos com aqueles provenientes de calos embriogênicos,. dando. origem aos h1bridos somáticos. Recentemente,. et. TUSA. alii. (1990) relataram a regeneração de plantas a partir de protopIastos de folhas do limão 'Femminello·.. Mas. até. então,. a. obtenção de plantas a partir de protoplastos só. havia. descrita para. embriogêni-. aqueles. provenientes. de. calos. sido. COSo. Alguns fatores podem influenciar no de isolamento dos protoplastos. dado numérico. a. Não. se. de. disp~e. respeito do impacto da idade. processo. dos. calos, ou. e. melhor, o tempo decorrido entre um subcultivo. nenhum. outro,. no. rendimento (número de protoplastos/ml), no processo de isolamento dos protoplastos.. Entretanto, diversos autores. mendam que os calos não sejam. mantidos. por. mais. reco-. de. três. semanas no mesmo meio de cultura, antes do processo de isolamento dos protoplastos (VARDI et. alii,. 1982;. alii, 1983, KOBAYASHI. 1988;. HIDAKA. et. alii,. 1988) e que os subcultivos sejam. semanas.. Nas culturas. em. realizados. suspensão,. KOBAYASHI et. &. a cada. recomenda-se. KAJIURA, quatro que. o. subcultivo seja realizado a cada 15 dias (GROSSER & GMITTER, 1990) . Outros fatores, do meio de maceração, a fonte e para. a. digestão da parede. tais a. comq~. pressão. combinação. celular,. afetam. osmótica. das o. enzimas. rendimento.

(53) 25 dos protoplastos e a posterior. capacidade. de. dos. divis~o. mesmos em meio de cultura. Foram realizados vários protocolos,. onde. concentrações e as fontes das enzimas variam para cada tivar e/ou espécie (VAROI & GALUN, 1988).. as cul-. Segundo VAROI et. alii (1982), a macerozyme produziu melhores. resultados. nos. diversos cultivares analisados do que a pectinase. O rendimento,no isolamento, tem variado 10. 6. a 4x10. 6. entre. protoplastos/grama de calo e o tempo de digestão. enzimática,. entre. 4. a 16 horas, dependendo da. concentraç~o. enzimática, do material tratado (folhas, calos embriogênicos e não embriogênicos) e dos genótipos, de acordo com. os. versos protocolos já estabelecidos. gêneros. para. Citrus. e. di-. relacionados. A concentração osmótica do meio de tem sido mantida por volta de 0,7 M, sendo que. maceração. os. açúcares. mais utilizados têm sido o manitol e a sacarose,em. combina-. ção ou apenas o manitol. (VAROI. & GALUN,. 1988;. GROSSER. &. GMITTER, 1990).. o meio MT, macronutrientes. e. com. a metade da concentração dos. sem os micronutrientes e vitaminas,. se mostrado bastante adequado para o. isolamento. de. tem. proto-. pIastos.. e. importante lembrar que um bom rendimento no. isolamento dos protoplastos não pode ser considerado como um fator isolado, pois muitos dos protoplastos. podem. não. ser.

(54) 26. viáveis.. Por esta. raz~o,. é. lidade dos protoplastos ap6s. aconselhável o estudo da o. isolamento.. viabi-. Neste sentido,. muitos trabalhos têm sido realizados, principalmente, com utilizaç~o. de corantes como. fluorescelna. por. exemplo,. (BURGER & HACKETT, 1982).. o. diacetado. Existem. muitos. rantes que podem ser utilizados para avaliar. a. dos protoplastos (ERIKSON, 1985).. metileno. O azul de. a de co-. viabilidade. bém é um corante que tem sido amplamente utilizado. tam-. em. pro-. toplastos vegetais (Hooley3, citado por GOLOMAN, 1988).. 2.2.4. Cultivo de protoplastos. Vários fatores podem influenciar do cultivo dos protoplastos,. entre. eles,. os. no. sucesso. considerados. mais importantes são a densidade de plaqueamento e. a. osmo-. laridade do meio de cultura. A densidade dos protoplastos no meio de tura tem grande influência no processo de. divisão. cul-. e. dife-. renciação dos mesmos (NAGATA & TAKEBE, 1971; VAROI et. alii,. 1975; KOBAYASHI et alii, 1985). VAROI et alii. (1975) verificaram que nos pro-. toplastos do cv. Shamouti, os melhores resultados,quanto. 3. ao. HOOLEY, R. Protoplastos isolated from aleurone layers of wild oat (AvEnã fãtUã L.) exibit the classic response to gibberelic acid. Planta, 154: 29-40, 1982..

(55) 27 número e o tamanho das colOnias de células formadas em de cultura foram conseguidos com a densidade de 10 protoplastos/ml. utilizada (4xl0. 5. A. mais. alta. densidade. de. 5. meio. e. 9x10·. plaqueamento. protoplastos/ml) resultou na formaç~o. pequenas colOnias de células que logo cessaram o. de. crescimen-. to. KOBAYASHI et alii (1985) realizaram um estudo para estabelecer as condições adequadas para a a partir de protoplastos do cv. Troviata e uma densidade de plaqueamento de 4x10· 0,15M de manitol,. embriogênese. notaram. que. protoplastos/ml. 751. dos protoplastos dividiram-se. senvolveram-se em embri6ides.. e. Em contraste, quando os. toplastos foram cultivados a uma. densidade. de. 10. 5. em com depro-. pro to-. pIastos/ml, estes dividiram-se e formaram calos. De uma forma geral, a densidade mento utilizada nos diferentes trabalhos protoplastos/ml. (VARDI & GALUN, 1988;. tem. de. plaquea-. sido. de. 10. 5. & GMITTER,. GROSSER. 1990) . Com a finalidade de se obter. a. divisão. protopIastos, nos casos em que o plaqueamento for com. bai xa. densidade. (lOs -. 10. 2. dos. realizado. protopl astos/ml ) ,. estes. podem ser plaqueados sobre uma camada "alimentadora", formada por protoplastos que pelo. uso da. radiaç~o. sua. divisão. X ou gama (VARDI & RAVEH,. plaqueamento a uma baixa uma. tiveram. densidade. camada "alimentadora", é. um. de. interrompida 1976) •. protoplastos. procedimento. o sobre. conveniente.

(56) 28. quando o nOmero de protoplastos viâveis é desconhecido exemplo, ap6s um após a. fus~o. tratamento. mutagénico). e,. de protoplastos quando número. produzidos pela. fus~o. é. variâvel e. especialmente,. de. protoplastos. previsível. n~o. (por. (VAROI et. a 1 i i, 1989).. Os protoplastos, sendo células isoladas, desprovidas de. p~rede. eficiente na mizaç~o. celular,. absorç~o. de elementos minerais do meio. A. do meio de cultura é. aplicaç~o. representam um sistema bastante. desta tecnologia.. um. fator. primordial. oti-. para. a. Em geral, a exigéncia nutricio-. nal para a cultura de protoplastos é a. mesma. para. células. isoladas (CARNEIRO & CONROI, 1990). Em citros,tem sido utilizado, na maioria trabalhos, o meio de MURASHIGE e TUCKER (1969), sem. dos. regula-. dores de crescimento e com os estabilizadores osmóticos descri tos anteriormente.. HIOAKA & KAJIURA (1988) utilizaram. meio de MURASHIGE & SKOOG (1962) e GROSSER & GMITTER idealizaram um meio de cultura, com xa, utilizado principalmente. composiç~o. para o. cultivo. mais de. o. (1990). complegenótipos. mais recalcitrantes. Os protoplastos de citros têm uma fase "lag" relativamente extensa.. As primeiras divisões. s~o. geralmente. observadas 10-14 dias após o plaqueamento. O tempo. necessá-. rio para a. formaç~o. fatores,. entre eles. est~o. plaqueamento. de calos é afetado por. a fonte de protoplastos e. (VAROI & GALUN,. 1988) •. vários a. densidade. Segundo. GROSSER. de. &.

(57) 29. GM!TTER (1990), a eficiência de plaqueamento, definida a porcentagem. de. protoplastos que se dividem. para. como produ-. zir colônias, geralmente varia de 0-35%. A guida. pelo. produção. de. embrióides. de colônias de células é então se-. formaç~o. desenvolvimento embrióides. de. a. calos. partir. e, finalmente, pela. destes. se tornam aparentes 6 a 7 semanas. queamento dos protoplastos (VAROI et alii, et alii, 1988). O número colônia é. calos.. de. embri6ides. após. 1982;. Os o. pla-. KOBAYASHI. formados. de. cada. baixo e,na maioria dos casos, nem todos mostram. capacidade de formar plantas normais.. O glicerol. tem. utilizado para estimular a embriogênese nestes calos. a. sido (GROS-. SER & GMITTER, 1990). Segundo VARO! & calos. GALUN. (1988),. derivados de protoplastos atingem o diâmetro. mm, eles são individualizados e transferidos contendo 4% de sacarose mesmos.. quando. para. melhorar. o. para. dos para o meio MT com. 2%. de. de. 1-2. meio. MT. crescimento. Calos que atingem o diâmetro de 7mm são glicerol para. os. dos. transferi-. indução. de. embri6ides.. Os embri6ides são individualizados e cultivados. em meio. contendo 4% de sacarose e. MT. 1.500. mg/l. Embriões com folhas cotiledonares expandidas são dos para tubos contendo meio 0,05 mg/l de NAA.. MT. A adição de NAA. de. EM.. transferi-. com 2% de sacarose e 0,02promove. a. formação. da. Posteriormente,. as. raiz e o alongamento do eixo. caulinar.. plântulas são aclimatizadas e. transferidas para o solo..

(58) 30. 2.2.5.. Fus~o. de protoplastos. 2.2.5.1. O gênero reo no qual um. de híbridos somáticos. Obtenç~o. Citrus foi o primeiro gênero. processo. eficiente. foi. estabelecido. regenerar plantas a partir de protoplastos (VARDI 1975, 1982; KOBAYASHI et alii,. 1983;. arb6para. et. alii,. & CHANDLER,. GROSSER. 1987; KOBAYASHI et alii, 1987 e VARDI & GALUN, 1988). et alii. (1986) obtiveram também a. regeneraç~o. de. partir de protoplastos do gênero l'1icrocitrus. lhos foram,então, a base para trabalhos. VARDI. plantas. Estes. a. traba-. posteriores,. visando~. inclusive,a fusão de protoplastos. O primeiro. exemplo. de. hibridação. bem sucedida envolvendo Citrus foi um híbrido. somática. intergenérico. alotetrapl6ide produzido pela fusão de protoplastos de calos embriogênicos. do. cv.. Trovita. sinensis). ( C.. com. proto-. plastos de folhas de Poncirus trifoliata (OHGAWARA et. alii,. 1985) . GROSSER et alii. (1988) produziram os. ros híbridos somáticos a partir de gêneros compatíveis.. A. fusão foi realizada. isolados de uma cultura de calos, em. primei-. sexualmente. entre. protoplastos. suspensão,. de. Citrus. sinensis, com protoplastos isolados de calos. originados. região do. (Blanco).. epic6tilo. de Severinia. disticha. in-. na A. produção deste híbrido demonstrou que a fusão de. protoplas-. tos é uma forma viável de transpor a barreira da. hibridação.